Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation de la perfusion hypothermique oxygénée et des « transporteurs d’oxygène » comme modalité de préservation des transplants rénaux et utérins dans un modèle porcin
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Jusqu'à trois heures d'anesthésie profonde, une ouverture de l'abdomen et une heure de préparation des vaisseaux des organes à prélever : 42 porcs de 100 kilos, âgés de cinq à six mois, sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. L'utérus et les reins de 30 femelles, ainsi que les deux reins de 12 mâles, sont prélevés pour comparer des méthodes de conservation des greffons par perfusion à froid, oxygénée ou avec des "transporteurs d'oxygène". Les retombées visées, de nouvelles pratiques en transplantation rénale et utérine chez l'humain, attendent encore une "éventuelle autorisation" de l'Agence de la biomédecine. Le porteur reconnaît que l'utérus porcin, bifide, diffère de celui de la femme, et juge que le porc "reste cependant un bon modèle" pour ce projet.
Objectifs
En transplantation d’organes, la période entre le prélèvement du transplant chez les donneurs et sa revascularisation chez le receveur est une période particulièrement critique. La préservation des organes est principalement basée sur la mise en hypothermie des organes afin de diminuer le métabolisme à 4°C. Cependant, la préservation en hypothermie statique n'est pas encore optimum. Ainsi, il existe actuellement un développement des techniques de préservation visant à apporter de l’oxygène aux transplants tout au long de la préservation. Ainsi l’objectif de notre étude est d’évaluer l’impact de la perfusion hypothermique 1) oxygénée et 2) avec des « transporteurs d’oxygène » au cours de la préservation des transplants rénaux et utérins dans un modèle porcin, organes qui répondent à des problématiques de conservation bien différentes.
Bénéfices attendus
L’évaluation de modalités innovantes de préservation dans ce modèle pré-clinique porcin permettra de proposer à la fois en transplantation rénale et utérine de nouvelles modalités en clinique humaine avant une éventuelle autorisation d’application en clinique par l’Agence de BioMédecine.
Procédures
Procédure unique sous anesthésie générale profonde, Procédure sans réveil (maximum 3h)- Anesthésie générale (30min)- Laparotomie (30 min)- Préparation vasculaire des transplants (1h)- Prélèvement de sang (30 min)- Mise à mort sous anesthésie générale profonde (10 min)- Puis prélèvements multi-organes
Impact sur les animaux
Procédure sans réveil, après anesthésie profonde longue (3h maximum) pouvant causer un stress
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, sous procédure complète d’anesthésie profonde, pour prélèvements multiorganes.
Remplacement
L'étude des paramètres de perfusion/évaluation d’un organe, compatibles avec une transplantation ne peut se concevoir que dans un modèle animal pré-clinique (donneur), il n’existe pas de remplacement possible pour ces expérimentations qui répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement. Cependant, de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés, l’étude de la revascularisation des organes après la préservation hypothermique ne sera pas réalisée dans un modèle d’allo transplantation avec utilisation de sujets supplémentaires (receveurs) mais par la mise des organes sur machine de perfusion normothermique oxygénée.
Réduction
Ce protocole de recherche a été réalisé pour optimiser le prélèvement des organes sur chaque animal. Ainsi l’utérus et les reins de chaque animal seront prélevés pour inclusion dans les projets de recherche pour 30 animaux femelles. Bien qu’à ce jour, il ne soit pas retrouvé dans la littérature de données en faveur d’un impact du sexe du donneur sur la préservation des transplants, nous souhaitons pouvoir inclure des mâles dans l’analyse des transplants rénaux afin d’évaluer tout effet lié au sexe. 12 animaux « mâles » avec un prélèvement rénal bilatéral simple seront inclus pour mener à bien le protocole de recherche sur la transplantation rénale. Les groupes de 5 organes semblent suffisants pour permettre une analyse statistique des résultats. Cependant l’ensemble des reins seront inclus avec au total 10 reins dans chaque groupe pour augmenter au maximum la puissance statistique et utiliser au mieux de matériel biologique disponible.
Raffinement
Avant protocole, selon leur taille et leur comportement, les animaux peuvent être hébergés par 1, 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est apporté quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est apporté en rotation dans les boxes selon un programme hebdomadaire. Au moment du protocole : de façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures de ce projet seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale et un traitement analgésique est donné en per-opératoire . Une table chauffante est utilisée lors de l’anesthésie générale et des procédures suivantes.
Choix des espèces
L’anatomie abdominale et pelvienne ainsi que la physiologie du porc jeune adulte de 100 kg (5-6 mois) sont proches de celles de l’homme adulte et font donc de cette espèce un excellent modèle pré-clinique. Toutefois, bien que l’anatomie de l’utérus porcin (bifide) diffère de celui de la femme, il reste cependant un bon modèle dans notre projet de préservation de transplants vascularisés. Effectivement, le modèle porcin a précédemment été évalué pour étudier la vascularisation de l’utérus en vue d’une transplantation chez l’Homme.
Recherche de biomarqueurs de santé digestive chez le poulet
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Soumis à des prises de sang au sinus occipital, prévues à J8, J21 et J35, 240 poulets de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une partie reçoit un régime alternatif au soja, à base de matières premières locales, que le porteur dit susceptible d'entraîner des désordres digestifs, et la moitié des poulets subit un "challenge vaccinal (anticoccidien surdosé)" qui peut perturber leur santé digestive. L'objectif est de repérer des biomarqueurs de santé digestive pour les élevages de poulets de chair, et le porteur compte d'avance 5 % de mortalité, soit trois oiseaux par traitement. Il promet des outils de suivi en élevage "ne nécessitant pas de procédure invasive pour les animaux". Pour les mettre au point, tous les poulets sont tués par injection de pentobarbital afin de prélever leur tube digestif, leurs organes annexes et leur contenu digestif.
Objectifs
Le maintien de l’homéostasie intestinale - équilibre entre l'hôte, le microbiote intestinal et les composés alimentaires présents dans le tube digestif - est essentiel pour assurer la santé et le bien-être du poulet. Cependant, plusieurs facteurs inhérents à la qualité des aliments, à la gestion des oiseaux et à l'environnement peuvent affecter cette homéostasie et engendrer potentiellement de multiples perturbations avec des conséquences négatives sur la santé, le bien-être et des rejets dans l'environnement.
Bénéfices attendus
Ce programme contribuera à proposer : - des biomarqueurs de santé les moins invasifs possibles pouvant être utilisés pour quantifier la robustesse du poulet et proposer des stratégies de prévention. -un socle de connaissances sur la l’homéostasie digestive des volailles peu étudiée de façon globale. - un ou plusieurs outils de suivi en élevage ne nécessitant pas de procédure invasive pour les animaux.
Procédures
A J8, J21 et J35, les animaux subiront une prise de sang au sinus occipital , cette intervention prend 5 secondes.
Impact sur les animaux
Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut engendrer du stress lié à la contention de l’animal et un hématome. Cette procédure est assurée par des personnes expertes qui maitrisent parfaitement la technique réduisant le risque de stress et d’hématome pour l’animal. De plus, le régime alternatif intégrant des matières premières plus locales et alternatives au soja (importé) sont susceptibles d’entrainer dans certains cas des désordres digestifs. Ces désordres sont malheureusement fréquents sur le terrain ; ils affecteraient près de 50% des lots. Pour la moitié des animaux, un challenge vaccinal (anticoccidien surdosé) sera appliqué pouvant induire une perturbation temporaire de la santé digestive des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort par injection de pentobarbital en respectant la règlementation en vigueur (annexe 4 del’arrêté du 1/02/13) afin de réaliser les prélèvements des différentes parties du tube digestif, les organes annexes et digesta.
Remplacement
Les connaissances sur la physiologie digestive et sur les possibles liens entre matrices invasives (tissu, contenu digestif), peu invasive (sang) et non invasive (fientes) sont encore très éparses et ne permettent d'envisager une expérimentation in silico. L’utilisation de l’animal ne peut être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.
Réduction
Les animaux seront élevés en groupe et au sol dans un bâtiment d’élevage standard. Il a été estimé qu’un nombre de 20 poulets par condition était nécessaire pour identifier une différence significative entre les groupes en termes de santé digestive et biologiquement pertinente au regard de la bibliographie (phosphatase alcaline, Chen et al., 2014). Considérant une mortalité de 5% (3 animaux par traitement), il est nécessaire de considérer 63 animaux par traitement (20 animaux * 3 dates + 3 mortalités possibles).
Raffinement
Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Le milieu sera enrichi avec des enrichissements permettant aux animaux de grimper et de se cacher (Perch'up).
Choix des espèces
Le projet est un programme de recherche finalisée visant à identifier des biomarqueurs de la santé digestive chez le poulet de chair afin de proposer des méthodes d’évaluation peu ou non invasives. Il n’existe pas de modèle mathématique ni de test in vitro permettant d’atteindre cet objectif. L’objectif premier de ce projet est d'identifier des biomarqueurs peu ou non invasives de santé digestive spécifiquement chez le poulet qui sera le modèle d’étude.
Étude des mécanismes de modification de la réponse immunitaire par l’influence de cellules mémoires
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 946 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune anesthésiée deux fois à six heures d'intervalle pour une injection intraveineuse puis une administration de produits directement dans la trachée. Le porteur qualifie ces produits de "non douloureux" sans les nommer, et affirme que "les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l'animal". Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes, une partie appartenant à une lignée transgénique riche en cellules mémoires dites "MAIT". Le projet porte sur "une question fondamentale en immunologie", et les applications évoquées, de nouveaux adjuvants pour la vaccination, sont renvoyées au conditionnel et au "plus long terme".
Objectifs
Le système immunitaire a pour rôle de détecter un potentiel danger et d’y répondre par le biais des globules blancs afin d’éliminer cette source de danger. On compte parmi ces globules blancs des cellules appelées « lymphocytes T », dont le sous-type dit « CD4 » est absolument essentiel pour l’organisation et l’action du système immunitaire. Par exemple, les patients qui ont un déficit en lymphocyte T CD4 développent de graves maladies infectieuses. Chaque lymphocyte T généré dans l’organisme est capable de reconnaître une cible qui lui est unique. Quand un lymphocyte T n’a pas encore rencontré sa cible au long de la vie de l’individu, on dit qu’il est « naïf » et lorsqu’il a rencontré sa cible, on dit que cette cellule est « mémoire ». Les cellules mémoires sont capables de répondre plus rapidement en cas de reconnaissance d’un danger et c’est sur ce principe qu’est basée la vaccination.
Bénéfices attendus
Ce projet tente de répondre à une question fondamentale en immunologie : comprendre les différents signaux qui sont intégrés par les cellules T CD4 naïves et qui peuvent influencer leur activité. Ce projet pourrait permettre à court terme d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent l’activation des cellules T CD4 naïves qui, pour rappel, sont des cellules clés de la fonction du système immunitaire. A plus long terme, nos résultats pourraient avoir des applications très intéressantes notamment dans le domaine de la vaccination car nous pourrions développer de nouveaux adjuvants capables d’activer des cellules mémoires et ainsi orienter la réponse T CD4 naïve de la façon la plus optimale par rapport à l’effet recherché.
Procédures
Dans la procédure expérimentale visant à évaluer l’effet des cellules mémoires sur l’activité des cellules naïves, les souris anesthésiées recevront une injection intraveineuse (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : suite à l'injection d’anesthésique dans l'abdomenn : douleur légère immédiate, durée brève suite à l'administration intra-trachéale après anesthésie : douleur légère post anesthésie, durée brève suite à liInjection intraveineuse sur souris anesthésiées par inhalation d’isoflurane : douleur légère post anesthésie, durée brève Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront sacrifiés pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées
Remplacement
Le type d’activité que peut adopter une cellule CD4 naïve a déjà été étudiée in vitro et nous sommes capables aujourd’hui de modifier le comportement d’un lymphocyte T CD4 in vitro. Cependant, le comportement que va adopter un lymphocyte T CD4 in vivo peut être très différent de celui obtenu in vitro. Malheureusement, nous n’avons pas aujourd’hui les technologies nous permettant de reproduire in vitro les différents signaux complexes que peuvent recevoir les cellules naïves au sein de leur environnement proche. En effet, les mécanismes qui peuvent moduler l’activité des cellules naïves CD4 sont très nombreux et font notamment intervenir les cellules présentatrices de l’antigène (c’est-à-dire la source de danger), les cellules naïves et les cellules mémoires. Ainsi, une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris est nécessaire. Cette étape est notamment indispensable pour tester les mécanismes de régulation. Stratégie de remplacement : Des expériences in vitro ont déjà été réalisées au laboratoire et ont démontré que l’environnement immédiat des lymphocytes est déterminant pour leurs fonctions. Il est maintenant nécessaire de valider ces résultats dans un environnement intégré qu’est la souris.
Réduction
Nous utiliserons de façon générale 12 souris par groupe expérimental. Il s’agit d’un nombre suffisant nous permettant de surmonter les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à notre modèle. Ce nombre se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire en utilisant ce modèle.
Raffinement
Afin de limiter aux maximums les douleurs et souffrance de l’animal : Utilisation d’anesthésiques pour les injections intraveineuses (par inhalation d'isoflurane dans une boite à tapis chauffant) et intratrachéales (mélange de kétamine et xylazine injectées par voie intrapéritonéale et réalisées sur tapis chauffant pour éviter le refroidissement de l’animal). De plus, nous injecterons après l’anesthésie une solution de réhydratation Ringer-Lactate chauffée afin d’éviter le refroidissement de l’animal. Confort : Crème vaseline oculaire déposée à l’aide d’un coton tige pour éviter l’assèchement de l’œil durant et après l’anesthésie. Surveillance : Surveillance de l’animal tous les 3 jours pour surveiller l’état général des souris. Une grille de score sera utilisée pour évaluer de manière objective l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie pour plusieurs raisons : a) nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet notamment d'utiliser des souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt. b) la souris est aussi un modèle de choix du fait de la disponibilité de souches congéniques (« génétiquement proches ») et transgéniques (« génétiquement modifiées »). c) enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris Nous utiliserons des souris de « phénotype sauvage » (non génétiquement modifiées) mais également une lignée transgénique car cette lignée possède un plus grand nombre de cellules mémoires particulières dites « MAIT » ce qui permettrait d’observer plus facilement l’effet biologique attendu (influence des cellules mémoires sur le devenir des cellules naïves). Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 12 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Évaluation du bénéfice thérapeutique anti-tumoral de l’inhibition d’une protéine P chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
284 souris femelles immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer de l'os sont injectées sous leur peau sur animal vigile, la tumeur est mesurée trois fois par semaine et des composés sont administrés dans l'eau de boisson et par injection, pour tester si l'inhibition d'une protéine renforce la chimiothérapie. Le porteur décrit une gêne possible à la locomotion et des effets tardifs de la chimiothérapie sur la reproduction. Il justifie le recours à l'animal par les limites des cultures in vitro en deux dimensions et présente les femelles comme moins agressives.
Objectifs
Le cancer reste un enjeu clinique important en France (382 000 nouveaux cas et 158 000 morts par an). Bien que le cancer soit mieux pris en charge aujourd’hui, les options thérapeutiques sont limitées pour certains cancers, comme pour le cancer de l’os. Sa prise en charge repose essentiellement sur les chimiothérapies qui sont associées à des effets indésirables ou à de la résistance. Il est nécessaire de remplacer celles-ci par des alternatives thérapeutiques ou de limiter les doses de chimiothérapies en les combinant à de nouvelles thérapies. Pour cela, il faut (1) identifier de nouvelles protéines qui jouent un rôle dans la réponse aux chimiothérapies et (2) évaluer le bénéfice à cibler ces protéines en combinaison avec les chimiothérapies. A l’aide d’une lignée cellulaire dérivée de l’os, il a été montré que la réduction de la quantité de la protéine P induit un arrêt de la prolifération des cellules cancéreuses en réponse à une chimiothérapie. Aujourd’hui il reste à démontrer que l’inhibition de la protéine P améliore la réponse aux chimiothérapies chez l’animal. L’objectif principal est de déterminer si l’inactivation de la protéine P est suffisante pour augmenter l’effet anti-tumoral des chimiothérapies. L’objectif secondaire est de déterminer si la protéine P joue un rôle dans le développement d’une tumeur, démontrant que l’inhibition de la protéine P peut être une approche anti-cancer à elle seule. Pour cela, une greffe de cellules génétiquement modifiées présentant une diminution de la quantité de la protéine P sera pratiquée chez la souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anti-cancer en santé humaine. Ce projet permettra d’évaluer le bénéfice thérapeutique de la perte de fonction d’une protéine P dans le traitement de cancers par chimiothérapies. Cette stratégie thérapeutique innovante permettra de réduire la dose des chimiothérapies utilisées tout en augmentant leur efficacité et ainsi diminuer les effets indésirables associés aux chimiothérapies.
Procédures
Des cellules humaines de cancer de l’os sont injectées sous la peau des souris. Pour effectuer ce geste, la souris est maintenue environ 15 sec, une seule injection de 0.1 ml. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. Les composés sont administrés par voie orale dans l’eau de boisson (à partir de l’entrée des souris en protocole jusqu’à la mise à mort),ou par injection intrapéritonéale (1x/semaine, 10 sec, pendant 5 semaines).
Impact sur les animaux
La greffe de cellules humaines par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. La tumeur pourrait entrainer dans de très rare cas une gêne à la locomotion. Le traitement ajouté dans l’eau de boisson donne un goût amer. Les effets non désirables des chimiothérapies sont observés à long terme (au-delà de 10 semaines de traitement), par exemple une atteint de fonction reproductrice chez la femelle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. En effet, les animaux ayant subi une injection de cellules tumorales, ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
En amont de ces expérimentations in vivo, les chimiothérapies et le médicament-candidat ont été testés sur les cellules in vitro. Les approches in vitro sont nécessaires mais elles restent limitées à un seul type cellulaire ayant une structure en 2D. La deuxième étape de validation du médicament-candidat est in vivo, c’est-à-dire d’étudier son action dans des conditions physiologiques et seul un organisme entier le permet.
Réduction
Une étude préliminaire de validation du modèle est conduite sur un nombre limité de souris (20 souris). Si les résultats de cette étude sont concluants, l’étape 2 sera alors mise en œuvre pour déterminer la concentration de chimiothérapie à utiliser. Cette procédure sera également faite sur un nombre limité d’animaux (50) pour 3 chimiothérapies testées (chimiothérapies classiquement administrées chez l’homme pour le cancer de l’os). Enfin, à l’issu de cette 2ème étape, la procédure 3 sera conduite en séquentielle afin de ne pas avoir à gérer un nombre d'animaux trop important (une chimiothérapie à la fois). Le but de cette procédure est d’étudier s’il est possible de réduire les effets indésirables des chimiothérapies en co-administrant un médicament-candidat.
Raffinement
Le traitement ajouté dans l’eau de boisson ayant un goût amer, 3% de sucrose sont additionnés pour permettre une bonne hydratation. Les analyses de croissance des tumeurs sont non invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requiert pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par la pesée des animaux, et la mesure du développement tumoral. De l'aliment sera mis en fonds de cage si une souris présentait une gêne à la locomotion. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l’analyse de greffes de lignées cellulaires en oncologie. Les expérimentations sont réalisées sur des souris immunodéprimées pour qu’il n’y ait pas de rejet de la greffe des cellules humaines. Des femelles sont mises en œuvre car elles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de constitution des groupes de traitement des animaux. Les souris femelles sont également choisies car les cellules humaines ont été obtenues à partir d’une tumeur développée chez une femme. La greffe est pratiquée sur les souris de 6–8 semaines, pour des raisons d’efficacité de prise tumorale et de reproductibilité.
La protonthérapie à très haut débit pour protéger les tissus sains de la peroxydation radio-induite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur cerveau ou leurs poumons sont irradiés sous anesthésie, avec des tests comportementaux nommés (open-field et reconnaissance d'objet) et des scanners, pour évaluer une protonthérapie censée épargner les tissus sains. Le porteur attend des troubles neurocognitifs après l'irradiation du cerveau et des fibroses pulmonaires après celle des poumons. Il indique qu'aucune étude in vitro n'a reproduit l'effet observé in vivo et juge "indispensable" le passage par un modèle vivant.
Objectifs
La radiothérapie est une des options thérapeutiques les plus importantes dans le traitement des cancers. Ce type de traitement consiste en l’utilisation de rayonnements ionisants ( photons ou des électrons) pour traiter les tumeurs. La principale limite de ce traitement est l’apparition de toxicités au niveau des tissus sains adjacents. La protonthérapie est une modalité particulière de radiothérapie qui consiste à irradier la tumeur avec un faisceau de protons au lieu de photons. L’avantage considérable de cette technique tient au fait que la plus grande partie de la dose va être déposée au niveau de la tumeur épargnant les tissus sains situés de part et d’autre de la tumeur, diminuant ainsi la toxicité du traitement. Cependant la protonthérapie nécessite des équipements très couteux et complexes à mettre en œuvre d’où son emploi limité au traitement de certaines tumeurs.
Bénéfices attendus
- Cette étude devrait permettre de mettre en évidence que la modification des lipides peut être utilisée comme un marqueur précoce de la préservation des tissus sains dans notre nouvelle technique d’irradiation. Ce type de marqueur précoce (24 heures) permettrait d’accélérer la recherche sur la protonthérapie à très haut débit puisqu’au lieu d’attendre plusieurs mois, les résultats seraient connus en quelques semaines. Cela permettrait de répondre aux questions nécessaires pour le passage vers la clinique plus rapidement telles que la dose optimale, le temps à respecter entre les 2 séances d’irradiation pour que la seconde irradiation conserve ses propriétés, etc.
Procédures
- Pour la procédure d’irradiation du cerveau, la seule intervention prévue sera l’irradiation en elle-même réalisée sous anesthésie générale (15 à 20 minutes par animal). Les animaux réaliseront également quelques tests comportementaux basiques (Open-Field et reconnaissance d’objet) qui n’entrainent aucun effet délétère pour l’animal. A différents temps, les animaux seront anesthésiés profondément et mis à mort pour fixation de leurs organes (sans réveil) - Pour la procédure d’irradiation des poumons, la première intervention prévue sera l’irradiation en elle-même réalisée sous anesthésie générale 15 à 20 minutes par animal. Les animaux seront imagés à 4 reprises : scanners thoraciques avant l’irradiation, deux mois post-irradiation, 4 mois post-irradiation et 6 mois post-irradiation. Ces scanner seront réalisés sous anesthésie générale 15 à 20 minutes par animal. A différents temps, les animaux seront anesthésiés profondément et mis à mort pour fixation de leurs organes (sans réveil)
Impact sur les animaux
Bien que l’irradiation et l’imagerie scanner en elles-mêmes ne soient pas douloureuses ni invasives, les souris seront anesthésiées tout au long des procédures pour éviter tout mouvement. Les nuisances seront issues des effets des irradiations : - Les effets indésirables attendus après irradiation du cerveau sont l’apparition de troubles neurocognitifs. - Les effets indésirables attendus après irradiation des poumons sont l’apparition d’inflammations, de lésions et finalement de fibroses pulmonaires.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés 24 heures, 3 mois ou 6 mois après irradiation selon les procédures pour prélèvements et analyses.
Remplacement
Les effets protecteurs des tissus sains après irradiation en électrons à très haut débit ont été décrits uniquement in vivo sur le poumon et le cerveau de souris. Pour reproduire et analyser ces effets après irradiation en protons, il nous faut donc reproduire les mêmes conditions expérimentales in vivo cette fois avec des protons. En ce qui concerne la possibilité de recourir aux tests in vitro pour l’étude de la modalité d’irradiation, aucune étude in vitro étudiant par exemple les dommages à l’ADN sur cellules en culture, n’a montré de différence alors que de nombreux modèles in vivo ont démontré l’existence de l’effet étudié sur des animaux. Il est donc indispensable de passer sur un modèle vivant intégré et autonome.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide de tests statistiques On réalisera un suivi de la fibrose pulmonaire par imagerie non invasive pour éviter l’euthanasie de souris supplémentaires.
Raffinement
l’irradiation et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse à l’isoflurane. Ce sont des procédures indolores et non invasives mais les souris devront rester immobiles dans leur système de contention tout le long de la procédure. - les animaux seront surveillés 5 jours/7 pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal être. Les souris seront pesées 2x/semaine et euthanasiées si on constate une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids initial. Nous savons par expérience que les doses de 10 Gy sur le cerveau ou 13,5 Gy sur le thorax sont très bien tolérées chez la souris, notamment au niveau cutané et ne nécessitent pas de soins spécifiques. Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une grille de score va nous permettre d’évaluer de façon objective l’état de l’animal et de prendre les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance en cas de besoin. Dès l’irradiation, l’alimentation usuelle des animaux sera complétée par des aliments gélifiés et des petits granules disposés directement dans le fond de leur cage. L’accès à la nourriture sera ainsi plus aisé.
Choix des espèces
La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en cancérologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Nous travaillerons sur des souris âgées de 8 semaines, soit de jeunes adultes, car un dispositif élaboré de contention des animaux avec masques créés par imprimante 3D a été réalisé pour des animaux de 8 semaines
Implication du récepteur TRPV1 dans l’inflammation cutanée liée au psoriasis chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1600 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par les établissements partenaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après tonte et dépilation sous anesthésie, un produit est appliqué sur leur dos jusqu'à vingt-quatre fois pour induire un psoriasis, avec des injections sous-cutanées et des pesées répétées. Le porteur attend une perte de poids pouvant atteindre 20 %, un érythème, une desquamation et un épaississement de la peau, et précise que l'élevage préalable conduit aussi à tuer les animaux non sélectionnés. Il affirme ne pas pouvoir se passer de l'expérimentation animale pour cette maladie multifactorielle.
Objectifs
Le psoriasis est une maladie pro-inflammatoire chronique et multifactorielle de la peau (démangeaisons, plaques inflammatoires, …), touchant 2 à 4% de la population française, principalement bénigne et actuellement sans traitement curatif définitif. Dans 20% des cas, des formes sévères sont relevées montrant l’augmentation des risques cardiovasculaires et métaboliques chez ces patients. Le récepteur TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloide 1) est un acteur majeur dans la perception et l’intégration des sensations douloureuses (nociception), et est impliqué dans l’inflammation des couches superficielles de la peau (épiderme externe et derme plus profond), dans de nombreuses maladies, mais son rôle précis au niveau vasculaire local et/ou dans les échanges entre les différents types cellulaires, n’est pas clairement démontré à ce jour. Aujourd’hui, parallèlement à des études pharmacologiques en biologie cellulaire (in vitro sur cultures cellulaires) ou par des analyses biochimiques et de biologie moléculaire sur organes isolés (ex vivo, explants de peau ou prélèvements tissulaires de patient), notre objectif est de caractériser in vivo l’implication du récepteur TRPV1 dans un modèle induit de psoriasis chez des souris génétiquement modifiées. Ce projet inclus 2 procédures expérimentales. La procédure 1, de sévérité legère, est une procédure d'élevage permettant de générer 3 nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées « Knock-Out tissu-spécifique », où l’expression du gène TRPV1, soit le complexe protéique constitutif du récepteur TRPV1 exprimé à la membrane cellulaire, est spécifiquement invalidée dans l’un des 3 compartiments cellulaires suivants : vasculaire (microcirculation vasculaire locale), épidermique (relations entre les cellules constitutives de l’épiderme) ou nerveux (relations entre cellules sensitives), et de sélectionner au maximum de 1600 animaux d’intérêt. Ces animaux seront tous inclus dans la procédure 2, de sévérité modérée, permettant d’induire un modèle psoriasique selon 3 modalités : très court terme / précoce – 3 jours, court terme / aigüe – 6 jours et long terme / chronique – 9 semaines. Au terme de l’induction du modèle pathologique, des analyses fonctionnelles et biochimiques permettront de caractériser finement l’implication du récepteur TRPV1 au niveau des 3 compartiments précédents, de proposer une nouvelle approche de développement de traitements du psoriasis et/ou des pathologies dermatologiques similaires.
Bénéfices attendus
Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif définitif, seuls des traitements symptomatiques aux résultats transitoires sont proposés aux patients étant atteint d’un psoriasis. L'idée novatrice de ce projet est d'étudier l'implication fine du récepteur TRPV1 et de le placer au centre de la dérégulation de l'équilibre homéostatique (constantes fonctionnelles régulées et maintenues à des valeurs bénéfiques pour l’organisme), incluant l'ensemble des acteurs, et d'identifier si possible le site d'inflammation privilégié (épithélial, neuronale, vasculaire) permettant d'envisager une possible nouvelle voie de développement d’un traitement diminuant le nombre et l’intensité des poussées.
Procédures
Les souris issues des 3 nouvelles lignées KO tissu-spécifique TRPV1, soit au maximum 1600 animaux, obtenues par la procédure 1 – élevage et obtention des 3 lignées de souris LoxP-Cre Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, seront incluses dans la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris et seront donc soumises à 3 types d’interventions : I – en amont du protocole d’induction (procédure 2), chaque souris sera tondue et dépilée (crème VEET « peaux sensibles »), sous anesthésie gazeuse ; intervention réalisée 1 fois et d’une durée maximale de 5 minutes, II – durant le protocole d’induction (procédure 2), chaque souris vigile recevra une application externe / topique de Vaseline® (condition contrôle) ou d’Aldara™ 5% (condition induite), sur la zone dépilée ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce – 3 jours », 5 fois pour la modalité « aigüe – 6 jours » et 24 fois pour la modalité « chronique – 9 semaines » et d’une durée de moins de 5 minutes, III – Durant la procédure 2, chaque souris vigile recevra une injection sous-cutanée préventive de NaCl 0,9% (300µL), après contention manuelle, pour limiter déshydratation générale liée à la procédure d’induction ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce », 3 fois pour la modalité « aigüe » et 6 fois pour la modalité « chronique », d’une durée d’environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont : I – du stress lors des pesées régulières (entre 2 et 7 fois par semaine, durée inférieure à 30 secondes) diminuant avec l’habituation, II – du stress lors des anesthésies gazeuses générales de préparation (tonte, dépilation) des animaux en amont de l’induction du modèle, de faible intensité (maximum 5 minutes), III – du stress et de l’inconfort lors des manipulations des animaux vigiles pour induire le modèle (application dorsale de crème, injection sous-cutanée préventive, observations comportementales, …), de faible intensité, et se réduisant avec l’habituation à la répétition journalière des opérations (5 minutes par animal et par jour), IV – une perte de poids corporel transitoire, attendue durant les premières 48 heures après début du traitement d’induction et pouvant atteindre 20% maximum, due à une déshydratation générale, soit d’une intensité modérée (maximum durant une semaine), V – L’apparition des « symptômes » induits, caractéristiques du psoriasis (rougeur / érythème, desquamation, épaississement cutané), d’intensité faible à modérée (durée totale de l’expérimentation) et VI - du stress lors de la réalisation des transferts des animaux vers nos partenaires (préparation, conditionnement, nouvel environnement transitoire, vibrations lors du transport, …), de faible intensité, sur 24-48h.
Devenir
Ce projet comporte 2 procédures expérimentales. Lors de la procédure 1 – Elevage et obtention des 3 nouvelles lignées de souris Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, l’apparition éventuelle d’un phénotype dommageable mettrait fin au projet et l’ensemble des animaux seraient mis à mort. Les animaux présentant les génotypes d’intérêt, ainsi que les géniteurs d’intérêt pour la cryoconservation de leurs gamètes, seront gardés en vie. Les animaux non-sélectionnés seront mis à mort. Les animaux sélectionnés en procédure 1, intègreront la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris, où ils seront transférés immédiatement vers nos partenaires (modalité « précoce – 3 jours » et « aigüe – 6 jours ») ou intègreront la modalité « chronique – 9 semaines », où ils débuteront le protocole d’induction du psoriasis, avant d’être transférés, à leur tour, vers nos partenaires, qui se chargeront de finaliser l’induction et de réaliser les expérimentations finales, puis mettrons à mort l’ensemble des animaux. Ils seront donc tous conservés en vie dans notre établissement.
Remplacement
Le psoriasis est une maladie multifactorielle, dont la physio-pathologie implique différents intervenants et composantes au sein de la peau (vasculaires, nerveux, barrière cellulaire, …), ne pouvant être reproduits et étudiés uniquement par le développement de modèles cellulaires et/ou l’utilisation de méthodes alternatives. Nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale et de la mise en place de protocoles in vivo pour prendre en compte l’ensemble de ces aspects.
Réduction
L’ensemble du projet a été conçu afin de réduire au maximum le nombre d’animaux sans compromettre l’interprétation statistique des résultats. De par la variabilité interindividuelle dans les tests fonctionnels finaux, nous devons inclure 20 animaux par double analyse fonctionnelle pour obtenir des résultats robustes. Si les variations des résultats expérimentaux sont « significatives », nous envisagerons de réduire le nombre d’animaux par groupe et ainsi diminuer le nombre global d’animaux nécessaire. De plus, nous limiterons le nombre de groupes « contrôle » dans les 3 modalités d’induction du modèle (précoce - 3 jours, aigüe - 6 jours, chronique - 9 semaines), en utilisant les animaux contrôles de la modalité d’induction « aigüe - 6 jours » pour la réalisation des analyses de la modalité « précoce - 3 jours ».
Raffinement
Les responsables du projet s’assureront du bien-être de l’ensemble des animaux au quotidien, par la réalisation d’observations comportementales et d’évaluations du poids corporel, au minimum 2 par semaine. Si nécessaire et en suivant une échelle de cotation adaptée, les responsables prendront en charge la gestion de la douleur ou du mal-être par une analgésie adaptée, et si un point limite est atteint, pratiqueront la mise à mort immédiate de l’animal concerné.
Choix des espèces
L’utilisation de souris comme modèle d’étude in vivo est courant en immuno-dermatologie. Son système immunitaire, humoral et cellulaire est largement décrit depuis de nombreuses années et font référence, ce qui nous permettra d’expérimenter sans avoir recourt à des espèces de mammifères plus proches de l’homme. Dans notre contexte, il nous semble d’autant plus pertinent d’induire un psoriasis sur cette espèce, car, commercialement, nous pouvons obtenir des animaux génétiquement modifiés d’intérêt (mutant KO total TRPV1, souris LoxP-TRPV1, souris Cre-tissu spécifique), et créer des souris Cre-LoxP KO spécifique TRPV1 par les méthodologies d’inactivation Cre-LoxP développées dans les années 2000. Le modèle inductible d’inflammation cutanée / psoriasis est documenté depuis plus de 10 ans, utilisé par de nombreuses équipes mondialement et nos partenaires sont rompus à son utilisation. Les 3 nouvelles lignées produites permettront de caractériser l’implication du récepteur TRPV1 au sein de 3 compartiments cellulaires impliqués dans le psoriasis induit chez la souris. Le psoriasis touche l’ensemble de la population, du jeune à l’adulte, avec un pic d’apparition de la maladie chez l’homme se situant entre 20 et 30 ans. Notre étude souhaite évaluer les phases précoces d’apparition du psoriasis, puis l’installation de la pathologie à court terme (phase aigüe) et l’évolution à long terme (phase chronique) dans un modèle induit de dermatite psoriasiforme chez la souris. Nous utiliserons donc des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et dont le poids variera entre 20 et 30g au moment de débuter le protocole d’induction du modèle.
Circulation sanguine- Thrombose artérielle et veineuse
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
1200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue sans réveil, dans des procédures classées de gravité légère mais menées sous anesthésie terminale. Selon le test, l'extrémité de la queue est sectionnée, une sonde est posée sur la carotide ou un dispositif induit une thrombose sur la veine cave, pour évaluer l'effet de substances sur la coagulation dans le développement de médicaments. Le porteur n'attend pas d'effets toxiques majeurs, les composés ayant déjà été caractérisés à ce stade. Il indique que les tests in vitro ou informatiques ne peuvent "entièrement suppléer" le modèle animal, faute d'un environnement biologique intact.
Objectifs
En dépit des efforts menés pour prévenir et traiter la thrombose, la thrombose artérielle notamment reste une cause majeure de mortalité dans la population adulte des pays développés puisqu’aucune des thérapies proposées à ce jour ne donne entière satisfaction en termes d’efficacité et/ou de sécurité. En effet, les substances utilisées actuellement présentent d’importantes restrictions thérapeutiques en raison de leurs effets secondaires tels que le saignement prolongé en lien avec une altération de la coagulation sanguine. Par ailleurs, si certains cancers, comme la leucémie, peuvent causer une thrombocytopénie qui se caractérise une baisse du nombre de plaquettes (essentielles à une bonne coagulation sanguine), les traitements de certains cancers peuvent aussi d’affecter la moelle osseuse et de mener à une baisse du nombre de plaquettes (agents chimio-thérapeutiques, médicaments biologiques, radiothérapie). Les hémorragies ainsi causées, cérébrales notamment, constituent un problème médical majeur qui justifie la poursuite des recherches vers des thérapies anti-thrombotiques et anti-cancéreux efficaces et plus sûres. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets des substances sur la circulation sanguine, et en particulier sur la coagulation du sang, dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles permettent d'écarter les molécules qui auraient des effets néfastes sur la santé humaine (troubles de la coagulation, saignement, thromboses), ou de garder des molécules qui pourraient faire preuve d'efficacité soit dans le cas de pathologies en lien avec la coagulation sanguine (thrombose artérielle ou veineuse) soit dans le cadre des traitements des cancers.
Bénéfices attendus
Les modèles décrits dans ce projet sont nécessaires à la découverte et à la mise sur le marché de nouveaux médicaments efficaces pour traiter les problèmes de coagulation sanguine, de manière sûre, ou pallier à certains effets secondaires d'autres médicaments sur la circulation sanguine. Ces modèles permettent d'écarter les molécules qui auraient des effets néfastes sur la santé humaine (troubles de la coagulation, saignement, thromboses), ou de garder des molécules qui pourraient faire preuve d'efficacité soit dans le cas de dans le cas de pathologies en lien avec la coagulation sanguine (thrombose artérielle ou veineuse) soit dans le cadre des traitements des cancers.
Procédures
Dans les modèles de ce projet, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure. Pour le test d’évaluation du temps de saignement (durée maximum de 30 minutes), les animaux sont anesthésiés et l’extrémité de la queue (2 mm) est coupée avant d’être plongée dans du sérum physiologique à température ambiante. Pour le test d’évaluation de la thrombose artérielle, les animaux sont anesthésiés puis une sonde de débit sanguin est positionnée autour d’une artère carotide pour la mesure en continue du débit sanguin. Un patch (dispositif induisant localement une thrombose) est positionné sur la carotide. Pour le test d’évaluation de la thrombose veineuse, les animaux sont anesthésiés puis un patch (dispositif induisant localement une thrombose) est positionné sur la veine cave au niveau abdominal. Pour le test d’évaluation de la thrombose dans le modèle du shunt artérioveineux, les animaux sont anesthésiés puis un cathéter est introduit d’un côté dans une artère carotide et de l’autre dans une veine jugulaire (de façon à établir une circulation extra-corporelle. Tous ces tests (sous anesthésie) n'excèdent généralement pas 2 heures et les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans réveil préalable). Pour les besoins de l'étude, peuvent être réalisés en fin de test (animal anesthésié), selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes. Les administrations par bolus rapide (par voie orale, intraveineuse, sous6cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) ou par perfusion lente (intraveineuse) sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure d’administration par bolus est de quelques secondes. Celle d’une administration par perfusion intraveineuse peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité de la substance testée.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux substances évaluées dans ces tests.
Devenir
Mises à part les administrations substances évaluées qui peuvent être effectuées avant le test lui-même, les procédures, qui sont toutes réalisées chez l'animal anesthésié, ne permettent pas un retour à l'état conscient (perte importante de volémie sanguine ou chirurgie).
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement par rapport à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison). Les tests statistiques paramétriques (e.g. : Student, Kuruskal, ANOVA...) utilisés seront définis en fonction du design expérimental de chaque étude (nombre de groupes testés). Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer des données sur la cinétique d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de stopper précocement la douleur, la souffrance ou l'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et fréquemment manipulés par des techniciens formés et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. A l'exception des traitements lorsqu'ils sont effectués sur animal éveillé, les animaux sont anesthésiés et analgésiés tout au long de la procédure. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur la coagulation sanguine chez le rat est prédictif de leur efficacité en clinique. Les procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisées de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mises en oeuvre à grande échelle au sein des laboratoires de pharmacologie. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques.
Etablissement et maintien d’une banque de xénogreffes de tumeurs humaines sur souris immunodéficientes.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
15105 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère. Elles servent à greffer et faire proliférer des fragments de tumeurs humaines, avec des greffes orthotopiques, des ovariectomies ou castrations et des injections intracardiaques, pour entretenir une banque de modèles tumoraux sur cinq ans. Le porteur décrit une gêne respiratoire, une occlusion intestinale, une ascite, une exophtalmie et des difficultés à se déplacer selon la localisation des tumeurs, et précise qu'aucun test statistique n'encadre les effectifs. Il présente cette banque comme une source de matériel tumoral pour la recherche pharmacologique et juge le modèle vivant "indispensable".
Objectifs
Les xénogreffes résultent de la greffe chez la souris de fragments tumoraux de patients obtenus suite à un prélèvement chirurgical»). Ces xénogreffes sont actuellement considérés comme le modèle tumoral le plus proche des tumeurs des patients et permettent la réalisation d’études biologiques et pharmacologiques dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ainsi elles constituent un outil essentiel pour étudier la biologie des cancers humains et pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ou encore de nouvelles combinaisons ou posologies de médicaments. Elles permettent également dans certains essais cliniques, une aide à la prescription pour le clinicien quand il a été possible de montrer l’efficacité d’une molécule sur la xénogreffe issue de la tumeur du patient. Ce caractère prédictif dépend toutefois de la possibilité de sélectionner les xénogreffes appropriées et donc d’avoir pu constituer des ensembles représentatifs de la diversité des tumeurs de patients. Cela nécessite le développement d’un grand nombre de modèles tumoraux différents pour une même pathologie. De même, certaines études biologiques nécessitent d’une quantité importante de matériel tumoral, à l’état frais, et ne seraient pas réalisables sans le passage en xénogreffe. Une banque de PDX maintenue sur souris constitue donc une source importante de matériel tumoral à l’état frais, sans les limitations des prélèvements issus des patients. Notre laboratoire a déjà développé un nombre important de modèles de différents types tumoraux (sein, poumon, côlon, mélanome, rétinoblastome, ovaire, lymphomes,…), notre objectif est donc de : - Maintenir les modèles pertinents existants comme source de matériel tumoral nécessaire pour les études biologiques et pharmacologiques - Obtenir de nouveaux modèles (tumeurs ou sous-types tumoraux) pour lesquels il existe un besoin et un rationnel scientifique ou clinique - Développer des modèles de métastases - Développer des modèles résistants pour comprendre les phénomènes de résistance aux traitements et les moyens de les contourner
Bénéfices attendus
Les xénogreffes issues des tumeurs patientes constituent un modèle préclinique cliniquement pertinent, dont les applications sont nombreuses, en recherche fondamentale et translationnelle. En recherche fondamentale, elles permettent d’étudier la biologie des cancers humains sans les limitations associées aux prélèvements issus des patients (matériel en quantité insuffisante, difficultés logistiques ou d’accès aux prélèvements, etc.), car elles constituent une source de matériel tumoral humain illimité, pouvant être conditionnée de façon différente selon les applications (à l’état frais, congelé, fixé, dissocié en single cell, etc.). Pour la recherche pharmacologique, le développement exponentiel de thérapies ciblées et individualisées dans le cancer ces dernières années a rendu nécessaire la mise au point de modèles précliniques représentatifs de la diversité et la complexité de la pathologie cancéreuse observée chez les patients. Les xénogreffes d’origine humaine constituent aujourd’hui l’outil d’analyse pharmacologique le plus proche de la clinique. Ces nouveaux modèles permettent de sélectionner les meilleurs composés anti-tumoraux : optimisation des modalités thérapeutiques, prédiction des effets du médicament, évaluation de l’effet sur la croissance locale et la dissémination métastatique, identification de marqueurs de réponse ou de résistance au traitement Par ailleurs, l'évaluation préclinique est une étape importante et obligatoire dans le développement d'un médicament avant son utilisation clinique. Ces expériences pharmacologiques sont possibles grâce au maintien des tumeurs sur souris, comme source de matériel tumoral.
Procédures
La greffe de matériel tumoral sera faite dans la majorité des cas en sous cutané. Des souris supplémentaires sont greffées au niveau de leur site d’origine ou bien autre site qui par l’absence de système immunitaire permet d’améliorer la prise tumorale Ces greffes seront réalisées1 fois / animal et sous anesthésie ; durée d’anesthésie chimique
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des procédures chirurgicales seront celles liées à l’incision de la peau ou du péritoine. L’utilisation d’anesthésique et d’analgésique permet de prendre en charge ces douleurs. Lors des anesthésies, une baisse de température corporelle est observée chez la souris ; pour éviter la baisse de température, les animaux sont placés sous lampe chauffante et tapis chauffant. Les injections de cellules ou l’administration de molécules par voie orale ou par injection ne provoquent pas de douleurs chez les animaux au-delà de l’injection elle-même Par ailleurs, la croissance des tumeurs surtout quand elles sont greffées au niveau de leur site d’origine pourraient provoquer une perte de poids et aussi une gêne pour se déplacer juste après la greffe. L’alimentation gélifiée ajouté dans la cage et la réhydratation aident à diminuer l’inconfort des animaux. Les gênes causées par le développement des tumeurs orthotopiques ou bien apparition des métastases peuvent être : - gêne respiratoire par le développement des tumeurs au niveau des poumons - Diarrhée, perte de poids plus de 72h ou occlusion intestinale pour les tumeurs de colon, - apparition d’ascite pour les tumeurs de l’ovaire - difficulté à se déplacer pour les greffes au niveau de l’os et au niveau de la glande mammaire - exophtalmie pour les tumeurs de l’œil - Difficultés de déplacement ou boitillement avec ou sans déformation du genou pour les tumeurs intra-osseuses
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures pour des prélèvements post-mortem
Remplacement
l'utilisation des animaux se justifie par le fait que la tumeur interagit avec son environnement pour se développer qu'elle soit placée en sous- cutanée ou dans une localisation proche de son site originel (vascularisation, stroma…). Un modèle vivant intégré est donc indispensable pour étudier les interactions entre la tumeur et ses organes cibles mais également avec l’organisme dans sa totalité. Ces modèles vont nous permettre d'étudier le développement de la maladie en essayant de mimer et comprendre leur mécanisme oncogénique dans des modèles orthotopiques. Par ailleurs, nous pourrons également explorer et valider l'efficacité de nouvelles thérapies dans des modèles sous-cutanés rares voire inexistants pour certains types de cancers ou des modèles orthotopiques particuliers, le plus proche de clinique. Il n'e'xiste donc pas de méthode alternative capable de répondre à la question scientifique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à son strict minimum, notamment grâce au calcul du taux de prise du modèle établi qui permet de ne greffer que le nombre d’animaux nécessaires au maintien de la xénogreffe. Par ailleurs, nous recherchons continuellement à améliorer nos techniques de congélation/décongélation des tumeurs pour éviter de garder des animaux greffés en continue pour le maintien de modèles non utilisés. A noter que pour l’apprentissage des nouveaux gestes expérimentaux, le personnel sera formé d’abord sur les animaux euthanasiés et une fois le geste maîtrisé, leur formation est complétée sur les souris en vie. Pour cette étape, afin de réduire le nombre d’animaux et après l’avis favorable du vétérinaire, nous utiliserons les animaux greffés par ailleurs et dont les tumeurs n’ont pas poussé. Aucun test statistique n’a été mis en œuvre
Raffinement
Les différentes procédures seront mises en œuvre de façon à engendrer le minimum de contraintes et de douleur aux animaux : utilisation d’anesthésique et d’analgésiques systématique lors des chirurgies, addition d’alimentation hydraté en post-opératoire, hydratation supplémentaire de l’animal si perte de poids ou difficulté à se déplacer après chirurgie ; Les animaux seront surveillés le jour de la chirurgie pour les greffes en SC et interscapulaires (90% des greffes) et pendant 24h pour les ovariectomies, les castrations, les greffes autres que les SC et interscapulaires. sous-capsule rénales et l’ injection des cellules en intracardiaque. Par la suite, les animaux sont surveillés 1 fois par semaine par le personnel dédié. Par ailleurs, sauf exception, les greffes sont programmées et réalisées au plus tard le jeudi matin. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite.
Choix des espèces
Choix de l’espèce « Souris » c’est le modèle in vivo d’un mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique Choix de la lignée murine : nécessité d’un déficit immunitaire pour éviter le rejet de la xénogreffe d’origine humaine par la souris. Différentes souches sont utilisées en fonction des types et sous-types tumoraux pour favoriser la prise et la croissance des modèles de xénogreffes La greffe a lieu entre 5 à 11 semaines pour que les souris aient fini leur croissance mais suffisamment tôt pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux car l’immunodéficience peut diminuer avec l’âge. Les animaux à cet âge supportent également mieux l’anesthésie, la chirurgie et les traitements.
Modèle d’ischémie reperfusion chez le rongeur (2022-B-021)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Rats : 1440
490 souris et 1440 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Le thorax est ouvert et l'irrigation du coeur interrompue pendant quinze minutes à une heure, suivie d'une reperfusion pouvant durer jusqu'à quatre heures, pour reproduire un infarctus et tester des molécules en développement. Le porteur décrit une douleur et un stress liés à la chirurgie, une perte de poids et une mise à jeun pouvant atteindre seize heures. Il conclut que la mesure des paramètres cardiaques ne peut être réalisée que sur des animaux vivants et juge "indispensable" l'analyse histologique qui impose leur mise à mort.
Objectifs
Selon l’organisation mondiale de la santé, la première cause de mortalité dans le monde est l’infarctus du myocarde. Ce projet a pour but de développer deux types de modèles afin de tester et démontrer l’efficacité de molécules en développement. Le premier modèle (infarctus aigu) permet de recueillir de nombreux paramètres cardiaques qui servent à tester de nombreuses molécules en développement. Le second modèle (infarctus du myocarde chronique) est utilisé pour tester l’efficacité d’une molécule en développement sur différents paramètres cardiaques afin de voir si cette dernière améliore la survie et restaure les fonctions cardiaques chez les personnes ayant subi un infarctus du myocarde..
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester l’efficacité de molécules en développement afin de trouver un candidat médicament susceptible de traiter les pathologies liées à l’infarctus et ainsi d’améliorer la prise en charge / le pronostic de ces patients.
Procédures
Au cours de sa vie, un animal ne pourra être impliqué que dans une procédure de cette demande de projet. Pour tous les animaux l’identification (quelle que soit l’identification) dure 30 secondes. Pour les procédures comportant l’anesthésie chimique, le temps d’injection de l’anesthésique est estimé à 30 secondes. Les temps d’intervention sur l’animal estimés pour chaque procédure sont les suivants : - Mise en place de la sonde dans le coeur en passant par la carotide (20 min), mise en place de l’électrocardiogramme (20 min), ouverture du thorax de l’animal (20 min) + interruption de l'irrigation localisée d'une partie du coeur (ischémie) pouvant aller de 15min à 1h00 + reperfusion cardiaque pouvant aller de 30 min à 4h00 soit un total de 6h00. - Mise en place d’un cathéter en veine jugulaire (15min), mise en place d’un cathéter en fémorale ou carotide (15min), ou mise en place de la sonde dans le coeur en passant par la carotide (20 min), mise en place de l’électrocardiogramme (20 min), ouverture du thorax de l’animal (20 min) + ischémie cardiaque pouvant aller de 15min à 1h00 + reperfusion cardiaque pouvant aller de 30 min à 4h00 soit un total de 6h15. - Ouverture du thorax + réalisation de l’ischémie cardiaque + fermeture du thorax (30 min) pour la première étape puis pour la seconde étape mise en place d’un cathéter en fémorale ou carotide (15min) ou mise en place d’une sonde dans le coeur en passant par la carotide (20min), mise en place d’un électrocardiogramme (20min) soit au total un maximum de 40 min. Les différents types d'administration prendront moins d'une minute par animal.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures de ce projet incluant des gestes chirurgicaux, un certain niveau de douleur et de stress sont attendus nécessitant une anesthésie et analgésie pré et post-opératoires appropriées. Une perte de poids et une réduction de l’activité peuvent être observées dans les 72h suivant les interventions Dans le cadre de ce projet, les signes cliniques de la pathologie (exemple : essoufflement de l’animal, prostration, yeux mi-clos, …) sont attendus et feront l’objet d’un suivi spécifique. Une mise à jeun (durée maximum de 16h00) pourra également être mise en place. Les animaux auront alors toujours accès à l'eau. Cette mise à jeun pourra avoir un impact sur l’induction de la pathologie en maximisant la zone touchée par l'ischémie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des trois procédures car il est indispensable de réaliser des analyses histologiques pour quantifier la taille de l’ischémie.
Remplacement
Des modèles animaux artificiels (exemple : rats ou souris mannequins, peau synthétique) existent afin de permettre à l’expérimentateur en formation d’acquérir certains gestes de base tels que la pose de points de suture ou des injections et prélèvements simples. Cependant, la chirurgie présentée dans ce projet ainsi que la mesure des paramètres physiologiques dans ce type de modèle ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants.
Réduction
Une mise au point du modèle préalable aux études permettra une réduction du nombre d’animaux impliqué dans les études. C’est pour cette raison qu’une procédure dédiée à la mise au point des modèles d’ischémie, a été incluse dans ce projet. Pour la mise au point du modèle, nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux surnuméraires ou issus d’un précédent projet, (après avis favorable de la structure du bien être animal et du vétérinaire désigné) ce qui rentre dans le cadre d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. L'ensemble de ces conditions s'inscrivent dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux. Les modèles d'infarctus du myocarde aigu et chronique seront réalisés sur un nombre limité d’animaux mais suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents en fonction de l’effet attendu de la molécule testée.
Raffinement
L’expérimentateur s’assurera que toute manipulation sera conforme à la réglementation en vigueur et entrainera un minimum de stress ou de douleur chez l’animal. Préalablement à toute expérimentation, des points limites (exemples : yeux mi-clos, prostration, poils hérissés, essoufflement, etc …) sont définis en accord avec la littérature scientifique et la réglementation en vigueur. La mise en place des points limites permettra un meilleur suivi des animaux lors de la réalisation des différentes procédures de ce projet mais également de maintenir leur bien-être tout au long de l’expérimentation ainsi que la mise en place d’une prise en charge précoce et adaptée de l’animal si cela est nécessaire. Dans le cas où le bien-être de l’animal serait dégradé après 48h de traitement, une euthanasie sera réalisée immédiatement sur décision du directeur d’étude et /ou du vétérinaire désigné. Avant tout acte de chirurgie, l’anesthésie ainsi que l’analgésie nécessaires au suivi pré et post opératoire de l’animal devront être validées par le vétérinaire désigné. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur couverture chauffante avec rétrocontrôle de la température afin que les animaux soient maintenus à 37°C. L’ajout de système de réchauffement complémentaires pourra être utilisés en cas de baisse de température de l’animal (exemple : bouillotes, etc..). Le réveil des animaux s’effectuera dans un environnement permettant le maintien de la température corporelle (ex: lampe chauffante, enceinte thermorégulée, etc…). Les animaux inclus dans le modèle chronique seront hébergés individuellement après chaque chirurgie jusqu’à la fin du suivi post opératoire (7 à 10 jours) et/ou après cicatrisation totale de l’animal. Afin de limiter le stress dû à l’hébergement en cage individuelle et de maximiser le bien-être de l’animal, de l’enrichissement spécifique à chaque espèce sera utilisée (exemple : igloo, bûchette, coton, etc…). De plus, quelques soit la procédure, les animaux pourront être hébergés individuellement 24h avant le début de la chirurgie afin de minimiser l’impact du stress dû à l’hébergement individuel en post-chirurgie et standardiser l’impact de l’individualisation des animaux.
Choix des espèces
D'un point de vue scientifique, nous disposons d'un grand nombre d'articles et de données validées sur le rat et la souris dans ce type de modèle de maladie. C'est pour cette raison que nous souhaitons inclure ces deux espèces dans notre projet. Ce type de modèle de maladie est réalisé chez des animaux adultes car il s’agit de reproduire des maladies de l’Homme adulte.
Evaluation de l’innocuité et de l’effet protecteur d’un vaccin à base de vésicules de membranes externes d’Entérobactéries dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une primo-vaccination et deux rappels de nanoparticules bactériennes par des voies variées, puis une infection par gavage avec un pathogène, avec des prélèvements de sang à la lancette et de fèces jusqu'à l'euthanasie par dislocation cervicale. Le porteur indique que les endotoxines des nanoparticules peuvent provoquer un choc septique et que l'infection entraîne perte de poids et diarrhée pendant deux à trois semaines. Il revendique un recours "irremplaçable" à l'animal, le vaccin étant destiné aux animaux réservoirs pour limiter des E. coli zoonotiques.
Objectifs
Escherichia coli est une bactérie qui colonise le tube digestif de l’Homme et des animaux à sang chaud dès la naissance. Certains sous-groupes d’E. coli sont pathogènes et ont pour réservoir principal les animaux. Ces E. coli pathogènes causent des maladies zoonotiques. Une des manières de prévenir ces maladies humaines est de limiter la colonisation des E. coli pathogènes présents au niveau du réservoir animal. La vaccination est l'un des moyens mis en œuvre pour limiter cette colonisation. Notre projet a pour objectif de tester un nouveau type de vaccin à base de nanoparticules bactériennes. Les nanoparticules sont reconnues par les cellules immunitaires, induisent une réponse immunitaire et ont des propriétés auto-adjuvantes, les rendant attractives pour une application vaccinale. De plus, les nanoparticules sont spontanément produites par les bactéries, leur coût de production est donc très compétitif. Enfin, elles peuvent présenter des antigènes dans leur conformation native. Notre objectif est de développer un vaccin dérivé de nanoparticules exprimant des antigènes spécifiques des E. coli pathogènes d’intérêt. Nous souhaitons obtenir la preuve de concept de l’innocuité et de l’efficacité de notre vaccin chez un modèle murin. Nous voulons confirmer que notre vaccin permet d’induire une réponse immunitaire suffisante pour diminuer le portage d’un pathogène spécifique de la souris. Les objectifs de notre projet seront d’évaluer (i) l’innocuité, (ii) la réponse immunitaire induite et (iii) la protection conférée contre une infection à une bactérie pathogène spécifique suite à l’administration de notre vaccin chez la souris.
Bénéfices attendus
Le but final de ce projet est d’utiliser les nanoparticules comme vaccin chez l’animal réservoir afin de diminuer le portage des E. coli pathogènes. Les tests effectués sur les souris nous servirons de preuve de concept. Le but de cette preuve de concept est de s’assurer de l’innocuité de notre vaccin et qu’il confère un effet protecteur aux souris contre le pathogène spécifique. Si cela est le cas, ces tests nous permettront alors de déterminer la dose/poids optimale et la meilleure voie d’administration du vaccin permettant de développer une réponse immunitaire adaptée et spécifique contre notre antigène d’intérêt. Toutes ces informations sont cruciales pour tester par la suite notre vaccin chez le réservoir animal. A plus long terme, notre stratégie vaccinale que nous testons ici sera développée avec d’autres antigènes présentés afin de cibler d’autres bactéries pathogènes, des virus, etc.
Procédures
Les souris recevront une primo-vaccination et deux rappels avec des doses différentes de nanoparticules (pour chaque lot 1, 2 et 3) ou avec une solution physiologique témoin (pour le lot 4 contrôle). Trois voies d’administration des nanoparticules ou de la solution physiologique témoin seront testées parmi les suivantes : la voie intra-péritonéale ou le gavage oral ou la voie intra-nasale ou la voie intra-musculaire ou la voie sous-cutanée. Il y aura deux semaines d’intervalle entre chaque vaccination (J0, J14 et J28). Deux semaines après la dernière vaccination (J42), les lots 1, 2 et 3 resteront inchangés. Le lot 4 sera divisé en deux afin de constituer un lot non vacciné et infecté (lot 4) et un lot non vacciné et non infecté (lot 5). Toutes les souris des lots 1, 2 et 3 et du lot 4 seront infectées une seule fois par gavage oral avec la solution physiologique témoin contenant le pathogène spécifique à l’aide d’une sonde de gavage. Différentes concentrations du pathogène spécifique seront testées afin d’étudier l’efficacité de note vaccin contre une faible et une forte concentration du pathogène. La solution physiologique témoin sera administrée une seule fois par gavage oral avec une sonde de gavage au lot 5 constituant le lot non vacciné et non infecté. Deux semaines après l’infection (J56), tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Pour chaque lot de souris, un prélèvement de sang à la veine mandibulaire sera effectué à différents stades de l’expérimentation : le jour précédant la première vaccination (J-1), puis 1 fois/semaine à partir de la première vaccination. 100µL de sang seront prélevés sur chaque animal avec une lancette. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie gazeuse avec de l’isoflurane à 2L d’air/minute. Après infection avec le pathogène spécifique (J42), des prélèvements de fèces seront réalisés 3 fois/semaine le matin jusqu’au jour de l’euthanasie (J56). Les prélèvements seront effectués à l'anus grâce à une contention.
Impact sur les animaux
Bien que les nanoparticules ne se répliquent pas et ne peuvent donc pas générer une infection chez les souris, la présence d’endotoxine à leur surface pourrait avoir des effets indésirables sur les souris et engendrer, dans le pire des cas, un choc septique dans les 48h qui suivent l’administration des nanoparticules. Ces effets indésirables seront évalués par l’observation quotidienne et par des pesées 3 fois/semaine des souris ainsi que par la détermination des signes cliniques (état général des animaux, poids, poil, prostration, comportement, yeux, température du corps). De plus, l’évaluation de l’effet protecteur du vaccin se fera via une infection avec un pathogène spécifique des souris. Chez la lignée de souris choisie, l’infection avec ce pathogène spécifique n'induit pas de pathologie aigüe mais une légère maladie caractérisée par une perte de poids modeste et transitoire ainsi qu'une légère diarrhée due à une inflammation minime au niveau de l’intestin. Les symptômes décrits peuvent durer 2 à 3 semaines. Après, l’élimination du pathogène se fait spontanément. Si aucun effet protecteur n’est obtenu, il conviendra de changer certains paramètres tels que l’administration des nanoparticules ainsi que leur dose, ce qui est déjà envisagé dans les procédures décrites.
Devenir
A la fin de la procédure n°1, tous les animaux seront gardés en vie afin qu'ils soient dirigés vers la procédure n°2, si les signes cliniques observés ne sont pas jugés trop sévères. A l'issue de la procédure n°2, tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale dans le but de faire des prélèvements d’organes et d’observer l’effet du vaccin et de l’infection au pathogène spécifique sur les souris.
Remplacement
Le recours à l’animal est irremplaçable car le vaccin candidat est destiné aux animaux et aucun autre modèle (notamment in vitro) ne permet d’évaluer l’innocuité de notre vaccin sur l’organisme, la réponse immunitaire induite ainsi que son effet protecteur contre une pathologie induite par un pathogène spécifique de la souris.
Réduction
Dans le cadre de la réduction de l'utilisation d'animaux de laboratoire, le nombre d'animaux a été limité au maximum : 3 lots de 5 animaux + 1 lot de 10 animaux contrôle par paramètre. Les paramètres testés seront la dose de nanoparticules, la voie d’administration des nanoparticules et la concentration du pathogène spécifique des souris. Nous testons tous les paramètres indispensables nécessaires au développement d’un vaccin. Les nombre de lots d’animaux sont multipliés par trois car nous effectuerons les expérimentations trois fois afin obtenir un résultat statistiquement interprétable.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées au nombre de 5 par cage, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 2 fois par mois. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement. Tout animal présentant des signes de douleur, souffrance ou angoisse sera euthanasié. Également, lors de l’injection des nanoparticules par voie intra-nasale (procédure n°1) ainsi que lors des prélèvements de sang, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse avec de l’isoflurane à 2L d’air/minute afin d’éviter tout stress. Enfin, aucun analgésique ne sera utilisé puisque qu’aucune chirurgie n’est prévue lors des procédures.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude de l’établissement de la colonisation intestinale. Dans le cadre de notre projet, l’infection intestinale réalisée chez la souris reflète la colonisation intestinale rencontrée chez les animaux réservoir. Les souris seront âgées de 5 à 8 semaines en début de projet. Dans la littérature, les souris soumises à une infection intestinale sont classiquement âgées de 6 à 8 semaines, âge auquel elles sont considérées adultes. Nous prenons une marge d’une semaine pour permettre l’acclimatation.
Caractérisation d’un nouveau gène candidat PLCB1 impliqué dans les myopathies congénitales à spirales cylindriques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris génétiquement modifiées, dépourvues d'une protéine liée à une myopathie humaine, subissent une série de tests moteurs, de la mesure de force à la marche forcée sur cylindre rotatif, avant d'être tuées sous anesthésie pour prélever leurs muscles. Le porteur indique que ce modèle présente une morphologie anormale de plusieurs organes et une faible espérance de vie, la plupart des animaux privés du gène fonctionnel mourant au sevrage vers trois semaines. Il affirme que seule la souris permet de reproduire les défauts musculaires observés chez l'humain, la protéine étant conservée à 97 %.
Objectifs
Après avoir identifié une mutation candidate dans un gène engendrant une protéine impliquée dans la production de lipides chez une famille avec deux enfants atteints de myopathie à spirales cylindriques, nous souhaitons valider l'impact de cette mutation dans la maladie avec un modèle souris afin de valider un nouveau gène de myopathie et le diagnostic de cette famille. Cette mutation est présente sur les 2 copies présentes du gène chez les enfants et correspond à une perte de fonction, c'est-à-dire que nous avons démontré qu'elle entrainait une diminution de la lecture du gène dans les cellules entrainant donc une diminution de la production de protéine. Ce projet vise donc à caractériser un modèle souris ne possédant pas cette protéine dans le but de valider le rôle de la perte de fonction du gène dans la maladie grâce à des études du tonus et de la force musculaires et de la forme, de l'aspect et du fonctionnement moléculaire du muscle chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront tout d'abord de valider l'implication de ce gène dans les myopathies congénitales, et d'identifier une nouvelle cause génétique possible. De plus, ils permettront de mieux comprendre les protéines impliquées dans ces pathologies, dans le muscle sain et dans le développement de la maladie. Valider un nouveau gène dans les myopathies congénitales permet tout d'abord d'avoir de nouveaux diagnostics pour les familles de patients et aussi d'avoir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le développement de traitements de la maladie.
Procédures
Les souris sont marquées afin d'être identifiées et un suivi journalier sera assuré. Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques entre 3 semaines et 8 mois d'âge maximum : - La mesure de la force du corps : les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 3 min maximum et elle sera mesurée 1 fois par mois. - La mesure de la force des pattes : le test sera effectué pendant 30 sec maximum et sera réalisé une fois par mois. - L'évaluation de la capacité de l'animal à se mouvoir : les animaux sont placés dans une enceinte contenant des cages individualisées pour le suivi de l'activité locomotrice pendant 24h. Ce test se fera 1 fois par mois. - La mesure de l'endurance et de la résistance à la fatigue : le test dure 5 jours et les souris marcheront sur un cylindre rotatif pendant 5 à 15 min par jour. Ce test ne sera réalisé qu'une seule fois durant l'étude. - La mesure des propriétés contractiles musculaires in situ : il s'agit d'un test qui ne sera réalisée qu'une seule fois par souris et la durée totale, de l'anethésie jusqu'à la fin des mesures, sera de maximum 1h. Au maximum, 28 tests de phénotypages seront effectués sur les souris vivant jusqu'à 8 mois.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, un seul gène est muté générant chez la souris un phénotype sévère et dommageable entrainant une faible espérance de vie, de 3 semaines d'après la littérature existante. A ce jour, seul le modèle ne portant qu'une seule copie fonctionnelle du gène a été observé , les animaux ne portant pas le gène fonctionnel mourant pour la plupart au moment du sevrage, c'est-à-dire à trois semaines de vie. Les souris observées ont été décrites comme présentant une morphologie anormale des ovaires, un foie plus grand, une rate plus grande, des noeuds lympahtiques plus grands, une morphologie anormale des reins et des yeux. Les animaux ne présentent pas d'infertilité contrairement aux animaux ne portant pas le gène fonctionnel. Les caractéristiques musculaires de ce modèle n'ont encore jamais été évaluées, à notre connaissance. Les différents tests phénotypiques permettant de suivre et mesurer la force, la résistance à l'exercice et la capacité à se mouvoir de la souris pourront induire du stress pendant une durée pouvant aller de 1 min à 15 min maximum et pourront induire de la fatigue à la fin des tests.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour tous les tests jusqu'au test de la mesure des propriétés contractiles des muscles. A l'issu de ce test qui est réalisé sous anesthésie, les animaux sont mis à mort sous anesthésie et les organes seront prélevés pour des études moléculaires des muscles. Cela concerne l'ensemble des animaux d'expérience, soit 60. Pour ce qui est des animaux permettant le maintien de la lignée durant l'étude, une fois que le nombre souhaité d'animaux d'expérience sera atteint, les animaux ayant permis leur naissance seront mis à mort afin d'éviter la multiplication d'animaux alors que l'étude sera terminée.
Remplacement
Pour caractériser la myopathie à spirales cylindriques et identifier l'impact de la mutation du gène d'intérêt, nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l'Homme, il nous permet de valider la pathogénécité de cette mutation. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation de l'atteinte musculaire seraient impossible à évaluer.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les études réalisées. De plus, l'étude sera longitudinale afin de travailler sur les mêmes animaux sans en multiplier leur nombre. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d'accouplements avec deux femelles pour un mâle. L'observation des souris permettra d'optimiser au mieux leur nombre. Nous prévoyons cependant 185 animaux pour cette étude. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisée avec un test maximum par jour.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d'améliorer le bien-être de l'animal. Si des difficutés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l'animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupes de 2 à 4 par cage et la qualité de l'air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d'accouplements seront constitutées de deux femelles par cage facilitant l'élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance, il seront donc surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaines. Si une perte d'état rapide est observée chez les animaux, l'étude sera alors stoppée. De même, en cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l'étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d'évaluer et de comprendre l'impact de la perte de fonction de la protéine d'intérêt dans la myopathie en spirales cylindriques, une pathologie humaine, nous avons besoin d'étudier son effet sur les fibres musculaires, de préférence chez les mammifères. La protéine que nous étudions est très bien concervée chez la souris avec 97% d'homologie. Ceci suggère une fonction très similaire chez l'humain et la souris. De plus, la structure des muscles est similaire chez la souris et l'humain. Les myopathies causant des défauts structuraux du muscle, la souris nous permettra de reproduire le plus fidèlement possible les défauts observés chez l'humain et ainsi de modéliser au plus près la maladie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherche dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier l'impact de la mutation sur le phénotype d'un individu entier ainsi que sur la structure de la fibre musculaire. Le modèle utilisé étant déjà décrit comme ayant une faible espérance de vie, les études phénotypiques seront faites à 3 semaines de vie. Les souris seront néanmoins obervées et suivies attentivement de la naissance jusqu'à la mise à mort.
Etude de pharmacocinétique d’une molécule administrée chez le rat ou la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
Rats : 3300
7 500 souris et 3 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une molécule par diverses voies, avec prélèvements répétés de sang, d'urines et de fèces, une partie des rats subissant la pose d'un cathéter sur le canal biliaire et un séjour en cage métabolique, avant des prélèvements terminaux d'organes. Le projet mesure le comportement pharmacocinétique de composés candidats. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro fiable et que le recours aux animaux est "indispensable".
Objectifs
Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Ils vont permettre de décrire les différentes phases que va subir le composé quand il entre dans l’organisme du rongeur par différentes voies. Le rongeur a été choisi dans ce projet car c’est un modèle de choix du fait de la bonne disponibilité de la littérature, d’études rétrospectives en pharmacocinétique, de sa facilité d’utilisation et de son anatomie et sa physiologie bien connues.
Bénéfices attendus
La connaissance des propriétés pharmacocinétique d’un produit chez l’animal avant le design des études de pharmacologie permet d’utiliser le meilleur traitement (dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. A terme, les résultats précliniques de ce projet permettront de mieux comprendre la pharmacocinétique de nos composés afin de de développer en clinique des composés prometteurs ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.
Procédures
Procédure 1 : Etude de pharmacocinétique d'une durée de 24 heures pour un composé pharmaceutique administré chez le rat ou la souris avec prélèvements de sang, urines, fèces et tissus. Un maximum de 4 prélèvements de sang pour la souris et de 7 prélèvements pour le rat seront effectués sur ces 24h. Procédure 2 : Etude d’excrétion d’une molécule administrée chez le rat avec prélèvement de la bile via un cathéter au niveau du canal cholédoque, urines, fèces. Les sécrétions biliaires et urinaires seront collectées en continu sur une période de 24 heures en cage métabolique apre sune période d'acclimation de 15 heures. la procédure en elle même dure 39 heures.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux recevront des molécules issues de notre recherche. Les nuisances attendues : stress en cage métabolique ou suite de chirugie pour pose de pompe osmotique en s.c.. : mis en place d'un suivi analgésique et d'une observation réguliere des animaux.
Devenir
Tous les animaux des ces procédures seront mis à mort à la fin de l'étude afin de permettre la réalisation de prélévements terminaux (sang et organes).
Remplacement
Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé.
Réduction
Dans un but de diminution du nombre d’animaux et d’augmentation de l’information, le nombre d’animaux de l’étude est basé sur notre expérience. Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux qui permet d’obtenir des résultats avec une variabilité acceptable. Ainsi en screening, 2 animaux sont utilisés pour la voie intra veineuse et 3 animaux pour la voie orale pour décrire la pharmacocinétique des produits sur 24h. L’étude pharmacocinétique est réalisée par prélèvements multiples.
Raffinement
Animaux qui entrent dans l’étude : suivi régulier du comportement. Nous utilisons les Guides d'évaluation du Bien-Etre pour évaluer l'inconfort ou la souffrance de nos animaux. Nous avons défini des critères d'alarme et d'interruption adaptés à la procédure. Le nombre de groupes dans chaque expérience est optimisé en fonction des temps de prélèvements nécessaires, notamment de la durée de l’étude. Pour obtenir plus d’informations les échantillons utilisés pour le dosage du produit administré peuvent aussi être utilisés pour la bioanalyse des métabolites.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Nos modèles ont été sélectionnés et seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur, afin de limiter l’utilisation de gros animaux pour les études précoces de recherche. Le rat et la souris sont choisis pour ces études parce que ces espèces sont aussi très représentées dans les modèles pharmacologiques et dans les études de toxicologie. L’étude des corrélations entre les données vitro et les données vivo obtenues chez le rat et la souris permettent de mieux définir la prédiction de la pharmacocinétique chez l’homme avant les premières études cliniques. Les rats et les souris utilisés dans ce projet seront des adultes afin que leur métabolisme soit mature (pas de forme pédiatrique dans nos aires thérapeutiques)