Recherche appliquée

180 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas ou foie sont greffées sous leur peau, puis un anticorps ou un placebo est injecté trois fois par semaine pendant jusqu'à soixante jours, avant l'euthanasie pour prélever les tumeurs. Le porteur affirme n'avoir observé aucun effet secondaire des traitements dans des projets antérieurs, la surveillance portant surtout sur la taille des tumeurs. Il indique qu'il est "indispensable" d'évaluer l'anticorps dans un organisme entier, la culture cellulaire ne reproduisant pas l'environnement tumoral.

Objectifs

La transplantation de cellules cancéreuses humaines chez la souris permet d'en approfondir la caractérisation biologique. Dans ce travail, nous souhaitons évaluer les effets anticancéreux d'un anticorps, développé dans notre laboratoire, sur la croissance des cellules cancéreuse humaines (côlon, pancréas, foie) greffées chez la souris. Nous savons que ces cellules ne forment pas de métastases dans nos conditions de croissance chez la souris. Les animaux greffés seront soignés dans des conditions standard (portoir avec cages ventilées et enrichissement) et nourris sans restriction avec une alimentation standard. Ce modèle permettra d'étudier les effets du traitement avec l'anticorps d’intérêt. Même si certaines données ont d'ores et déjà pu être obtenues sur le rôle de l'anticorps dans les modèles de cellules en culture, il est indispensable d'évaluer leur efficacité dans un modèle animal plus intégré, impliquant tous les types cellulaires de l'environnement de la tumeur chez la souris. Une expérience se déroulera sur 60 jours entre le moment où les cellules cancéreuses sont greffées et l'analyse des résultats. Si nous envisageons un délai de 5 ans, celui-ci englobe le temps de plusieurs expériences et le temps de l'écriture d'une publication pour valoriser le travail.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à ce que l'anticorps d’intérêt diminue la croissance des tumeurs chez la souris dans le but de développer une nouvelle piste thérapeutique dans le traitement des cancers digestifs chez l'homme.

Procédures

Les souris utilisées sont des femelles adultes de 6 semaines à leur arrivée à l'animalerie. Nous avons choisi des femelles pour éviter l'agressivité des mâles liée au sexe et des adultes pour avoir un système mature et des animaux qui sont adultes du début à la fin de l'expérience. Après un temps d'acclimatation de 4 jours, elles entrent dans un protocole de suivi de croissance tumorale pour une durée maximum de 60 jours. On réalise une injection de cellules tumorales humaines digestives sous la peau de souris femelles adultes sous anesthésie. Les cellules vont être tolérées par la souris et vont commencer à croître à l’endroit de l’injection. Cette injection dure moins de 30 secondes. A partir du jour d’implantation, les souris vont recevoir un composé visant à diminuer ou ralentir la croissance tumorale. Ces injections se font 3 fois par semaine sur animal non endormi et sont composées soit d’un placebo, soit de la molécule d’intérêt. L’ensemble des souris est également évalué 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs au cours du temps. Cette évaluation se fait le même jour que les injections pour éviter l’accumulation de stress soumis aux animaux. L’ensemble de ces actes (injection et évaluation) ne dépassent pas 1 minute par animal. A la toute fin de l’expérience tous les animaux sont euthanasiés.

Impact sur les animaux

L’utilisation des molécules d'intérêt ou des molécules chimio-thérapeutiques utilisées dans les traitements des cancers digestifs, a d’ores et déjà été réalisée et validée dans des projets antérieurs et aucun effet secondaire nuisible n’a été noté. Les différents traitements n’affectent ni l’état général, ni le poids des animaux. Seules la taille des tumeurs et la nuisance liée aux injections répétées pour le traitement en cours d’expérience doivent être surveillée de manière vigilante, car ils peuvent être susceptibles d’altérer le bien-être animal et être à l’origine d’une perte de poids importante.

Devenir

A la fin de l’expérience ou lorsqu’un animal a été jugé avoir atteint un point limite affectant le bien-être animal, il sera euthanasié pour prélever les tumeurs greffées et les analyser. Aucun autre organe ne sera prélevé.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu de la complexité physiologique de l’environnement de la tumeur comprenant plusieurs types cellulaires impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant à travailler à l'échelle d'un organisme. Des études sur cellules en culture sont, par ailleurs, prévues pour étudier d’autres paramètres qui complèteront ce volet d’expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats exploitables. Ce nombre est de 5 souris par sous-groupe, chacune greffée de 2 tumeurs sur chaque flanc, c'est à dire 10 tumeurs greffées par groupe, ceci dans le but de diminuer de moitié le nombre d'animaux inclus dans une expérience.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les animaux seront anesthésiés au moment de la greffe des cellules cancéreuses sous la peau. Au cours de l’expérience, une surveillance visuelle quotidienne et un suivi clinique (3 fois par semaine) seront réalisés dans le calme pour limiter au maximum le stress des animaux. L’administration d’analgésique sera réalisée si nécessaire (en cas de douleur). Des conditions d’hébergement standard adaptées sont appliquées avec une alimentation standard sans limite de quantité. Enfin, un enrichissement composé de coton et de lanières cartonnées en accordéon sera proposé aux animaux afin qu’ils puissent se confectionner des nids.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont des femelles adultes de 6 semaines à leur arrivée à l'animalerie. Nous avons choisi des femelles pour éviter l'agressivité des mâles liée au sexe et des adultes pour avoir un système mature et des animaux qui sont adultes du début à la fin de l'expérience. Après un temps d'acclimatation de 4 jours, elles entrent dans un protocole de suivi de croissance tumorale pour une durée maximum de 60 jours. Nous avons choisi l'utilisation de la souris qui est une espèce animale qui se rapproche au mieux sur le plan physiologique à l’espèce humaine. Seule la souris nous permettra de répondre clairement aux questions que nous nous posons sur les effets anticancéreux d'un anticorps sur les cancers digestifs humains. De plus, le modèle souris apporte 2 autres avantages : sa taille et sa masse qui limite les quantités de traitement à administrer et le nombre extrêmement grand d'outils biologiques qui permettent la caractérisation des tissus cancéreux chez la souris. Les souris utilisées sont des femelles adultes pour que les animaux restent au même stade mature tout au long de l’expérience. Nous avons privilégié des femelles pour limiter les conflits entre mâles greffés dans une même cage.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Helicobacter pylori puis gavées d'un composé nommé EX-01, jusqu'à deux fois par jour pendant quatorze jours, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur vise un médicament contre l'infection à H. pylori, associée aux cancers de l'estomac, et renvoie cette retombée à terme. Il affirme que des expériences chez la souris sont "indispensables" pour confirmer l'activité du composé, jugée impossible à modéliser in vitro.

Objectifs

Le cancer gastrique est actuellement la 4e cause de mortalité par cancer dans le monde. L’infection chronique par Helicobacter pylori est considérée comme étant reponsable dans plus de 93% des carcinomes gastriques. Le composé EX-01, naturellement présent dans l’alimentation, dont l’inocuité a été montrée mais dont la composition est actuellement confidentielle car en instance de brevetage, a montré des effets antibiotiques in vitro sur Helicobacter et Campylobacter. Il a également montré des effets anti-cancéreux dans les cancers de la prostate et du pancréas mais son action n’a pas encoré été étudiée dans le cancer de l’estomac. Nous souhaitons donc à présent étudier in vivo les effets de ce composé, l’objectif à terme étant la création d’un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori chez l’Homme. L’objectif de ce projet est d’étudier in vivo chez la souris les effets du composé EX-01 sur la colonisation de l’estomac par la bactérie Helicobacter pylori.

Bénéfices attendus

L’objectif à terme est de développer un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori.

Procédures

Gavage sur animal vigile: 20 souris, 1 fois par jour sur 3 jours Gavage sur animal vigile: 40 souris, 1 fois par jour sur 3 jours puis 2 fois par jour sur 14 jours

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au stress du gavage 2 fois par jour, et à l’infection à H. pylori. L’infection à H.Pylori peut induire une légère inflammation au niveau de l’estomac au bout de 5 semaines

Devenir

Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.

Remplacement

L’effet antibactérien du composé EX-01 sur la croissance de H. pylori a été montré in vitro (dépôt de brevet en cours). L’absence de toxicité chez la souris a été démontrée. Des expérimentations chez la souris avec ce composé sont indispensables afin de confirmer sa biodisponibilité et son activité in vivo dans la muqueuse gastrique (environnement acide susceptible d’affecter l’activité de la molécule), éléments qui ne peuvent pas être modélisés in vitro.

Réduction

Le modèle d’infection à H. pylori est connu et maitrisé par notre équipe. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des analyses biologiques de H. pylori à partir de la muqueuse gastrique des souris infectées, et l’analyse histopathologique pour quantifier l’inflammation gastrique. Des études statistiques seront réalisées : d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. pylori, qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de litière). Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs. Si l'animal commence à perdre du poids, de la nourriture humidifiée sera mise dans la cage. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas en 48 h il sera immédiatement euthanasié. Si l'animal présente des signes de souffrance trop importants il sera euthanasié sans attendre. Les souris seront pesées deux fois par semaine, si la perte de poids est de 10% par rapport à la semaine précédente l’animal sera euthanasié sans attendre.

Choix des espèces

Le modèle d’infection à H. pylori a été mis au point chez la souris C57BL6J et est maitrisé au laboratoire. Les souris seront utilisées à un âge de 6 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. pylori. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.

402 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent entre zéro et trois jours une injection dans le foie, âge choisi pour la prise de greffe des cellules progénitrices humaines, puis, selon les procédures, jusqu'à six injections par semaine dans le ventre pendant six à quatorze semaines, des anesthésies hebdomadaires pour suivre leurs tumeurs par imagerie et des prises de sang à la veine temporale. Pour apprendre le geste de l'injection dans le foie, l'équipe utilise trois portées, environ 72 souriceaux, et prévoit des pertes liées à leur jeune âge et au rejet par leur mère après les manipulations. Le porteur écrit que la stratégie testée contre un lymphome "pourrait offrir des réponses anti-cancéreuses durables et efficaces". Chez les souris, les tumeurs peuvent provoquer des difficultés respiratoires, signe de cellules tumorales dans les poumons ou de métastases.

Objectifs

Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les patients atteints de cancer consiste à prélever leurs globules blancs en les modifiant pour leur permettre de reconnaitre et de cibler des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses. Après réinjection aux patients, ces cellules modifiées sont ainsi capables de reconnaitre et de détruire spécifiquement les cellules cancéreuses. Elles représentent aujourd’hui un espoir dans le traitement de certaines leucémies réfractaires ou en rechute et ont considérablement amélioré le résultat global des patients. Cependant plusieurs obstacles restent à résoudre dans ce domaine. Tout d'abord, malgré un taux élevé de patients montrant une réponse complète à ce traitement par thérapie cellulaire, la rechute de la maladie reste un défi important avec des taux de survie sans progression inférieurs à 50 %. Après le traitement, la survie à 3 ans est de seulement 16,1 %. Plusieurs raisons expliquent cet échec à obtenir des rémissions durables. La perte précoce, la faible expansion et l'épuisement des cellules thérapeutiques modifiées, sont des facteurs d’échec importants. La reconstitution tardive des cellules immunitaires effectrices possédant une activité anti-tumorale après la thérapie cellulaire, représente un autre défi important. Cette immunodéficience augmente non seulement les risques de rechute, mais entraîne également un taux important d’infection post-greffe. Dans ce contexte, une stratégie d'implantation de cellules progénitrices pourrait contourner certains de ces principaux défis (disponibilité immédiate, expansion efficace et réponse antitumorale durable) en accélérant la reconstitution d'un thymus chez les patients. Le modèle animal développant une tumeur de lymphome, ainsi que l’efficacité des cellules thérapeutiques modifiées matures ont été validés précédemment. Dans le cadre de ce projet, nous allons évaluer l’effet thérapeutique des cellules progénitrices, en suivant notamment la régression des tumeurs, la maturation des cellules anti-cancéreuses et leur persistance in vivo.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant des cellules progénitrices, et donc d'une plateforme de développement de ces cellules à visée d'utilisation clinique. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. Cette stratégie pourrait offrir des réponses anti-cancéreuses durables et efficaces en contournant les obstacles majeurs reportés à ce jour dans le domaine des immunothérapies pour le cancer.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : - des injections intrahépatiques (1X; durée 5 sec); - des injections par voie sous-cutanée (1X/sem pendant 5 semaines; durée 5-10 sec); - des injections par voie intraveineuse (1 ou 2X selon la procédure; durée 2-3 minutes); - des injections par voie intrapéritonéale (6X/sem pendant 6 à 14 semaines selon la procédure; durée 5-10 sec); - des anesthésies sous isoflurane (1X/semaine, pendant 5 à 13 semaines selon la procédure; durée 20 min maximum ); - des prélèvements sanguins par ponction dans la veine temporale superficielle (1X ou 3X maximum selon la procédure; durée 2-3 min); - un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque (1X, après euthanasie).

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Lors de la mise au point de la technique d’injection intra-hépatique, une perte du nombre d’animaux peut être attendue en raison du jeune âge des animaux, ainsi que du rejet de la mère après les manipulations. Par ailleurs, les cellules matures pourraient occasionner au long cours une réaction des globules blancs humains contre les tissus de souris. Cet effet peut être observé chez la souris immunodéficiente greffée depuis plus de six mois avec des cellules-souches sanguines humaines. Bien que cet effet soit moins attendu avec les cellules progénitrices grâce à leur maturation dans le thymus de la souris, et donc une tolérance contre les cellules murines, la durée de nos études ne dépassera pas six mois pour éviter cet éventuel effet indésirable. D'autre part, ce projet comprenant l’apparition de tumeurs, le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par imagerie seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. Enfin, des difficultés respiratoires peuvent apparaitre, signe de présence de cellules tumorales au niveau des poumons, ou de métastases.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever le sang en vue d'analyses post-mortem.

Remplacement

Toutes les étapes visant à améliorer la performance du produit de thérapie cellulaire ont été mises au point avec des expériences exclusivement in vitro et notamment des caractérisations du produit final par des méthodes de séquençage et d'analyse de populations cellulaires. Néanmoins il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir les globules blancs matures du point de vue fonctionnel. La seule méthode existante consiste en un système de co-culture des cellules-souches sanguines avec des cellules-souches nourricières . Bien que ce modèle permette d’obtenir des globules blancs exprimant les marqueurs de différenciation, les cellules n’atteignent pas la maturité fonctionnelle. Seule l’injection dans un modèle de xénogreffe permettra de répondre à ce point, modèle où le greffon provient d'une espèce différente du receveur, respectivement cellules d'origine humaine implantées dans un modèle de souris. Cette xénogreffe permettra la maturation et la différenciation complète des progéniteurs des globules blancs dans l’environnement du thymus de la souris. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique.

Réduction

La première étape de ce projet vise à acquérir le geste technique d’injection intra-hépatique chez le souriceau nouveau-né, notamment la reproductibilité du mode opératoire et l’inter-opérabilité, ainsi que le suivi de la survie des animaux. Nous utiliserons à cet effet 3 portées, soit environ 72 souriceaux agés de 0 à 3 jours. Il n'y aura pas d'analyse statistique pour cette première étape de mise au point technique. La deuxième étape du projet consiste à injecter les cellules progénitrices et à valider leur effet thérapeutique dans un modèle de cancer . Le produit avec lequel nous envisageons d’effectuer les tests fonctionnels in vivo a été optimisé au préalable, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations. Par ailleurs, le modèle animal choisi dans cette étude est un modèle murin immunodéficient, utilisé avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules-souches sanguines humaines. L’utilisation de ces souris nous permettra d’obtenir des résultats homogènes et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental; nous utiliserons ainsi 6 souris par groupe et par condition. En utilisant des tests statistiques non paramétriques, selon le paramètre mesuré (croissance tumorale, poids des souris, analyse des globules blancs), nous réaliserons des études permettant de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de leur poids et de la croissance tumorale. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont utilisées avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules humaines. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. Le profond déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules-souches sanguines humaines, et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines dans un hôte murin. Ce modèle est notamment très utilisé pour tester l’efficacité anti-cancéreuse de globules blancs modifiés ou de leurs cellules progénitrices. Par ailleurs, le thymus de ces souris, tout comme celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une allogreffe de cellules-souches sanguines (greffon et hôte de même espèce), sont caractérisés par une atrophie majeure et une architecture altérée. Ces souris présentent donc un environment similaire à celui des patients. Nous utiliserons des souris nouveaux-nés (P0), permettant une bonne prise de greffe des cellules progénitrices. Nos précédentes études ont démontré que les cellules progénitrices pourraient se greffer dans le thymus sans conditionnement (irradiation ou chimiothérapie) chez les souriceaux nouveau-nés (0 à 3 jours post naissance). Une fois cette période passée, afin d’obtenir une prise de greffe dans le thymus, il faut irradier les animaux et co-administrer les cellules progénitrices modifiées avec les cellules souche hématopoïétiques.

354 souris BALB/c vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et une partie d'entre elles passe jusqu'à 90 minutes par séance immobilisée dans un tube de contention, après trois jours d'habituation de 30, 60 puis 90 minutes. Les souris reçoivent des substances sensibilisantes sur les flancs tondus et derrière les oreilles, ou les respirent par le nez et la bouche, au risque d'irritations de la peau ou des voies respiratoires et de signes d'asthme, puis sont mises à mort à différents jours, jusqu'à J13, pour l'analyse de leurs ganglions. Le but affiché est d'identifier des marqueurs qui permettront plus tard de développer une méthode de culture cellulaire capable de repérer les substances qui déclenchent des allergies respiratoires. Les lots décrits dans les procédures totalisent au moins 368 souris, pour 354 déclarées.

Objectifs

L’allergie est classée au 4ème rang des affections chroniques les plus fréquentes par l’Organisation Mondiale de la Santé. Les symptômes allergiques peuvent prendre des formes cutanées ou respiratoires et font suite à l'exposition répétée des sujets à une substance dite sensibilisante. Jusqu'à 25% des cas d'asthme déclarés sont d'origine professionnelle et font suite à une exposition répétée, par voie respiratoire ou cutanée, à des substances sensibilisantes chimiques. A ce jour, aucune méthode n'a été validée par les instances règlementaires européennes pour identifier les substances chimiques avec un potentiel sensibilisant respiratoire. Or, ces substances présentent un danger pour les individus exposés. La différenciation des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques locaux est une étape déterminante dans le développement de la maladie allergique. L’objectif de ce projet est d’identifier des gènes régulant la différenciation des lymphocytes T au cours du processus de sensibilisation respiratoire chez la souris. Afin d’atteindre cet objectif, deux voies d’exposition seront utilisées sur un modèle murin de sensibilisation qui sera combiné à des outils d’analyse de l’expression des gènes afin d’identifier les gènes cibles exprimés par les cellules immunitaires d’intérêt activées par des sensibilisants respiratoires et des sensibilisants cutanés. L’objectif final est de développer un modèle de culture cellulaire, alternatif au modèle animal, qui permettra d’identifier spécifiquement les substances chimiques ayant le potentiel de déclencher une maladie allergique respiratoire, grâce aux biomarqueurs qui auront été identifiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes immunologiques mis en jeu au cours de la sensibilisation respiratoire. Ces connaissances sont nécessaires pour améliorer la description des évènements clés menant au développement de l’allergie respiratoire. En outre, de nouveaux biomarqueurs seront identifiés au cours de ce projet, ils permettront de développer un modèle de culture cellulaire alternatif au modèle in vivo permettant de prédire le potentiel sensibilisant respiratoire des substances chimiques. De telles méthodes sont nécessaires, pour identifier le risque associé à l'exposition aux substances sensibilisantes, afin de prévenir le développement de maladies allergiques. Aucun modèle de culture cellulaire n’est validé à ce jour par les instances européennes pour identifier les substances chimiques avec des propriétés sensibilisantes respiratoires.

Procédures

Un lot de 52 souris vigiles seront exposées par application cutanée à 2 sensibilisants allergiques et au solvant approprié. La veille de la première application, les flancs des animaux seront tondus sous anesthésie gazeuse. Les produits seront appliqués sur les flancs des souris à J0 et J5, puis derrière les oreilles à J10, J11 et J12. Les animaux seront mis à mort J0, J3, J7, J10 et J13. Les ganglions lymphatiques auriculaires seront collectés puis analysés par cytométrie en flux. Cette méthode permet d’analyser l’expression de protéines d’intérêt par marquage fluorescent. Trois lots de 28 souris et un lot de 20 souris vigiles seront exposées par application cutanée à 7 substances et au solvant approprié. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps déterminés par les analyses en cytométrie en flux puis différents tissus seront collectés. Deux lots de 36 souris seront exposés de façon vigile à 2 sensibilisants allergiques de référence et au solvant approprié par exposition oro-nasale, une fois par jour pendant 90 min maximum à J0 et J5 puis à J10, J11 et J12 pendant 25min au maximum. Les animaux seront mis à mort à J0, J3, J7, J10 et J13 puis les ganglions lymphatiques mandibulaires seront collectés et analysés par cytométrie en flux. Sept lots de 20 souris vigiles seront exposés aux mêmes 7 substances que pour l’exposition cutanée, par exposition oro-nasale. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps déterminés par les analyses en cytométrie en flux puis différents tissus seront collectés. La fonction respiratoire des animaux sera évaluée à J0, J10 et J12 de façon non invasive. Un lot de 10 souris seront utilisées pendant 2 semaines pour mettre au point l’ajustement du matériel utilisé pour l’exposition oro-nasale et la mesure de la fonction respiratoire. Ces animaux seront réutilisés dans la procédure d'exposition oro-nasale : ils seront inclus dans la phase de phénotypage.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront principalement dues aux voies d’administration des substances chimiques. Malgré le plus grand soin apporté pour limiter l’inconfort des animaux, la procédure de sensibilisation par application cutanée pourra induire de l’irritation cutanée. L’exposition des animaux par inhalation pourra induire de l’irritation des voies aériennes. L’exposition par inhalation, qui sera faite par voie oro-nasale, pourra induire du stress chez les animaux qui seront mis en tubes de contention. Avec les deux procédures, des signes d’asthme pourront également apparaitre. Dans tous les cas, dès l’apparition de signes de souffrance non réversibles, les animaux seront mis à mort.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures d'exposition cutanée et oro-nasale, les animaux seront mis à mort. Les animaux utilisés pour la mise au point de l'exposition oro-nasale pourront être inclus dans la procédure d'exposition oro-nasale si leur état n’a pas nécessité de mise à mort.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux à des fins expérimentales car le modèle animal permettra d’étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la différenciation des lymphocytes T lors du processus de sensibilisation in vivo. Aucun modèle de culture cellulaire n’est à ce jour établi et validé pour étudier ces mécanismes. C’est d’ailleurs l’objectif au terme de ce projet : le développement d’un modèle de culture cellulaire à partir des données issues de ce projet afin de proposer un modèle alternatif pour l’évaluation du potentiel sensibilisant respiratoire.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux utilisés afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques valables entre les groupes expérimentaux. En accord avec la littérature, nous avons porté à 4 le nombre de souris par groupe. En outre, nous allons collecter le maximum de tissus afin de pouvoir effectuer les analyses post-mortem nécessaires à ce projet en utilisant un nombre minimal de souris. L’analyse sur cellule unique permet de diminuer la variabilité entre les individus, car environ 2000 cellules seront analysées dans chaque échantillon, ce type d’analyse permet donc de réduire le nombre d’animaux à inclure par groupe expérimental.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué chaque jour lors des soins quotidiens apportés par les zootechniciens et lors des contrôles quotidiens effectués par les autres membres participant à ce projet (techniciens de recherche et chercheurs). Toutes les personnes intervenant dans ce projet sont formées initialement et de façon continue à l’expérimentation animale et en particulier au bien-être animal. Les gestes réalisés seront maitrisés afin de garantir le confort maximum des animaux lors des traitements. Les animaux seront hébergés par groupe dans des cages répondant aux exigences de la réglementation en terme de dimensions. Un enrichissement varié (maisonnette et éléments de nidification) leur sera apporté. Une observation renforcée après les expositions aux substances chimiques permettra la prise en charge rapide des animaux en cas de souffrance ou d’atteinte de point limite. Les animaux exposés par inhalation oro-nasale seront habitués aux tubes de contention pendant plusieurs jours et suivant un temps de contention croissant avant d’être exposés aux substances chimiques. Nous proposons d’habituer les animaux comme suit: Jour 1 : habituation de 30 min Jour 2 : habituation de 60 min Jour 3 : habituation de 90 min Jour 4 : exposition de 90 min

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée pour plusieurs raisons : -la souris est l’espèce couramment utilisée pour les études de toxicologie, elle est notamment l’espèce sélectionnée dans la ligne directrice 429 de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) portant sur le modèle Local Lymph Node Assay qui permet d’identifier les substances chimiques allergéniques; -la composition et le fonctionnement du système immunitaire de la souris sont semblables à celui de l’Homme et les résultats issus des expériences pourront donc être extrapolés raisonnablement aux effets attendus chez l’Homme ; -la souche BALB/c est choisie car son système immunitaire est adapté aux études de sensibilisation allergique. Cette souche, bien qu’orientée Th2, permet d’étudier la différenciation des lymphocytes T en ses différents sous-types et plusieurs études ont montré qu’elle permet le développement d’une réaction allergique respiratoire aux substances chimiques. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8-10 semaines, stade de développement auquel la souris atteint l’âge adulte. Nous souhaitons étudier la réponse allergique sur des animaux ayant un système immunitaire mature.

500 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort prévue, réintégrés ensuite à la colonie de l'établissement. On leur injecte un allergène qui déclenche des démangeaisons, grattage, léchage et mordillements, puis on teste des molécules par diverses voies, avec des prises de sang à la jugulaire et des biopsies de peau. Ce modèle sert à sélectionner de futurs médicaments vétérinaires contre la dermatose atopique féline, en vue d'une mise sur le marché. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne peut reproduire cette maladie hors de l'animal.

Objectifs

​​L’objectif du projet est de mettre en place un modèle de prurit chez le chat et d’utiliser ce modèle pour la sélection de futures molécules thérapeutique pouvant entrer dans la composition de nouveaux médicaments destinés à une mise sur le marché pour traiter la dermatose atopique féline (DAF). La maîtrise de ce modèle permettra d’évaluer primairement l’efficacité, secondairement la tolérance, le profil pharmacocinétique de molécules et également de suivre l’évolution de certains bio-marqueurs de l’inflammation (interleukines, PBMCs (peripheral blood mononuclear cell)…) dans notre modèle avec et sans traitement.

Bénéfices attendus

La DAF est la deuxième allergie la plus fréquente chez le chat après l’allergie aux puces : elle touche environ 12.5% de la population féline. C’est une dermatose inflammatoire et prurigineuse avec une influence saisonnière en fonction des allergènes incriminés. Le symptôme principal est un prurit (y compris un toilettage excessif) et certains chats présentent en symptômes secondaires une alopécie (perte de poils), des otites externes… Sa gravité réside principalement dans son impact sur la qualité de vie du propriétaire et de son chat, ceci pouvant être une cause de demande d’euthanasie.

Procédures

Traitements : Lors de cette procédure expérimentale, l’administration du produit sera réalisée par voie intraveineuse (IV), intramusculaire (IM), sous-cutanée (SC), orale, transcutanée, ou autre. Le volume maximal administré sera en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires. Prélèvements de sang : généralement à la veine jugulaire sur animal vigile. Les volumes totaux de sang prélevés suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal, et ne dépasse jamais 20% du volume de sang circulant par kg de poids vif. Un temps de repos suffisant est déterminé entre chaque phase de prélèvement si l’étude en compte plusieurs et entre chaque étude. Ainsi, pour un volume maximum prélevé correspondant à 7.5%, 10%, 15% et 20% du volume de sang circulant par kg de poids vif sur une période de 24h, le temps de récupération est de 3, 7, 14, et 28 jours respectivement. Prélèvements de fluides biologiques/tissus/matrices : Des raclages cutanés et/ou des biopsies de peau pourraient être réalisés. Dans le premier cas, le prélèvement s’effectuera avec une lame de bistouri émoussée. Dans le second cas, l’acte sera réalisé sous anesthésie locale, sur un animal vigile avec ou sans tranquillisation et suivies les cas échéant par des points de suture. Le nombre de biopsies sera limité à 1 par jour et 8 par étude pour chaque chat. La taille et la profondeur de la biopsie seront définies et argumentées dans le plan d’étude.

Impact sur les animaux

Les chats recevant une injection d’élément allergisant et dévélopperont des signes pruritique : grattage, léchage, mordillement ou des frottements de n’importe quelle partie du corps. Les signes cliniques apparaissent généralement dans les 30 minutes après l’injection et le prurit disparait spontanément quelques heures après cette injection. Des prélèvements sanguins répétés pourront également générer un inconfort. Des biopsies de peau pourraient être collectées. Avant de conduire des études d’efficacité nous avons généralement des informations de tolérance dans le chat, des réactions d’intolerance sévère à cause des produits évalués ne sont donc pas attendues. Les phases de traitement/prélèvement sur un animal vigile peuvent occasionner un léger stress/baisse de bien-être en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/recueil d’échantillons.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les euthanasies ne sont pas prévues. Par conséquent une réintroduction de l’ensemble des animaux qui participeront à ce projet dans la colonie hébergée au sein de l’EU est envisagée. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire la DAF et pouvoir évaluer l’état général de l’animal et l’intensité des manifestations dermatologiques, la complexité des mécanismes biologiques en jeu ne pouvant être reproduite in vitro.

Réduction

Les comportements pruritiques présentent une variabilté entre individus. L’expérience avec ce type de modèle nous montre qu’il faut déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe permettant des résultats exploitables et répétables. Ce sont des études de preuve de concept : étapes précoces de l’évaluation d’un nouveau produit/composé actif. L’évaluation et l’intérprétation des résultats sont faites en comparant le temps où un comportement pruritique est observée durant une période définie pour chaque groupe. Les groupes de traitement sont : non-traité (contrôle négatif) et/ou le groupe traité avec un produit de référence (contrôle positif) et le (ou les) groupe(s) traité(s) avec le produit à évaluer. Il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique dans le cadre de ce projet. Dans le plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser l’utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre d’animaux permette d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettent de prendre une décision sur le niveau de sensibilisation et/ou l’efficacité du produit/des produits évalués. Également en plus d’étudier le contrôle du prurit, l’utilisation d’un modèle permet une comparaison pharmacocinétique/pharmacodynamoqie et aussi une évaluation de la tolérance : donc une étude au lieu de trois.

Raffinement

Les animaux sont manipulés quotidiennement afin de les habituer à la contention et au contact des expérimentateurs. Les traitements et prélèvements sont réalisés généralement sur animaux vigiles selon les procédures en vigueur au sein de l’animalerie. Pour les chats, une contention légère est suffisante pour l’administration du traitement et les collectes d’échantillons et n’induit pas de nuisance au bien-être des animaux autre que d’être maintenus pendant des temps très courts. Les volumes prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être ne sera pas altéré. Dans le cas d’administrations ou de prélèvements spécifiques (biopsie de la peau), les animaux pourront être anesthésiés localement ou totalement pendant la durée de l’acte. L’anesthésie et le réveil des animaux se feront sous la surveillance d’un vétérinaire. Toute observation d’un état de santé ou d’un comportement anormal d’un animal fera l’objet d’un examen par un vétérinaire qui proposera les mesures adéquates pour protéger l’animal : si nécessaire, le sortir de la procédure expérimentale et/ou lui administrer un traitement. L’euthanasie (si nécessaire) sera effectuée sur site. Suite à l’injection d’élément allergisant, des personnes qualifiées évaluent régulièrement le comportement général, le grattage, la respiration et la peau avec une grille qui permet de définir si les réactions sont absentes, légères, modérées ou sévères. Ces critères constituent des points limites qui une fois atteints ou dépassés, entraineront l’exclusion de l’animal de l’étude et son traitement. La réaction induite et l’inconfort que l’injection d’élément allergisant peut engendrer sont vite et efficacement contrôlés avec par exemple des corticoïdes. Les chats pourront avoir leurs griffes épointées pour diminuer et limiter le risque de blessures lors du comportement pruritique. Également, par exemple, une colerette pourrait leur être posée si les points limites sont atteints le temps que le traitement agisse. La grille d’évaluation des lésions et les points limites sont validés par le comité d’éthique et pourront être révisés de manière rétrospective selon les résultats obtenus à chaque étude.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. Les modèles expérimentaux qui permettront d’évaluer les produits vétérinaires doivent être développés dans la même espèce pour plus de pertinence. L’espèce féline a été retenue comme correspondant à l’application clinique future des produits visant à traiter les signes de dermatose atopique. Les modèles seront à mettre en place chez des chats jeunes adultes sains. Ceci correspond à des animaux de plus de 3 mois avec un système immunitaire mature.

1 212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris de lignée NOD développent spontanément un diabète de type 1, avec soif excessive et perte de poids, et reçoivent par voie intraveineuse sous anesthésie des nanoparticules d'oxyde de fer censées réguler leur système immunitaire. Le porteur teste ce traitement en prévention et en curatif, et renvoie une application chez l'humain au long terme. Il qualifie le recours à la souris d''incontournable' et affirme qu'aucun modèle in vitro n'étudie les mécanismes immunitaires du diabète auto-immun.

Objectifs

L'organisation mondiale de la santé considère aujourd’hui le diabète comme une priorité sanitaire. Environ 5% des patients diabétiques souffrent du diabète auto-immun de type 1, la maladie métabolique la plus fréquente chez l'enfant dans les pays développés. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune complexe qui résulte de la destruction spécifique des cellules pancréatiques qui produisent l'insuline et de la perte de la capacité à contrôler le niveau de glucose dans le sang. Le diabète de type 1 survient suite à une réaction anormale du système immunitaire. De nos jours, il n’existe pas de traitement curatif sûr pour cette pathologie. Ce projet repose sur l'hypothèse que la régulation de la réponse immune peut avoir le potentiel d'induire la rémission du diabète de type 1 déclaré et/ou de le prévenir lorsqu'il est appliqué dans le prédiabète tardif, avant le déclanchement de la maladie. Des nanoparticules d’oxyde de fer, portant des molécules qui régulent le système immunitaire seront utilisées pour les traitements de souris non-obèses diabétiques. Ce type de nanoparticules est déjà utilisées en clinique en tant qu’agent de contraste en radiologie. Ce projet vise à valider et améliorer le protocole thérapeutique en termes de durée de traitement, de dose et de voie d’administration de souris diabétiques et à développer un protocole pour un traitement prophylactique. Il est également prévu d’examiner l'impact du traitement par nanoparticules sur le système immunitaire à court et à moyen terme pour la compréhension des mécanismes impliqués dans leur effet thérapeutique au niveau de l'organe affecté et du système immunitaire. Globalement ces travaux pourront contribuer à terme à valider une approche d'immunothérapie antigène-spécifique pour l'homme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu pour ce projet est l’optimisation d’une nouvelle approche de thérapie du diabète de type 1 basée sur l’administration de nanoparticules capables de réguler le système immunitaire. Un deuxième bénéfice potentiel est la compréhension des mécanismes impliqués dans un effet thérapeutique du traitement au niveau de l'organe affecté et du système immunitaire. Ces connaissances pourraient contribuer, à plus long terme, à la translation de ce type de traitement à l’homme.

Procédures

Le dosage glycémique pour suivre l’évolution du diabète sera effectués par prélèvements d’une goutte de sang pour (un lecteur de glycémie capillaire) lorsque la glycosurie avec la bandelette s’avère positive sur toutes les souris (1212). Les traitements curatifs ou prophylactiques du diabète auto-immun par les nanoparticules seront administrés par voie intraveineuse sous anesthésie générale gazeuse (1038 souris). La durée des traitements sera soit de 10 jours soit de 4 semaines. L’injection des lymphocytes par voie intraveineuse sous anesthésie gazeuse se fera sur 120 souris et 54 souris seront utilisées pour les préparations cellulaires. Le temps estimé pour effectuer le dosage de glycosurie ou de glycémie est environ 10 secondes par souris. Les temps pour effectuer l’injection intraveineuse, après induction de l’anesthésie, est 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Aucun effet indésirable majeur n’est attendu à la suite des traitements avec le nanoparticules car elles sont déjà utilisées en clinique en tant qu’agent de contraste en radiologie. Le déclenchement du diabète chez les souris non-obèses diabétiques survient entre 13 et 30 semaines avec un incidence moyenne de 18 semaines. L'incidence du diabète est de 70% chez les femelles. Des diminutions de la teneur en insuline se produisent chez les femelles à environ 13 semaines d'âge. Le début du diabète est marqué par une glycosurie et puis par une glycémie modérée. La maladie peut induire chez les souris une surconsommation d’eau et tardivement une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que la réponse au traitement, et leur système immunitaire seront alors caractérisés.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques. Aucun modèle in vitro alternatif n’est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun et donc impossible d’analyser in vitro, mais qui dispose du modèle très performant, la souris NOD. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle de la souris est incontournable.

Réduction

Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. L’incidence du diabète et les différences entre les populations lymphocytaires au cours des différents traitements seront analysées par un test statistique adapté. Le protocole expérimental prévoit l’analyse du système immunitaire de tous les animaux traités avec les nanoparticules pour limiter la répétition des expériences.

Raffinement

Les points finaux pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, 3-5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs. Les injections intraveineuses sont effectuées sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La NOD est considérée comme le meilleur modèle du diabète auto-immun spontané permettant d’étudier la maladie et la réponse immunitaire diabétogène. La souris NOD développe un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines d'âge. Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l'étude de cette maladie, en effet les mécanismes immunopathologiques découverts à l'aide des modèles murins sont similaires chez l'homme. Aucun modèle in vitro alternatif n'est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun. Les souris NOD adultes développent un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines. Notre étude d’incidence se concentre sur des animaux déclarant un diabète entre 13 et 22 semaines d’âge. Les souris de 12 semaines seront utilisées pour le traitement de prévention de la maladie et les études mécanistiques.