Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Caractérisation d’un modèle souris knock in pour la myopathie myotubulaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système urogénital
32 souris vont être utilisées dans des procédures pouvant atteindre un niveau de souffrance sévère. La plupart sont tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, seules les femelles porteuses de la mutation étant gardées pour entretenir la lignée. Ces souris knock-in reproduisant une myopathie myotubulaire subissent des tests répétés de force musculaire, dont un où l'expérimentateur tire sur la queue de l'animal agrippé à une grille, puis une mesure terminale des propriétés du muscle sous anesthésie sans réveil. Le porteur décrit une faiblesse musculaire et un poids réduit dès cinq semaines, et affirme que la souris est la 'seule espèce' assez proche de l'humain pour ces mesures.
Objectifs
La myotubularine (MTM1) est une protéine qui est mutée dans une maladie musculaire sévère appelée myopathie myotubulaire. Seuls les patients mâles sont atteints par cette myopathie ; ils présentent une faiblesse musculaire généralisée et des déficiences respiratoires. Plus de 60% d' entre eux ne survivent pas plus de 2 ans. Le but de cette étude est de comprendre plus en détails cette maladie à l' aide d 'un nouveau modèle souris qui possède une mutation importante pour le fonctionnement de la protéine MTM1. Une meilleure connaissance de cette fonction essentielle nous permettra de mieux comprendre cette myopathie et potentiellement de pouvoir proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Bénéfices attendus
Par cette étude nous envisageons d’évaluer les conséquences fonctionnelles, cellulaires et biomoléculaires de cette mutation sur la maladie, dans un nouveau modèle de souris pour la myopathie myutubulaire. Ainsi, une caractérisation globale sur des aspects comportementaux, physiologiques, biomoléculaires et histologiques nous permettrons de mieux comprendre la maladie et de mieux évaluer les effets de la maladie.
Procédures
Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques à savoir: 1.Mesurer la force du corps: test réalisé à raison de trois essais d'une minute par souris avec quinze minutes de pause entre chaque essai. 2. Mesurer la force des pattes (sur 2 ou 4 pattes): trois essais par souris avec un temps de repos de quinze minutes entre chaque essai. 3. Mesurer la position des pattes pendant le déplacement: test effectué une fois par semaine. 4. Evaluation de l’activité locomotrice: ce test se déroule sur 2 heures. 5. Mesure de la position des pattes pendant la marche (l’angle des pattes et la longueur des pas): ce test durera une minute au maximum. Les 5 tests cités precédemment seront réalisés une fois par semaine à partir de l âge de 4 semaines et jusqu' à 8 semaines car des données préliminaires ont montré une faiblesse musculaire dès l 'âge de 5 semaines. 6. Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ qui est une procédure expérimentale sans réveil: les souris seront anesthésiées par injection intrapéritonéale d 'un anti douleur et d 'un mélange d'anesthésiques pendant cinq secondes environ. La durée totale de cette procédure sera au maximum d 'une heure.
Impact sur les animaux
Pour cette étude , nous utiliserons un modèle atteint de Myopathie myotubulaire (MTM1). Cette souris développe une faiblesse musculaire et peut montrer des difficultés de locomotion qui apparaissent vers 5 semaines d' âge en moyenne. Ces animaux mutants ont également un poids corporel inférieur aux animaux contrôles (données préliminaires de nos collaborateurs). Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants: pour la mesure de la force du corps, la souris reste accrochée sur une grille retournée pendant maximum 1 minute. Pour la mesure de la force des pattes, l'expérimentateur tire progressivement sur la queue de l'animal agrippé sur la grille du dynanomètre afin d'obtenir la force développée par la souris. Pour les tests de position des pattes et de l activité locomotrice, il n y a pas de nuisance hormis la manipulation de la souris. Ces différents tests peuvent cependant générer du stress physique chez l animal. La mesure des propriétés contractiles musculaires in situ est réalisée sous anesthésie par une injection d 'anesthésiques et d 'anti douleur , ce qui nécessite de manipuler la souris. Ce dernier test est sans réveil, à la fin de l'expérimentation les animaux sont mis à mort puis les différents muscles et organes sont prélevés pour des analyses ultérieures.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour ce qui concerne les tests de phénotypage. . La dernière expérimentation qui est "sans réveil" consiste à mesurer les propriétés contractiles musculaires in situ sous anesthésie. A l'issue de cette procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever des organes pour de futures expériences. Cela concerne l'ensemble des animaux qui serviront à caractériser la lignée soit 24 animaux. Pour l 'évaluation des symptomes des souris malades, les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car il s 'agit d' une étude pilote, sauf les femelles porteuses de la mutation qui pourront ête réutilisées pour le maintien de la lignée. Pour le suivi des animaux géniteurs, nous conserverons uniquement les femelles porteuses de la mutation et les mâles WT pour de futurs nouveaux croisements de maintien de la lignée, les autres génotypes produits ne seront pas utilisables pour ces croisements et seront donc euthanasiés.
Remplacement
Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse (myotubularine) dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Nos connaissances sur ce modèle animal mutant et de précédentes études montrent que 12 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. Seuls les animaux mâles seront étudiés soit 24 souris au total pour cette étude (caractérisation de la lignée). Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer la dommagibilité de cette lignée, à savoir 8 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles mutants et femelles porteuses de la mutation.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène MTM1, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la myopathie myutubulaire. Les symptômes de faiblesse musculaire liés à cette mutation ponctuelle apparaissent relativement tôt c'est à dire vers 5 semaines (données préliminaires de nos collaborateurs) et d’autre part, nous souhaitons suivre l 'évolution de cette myopathie. Les souris mâles seront utilisées lors des tests de comportement afin d'évaluer la progression des symptômes (entre 4 et 8 semaines d âge). Ces mesures ne peuvent pas ête réalisées sur d 'autres espèces évolutivement plus éloignées de l Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.
Système Nerveux Central- Tests sur les maladies neurodégénératives
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 860
1 276 souris et rats vont être utilisés dans des procédures pouvant atteindre un niveau de souffrance sévère, la plupart tués à l'issue et 120 rats réutilisés pour d'autres études. Des substances neurotoxiques leur sont injectées ou données dans l'alimentation pour provoquer une mort neuronale et des symptômes de maladie de Parkinson, Huntington, Alzheimer, sclérose en plaques ou AVC, suivies de chirurgies dans le cerveau et de tests comportementaux moteurs et mnésiques. Le porteur indique que ces modèles provoquent tremblements, déficits moteurs et parfois agressivité, et teste des substances censées améliorer les symptômes. Il reconnaît l'existence de cultures de neurones et de tranches cérébrales, mais conclut à la nécessité de modèles animaux plus complexes.
Objectifs
Le projet consiste à décrire les tests réalisés pour induire des effets neurotoxiques conduisant à la mort neuronale et à des symptômes moteurs ou non-moteurs chez l'animal
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurologiques. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer ou la sclérose en plaques. Des médicaments permettent de limiter les symptômes moteurs (L-Dopa) dans le cas de la maladie de Parkinson ou les troubles de la mémoire (Donepezil) dans le cas de la maladie d'Alzheimer. Les corticoïdes sont utilisés en première intention pour diminuer les poussées observées chez les patients atteints de sclérose en plaque. Les immuno-modulateurs et/ou immuno-suppresseurs permettent de limiter la fréquence des poussées. Pour les accidents vasculaires cérébraux, le caillot formé au niveau de l'artère cérébrale peut être dissout par l'administration d'Altéplase dans les premières heures suivant l'apparition des symptômes. Néanmoins, il n'existe pas de traitements neuroprotecteurs ou régénérateurs suite à un AVC. Les substances tests qui seront administrées dans le cadre de chacune de ces procédures seront étudiées soit pour leur capacité à améliorer les symptômes dans ces modèles, soit pour leur capacité à traiter la maladie.
Procédures
Les modèles de maladie de Parkinson et de Huntington sont induits par l’administration unique ou sur 5 jours (intrapéritonéale) d’une substance réactive ; chaque administration dure environ 1 à 2 secondes. Des tests comportementaux moteurs (durée max =60 minutes et entre 1 et 3 tests sur 1 à 5 jours) peuvent être réalisés avant euthanasie des animaux et prélèvement d'organes. Pour mimer la sclérose en plaque, les animaux sont nourris avec des aliments contenants la substance réactive sur une durée de 5 semaines. Des tests comportementaux moteurs peuvent être réalisés pendant ces 5 semaines (maximum de 3 tests sur 1 heure, 1 fois par semaine). A la fin des expériences, des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Certains modèles Parkinsoniens, des modèles de mort cellulaire ou d'accident vasculaire nécessitent une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Cette intervention dure entre 30 et 60 minutes. Les animaux sont ensuite évalués dans différents tests moteurs (durée maximum = 3 heures par jour, 1 à 2 séries de tests par semaine sur 4 à 5 semaines) ou non-moteurs (tests mnésiques réalisés quotidiennement pendant environ 1 h sur 4 à 5 semaines). Des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Pour chaque modèle, les animaux recevront une substance test de manière aigue ou de manière chronique au cours de l’expérience. Classiquement, les administrations par bolus durent de l’ordre de la seconde, mais des administrations par infusion peuvent durer jusqu’à plusieurs heures (1 à 2 heures) et seront dans ce cas réalisées via un cathéter implanté sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude (1 à 2 prélèvements avec au minimum une semaine d'intervalle, chaque prélèvement dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les modèles utilisés pour mimer certains aspects de la maladie de Parkinson peuvent induire des tremblements au niveau de la mâchoire ou des déficits moteurs légers à modérés. Les tremblements peuvent être également observés au niveau des membres inférieurs ou supérieurs de manière temporaire. Pour le modèle de sclérose en plaque, les déficits moteurs sont relativement légers. Dans les modèles de la maladie d'Alzheimer, les déficits attendus sont plutôt d’ordre mnésique. Dans certains modèles, les animaux peuvent être plus agressifs (ce comportement diminue dans le temps, environ 3 semaines après lésion). Le modèle d'accident vasculaire entraîne des déficits moteurs clairs (difficulté à marcher, à coordonner les mouvements). Pour tous ces modèles sur animal vivant, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées.
Devenir
Les rats ayant subi une procédure légère peuvent être réutilisés pour une nouvelle procédure. Une partie des rats ayant subi une procédure modérée peuvent être ré-utilisés pour une seconde étude (cas d'animaux lésés à la 6-OHDA par exemple). Pour les autres modèles, les animaux seront euthanasiés à la fin des expériences.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontré sur des modèles plus complexes (modèles animaux), permettant l'évaluation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux, par exemple.
Réduction
Dans ce projet, des modèles cellulaires sont utilisés pour pouvoir séléctionner les meilleurs candidats médicaments et pouvoir limiter les nombre d'animaux à tester sur des modèles plus complexes. Dans le cas des études chez l'animal vivant, les substances à tester ont déjà subi une phase de sélection afin de réduire le nombre d'animaux vivants testés.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Les rongeurs sont administrés avec une substance anti-inflammatoire le jour de la chirurgie et pendant 48 heures pour toutes les procédures incluant une chirurgie, à l'exception du modèle d'ischémie cérébrale. Une substance analgésique locale est également appliquée sur le crâne de l'animal pour limiter la douleur. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de l'oeil. Lors de la chirurgie, la surface du cerveau peut être endommagée lorsque le crâne est percé et induire une hémorragie. Si l'hémorragie ne cesse pas après l'application de tampons absorbants, l'animal sera euthanasié. Les animaux vont être pesés suite à la chirurgie pour évaluer leur récupération. Un rongeur montrant une perte de poids supérieure à 15%, le poil hérissé ou encore le manque de toilettage sera euthanasié. La chirurgie peut entrainer le gonflement de l'abdomen, lié à un ralentissement du transit intestinal/constipation. De l'huile naturelle (huile de maïs par exemple) peut être administrée pendant plusieurs jours, une à 2 fois par jour, pour limiter la douleur chez l'animal et éviter l'occlusion intestinale. Dans la plupart des modèles de neurodégénerescence, l'évaluation comportementale peut être complétée par des marquages histologique au niveau cérébral afin de raffiner le modèle. L'apparition d'effets secondaires liés à l'administration d'une substance d'essai peut être constaté ou potentialisé suite à l'administration de la substance réactive (exemple de crise épileptique spontanée induite par une substance). Les animaux seront immédiatement anesthésiés/euthanasiés pour raisons éthiques suite à l'observation de ce type de symptômes. Dans certains cas de modèles Parkinsoniens, les mouvements involontaire au niveau de la gueule de l'animal peuvent conduire à des mordillements de la patte controlatérale à la lésion et à une plaie. Cette dernière sera désinfectée avec une solution antiseptique si besoin. Les animaux peuvent perdre du poids pendant la période d'intoxication d'une substance réactive. Si la perte de poids est trop importante (supérieure à 15 %), l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Des tests de neurotoxicité ont été développés chez le rongeur et sont largement décrits dans la littérature comme méthodes prédictives pour évaluer l'efficacité de nouvelles substances pharmacologiques. Ces tests pharmacologiques sur rongeurs sont réalisés en amont des essais cliniques afin de sélectionner les candidats médicaments les plus efficaces et donc les plus prometteurs pour lutter contre les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période post-sevrage jusqu'à l'âge adulte.
Intérêt d’une thérapie matricielle pour contrer les dommages cérébraux et les déficits cognitifs induits par la radiothérapie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
220 rats sains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Leur cerveau entier est irradié, puis pendant six mois ils reçoivent chaque semaine une injection intraveineuse d'une molécule dite RGTA, avec quatre IRM et quatre batteries de tests comportementaux mesurant la fatigue, la locomotion, l'anxiété et la mémoire. Le porteur indique que l'irradiation provoque fatigue, perte de poids, sécrétions oculaires et érythèmes, qu'il présente comme transitoires. Il affirme qu'il est 'indispensable' de recourir à l'animal pour analyser ces phénomènes, en vue d'un éventuel passage chez l'humain.
Objectifs
Bien que la radiothérapie soit un traitement de référence pour traiter les tumeurs cérébrales, celle-ci peut induire des déficits cognitifs sévères qui altèrent grandement la qualité de vie des patients. L'irradiation cérébrale permet de contrôler la tumeur mais conduit également à des lésions du tissu cérébral sain qui aboutissent à un déclin cognitif, notamment des atteintes mnésiques. Actuellement,, il n’existe aucune prise en charge thérapeutique pour prévenir et/ou réparer les lésions cérébrales induites par la radiothérapie. Ainsi, ce projet vise à évaluer dans un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat adulte, l’intérêt d’une thérapie matricielle utilisant une molécule dénommée RGTA® (ReGeneraTing Agent). Les effets neuroprotecteurs et pro-cognitifs de cette molécule ont déjà été montrés dans différents modèles animaux de pathologies cérébrales. L’objectif de ce projet est double : 1/ mieux comprendre les mécanismes-clés des déficits cognitifs induits par la radiothérapie cérébrale et 2/ les limiter par une nouvelle thérapie matricielle. L’intérêt de la thérapie RGTA® pour contrer les lésions cérébrales et les déficits cognitifs induits par la RT cérébrale sera évalué dans un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat sain (non porteur de tumeurs cérébrales). Ce modèle animal a été développé au laboratoire et est bien caractérisé que ce soit en termes de décours temporel des altérations comportementales (fatigue/locomotion/cognition) ou des atteintes du tissu cérébral.
Bénéfices attendus
Cette étude préclinique doit permettre de 1/ de mieux comprendre les mécanismes responsables des troubles cognitifs observés après l'irradiation cérébrale et 2/ d’apporter des preuves expérimentales robustes pour évaluer l'intérêt du RGTA® en tant qu'agent neuroprotecteur, régénérateur et pro-cognitif dans le contexte des lésions cérébrales induites par la RT. A la fin du projet, les résultats seront accessibles sous la forme d’articles scientifiques. De plus, des biobanques de tissus cérébraux et de sang seront établies lors de ce projet et seront mises à disposition de la communauté scientifique. A long terme, une transposition à la clinique pourrait être envisagée pour atténuer le déclin cognitif des patients traités par RT et améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes procédures comme une irradiation de l’ensemble du cerveau qui durera 10 minutes. Les rats seront ensuite traités chaque semaine, pendant une durée de 6 mois, par la thérapie matricielle ou par son excipent (sérum physiologique), administrés par voie intraveineuse et durera au maximum 5 minutes par animal. Pour évaluer les effets du traitement, des IRM cérébrales d'une durée maximale de 45 minutes par animal seront réalisées et répétées 4 fois pendant l'étude. L'ensemble des animaux réaliseront également plusieurs tests comportementaux pour évaluer la fatigue, l'activité locomotrice, l'anxiété, la mémoire à court-terme et la mémoire à long-terme. Chaque animal réalisera 4 fois cette batterie de tests comportementaux (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois après irradiation cérébrale). L’ensemble des tests comportementaux seront échelonnés sur 2 semaines avec 1 seul test par jour et la durée de chaque test comportemental sera comprise entre 10 et 20 minutes.
Impact sur les animaux
A la suite de l'irradiation cérébrale, les animaux seront fatigués, présenteront une perte de poids et pourront présenter des signes de dégradation de leur état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, érythèmes cutanés sur la tête). Il est important de noter que ces effets indésirables sont transitoires et réversibles. De plus, l’ensemble de ces effets indésirables sont également retrouvés chez les patients traités par radiothérapie et le but de ce projet est d'évaluer l'intérêt du traitement RGTA® pour atténuer et réduire ces effets secondaires.
Devenir
A la fin de l'étude (6 mois après irradiation cérébrale), les animaux des différentes procédures seront mis à mort afin de mener des études post mortem sur le sang et le tissu cérébral.
Remplacement
Bien que des alternatives non-animales seront utilisées dans ce projet, il est indispensable d’avoir recours à l’expérimentation sur des animaux pour permettre une analyse intégrée des phénomènes complexes induits par l’irradiation cérébrale et d’évaluer l’intérêt de la thérapie matricielle utilisée dans ce projet. Ce projet permettra d'obtenir des preuves expérimentales suffisamment robustes pour in fine tester ce traitement chez l’Homme.
Réduction
Grâce à l'utilisation au préalable de tests statistiques appropriés et à l'utilisation de techniques d'investigation non invasives (imagerie IRM et tests comportementaux), le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une puissance des résultats sera réduit au minimum. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est estimé à 220 rats répartis en 4 groupes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en animalerie conventionnelle aux normes requises. Le personnel participant au projet est formé aux procédures en expérimentation animale. Des inspections du bien-être des animaux seront réalisées quotidiennement. De plus, toutes les mesures visant à réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux seront entreprises, notamment en appliquant une anesthésie et une analgésie appropriées. Concernant les effets indésirables liés à l’irradiation cérébrale qui peuvent affecter de façon transitoire l’état général des animaux, des mesures sont déjà mises en place dans l’équipe et connues par les personnes impliquées dans ce projet. De plus, une échelle d’évaluation de l’état général des animaux (score défini par plusieurs items visuels) a été mise en place dans l’équipe sur ce modèle animal pour surveiller finement l’état général des animaux. Enfin, des points limites spécifiques et de critères d'arrêt de souffrance seront utilisés afin de réduire toute souffrance ou douleur chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat possède un cerveau dont la taille est supérieure à la souris et qui est compatible avec les appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée ainsi qu’une imagerie IRM de haute résolution. D’autre part, plusieurs tests comportementaux visant à évaluer les déficits moteurs et cognitifs sont bien décrits chez le rat. Enfin, le modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat utilisé dans ce projet a été developpé par le laboratoire de recherche qui l'a d'ailleurs déjà très bien caractérisé en termes de dommages cérébraux et de modifications comportementales jusqu’à 6 mois après irradiation encéphalique. Ainsi, le laboratoire de recherche maîtise très bien ce modèle animal que ce soit dans le décours temporel de sa physiopathologie mais aussi en termes de prise en charge du bien-être animal. Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 5 mois (poids d’environ 350 g) lors de leur arrivée à l’animalerie. L’irradiation cérébrale sera réalisée sur des animaux âgés de 6 mois mais les rats arriveront à l’animalerie 1 mois avant afin de les acclimater dans leur nouvel environnement, de les habituer aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux. L’âge de 6 mois a été retenu puisqu’il correspond à l’âge adulte mature chez le rat et est équivalent à l’âge de 18 ans chez l’Homme. A ce stade de développement chez le rat, la substance blanche est complètement mature, ce qui représente un critère très important pour modéliser les atteintes cérébrales observées chez le patient adulte traité par radiothérapie.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements dans des modèles de dégénérescence de la rétine chez la souris ou le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 396
1 452 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection d'iodate de sodium détruit leur rétine pour reproduire une dégénérescence comme la DMLA, puis des molécules candidates leur sont administrées par diverses voies, avec des tests comportementaux mesurant la baisse d'acuité visuelle, avant prélèvement des yeux. Le porteur mène ce criblage pour développer des médicaments et renvoie l'usage chez l'humain à une éventualité. Il qualifie le recours à l'animal de 'stricte nécessité' et d''indispensable', affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit un 'organisme entier'.
Objectifs
Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie in vitro et/ou in vivo, de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de maladies ophtalmologiques avec la mise en place d’un modèle animal de dégénérescence de la rétine chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la baisse d’acuité visuelle et la dégénérescence rétinienne.
Bénéfices attendus
Ce projet se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de molécules thérapeutiques pouvant avoir un effet sur la dégénérescence de la rétine comme observée dans la DMLA ou la maladie de Stargardt. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de nouvelles molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.
Procédures
tous les animaux subiront une injection systémique de sodium iodate (sauf le groupe 1, sérum physiologique) pour induire la pathologie. l'injection sera unique et se fera par voie intra-péritonéale sur animal vigile. les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 1 mois après l'induction du modèle). selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale ou par voie topique, sur animal vigile. tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Des tests comportementaux pour mesurer l’acuité visuelle seront également réalisés : une fois avant le début des traitements mais après l’injection de sodium iodate afin de confirmer l’induction du modèle et/ou de procéder à l’allocation des groupes (durant la 1ère semaine), puis jusqu’à 1 fois par semaine pendant 4 semaines après l’injection de sodium iodate soit 4 fois maximum pour la durée d’une étude (voir figure en annexe). Le premier type de test dure 5 minutes maximum et chaque animal est testé jusqu’à 10 fois avec un intervalle de 5-10 minutes entre chaque test. Le deuxième type de test dure environ 5 secondes et le test est répété trois fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque répétition.
Impact sur les animaux
Du fait de l'induction du modèle, les animaux vont avoir une diminution de l'acuité visuelle (visible par les tests comportementaux mis en place) qui est liée à une dégénérescence de la rétine sans autre effet indésirable attendu aux doses administrées. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) ni aux tests comportementaux (procédure légère pour tester l’acuité visuelle).
Devenir
euthanasie pour récupérer différents organes, dont les yeux, pour analyses histologiques ou autre
Remplacement
Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ces modèles in vivo permettent de mesurer l’acuité visuelle en reproduisant la physiologie d’un organisme entier. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 6 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (kruskal-wallis test).
Raffinement
Les animaux seront sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement: les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Si les signes persistent au bout de 24h, l’animal sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié.
Choix des espèces
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir en ophtalmologie implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers notre modèle reproduisent au mieux la pathophysiologie de la dégénérescence de la rétine humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’acuité visuelle ou l’histologie de l’oeil, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.
Induction de la satiété par électrostimulation du système sympathique chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
511 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue. Une partie est opérée puis tuée sans réveil, l'autre subit une chirurgie de moins d'une heure trente puis dix-huit séances d'une heure de mesure de la prise alimentaire après un jeûne nocturne, dont neuf avec électrostimulation de nerfs, dans des procédures pouvant atteindre un niveau de souffrance sévère. Le projet vise à mettre au point un dispositif implantable contre l'obésité. Le porteur indique que la chirurgie provoque probablement douleur et perte de poids pendant deux à trois jours et que les impulsions électriques peuvent causer un inconfort, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut remplacer l'animal, l'obésité devant être étudiée sur un 'organisme vivant'.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de développer un traitement par implantation d'un dispositif médical contre l’obésité qui consiste à électrostimuler des nerfs. Il a été démontré que les signaux acheminés par le système nerveux jouent un rôle important dans la prise alimentaire. Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité. En effet, les traitements les plus efficaces sont les approches chirurgicales lourdes comme la réduction de l’estomac, la technique du court-circuit des aliments (by-pass) ou encore la pose d’un anneau gastrique, visent à limiter le volume de l’estomac pour réduire les prises alimentaires. Cependant, ces traitements sont très invasifs et entraînent de nombreux effets indésirables (troubles digestifs, vomissement…) chez l’humain. Le développement d’un dispositif médical permettant par électrostimulation du système nerveux la régulation de la prise alimentaire pourrait être un outil très prometteur afin de lutter contre l’obésité. Pour cela nous allons tester l'électrostimulation de nerfs chez la rat en lien avec la satiété. Notre premier objectif sera donc de mettre en place le modèle expérimental sur animal anesthésié. Notre second objectif sera de déterminer les paramètres électriques les plus efficaces pour induire la satiété sur animal anesthésié. Et notre dernier objectif sera de tester ces paramètres sur un animal conscient et d'évaluer l'impact potentiel sur la prise alimentaire.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité. Les traitements les plus efficaces sont des traitements lourds (chirurgie bariatrique), engendrant de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements moins invasifs, plus efficaces et sans effet secondaire peuvent apporter des solutions plus satisfaisantes pour les patients souffrant d’obésité.
Procédures
Pour les procédures 1 et 2 : les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale (avec au préalable une mise à jeun). Les animaux ne seront pas réveillés et seront mis à mort à la fin de la procédure. Pour la procédure 3 : les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins d'une heure 30. Une semaine après la chirurgie, les animaux subiront 18 sessions d'une heure de quantification de prise alimentaire après un jeun nocture dont 9 avec électrostimulation des ganglions rachidiens et 9 sessions contrôles (sans électrostimulation). Chacunes des sessions sera séparée d'au moins un jour de récupération.
Impact sur les animaux
Deux des trois procédures de ce projet sont sans réveil, les nuisances seront donc inexistantes pour ces deux procédures sous réserve du respect des bonnes pratiques d'anesthésie. La dernière procédures sera réalisée sur des animaux ayant subi une chirurgie ce qui générera probablement une perte de poids et de la douleur pendant les 2 à 3 premiers jours chez les animaux suivant la chirurgie. Enfin, concernant cette troisième procédure, les impulsions électriques pourraient également induire un inconfort transitoire chez l'animal.
Devenir
Pour les procédures 1 et 2, il n’est pas envisagé de réveiller les animaux. Ils seront tous mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale pour des analyses histologique. Pour la procédure 3, tous les animaux seront également mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale pour une analyse anatomopathologique et histologique.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions posées dans ce projet. Le phénomène d’obésité ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et doit donc être étudié chez l’animal en intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un prérequis à la phase de développement clinique.
Réduction
Le nombre de rat a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables grâce à l’utilisation de tests statistiques.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (tubes en carton pour se cacher, briques de bois à grignoter). Une période d’acclimatation de 7 jours minimum, pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisée. Les chirurgies seront réalisées par du personnel ayant les compétences requises et les animaux seront sous anesthésie et analgésie, ce qui évitera toutes souffrances. Enfin, la mise à mort sera réalisée par surdosage de pentobarbital chez l'animal anesthésié. Des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux conscients et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés selon la fiche annexée à ce projet. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du responsable de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce rat (et plus précisement la souche Sprague–Dawley) sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux sympathique dans la prise alimentaire sur ce modèle. Des animaux adultes de 8 semaines d’âge seront utilisés.
Utilisation du modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris ou le rat pour l’évaluation de nouvelles molécules à utiliser à des fins préventives lors des transplantations rénales
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 1840
3 680 animaux non-humains, 1 840 souris et 1 840 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés à tester puis subissent une chirurgie de clampage de l'artère rénale d'environ 45 minutes, avec un risque d'hémorragie et une atteinte de la fonction rénale. La mise à mort permet d'analyser les organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité du syndrome d'ischémie-reperfusion et conclut à la nécessité d'expériences in vivo.
Objectifs
La transplantation d’organe est un traitement de choix de certaines maladies chroniques arrivées à un stade ultime ; elle concerne surtout les organes vitaux abdominaux ou thoraciques et notamment les reins. Le syndrome d'ischémie reperfusion (IR) est un phénomène incontournable en transplantation rénale. L’ischémie correspond à la phase où l’organe du donneur est isolé de la circulation sanguine et subit un défaut d’apport en nutriments et en oxygène, c’est-à-dire depuis le prélèvement chez le donneur jusqu’à la reprise du flux sanguin dans l’organe chez le receveur. La reperfusion de l’organe chez le receveur se traduit par une reprise de la circulation sanguine en lien avec le retour de l’apport en nutriments et en oxygène. Cette reperfusion est brutale ce qui génère énormément d’inflammation au niveau du greffon. À court terme, les conséquences délétères du syndrome d'IR se traduisent principalement par une reprise différée de la fonction rénale mais à plus long terme, on peut observer l’apparition d’une fibrose rénale voir la mort du greffon. Chez l'homme, la prévention du syndrome d'IR fait l'objet de recherches cliniques à travers le conditionnement du donneur, les molécules additives aux solutions de conservation, les modalités de perfusion du greffon rénal ou encore les molécules administrées chez le receveur. Les progrès engendrés par les traitements immunosuppresseurs expliquent, qu’aujourd’hui, l’IR est une cible thérapeutique majeure. Les modèles précliniques, en particulier murins, ont permis de nombreuses avancées dans la compréhension physiopathologique du phénomène d'IR. L’IR provoque des nécroses tissulaires dans le rein qui activent le système immunitaire en libérant des protéines importantes qui participent au processus inflammatoire et engendrent les lésions. Ces protéines peuvent être utilisées comme cibles pour neutraliser la cascade inflammatoire et par conséquent améliorer la reprise de fonction immédiate du rein. Cette stratégie pourrait se révéler bénéfique, sur le long terme, sur la survie des greffons qui représente un enjeu majeur en transplantation. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés issus de notre recherche dans un modèle d’IR chez la souris ou le rat afin de prévenir et de traiter le syndrome d’IR chez l’homme. Ces composés ayant par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur des cellules rénales humaines de patients.
Bénéfices attendus
Les traitements existants sont des cocktails d’immunosuppresseurs avec le risque de nombreux effets secondaires. L’identification d’un ou plusieurs candidat (s) médicament (s) agissant plus spécifiquement au niveau du greffon augmentera l’efficacité du traitement et permettra de diminuer les effets secondaires.
Procédures
1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 6 jours sous un volume de 5 à 10ml/kg en fonction de la voie d’administration 2/ Injection sous-cutanée d’un analgésiant 2 fois le jour de la chirurgie 3/ Chirurgie sous anesthésie gazeuse pendant environ 45 minutes, une fois dans l’étude 4/ Anesthésie gazeuse pour prélèvement sanguin, urinaire et mise à mort, une fois dans l’étude
Impact sur les animaux
Pendant la chirurgie sous anesthésie générale, il y a un risque d’hémorragie lié aux gestes chirurgicaux lors du clampage en lésant l’artère rénale. À la suite de la chirurgie, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une atteinte partielle de la fonction rénale, une mobilité réduite, ainsi qu’une perte de poids n’excédant pas 10% dans les 24 à 48h post-chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.
Remplacement
A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement de la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans le syndrome ischémique. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments.
Réduction
Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à l’heure arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Après la chirurgie, un enrichissement plus doux (igloo en carton) sera utilisé afin d’éviter tout accroc avec la cicatrice. La litière sera également remplacée par une litière plus douce et plus absorbante en fibre de cellulose pour éviter tout irritation de la cicatrice. Afin de palier l'inconfort lié aux procédures et obligatoirement lors des gestes de chirurgie, un programme d'anesthésie sera effectué par inhalation d’isoflurane (induction 3 à 5%, maintien 1 à 3%). Pour prévenir de la douleur, de la buprénorphine à 0.1 mg/kg en sous cutanée sera administrée 30 minutes avant et 4 heures après la chirurgie suivi d’un apport dans l’eau de boisson à 0.01 mg/ml pendant 48 heures. Pendant la chirurgie les animaux seront placés sur un tapis chauffant, une sonde rectale sera placée afin de mesurer leur température corporelle, le tapis régulera alors sa température pour maintenir le corps à 37°C. Pendant la phase de réveil, les animaux seront placés sur un tapis chauffant (37°C). Afin de faciliter la prise de nourriture, quelques croquettes humidifiées seront placées directement dans la cage. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques à ce modèle ont été établi conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal. Lors de la mise a mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane (induction et maintien de 3-5%).
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Le modèle utilisé sera mis au point, sur la base de la littérature existante. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.
Essai d’une thérapie cellulaire chez le rat avec des précurseurs de photorécepteurs édités génétiquement
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
295 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent sous anesthésie une injection sous-rétinienne de photorécepteurs issus de cellules souches humaines, puis des examens d'imagerie, des électrorétinogrammes et des tests comportementaux de la vision. La mise à mort permet des analyses de la rétine. Le porteur affirme que l'évaluation d'une récupération visuelle ne peut se faire qu'in vivo et décrit une piste thérapeutique pour des cécités aujourd'hui irréversibles.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’un canal ionique. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines, appelées cellules iPS. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une perte visuelle provoquée par une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules modifiées après transplantation. L’utilisation de cellules rendus artificiellement sensible à la lumière vise à contourner les difficultés rencontrées par différents groupes, et rapportées dans différentes études, d’obtenir une restauration fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire humaine de ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont obtenu un certain succès en termes de survie et d’intégration dans le tissus-hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d’édition du génome qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante. Les bénéfices attendus sont donc une restauration au moins partielle de la vue chez les animaux modèles aveugles. Ces résultats pourraient permettre à terme de proposer à des patients souffrant de cécité irréversible une thérapie visant à rendre au moins partiellement la vue ; les seuls traitement disponibles à l’heure actuelle permettent au mieux un ralentissement de la perte visuelle avant la cécité complète.
Procédures
Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection intraoculaire (sous la rétine) de cellules en suspension (2 groupes pour deux types de cellules différentes), ou de solution tampon (1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisé une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.
Devenir
A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (survie cellulaire ; différenciation et intégration aux tissus de l’hôte ; réponse à la lumière des cellules transplantées ; reconnexion avec les autres types cellulaire ).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 295 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30% (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.
Raffinement
Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec éléments d’enrichissement pour toute la durée du protocole ; nourriture et abreuvement à volonté. Les procédures prévoient une surveillance de leur état physique général (et particulièrement du système oculaire). Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue pour certains examens (imagerie, ERG) les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant ces différents actes. Le geste chirurgical, qui peut générer une nuisance ou une douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique puis un anti-inflammatoire non stéroïdien à durée d’action longue. Les signes de comportement anormal, signe de possible souffrance, seront également surveillés. Les points limites adaptés sont définis de manière adaptée aux procédures mises en œuvres et inclus une surveillance de l’état physique et comportemental de l’animal. L’observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal selon les méthodes adaptées et réglementaires.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.
Evaluation de l’efficacité de composés antiviraux sur un modèle in vivo de souris infectées par du virus de la vaccine
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par le virus de la vaccine par voie intranasale, dont une partie pour établir la dose létale, puis traitées par des injections deux fois par jour, avec perte de poids, détresse respiratoire et léthargie possibles. La mise à mort est justifiée par des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne rend compte d'une infection multiviscérale et présente le projet comme une préparation contre une réémergence de la variole.
Objectifs
L'objectif du projet est d'établir la preuve d'efficacité thérapeutique in vivo de molécules ciblant de nombreux virus et notamment les « Poxvirus ». Les Poxvirus sont des virus qui infectent les hommes et les animaux et sont responsables dans l’histoire d’épidémies très graves comme le virus de la variole ayant un taux de mortalité aux alentours des 30%. Bien qu’éradiqué, le virus est maintenu dans deux centres de recherche (aux Etats-Unis et en Russie) et une reconstruction du virus par génie génétique est possible. Une réapparition accidentelle ou une réintroduction volontaire du virus pourrait engendrer une pandémie avec un taux de mortalité estimé de 15 à 90%. D'autres poxvirus circulent, comme le monkeypox et le camelpox, et sont préoccupants. Il n'existe à l'heure actuelle qu'une seule molécule anti-poxvirus approuvée, mais les poxvirus développent rapidement des résistances contre celle-ci. Il est donc nécessaire de disposer de plusieurs antiviraux efficaces. Nous avons développé des molécules capables de bloquer la formation du virus et ainsi bloquer sa dissémination dans l'organisme. Les performances in vitro des molécules et les résultats préliminaires obtenus nous confortent et apportent un rationnel suffisant pour la poursuite des développements.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'établir l'efficacité de molécules d’intérêt contre une infection par un poxvirus. Ces résultats ouvriront la voie à une création de société pour assurer le développement pharmaceutique de ces molécules. Ce développement impliquera le test chez une seconde espèce animale, la poursuite des développements notamment une optimisation de la formulation et des études toxicologiques. En cas de succès, à plus long terme, le bénéfice final sera de pouvoir proposer des molécules thérapeutiques antivariolique et anti-poxvirus pour le traitement des émergences virales et assurer des stocks nationaux de préparation contre une réémergence de la variole d'origine accidentelle ou provoquée. Comme le montre la crise COVID, la vaccination d'une population importante est très complexe, longue, et requiert d'avoir en parallèle à disposition des médicaments antiviraux pour faire face aux premières phases de l’épidémie.
Procédures
Procédure 1a : détermination de la DL90 (dose létale 90%) du poxvirus ; les animaux seront anesthésiés une fois par injection intrapéritonéale puis infectés une fois par instillation intranasale. Procédure 1b : évaluation de l'innocuité du traitement sur 10 jours ; les animaux recevront 2 fois par jour pendant maximum 10 jours une injection au niveau du flanc d’une des molécules à différentes doses. Procédure 2a : évaluation de l'efficacité anti VACV-WR de la molécule ; les animaux seront anesthésiés une fois par injection intrapéritonéale puis infectés une fois par instillation intranasale et recevront 2 fois par jour pendant maximum 12 jours une injection des molécules au niveau du flanc. Un suivi précis des animaux sera alors réalisé. Les animaux en fin de procédure seront mis à mort après sédation préalable . Procédure 2b : Analyse des titres viraux dans les poumons à J+4 post-infection ; les animaux seront anesthésiés une fois puis infectés une fois par instillation intranasale. Les animaux recevront 2 fois par jour pendant maximum 6 jours une injection de la molécule au niveau du flanc. Les animaux en fin de procédure seront mis à mort après sédation préalable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables suivants peuvent être observés jusqu'à atteinte des points limites préalablement définis : perte de poids rapide ou progressive de 20 %, difficultés respiratoires, réduction de la mobilité, nécrose tissulaire au point d’injection, léthargie.
Devenir
Expérience 1a : Les souris n'ayant pas été mis à mort au cours de la détermination de la DL90 du virus de la vaccine le seront à la fin de la procédure pour des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Expérience 1b : Les souris utilisées pour l'évaluation de l'innocuité du traitement sur 10 jours seront mis à mort à la fin de la procédure pour des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Expérience 2a : Les souris n'ayant pas été euthanasiées au cours de l'essai d'efficacité antivirale de la molécule seront mis à mort à la fin de la procédure pour des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Expérience 2b : Les souris utilisées pour l'analyse des titres viraux à J+4 post-infection dans les poumons seront mis à mort pour dissection.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’évaluer les effets bénéfiques d’une molécule luttant contre une infection avec du virus de la vaccine. Les méthodes in vitro et ex vivo ne rendent pas compte de la complexité d'une infection multiviscérale.
Réduction
Nous avons calculé le nombre d’animaux de façon à obtenir des données statistiquement fiables avec le moins d’animaux possible. Seule la molécule la plus efficace in vitro est testée in vivo, et avec le minimum de conditions de concentrations et de plannings de traitement nécessaires au retour scientifique permettant d'évaluer le potentiel antiviral de la molécule testée. Le nombre d’animaux par groupe est suffisant pour mettre en évidence des différences de survie par la méthode de Kaplan-Meier et de charge virale par le test de Mann-Whitney.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux sur litière et avec un enrichissement (abri et matériel de nidification) afin de réduire le stress. Les souris sont hébergées en groupes avec un enrichissement du milieu (maison en carton, coton). Les procédures d’instillation du virus sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l'anesthésie les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les animaux sont quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance persistante l’expérience sera stoppée.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle d'étude pour évaluer l'efficacité de molécules antivirales contre le virus de la vaccine, avec notamment une réplication importante du virus dans les voies respiratoires. La littérature sur ce modèle est suffisamment riche pour permettre une comparaison de l’efficacité de la molécule. Souris Balb/c âgées de 4 à 6 semaines : il s’agit de la souche la plus utilisée pour les infections par du virus de la vaccine et l’âge est bien adapté car les souris âgées de 4 à 6 semaines ont déjà un système immunitaire fonctionnel.
Ciblage par vectorisation d’agents thérapeutiques dans le domaine de l’oncologie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sous la peau puis des injections intraveineuses de molécules-vecteurs, la mise à mort se faisant par dislocation cervicale pour collecter sang et organes. Le porteur cite comme effets possibles des chocs anaphylactiques et des détresses cardio-respiratoires. Il affirme qu'aucune alternative ne donne accès aux fonctions physiologiques des mammifères et conclut que le développement de ces vecteurs ne peut se faire qu'in vivo.
Objectifs
Le cancer est encore aujourd’hui une des causes majeures de mortalité dans le monde et pour lequel les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, avec certains cancers nécessitant de nouvelles approches thérapeutiques. Ainsi, les cancers du pancréas, les cancers des poumons et de la prostate (ainsi que leurs métastastases) sont des exemples d’enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer les perspectives thérapeutiques. Ce projet innovant a pour objectif d’évaluer si des molécules conjugués à des vecteurs (V-molécule) ciblants les récepteurs aux lipoprotéines LDL (LDLR) ou à la Transferine (TfR) permettent d’observer un effet clinique (thérapeutique, de distribution, d'extinction de gènes...) sur des modèles de tumeurs humaines implantées sur le modèle de souris. L’objectif principal de ce projet sera donc de développer, tester et optimiser nos molécules-vecteurs (V-molécule) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques au niveau des tumeurs. Par ces approches systémiques nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments. Les statines sont le traitement de référence pour soigner l’excès de cholestérol, ou plus exactement le LDL-cholestérol (lipoprotéine de faible densité), il s’agit d’un des médicaments les plus couramment utilisés dans le monde. Cette inhibition stimule secondairement l’expression des récepteurs aux LDL, permettant leur entrée dans la cellule cible. Il est fort probable que certains patients traités pour des cancers prennent des traitements à base de statine. Il est donc très important d’étudier l’effet de la prise de statine dans nos modèles tumoraux afin de voir leur effet sur l’expression du récepteur au LDL dans les tumeurs et autres tissus.
Bénéfices attendus
En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos V-molécules et les faibles quantités administrées, ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules Vecteurs (V-molécules) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Les implantations des cellules tumorales se font en sous-cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié (anesthésie gazeuse isoflurane). Cet acte chirurgical sera effectué une seule fois par souris et cela prend environ 1 minute. Les injections des "V-molécules" : les souris recevront une injection IV (veine caudale) de V-molécule et de molécule controle. Les animaux sont endormis pour injecter les molécules en solution isotonique stérile. Il y a l'injection d'une molécule par animal et cela prend environ 2 min.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous proposons d’étudier la biodistribution de nos V-molécules sur des temps d’incubation relativement courts. Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous cutanées, les injections en IV des composés V-molécules, ainsi que le développement de la tumeur chez l’animal en tant que pathologie. Les composés pharmacologiques peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des modifications et des troubles comportementaux.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de collecter le sang et les organes qui seront utilisés pour faire des analyses complémentaires.
Remplacement
Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos V-molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des conjugués développés. L'utilisation de rongeurs impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur des groupes de n=15 (V-molecule et molecule controle), à raison de 120 souris par an, réparties sur 4 études de 30 individus, sera suffisant pour appréhender un effet de nos molécules sur la croissance tumorale. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédure nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique (réduction, règle des 3Rs) a été défini en déterminant: -le test statistique : T-test (2 groupes), -l'effet biologique et la dispersion escomptées, cette estimation a été faite d'après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société, -le risque alpha.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont déplacées dans une pièce cyclée, insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale + chirurgie) réalisera les implantations sous-cutanées de cellules tumorales. Une observation quotidienne des animaux (poids, douleurs, souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs et des antalgiques sont prévus en cas de nécessité. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie (anesthésie gazeuse isoflurane) ou au cours du developpement tumoral constituera le point limite de l'expérience. Un enrichissement materiel (twists, cocon ou nid) de l'environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu'ils expriment un répertoire diversifié de comportements normaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs d'un seul fournisseur extérieur.
Choix des espèces
- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (NU(NCr)-Foxn1nu ) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides en sous-cutanée (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection de la V-molécule) en fonction de la taille des tumeurs.
Approche therapeutique pour la maladie de Huntington : validation d’un candidat médicament
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
636 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un candidat médicament contre la maladie de Huntington par mini-tablettes ou, en cas d'échec, par pompes osmotiques posées chirurgicalement jusqu'à quatre fois en six mois, et subissent des tests comportementaux dont le test d'alimentation supprimée par la nouveauté et l'actimétrie. La mise à mort sert à prélever les tissus cérébraux. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne mime les modèles comportementaux ni la complexité d'un "organisme entier".
Objectifs
A la suite d’une étude sur un système cellulaire permettant l’analyse du trafic intracellulaire des neurones, nous avons mis en évidence qu’une drogue était capable de restaurer la dynamique intracellulaire déficiente dans la maladie de Huntington. Nous avons ensuite démontré, avec des premiers résultats preuve de concept, l’intérêt thérapeutique de cette molécule dans un modèle souris de la maladie. L’objectif de ce projet est maintenant de 1/ caractériser l'efficacité de cette molécule et son mécanisme d’action moléculaire et 2/ définir les bénéfices d’un traitement long terme chez des animaux à des stades d’avancement de la maladie variables, reflétant la situation chez les patients et permettant de définir le meilleur schéma de traitement à envisager dans de futures études cliniques.
Bénéfices attendus
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de symptômes moteurs, cognitifs et psychiques conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires puis inexorablement à leur décès. La maladie est causée par une mutation hétérozygote du gène de la huntingtine, elle-même à l’origine d’un défaut de transport du facteur neurotrophique dérivé du cerveau, un facteur de survie neuronal essentiel. Le projet présenté a pour objectif de confirmer l’intérêt thérapeutique du candidat médicament identifié par des approches ex vivo comme restaurant le transport neuronal. Très concrètement, les résultats du projet permettront de 1/ valider que l’administration du médicament par voie orale à un intérêt thérapeutique comparable à la voie sous cutanée en continu 2/ évaluer si le traitement peut empêcher l’apparition des symptômes (stade présymptomatique), les ralentir (stade symptomatique) ou encore les faire reculer (stade avancé). Ces résultats permettront le développement clinique de la première molécule administrable par voie orale ciblant les causes de la maladie de Huntington avec pour objectif de répondre à une forte attente des patients et de combler un besoin médical non pourvu.
Procédures
2 actes expérimentaux impliqueront d’éventuelles nuisances mineures à l'animal: 1/ Lors de notre étude de l'efficacité d'un traitement long terme sur les animaux modèles de la maladie de Huntington, le traitement sera réalisé de préférence oralement au moyen de mini-tablettes appétentes ingérables par les souris dans un temps restreint. Or, dans le cas d’un échec du traitement oral, il pourra être envisagé que le traitement des animaux soit réalisé par voie sous-cutanée, via la pose de mini-pompes osmotiques. Dans ce cas, les animaux seront opérés sous anesthésie générale (procédure courte de 15-20 minutes par animal) avec un changement de pompe au bout de 6 semaines permettant un traitement long terme et nécessitant une nouvelle procédure chirurgicale dans la limite de 4 opérations sur 6 mois. Cette procédure est toutefois largement décrite et maitrisée dans la littérature. 2/ Au cours de cette même procédure, les animaux seront évalués par des tests comportementaux permettant d’évaluer leur capacités locomotrices et cognitives. Ces tests sont non invasifs et seuls deux sont considérés comme générant un stress de classe légère : le test d'alimentation supprimée par la nouveauté, requérant une mise jeun de 24h et l’actimétrie requérant un isolement des souris pendant 48h.
Impact sur les animaux
Nous pouvons identifier 3 nuisances potentiellement attendues sur les animaux : 1/ induction d'une légère inflammation dûe à la mise en place d'une minipompe osmotique dans l'espace intrascapulaire. Cette inflammation sera soulagée par une injection d'anti inflammatoire non stéroïdien; 2/ induction d'un stress léger lors du traitement oral : isolement des souris pendant le traitement, pour limiter ce stress les souris seront de moins en moins longtemps soumises à cet isolement selon leurs performances et ne seront pas isolées plus de 4h pendant la période d'habituation; 3/ induction d’un stress léger lors des tests de comportements impliquant une mise à jeun (test d'alimentation supprimée par la nouveauté) ou un isolement prolongé de 48h (actimétrie) : pour limiter ce stress et éviter qu’il n’impacte le reste des expérimentations, les tests comportementaux n’auront lieux qu’une fois tous les 3 mois et le test d'alimentation ne sera réalisé qu’une seule fois, en toute fin de procédure.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études immunohistochimiques et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes du traitement.
Remplacement
Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet thérapeutique du candidat médicament pour traiter les symptômes de la maladie de Huntington et d’évaluer son mécanisme d’action dans le cerveau. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de mimer les modèles comportementaux et de reproduire la complexité d’un organisme vivant.
Réduction
Pour notre première procédure, afin de caractériser le candidat médicament, nous utilisons le minimum d'animaux nécessaire pour assurer des analyses quantifiables et reproductibles (6 animaux par groupe d'étude). Cet effectif est le minimum à partir duquel des analyses statistiques peuvent être réalisées. Dans le cas de l'étude de l'efficacité du traitement par voie orale, puisque nous avons observé que le comportement de souris pouvaient varier en fonction du sexe dans ce modèle de la maladie de Huntington, nous incluront systématiquement des mâles et des femelles dans tous les groupes afin de pallier les potentiels disparités dans les résultats. Le nombre de 20 animaux par condition (10 mâles et 10 femelles) a été déterminé à l’aide d’un test statistique et des études préliminaires afin de réduire également au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. De plus, nous analyserons également l'ensemble de ces animaux qui effectueront les tests de comportement au niveau cérébral en fin de procédure.
Raffinement
L'ensemble des procédures vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le bien-être animal. Les souris seront habituées en amont à l'expérimentateur et à la manipulation et seront pesées régulièrement une fois par mois pour s'assurer d'une évolution pondérale correcte. Les souris seront quotidiennement observées et tout comportement anormal signe de mal être (poils, prostration) sera monitoré afin de prendre en charge la douleur. Pour exemple, une perte de poids de plus de 20% ou des signes indicatifs de douleur ou stress tels que la prostration, le renfoncement des yeux ou l’arrêt du toilettage entraîneront l'administration d'un supplément d'alimentation hypercalorique et hydratée fournie par l'animalerie ou d'un analgésique (carprofène). Des points limites suffisamment précoces et adaptés aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la huntingtine. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier.
Evaluation de l’efficacite et de la persistance des cellules T genetiquement modifiees dans des modeles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
705 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des cellules T génétiquement modifiées puis onze prélèvements sanguins hebdomadaires, le porteur décrivant une inflammation sévère avec perte de poids, pilo-érection et prostration. L'objectif est d'obtenir des données précliniques d'efficacité et d'absence de toxicité avant les premiers tests chez l'humain. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit in vitro la complexité des échanges entre les cellules impliquées dans la dissémination tumorale et le système immunitaire.
Objectifs
Les objectifs du projet sont : 1) vérifier l'impact des modification génétiques sur la persistance des cellules de l'immunité, c'est à dire à leur capacité à perdurer longtemps sans mourir dans un environnement complexe. 2) évaluer l'efficacité des cellules immunitaires génétiquement modifiées dans des modèles d'oncologie par bioluminescence
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont: 1)obtenir des données précliniques d'efficacité thérapeutique du produit. 2) obtenir des données sécurité/ d'abscence de toxicité du produit thérapeutique avant les premiers tests chez l'humain
Procédures
Nous prélèverons 100uL de sang toutes les semaines jusqu'à semaine 12 à partir de J3 après injection des cellules soit au total 11 prélèvements. Chaque prélèvement sanguin prend environ 2 minutes/souris maximum. La douleur des animaux pourra être atténuée par une injection de buprénorphine. L'injection des cellules prend entre 10 et 30 secondes par souris selon la voie d'injection, une seule injection par animal.
Impact sur les animaux
Développement d'une inflammation sévère associées à une perte de poids,une pilo-érection et une prostration de l'animal (dos vouté).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure
Remplacement
L’emploi des modèles animaux est nécessaire au projet car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives permettant de reproduire in vitro la complexité physiologique des échanges entre les nombreux types cellulaires responsables de la dissémination tumorale et de l'impact du système immunitaire sur celle-ci.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisé, chaque groupe contiendra le nombre minimum indispensable à l'obtention de résultats statistiquement pertinents. Nous prévoyons 3 expériences mais si les 2 premières expériences donnent le même résultat, la 3eme sera annulée pour réduire le nombre de souris utilisé. L'injection de cellules qui peuvent être analysées par la bioluminescence, facilitant ainsi leur suivi dans le temps sans avoir à mettre à mort un groupe d'animaux à un temps précis sera utilisée pour réduire le nombre d'animaux pour chaque expérience.
Raffinement
Dans une approche éthique, nous prévoyons de limiter au maximum le nombre d'animaux avec des scores cliniques sévères et mettre en place des points limites adaptés. Pour les actes de prélèvement invasifs comme les prélèvements sanguins, nous utiliserons un anesthésique local pour limiter la douleur. Nous utiliserons également une litière adaptée (douce, non-poussiéreuse) qui favorise l'expression des comportements normaux de la souris (enfouissement, nidification...). Un apport de gel hydrique dans la cage sera réalisé pour faciliter l'accès des animaux à une source hydrique.
Choix des espèces
Nous avons développé des méthodes permettant de modifier génétiquement les cellules humaines du système immunitaire . Afin de pouvoir estimer l'efficacité, l'abscence de toxicité provoquée par ces cellules sur l'organisme de l'animal et la persistance de ces cellules humaines, nous devons utiliser un modèle murin le plus relevant possible. Seules les souris immunodéficientes NSG ou NXG permettent la prise de greffe de cellules humaines et donc l'analyse de la biologie des cellules humaines in vivo. Souris adultes de 8 à 12 semaines pour leur poids relativement stable en fin de croissance, pour la facilité de manipulation, de prélèvement et d'analyses d'échantillons, d'évaluation physique (bien-être)
Efficacité d’un nouvel antibiotique contre Mycobactérium avium
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Toutes mises à mort à la fin de leur traitement pour la mise en culture de leurs poumons, 210 souris BALB/c vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou sévère. Infectées pendant deux heures par un aérosol de Mycobacterium avium, elles reçoivent ensuite des antibiotiques par gavage à la seringue ou par injection dans le ventre, cinq jours par semaine, pendant un à quatre mois. Le porteur liste parmi les effets attendus des gavages saignements, inhalation et décès, surtout lorsqu'ils sont pratiqués par des novices, qui s'exercent d'abord sur une souris factice. Il qualifie l'infection d'"indolore", sans décrire ce que la maladie fait endurer aux souris ni dire quelles procédures relèvent du niveau sévère.
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer l'efficacité d'un nouvel antibiotique, contre les infections respiratoires à Mycobacterium avium, une bactérie particulièrement difficile à traiter. Les objectifs secondaires sont de déterminer les meilleures combinaisons de traitements avec cet antibiotiques et de décrire la réaction des tissus de l'organisme sous ce(s) traitement(s).
Bénéfices attendus
Cet antibiotique a déjà montré une efficacité in vitro (en laboratoire) sur Mycobacterium avium, mais l'efficacité in vivo (chez l'être vivant) reste à démontrer. Si notre hypothèse de travail est correcte, notre projet permettra de mettre en évidence l'efficacité de ce nouvel antibiotique seule et en combinaison avec d'autres antibiotiques spécifiques. Cette efficacité permettra d'informer à court terme d'autres études expérimentales sur des combinaisons à tester et leur durée de traitement, mais également à moyen terme les essais cliniques thérapeutiques pour des patients en grand besoin de traitements plus efficaces et mieux tolérés dans cette indication.
Procédures
Il n'est pas prévu de prélèvement sanguin ou d'intervention chirurgicale. En revanche les souris seront infectées par des aérosols de mycobactérie (durée 120mn) et seront par la suite traitée par différents antibiotiques afin de déterminer leur efficacité. Si l'infection par aérosol est indolore, l'administration des antibiotiques se fait par voie orale (à la seringue) et/ou par voie injectable (dans le ventre). Ces administrations sont répétés tous les jours (durée 5 à 10 secondes), cinq jours par semaine pendant 1 mois, 2, 3 ou 4 mois pour certaines souris.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale du gavage et de l'injection, bien qu'en soit peu délétère, est répétée quotidiennement, pouvant provoquer un stress sur les animaux. C'est pourquoi il est prévu un rapport écrit de la surveillance quotidienne avec évaluation a posteriori du projet. Des points limites spécifiques ont été établis pour la surveillance. Les effets indésirables attendus, surviennet essentiellement lorsque les gavages sont faits par des novices. Ce sont : des saignements, un stress, une inhalation, le décès. Lors des injections, ce sont des douleurs, des hématomes, des troubles cutanés. Toutefois, le personnel novice sera dans un premier temps entraîné sur une souris d'entrainement fictive (Mimicky mouse, Dorset, UK) jusqu'à ce qu'ils acquièrent la dextérité et l'aisance nécessaire pour ne pas faire subir d'effet indésirable inutile aux souris.
Devenir
Afin de pouvoir tester l'efficacité des antibiotiques les animaux doivent être infectés puis traités. Après la durée de traitement prévue dans le protocole il est nécessaire de mettre en culture les poumons afin de mesurer l'efficacité des antibiotiques. Tous les animaux sont donc mis à mort à la fin de la durée de traitement.
Remplacement
La procédure de préhension et de gavage sera apprise sur une souris fictive jusqu'à ce que les personnes formées soient à l'aise avec ces procédure. Des analyses in vitro ont été réalisées en amont pour sélectionner les candidats, mais à ce jour, il n'existe pas de solution alternative satisfaisante pour remplacer les animaux dans cette indication.
Réduction
Le nombre de souris est calculé au plus proche de ce qui est nécessaire pour voir une différence significative entre les groupes de traitement.
Raffinement
Les mesures de raffinement suivantes seront prises pour diminuer la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Les souris seront suivies quotidiennement. Dans la cas où une douleur serait observée, les souris auront une injection d'analgésique une fois par jour jusqu'à normalisation de l'échelle de la douleur. Dans le cas d'une aggravation des signes de douleur, les souris concernées seront euthanasiées. Nous avons défini des points limites spécifiques au gavage. Les souris seront gardées dans des cages collectives (en respectant la limite de souris par cage) et enrichies (litières foisonnantes et absorbantes, tunnels, …). Nourriture et boisson seront ad libitum.
Choix des espèces
Dans notre étude précédente la souris BALB/c était le modèle animal répondant le mieux à l’antibiothérapie semblant le plus se rapprocher des données humaines. Il n'est pas justifié d'utiliser des modèles de souris immunodéprimées (ou d'autres espèces animales) moins semblables aux données cliniques