Recherche appliquée

3 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit un cancer colorectal par chirurgie ou par injection, puis elles subissent jusqu'à deux imageries par semaine pendant neuf semaines sous anesthésie, jusqu'à cinq traitements hebdomadaires pendant six semaines et des prélèvements sanguins en sous-mandibulaire sur animal vigile. Le porteur indique que les tumeurs sous-cutanées, coliques et péritonéales peuvent provoquer des difficultés de locomotion, des diarrhées et des occlusions intestinales. Il affirme que l'étude des tumeurs et métastases ne peut pas être modélisée in vitro et qu'aucune autre méthode n'apporterait un niveau d'information équivalent.

Objectifs

Le cancer colorectal représente un défi majeur de santé publique en raison de sa gravité et de l’augmentation croissante des cas nouvellement diagnostiqués en France et à travers le monde. Malgré des avancées significatives en termes de survie grâce aux chimiothérapies à base d’anticorps thérapeutiques, certains patients ne répondent pas ou peu aux traitements. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies afin d’améliorer l’efficacité antitumorale et de lutter contre les phénomènes de résistance.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer colorectal à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.

Procédures

Induction de cancer colorectal : 1 acte par animal soit par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale) soit sans chirurgie : injection intrapéritonéale (quelques secondes), injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale), injection par endoscopie (5-10min sous anesthésie générale) Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 9 semaines sous anesthésie générale. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 6 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse Prélevement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire volume maximal de 130μL( en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) pour une souris de 25g .

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux sont liés au développement de foyers tumoraux au niveau sous-cutané ainsi qu’au niveau du colon et des viscères. Une difficulté de locomotion peut éventuellement s'installer lorsque la tumeur sous cutanée évolue et des diarrhées ou occlusions intestinales peuvent apparaître lors de l’évolution des tumeurs du colon ou des métastases péritonéales. La définition de points limites, le suivi quotidien, les pesées ainsi que la grille de scoring nous permettront d’anticiper toute douleur ou souffrance qui seraient induites. Nous n’attendons pas de douleur ou d’intolérance liées aux composés tests.

Devenir

Toutes les souris seront mise à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

L'étude de tumeurs ou métastases résulte de l’interaction de nombreux types cellulaires et ne peut pas être modélisée in vitro. Aucune autre méthode expérimentale ne serait en mesure d’apporter un niveau équivalent d’information que la procédure expérimentale impliquant l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Les groupes témoins seront regroupés lorsque cela sera possible. La mise en oeuvre de l'imagerie (bioluminescence et échographie) permettra de suivre le même animal au cours du temps ce qui permet de réduire significativement leur nombre.

Raffinement

Les méthodes d'imagerie mises en oeuvre sont non invasives et les actes réalisés sous anesthésie ce qui limite la douleur et le stress infligé au cours de l’expérimentation. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des cages disposant d’un environnement enrichi et en accord avec les directives européennes. L'induction des modèles tumoraux sera réalisée sous anesthésie générale. Durant les actes de chirurgie, la douleur sera également prise en charge par l'utilisation d'antalgiques (paracétamol) la veille et 24h post opératoire et par l’administration d'anti inflammatoire (tolfédine) le jour et 24h post opératoire. Des grilles de scoring avec les points limites prédictifs seront mis en place et le personnel examinera les animaux quotidiennement afin d'anticiper la souffrance de l'animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.

2 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par ponction intracardiaque sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour, pendant seize jours au maximum, des composés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, pour déterminer la dose maximale tolérée d'inhibiteurs de kinases. Le porteur annonce comme seul effet indésirable attendu une perte de poids, et prévoit la mise à mort de tout animal atteignant un point limite. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable" parce que les tests in vitro ne prédisent pas la toxicité d'un organisme vivant.

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine : maladies inflammatoires, pathologies affectant le système nerveux périphérique et central, et cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à cribler des molécules organiques de masse moléculaire très faible (fragments) qui n’ont la plupart du temps qu’une faible affinité pour la cible compte tenu de leur taille. Le criblage va se faire contre une cible thérapeutique choisie dans le cadre d’une pathologie particulière. Il va s’agir ensuite de combiner différents fragments identifiés et/ou de les faire évoluer en se basant sur la structure tridimensionnelle de la protéine cible considérée pour obtenir un candidat médicament de forte affinité et spécificité pour la cible étudiée. Ce projet se situera dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Les études sur les modèles de cellules en culture et la pharmacocinétique in vivo des composés à tester auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations sur la toxicité du composé test. Après avoir selectionné les molécules in vitro à travers des cribles biologiques pertinents, il est nécessaire d'évaluer la dose maximale tolérée in vivo. En effet, le développement de tout nouveau composé thérapeutique nécessite l'évaluation du rapport bénéfice/risque entre les doses thérapeutiques efficaces, et les effets secondaires et les niveaux de toxicité potentiels, suceptibles de diminuer ou annuler les effets curatifs de nouvelles molécules. L'importance d'évaluer les propriétés toxiques des molécules candidates ne peut donc pas être sous évaluée. L'objectif du projet est de déterminer la gamme optimale de doses de la molécule ne générant pas d'effets indésirables chez la souris, ainsi que ses paramètres posologiques (dose et fréquence d’administration).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'identifier la plage de dose utilisable d'une nouvelle molécule thérapeutique ciblée, c’est à dire ne générant aucun effet indésirable chez la souris. Ceci permettra d’optimiser sa posologie pour l’évaluation de son activité biologique sur des modèles murins de pathologies humaines, mais également d'ajuster la dose initiale utilisée lors des essais cliniques. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dûs au traitement, pour le traitement de maladies à forts besoins médicaux non satisfaits (maladies neurodégénératives, inflammatoires et cancer) et ainsi améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux se verront administrer des composés test quotidiennement ou biquotidiennement pendant 16 jours maximum. Les administrations seront faites par injection du produit par voie orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous-cutanée. A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale et une ponction intracardiaque sera réalisée. Les animaux seront pesés quotidiennement.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu suite à l'administration d'une nouvelle molécule est une perte de poids.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Si ces tests sont nécessaires et permettent d'identifier les meilleures molécules candidates, ils ne permettent malheureusement pas de prédire la toxicité in vivo. Ces approches expérimentales ne constituent donc pas des méthodes alternatives ou substitutives à la complexité d’un organisme vivant. L'effet de l’administration du composé test in vivo résulte de l'interaction entre de nombreux mécanismes physiologiques qui ne peuvent être reproduits in vitro. Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été determiné de manière statistique afin d'obtenir des résultats analysables avec un test statistique. La réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet passe également par l'optimisation de l'utilisation des groupes contrôles : dans la mesure du possible des études pourront être définies pour tester plusieurs molécules en parallèles afin de limiter l’utilisation d’animaux dans les groupes contrôles.

Raffinement

Un soin particulier sera apporté au raffinement et à l'anticipation des points limites au cours du projet. Le suivi quotidien individuel des animaux par le biais de leur observation et pesées quotidiennes permettra de minimiser au mieux les nuisances induites par l’étude. Dans le cas de l’atteinte de l’un des points limites définis dans le projet l’animal sera euthanasié. En cas d'approche de ces critères des croquettes mouillées seront mises à disposition des animaux pour éviter d'atteindre les points limites.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques : oncologie, maladies inflammatoires et pathologie du système nerveux. La majorité des modèles animaux développés pour ces pathologies sont des modèles de souris génétiquement modifiées, souris transgéniques pour les pathologies inflammatoires et système nerveux, souris immunodéficientes pour les modèles en oncologie. Afin de tester l'activité biologique in vivo des molécules développées il est donc nécessaire d'avoir recours à ces modèles murins. Dans ce projet il n'y aura pas d'induction de pathologie, cependant ces études de détermination de la dose maximale tolérée serviront pour la suite de l’évaluation préclinique du médicament (notamment pour les études d’efficacité). Il est donc prévu d’utiliser la même souche pour ce projet et pour les études d’évaluation de l’efficacité afin d’éviter l’apparition d’une toxicité innatendue liée à la différence de souche lors de l’étude d’efficacité. Les animaux seront adultes, soit 8 à 10 semaines lors du début de l’étude, afin d’avoir un système immunitaire, hormonal et métabolique mature dans le but d’obtenir la réponse recherchée sans biais.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue et le cerveau prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus d'une lignée trisomique dont le porteur reconnaît le phénotype "dommageable", petite taille dans 80 % des cas et dermites à staphylocoque exigeant des antibiotiques chez la moitié d'entre eux, ils reçoivent pendant seize jours une molécule par voie intrapéritonéale puis passent le test de la piscine de Morris. Ce test d'apprentissage impose des séances de nage répétées, les animaux en difficulté ou épuisés étant retirés de l'étude. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour étudier les déficits cognitifs et propose comme candidat un médicament déjà utilisé contre l'alcoolisme.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 est la première cause de retard mental d’origine génétique. Le SD est lié à la présence d’une copie supplémentaire du chromosome 21 et touche 1 naissance sur 700. Il se caractérise par des déficiences intellectuelles : les personnes atteintes de SD ont des difficultés d’apprentissage et de mémorisation qui sont liées à des défauts dans le développement et le fonctionnement du cerveau. Cette anomalie chromosomique conduit à une surexpression des gènes du chromosome 21 humain, perturbant de nombreux systèmes physiologiques, morphologiques et biochimiques. Ces dérégulations se font de manière directe via l’augmentation de la production de protéines, ou indirecte à travers une multitude d’interactions de ces protéines sur l’ensemble du génome. Nous avons démontré le rôle du surdosage d'une protéine dans le modèle de rat SD, comme l'un des principaux moteurs du dysfonctionnement cognitif. Afin de mieux comprendre la conséquence du surdosage de cette protéine sur le fonctionnement cérébral dans notre modèle de rat SD et de développer une stratégie thérapeutique, notre projet est de tester une molécule qui est un médicament utilisé en clinique dans le traitement de l'alcoolisme, qui peut inhiber cette protéine dans un environnement cellulaire, et d’évaluer les capacités cognitives de notre modèle de rat SD.

Bénéfices attendus

La création et la caractérisation d’un modèle de rat portant la même mutation que l'humain, a permis de comprendre que la conséquence du surdosage d'une protéine est l'un des principaux moteurs du dysfonctionnement cognitif chez les patients trisomiques. Il n’existe à ce jour aucun traitement qui permet de restaurer les performances cognitives chez les patients. Toute molécule capable d’inhiber ou de réduire le surdosage de cette protéine sera potentiellement donc d’un grand bénéfice pour les patients.

Procédures

Nous allons réaliser les interventions suivantes : -Administration de composés par voie intra-péritonéale (moins d'une minute par rat) une fois par jour pendant 16 jours -test d'apprentissage dans la piscine de Morris : La durée du test est sur 7 jours : les 2 premiers jours 4 essais de 90s espacés d'1h sont réalisés chaque jour. Les 4 jours suivants, 2 essais de 90s, espacés de 2h, par jour. Le dernier jour, un seul essai de 90s. -Un prélèvement sanguin à la veine temporale superficielle (2 minutes par rat).

Impact sur les animaux

Le phénotype du notre modèle animal utilisé est considéré comme dommageable. En effet, les anomalies suivantes ont été observées : -Animaux de petite taille (80% des cas) -Dermites à Staphylococcus aureus nécessitant des traitements antibiotiques locaux (50%) voire des traitements antibiotiques généraux (20%). Concernant le SD, aucun phénotype délétère n’est observé chez ces rats dans leur environnement. Lors de l’injection par voie intrapéritonéale, une surveillance du site d'injection sera effectuée et un soin local pourra être appliqué en cas de lésion ou d'infection du site. Lors du test d'apprentissage (Piscine de Morris), les animaux présentant des problèmes de nage ou d'épuisement seront retirés de l'étude. Après les prélèvements sanguins, une surveillance de l'état des animaux, en s'assurant notamment qu'il n'y a pas de saignement au niveau de la zone de prélèvement.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés puis les cerveaux seront prélevés en vue d'analyses post-mortem (structures cérébrales).

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle pas d’alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. En effet, l’étude de déficits cognitifs nécessite un modèle vivant et suffisamment proche de l’Homme pour pouvoir être transposé à l’espèce humaine. Par ailleurs, il n’existe pas encore de modèle de cerveau in vitro ou autre permettant de réaliser de la recherche fondamentale dans ce domaine.

Réduction

Dans cette étude, nous comparerons trois groupes de rats: un groupe de rats contrôle négatif (sauvages + véhicule) ; un groupe de rats contrôle positif (mutant trisomique + véhicule) et le groupe d’intérêt (mutant trisomique + molécule à tester). Chaque groupe sera composé de 20 rats. En ce qui concerne le sexe, comme nous n’attendons pas à avoir un effet sexe, les 2 sexes seront utilisés (on veillera à avoir des groupes de mêmes proportions). Nous avons évalué le nombre de rats nécessaire pour pouvoir valider de façon statistique (test de Mann et Whitney) l’hypothèse que l’effet du traitement entre les groupes n’est pas nul. En fonction de ces paramètres, 20 rats par groupe seront nécessaires pour notre étude.

Raffinement

Du fait de leurs phénotypes dommageables, ces animaux font l’objet d’une attention particulière afin de pouvoir détecter le plus précocement possible tous problèmes pouvant altérer leur bien-être. Les animaux seront ainsi suivis quotidiennement tout au long de leur vie. Si un animal présente des signes de douleur ou de mal être, il sera présenté au vétérinaire puis, si un traitement est envisageable, il sera mis en place (on utilisera des anti-inflammatoires). A noter que le traitement utilisé devra être adapté au cas par cas en fonction des symptômes rencontrés. Si aucun traitement n’est envisageable, l’animal sera mis à mort. Par ailleurs, tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par 2 et disposeront d’un bâton à ronger comme enrichissement.

Choix des espèces

Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez cette espèce. De plus, les régions homologues du chromosome 21 humain sont retrouvées sur 2 chromosomes chez le rat contre 3 chez la souris. L’obtention d’un modèle de trisomie complète est donc plus simple à obtenir chez le rat. Le rat constitue ainsi un modèle de choix pour générer des modèles de maladies humaines pour le syndrome de down. Les rats seront adultes, agés de 15 à 16 semaines environ au début des tests. l'ensemble des tests sera réalisé sur une période de 3 semaines.

20 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une destruction par radiofréquence de trois zones du foie et l'injection d'un gel immunostimulant, puis des prélèvements sanguins tous les trois jours sur deux semaines, pour vérifier la tolérance d'un traitement avant un essai clinique humain. Le porteur indique que le gel pourrait migrer et provoquer une embolie pulmonaire menant à une mise à mort précoce, tout en jugeant ce risque improbable. Il affirme que l'expérimentation animale n'est pas "substituable" et retient le porc pour son foie proche de celui de l'humain.

Objectifs

Des métastases hépatiques compliquent l’évolution de 50% des cancers colorectaux (CCR), dont le traitement chirurgical ne peut être réalisé que dans moins de 20% des cas. Après chirurgie complète la moitié des malades développent une récidive dans le foie, évolution de métastases non visibles au moment de la chirurgie. L’efficacité des traitements est limitée par une toxicité non sélective de la chimiothérapie, par la sélection de cellules tumorales résistantes au traitement et par l’insensibilité des cancers digestifs à l’immunothérapie classique. Les objectifs de notre projet d’essai clinique sont de démontrer que la destruction thermique par radiofréquence (RFA) d’une tumeur associée à une injection intra tumorale d’un vaccin, peut, sans complication, induire une réponse immune suffisante pour inhiber la croissance de métastases à distance. Cette stratégie a été validée chez la souris mais sa faisabilité et la toxicité de la procédure n’ont pas été validées chez le gros animal avant réalisation d’un essai clinique prévu en 2022-23. Dans cet essai, l’immunité sera stimulée par l’injection dans le site de RFA, d’un gel contenant 2 immunostimulants. La validation de la faisabilité et de l’innocuité d’un traitement locorégional par l’association RFA-gel-vaccin chez l’animal est un prérequis avant le développement d’un essai clinique chez l’homme. L’objectif principal du projet est de déterminer, dans un modèle gros animal, la tolérance de l’organisme à ce traitement. Cette phase demeure indispensable à la protection des patients.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie in situ après radiofréquence permettra le traitement et le contrôle à distance et dans le temps d’un cancer digestif métastatique, non accessible au traitement chirurgical. Les objectifs du projet d’essai clinique sont de démontrer que la destruction thermique par radiofréquence d’une tumeur associée à une modulation pharmacologique in situ, peut, sans complication, induire une réponse immune suffisante pour inhiber la croissance de tumeurs à distance. Cette stratégie s’intégrera dans le traitement standard et sera probablement synergique avec les thérapeutiques validées et factuelles des cancers digestifs de stade IV en particulier chimiothérapies et thérapies ciblées. Elle pourrait permettre de rétablir l’efficacité de l’immunothérapie des cancers digestifs actuellement insensibles à ces traitements.

Procédures

Radiofréquence hépatique et injection du gel : Répétion de la technique opératoire sur 3 segments du foie les plus distants possible l’un de l’autre : - Même procédure pour tous les animaux - Sous anesthésie générale et controle échographique ponction percutanée du foie par un trocard coaxial - Placement de la sonde de RFA sous contrôle échographique - 2 cycles de RFA par site, dont la durée dépend de l’impédence calculée par la machine avec arrêt automatique, puis retrait de la sonde de RFA - Injection de 10ml de gel au centre de la thermo-lésion avec contrôle échographique de la cinétique d’injection - Retrait du trocard coaxial toujours sous contrôle échographique - Vérification échographique de l’absence de complication - Durée : 15 mn par cycle x 3 / animal Prélévements : Les animaux subiront de prises de sang à des fins de suivi de la fonction hépatique, de pharmacocinétique du produit injecté et de traçabilité de sa libération. Il est prévu au maximum des prélèvements de 20ml de sang toutes les 72 heures sur 14 jours de surveillance à des fins de suivi de la fonction hépatique, de pharmacocinétique du produit injecté. .Après euthanasie : Prélévement multi-organes à visée anatomo-pathologique.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de douleur, d’altération de l’état général de trouble digestif, d’altération de la fonction hépatique ou d’effet indésirable significatif après RFA hépatique chez l’homme. Les mêmes suites opératoires sont attendues chez l’animal. Les effets loco-regionaux du gel en administration hépatique ne sont pas connus (but de l’étude). La procédure est une combinaison de 2 traitements, RFA et immunothérapie intratumorale déjà largements validés chez l’homme et utilisés pour diminuer le risque de complication du traitement des cancers, en particulier métastases et carcinome hépatocellulaire. Les 2 risques cliniquement décelables chez l’animal seront : - La migration per-opératoire du gel, monitoré par echographie, dans le système sanguin et pouvant être à l’origine d’une embolie pulmonaire : risque improbable en raison du caractère thermosensible du gel qui gélifie instantanément à 37°C. La traduction clinique pourrait être des difficultés respiratoires. Cet effet pourrait nécessiter une oxygénation prolongée. Ce risque pourrait conduire au point limite le moins improbable : difficulté d’extubation et nécessité d’euthanasie précoce - Le risque d’activation d’une réponse immunitaire disproportionnée : risque improbable de traduction clinique car l’immunothérapie locale chez l’homme n’entraine pas de complication systémique et que la traduction clinique du risque le plus important qui serait une hépatite autoimmune ne se declenchera pas en une semaine. Un autre organe touché pourrait être le colon avec apparition d’une diarrhée. - Les effets immunitaires seront infra-cliniques et surtout visibles sur la biologie et l’anatomo-pathologie

Devenir

Mise à mort pour prélèvements anatomo-pathologique (étude de toxicité).

Remplacement

Malgré un important travail in vitro sur culture cellulaire pour exploration de facteurs influençant la réponse immune anti-tumorale, l’expérimentation animale n’est pas substituable pour la détermination des effets thérapeutiques de la réaction immune car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les études physico-chimiques, d’immunologie, d’efficacité et de toxicité cette stratégie d’immunothérapie anti tumorale ont été validées in vitro sur culture cellulaire et chez la souris femelle. Le risque de complication le moins improbable est la migration extra-hépatique per-opératoire du gel dans les 5 premières minutes qui suivent l’injection. Ce risque, non évaluable in vitro et chez le petit animal, doit-être évalué dans des conditions de volumétrie, de température, d’hémodynamique et de perfusion hépatique voisine de l’homme. Pour établir la sécurité du geste le porc procure la meilleure conficuration anatomique et physiologique.

Réduction

Nous avons préalablement évalué et publié par des expériences in vitro : - plusieurs gels afin de ne tester chez l’animal que celui qui s’est avéré le plus efficace. - les caractéristiques rhéologiques, d’adhésion et de gélification permettant de controler la cinétique et la stabilité du gel injecté. La stabilité du gel in vivo a été évaluée et publiée chez le petit animal par imagerie non invasive et imagerie par résonnance magnétique. Le faible nombre d’animaux sera compensé par : - Les données pharmacologiques exhaustives chez l’animal et chez l’homme des 2 adjuvants avec AMM qui sont utilisés en routine et du gel testés dans de nombreuses etudes cliniques. Pas de toxicité spécifique attendue des 3 composants. - Le nombre de sites traités /animal et de prélèvement post mortem afin d’obtenir des résultats robustes. Par exemple, le nombre maximal de 3 sites traités par animal permettant de mimer 3 lésions tumorales chez l’animal sain correspondra à la dose maximale utilisée chez l’homme De multiples prélèvements hépatiques, pulmonaires ou d’organes cibles de la réponse immune seront réalisés pour évaluer la présence ou non du gel et les effets secondaires immunitaires. Plusieurs centaines d’études cliniques ont été réalisées et certaines stratégies d’injection intratumorale sont réglementairement validées pour utilisation chez l’homme (virus oncolytiques, thérapie cellulaire…). Ces études confirment l’abscence de complication grave de l’injection intratumorale. L’étude sera considérée comme positive si des complications per ou post-opératoire, une diffusion extra-hépatique du gel ou des complications immunologiques graves surviennent chez 2 ou moins animaux sur 5. Ce curseur est établi parallélement a la phase de safety (2 ou moins complications graves /4 premiers patients /12) décrite dans le protocole de l’essai clinique de phase I chez l’homme. Si comme attendu aucune complication n’est décelée l’étude se limitera à 5 animaux. L'objectif de ce travail est l'étude des complications immédiates de l'injection du gel. Le critère d'analyse va être le nombre de complications peropératoires ou postopératoires immédiates par site traité donc n : 3X5 =15. Dans une optique de statistique non paramétrique le seuil de siginificavité est n=5. L'étude des complications immunologiques est un objectif secondaire donc en situation non réelle (immunité différente chez l'humain et pas de cible tumorale) pas de nécessité statistique.

Raffinement

Il n’y a pas de douleur, d’altération de l’état général, de trouble digestif, d’altération de la fonction hépatique ou d’effet indésirable significatif après RFA hépatique chez l’homme qui est le plus souvent réalisée sous anesthésie locale + sédation. Les mêmes suites opératoires sont attendues chez l’animal Le risque d’effets indésirables de la radiofréquence, largement utilisée chez l’homme est faible comme démontré dans la littérature. Contrairement à l’immunothérapie systémique, les effets à distance de l’immunothérapie locale, liés à l’activation immunitaire et en particullier les effets sur des organes à distance devraient être indétectables ce qui a été démontré par les nombreuses publications et les essais cliniques chez l’homme. La procédure est une combinaison de 2 traitements, RFA et immunothérapie intratumorale déjà largements validés chez l’homme et utilisés pour diminuer le risque de complication du traitement des cancers. Séparément les 4 composants du traiement, RFA, Hydrogel, GMCSF et vaccin, sont largement utilisés chez l’homme en pratique clinique Nous mettrons tout en oeuvre pour respecter le principe des 3R : - Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale lors de l’application de la radiofréquence et du gel, avec anesthésie locale concomittante du trajet de ponction per-cutanée et administration d’antalgiques puissants, tout au long de la procédure - Les porcs seront observés tous les jours par le personnel qualifié. Pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des porcs des mesures seront ajoutées afin de limiter leur stress. Les paramètres vitaux seront contrôlés pendant toute la durée des procédures. Des médications pré et post chirurgie seront administrées. - Un examen clinique quotidien permettra d’évaluer la douleur post-opératoire - Les animaux seront hébergés dans des boxes individuels avec la possibilité de se voir et de se toucher. L’environnement sera enrichi avec des jouets en plastique ou des balles accrochées au mur. Un fond musical est prévu dans la salle d'hébergement pendant la journée.

Choix des espèces

Malgré un important travail de physico-chimie, in vitro sur culture cellulaire d’exploration de facteurs influençant la réponse immune anti-tumorale, l’expérimentation animale n’est pas substituable pour la détermination des effets thérapeutiques de la réaction immune car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les études d’immunologie et de cette stratégie d’immunothérapie anti tumorale ont été validées chez la souris femelle. Le transfert à l’homme nécessite une étude de faisabilité et de toxicité chez le gros animal dans des conditions expérimentales se rapprochant de l’utilisation humaine. Le choix du modèle est centré sur le porc une espèce animale permettant en terme de taille et de physiologie, de reproduire le protocole de radiofréquence per-cutanée avec injection intra-lésionnelle d’un gel immunomodulateur sous contrôle échographique qui sera réalisé chez l’homme dans un essai de phase I. Les conditions anatomiques et physiologiques, proches de l’homme, permettront de détecter les risques de la procédure, d’en caractériser les effets locaux et à distance puis de suivre l’activation immunitaire et d’en décrire les effets eventuels sur des organes à distance. Nous avons besoin de porcs jeunes adultes d’environ 50 kg afin d’avoir un foie de dimensions similaires à celles de l’Homme et d’avoir des animaux facilement manipulables quand ils sont vigiles.

33 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse histologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une craniotomie puis une injection stéréotaxique dans le thalamus, avant deux semaines de surveillance, pour valider la diffusion d'un virus thérapeutique. Le porteur prévoit une couverture analgésique et une mise à mort en cas de perte de 20 % du poids. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative expérimentale à ce modèle murin.

Objectifs

Le but du projet est de définir la propagation d'un virus à visée thérapeutique ainsi que son intégration dans les cellules cibles du système nerveux central. Pour cela, nous allons procéder à trois étapes. La première consistera à valider les coordonnées d'injection d'un colorant dans une zone du cerveau de Souris, le Thalamus. Cela nous permettra de nous assurer de la validité et de la reproductibilité du geste technique. Une fois cette étape validée, nous procéderons à l'injection du virus de type adénovirus. Celui-ci s'incorporera dans les cellules du tissu cible et déclenchera l'expression d'une protéine fluorescente que nous pourrons ensuite analyser par histologie. Nous ciblons dans cette étude le thalamus qui n'a jusqu'à présent jamais été ciblé dans notre institut, mais nous maitrisons cette voie d'injection pour d'autres structures. Par ailleurs, ce virus a déjà fait l'objet d'injections dans d'autres structures mais son intégration n'était pas satisfaisante étant donné les populations de cellules atteintes qui ne correspondaient pas au type cellulaire efficace pour permettre l'expression du code génétique véhiculé par ce virus. Finalement, si ces étapes sont validées, nous utiliserons le virus candidat médicament dans une dernière étude afin de valider l'expression du matériel génétique apporté par le virus.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de poursuivre le développement d'un virus candidat médicament dont le but est de traiter les pathologies d'origine génétique du système nerveux central, dans les populations neuronales. Nous prévoyons en effet ensuite d'appliquer le vecteur thérapeutique sur des lignées de souris porteuses d'une mutation génétique, modèles d'une pathologie humaine (Syndrome de l'X fragile). Ce projet consiste donc à une des étapes indispensables du développement d'un candidat médicament.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés durant environ 60 minutes avec une mélange injecté par voie intra-péritonéale. Pour éviter toute douleur durant l'injection cérébrale, un injection sous-cutané d'antalgique sera aussi pratiquée (le geste dure quelques secondes et la couverture antalgique plusieurs heures).

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront une injection stéréotaxique. Celle-ci se réalise sous anesthésie par voie intra-péritonéale et dure environ 1 heure. Durant ce geste, une craniotomie est réalisée suivie d'une injection dans le cerveau. Trente minutes avant l'injection du virus, les animaux recevront une injection de buprénorphine (10 secondes). La zone est ensuite nettoyée et suturée. Les animaux seront ensuite surveillés durant deux semaines puis mis à mort.

Devenir

Tous les animaux doivent être analysés au niveau histologique, ce qui nécessite leur mise à mort.

Remplacement

ce projet s'inscrit dans la mise en place d'un candidat médicament chez l'Homme dont le modèle d'étude principal est une lignée de souris génétiquement modifiées. Il n'existe actuellement pas d'alternative expérimentale.

Réduction

Les effectifs dans les groupes expérimentaux sont réduits mais suffisants pour les analyses histologique ou génétiques planifiées. Il n'est pas possible de les réduire sans impacter la robustesse de l'analyse finale.

Raffinement

Les injections seront effectuées sous anesthésie (Kétamine/Xylazine) avec une couverture antalgique (Buprénorphine)), les animaux maintenus à température à l'aide d'un matelas chauffant et une surveillance étroite post-injection du site d'injection et de l'état des animaux sera réalisée pour réagir à tout signe de souffrance. Un suivi de poids sera mis en place pour les protocoles étalés sur 2 semaines afin de mettre en évidence une baisse de l'état général des animaux le cas échéant. En cas d'une baisse de 20% du poids initial sur une semaine, les animaux seraient euthanasiés immédiatement pour éviter toute souffrance.Des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance aux animaux.

Choix des espèces

La souris constitue le meilleur modèle d'étude car il existe une lignée Fmr1 KO qui est un bon modèle d'étude de la pathologie ciblée (syndrome de l'X fragile) Les animaux seront agés de 5-6 semaines, correspondant au stade cible pour l'étude de la pathologie dans le projet utilisant les animaux génétiquement modifiés.

974 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection du parasite du paludisme puis subissent des prélèvements sanguins quotidiens pendant sept à dix jours, pour évaluer l'effet d'une mutation sur la résistance à la sulfadoxine. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une hyperparasitémie, une anémie et un neuropaludisme, et précise qu'aucun analgésique ne sera administré pour ne pas fausser les résultats. Il affirme que les tests in vitro se sont révélés non reproductibles et qualifie le modèle murin d'"indispensable".

Objectifs

La combinaison sulfadoxine/pyriméthamine est le traitement prophylactique recommandé pour la prévention du paludisme chez la femme enceinte et l’enfant de moins de 5 ans. Cependant, la résistance à cette combinaison thérapeutique est due à l’émergence de mutations sur les gènes dhfr et dhps de Plasmodium falciparum. La mutation I431V de DHPS chez P. falciparum fut identifiée pour la première fois au Nigéria en 2006 et des quintuples mutants de DHPS furent décrits en Afrique Centrale. Cette nouvelle mutation semble être une mutation émergente dans ces pays. A ce jour il n’existe aucune donnée phénotypique de ce génotype. Les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciparum n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. La forte homologie entre les enzymes DHPS de P. falciparum et de P. berghei fait du parasite murin un bon modèle d’études du niveau de résistance à la sulfadoxine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir les premières données phénotypiques dues à la nouvelle mutation I431V de DHPS décrite en Afrique Centrale. L’évaluation de l’effet de cette mutation sur la résistance à la sulfadoxine est primordiale et indispensable pour prédire de l’efficacité du traitement préventif intermittent par sulfadoxine/pyriméthamine utilisé chez les femmes enceintes et les enfants de moins de 5 ans. Ce travail sera une première étape qui permettra d’évaluer la nécessité de la mise en place d’études à grande échelle sur le terrain afin d’actualiser les recommandations mondiales.

Procédures

Injection par voie intra-péritonéale (1 injection, durée estimée 10 secondes). Induction d'une maladie expérimentale : paludisme pendant 7 à 10 jours. Prélèvement sanguin quotidien pendant 7 à 10 jours (durée estimée 10 secondes).

Impact sur les animaux

La souris peut développer une hyperparasitémie accompagnée d’anémie et/ou un neuropaludisme. La surveillance et le suivi quotidiens de la parasitémie permettront de s’affranchir de ces risques.

Devenir

Procédure 1 : Souris et rat euthanasiés au CO2 pour réalisation d'exsanguination. Procédures 2 et 3 : Mise à mort par dislocation cervicale avant apparition des signes de gravité du paludisme (hyperparasitémie et/ou neuropaludisme).

Remplacement

Pour étudier la résistance des parasites aux différents antipaludiques, des tests in vitro peuvent être réalisés. Cependant, les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciaprum menées au laboratoire n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. Ces variabilités techniques majeures sont décrites dans la littérature. Un modèle murin in vivo est donc indispensable pour obtenir des données phénotypiques des différents génotypes de DHPS.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée (test de Student). Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Dans un objectif de réduction, des rats seront utilisés à certaines étapes de la procédure 1 afin de recueillir la quantité de parasites nécessaire à l’expérimentation.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est aussi un facteur de variabilité expérimentale. Les animaux seront hébergés en cage de 2 rats ou de 5 souris, conformément aux recommandations de l'établissement utilisateur. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement de l’habitat. Aucun traitement analgésique ne pourra être administré sous peine d'interférer avec les paramètres étudiés. Nous effectuerons une surveillance quotidienne des souris (état général, prise de nourriture, toilette, mouvements), afin de détecter le plus précocement les signes de souffrance. L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des hôtes intermédiaires de Plasmodium berghei et constitue un modèle animal reconnu Des souris âgées de 6 semaines et des rats âgés de 9 semaines seront utilisés puisqu’ils auront terminé leur croissance.