Recherche appliquée

12 cochons vont être utilisés, tous mis à mort pour prélever leurs reins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des immunisations sous sédation puis sous anesthésie générale pour déclencher une maladie rénale rare, avec des prélèvements de sang et d'urine. Le projet vise à dater le début des lésions rénales afin de mieux interpréter une étude antérieure d'un candidat médicament, réclamée par les autorités de santé américaines. Le porteur écarte la souris et le rat, dont la cible du médicament diffère de celle de l'humain, et retient le cochon pour la proximité de ses reins.

Objectifs

La glomérulonéphrite à croissants est une maladie rare du rein qui abîme très rapidement les petits filtres du rein, appelés glomérules. Cette maladie est provoquée par une réaction excessive du système immunitaire contre le rein. Au cours de cette réaction, les glomérules produisent en excès une protéine (facteur de croissance) qui participe à l’apparition des lésions rénales. Une étude précédente menée chez le porc a montré la capacité d’un candidat médicament à protéger le rein en bloquant l’action de cette protéine d’intérêt. Le but de ce projet est de mieux comprendre à quel moment, au tout début de la maladie, cette protéine commence à augmenter et à quel moment les premières lésions du rein apparaissent. Cela permettra de savoir si, dans l’étude précédente, le traitement avait été donné alors que la maladie avait déjà commencé, ou au contraire très tôt avant l’apparition des premières lésions. Cette information est importante pour mieux interpréter les résultats déjà obtenus et pour poursuivre le développement du médicament dans des conditions proches de celles rencontrées chez les patients. Pour cela, les animaux seront observés à deux moments très précoces après le déclenchement de la maladie, puis comparés à des animaux sains. L’objectif est de décrire les toutes premières étapes de la maladie.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal de ce projet est de permettre le développement d’un nouveau traitement destiné à une maladie rénale rare et grave pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitement pleinement satisfaisant. Les autorités de santé américaines ont demandé des informations complémentaires pour s’assurer que ce traitement agit bien lorsque la maladie est déjà installée, et non avant son apparition. Une étude précédente avait été réalisée très tôt après le déclenchement de la maladie, ce qui nécessite aujourd’hui d’en préciser le contexte. L’étude proposée vise donc à mieux comprendre à quel moment la maladie débute réellement et à vérifier que le traitement est efficace dans des conditions comparables à celles des patients. Ces résultats sont essentiels pour accélérer le développement du médicament et améliorer à terme la prise en charge des personnes atteintes de cette maladie rare.

Procédures

Les animaux recevront une immunisation à J-6 par voie sous-cutanée sous sédation profonde (durée 30 min, 1 seule fois), puis une immunisation par voie veineuse, sous anesthésie générale, à J0 et à J1 (durée 2h à chaque fois). Ils auront un prélèvement sanguin et urinaire à J0, J1 (sous la même anesthésie générale réalisée pour l'immunisation, sans augmentation du temsp d'anesthésie) et J4, sous anesthésie générale (10-15 min).

Impact sur les animaux

Un stress léger à modéré de courte durée est attendu lors de la contention et de la manipulation des animaux. Les prélèvements sanguins et urinaires peuvent être à l'origine d'une légère irritation (rare) ou d'un petit hématome n'entrainant aucune gêne (occasionnellement) au point de ponction. L’immunisation est susceptible d’entrainer une inflammation locale limitée. Les nuisances seront limitées pour les animaux car la pathologie induite commencera tout juste à se développer (absence de douleur). Les animaux sont susceptibles, dans moins de 20% des cas, d’éprouver un choc de type allergique, sous anesthésie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélever leurs reins pour faire des analyses. Ces examens permettent d’évaluer la mise en place de la maladie.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas de méthodes réalisées uniquement en laboratoire, sur ordinateur ou à partir de tissus isolés qui permettent de reproduire fidèlement l’ensemble des mécanismes en jeu dans cette maladie rénale rare. Celle-ci fait intervenir de nombreuses interactions complexes entre le système immunitaire, les cellules du rein et la circulation sanguine. L’objectif de l’étude étant de comprendre précisément à quel moment la maladie commence et comment elle évolue dans l’organisme, le recours à un modèle animal adapté reste aujourd’hui indispensable. Les approches alternatives existantes ne permettent pas encore de répondre à ces questions de manière fiable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour répondre à l’objectif scientifique du projet. L’étude repose sur trois animaux étudiés au temps J1 de l’induction de la maladie, trois animaux au temps J4 et trois animaux contrôles, ce qui permet de caractériser l’installation de la pathologie et de disposer d’un point de référence sans multiplier inutilement les effectifs. Ce design expérimental s’appuie sur les données de variabilité obtenues lors des études antérieures et permet d’obtenir des informations robustes tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Trois animaux supplémentaires au maximum seront ajoutés, uniquement en cas de mortalité dans les groupes précédents, portant le nombre total à maximum 12.

Raffinement

Les porcs sont hébergés en groupes sociaux, dans des conditions correspondant aux besoins physiologiques de l’espèce. Des enrichissements variés sont mis à disposition. Les interventions sont réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress chez ces animaux. Des critères d’arrêt de l’expérimentation précoces et stricts seront définis afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de l’étude. Les méthodes de prélèvements sont raffinées afin de limiter le risque d'iritation. La pathologie étant à un stade très précoce, les animaux ne présenteront pas de symptomatologie clinique apparente ni de signes de souffrance attendus. Aucune analgésie n’est donc nécessaire. Une surveillance régulière et adaptée sera mise en place, permettant toute intervention immédiate si nécessaire, conformément aux recommandations en vigueur, afin de minimiser au maximum toute contrainte ou détresse animale.

Choix des espèces

Le choix du porc comme modèle animal s’explique par sa grande ressemblance avec l’être humain, notamment pour le fonctionnement des reins. Les reins du porc fonctionnent de manière très proche de ceux de l’homme, ce qui permet d’étudier la maladie et l’effet d’un traitement dans des conditions proches de la réalité chez les patients. Les souris et les rats ne peuvent pas être utilisés dans ce cas, car la cible du médicament étudié n’est pas la même chez ces espèces et le traitement ne peut donc pas agir correctement. En revanche, chez le porc, cette cible est très similaire à celle de l’humain, ce qui permet d’évaluer de manière fiable l’efficacité du médicament. Les animaux utilisés ont un poids d’environ 30 kg au début de l’étude, ce qui correspond à un stade où leur système immunitaire est déjà mature, garantissant des résultats plus pertinents et mieux transposables à l’homme.

Deux à quatre anesthésies générales de deux heures chacune pour des examens d'IRM : 18 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. La cuprizone incorporée à leur nourriture détruit la myéline et provoque des troubles moteurs, une perte de poids et des comportements anxieux, réversibles à l'arrêt du produit. Le projet compare une nouvelle méthode d'IRM à la technique de référence pour mesurer la myéline. Leur mise à mort sert à vérifier que les images correspondent à la réalité du cerveau.

Objectifs

De nombreuses maladies du cerveau et de la moelle épinière s’accompagnent d’une atteinte de la myéline, une structure agissant comme une couche isolante autour des neurones, permettant aux messages du cerveau de circuler plus vite et efficacement. Parmi ces maladies, nous retrouvons la sclérose en plaques (SEP), dont l'incidence est en augmentation depuis plusieurs années. Ainsi, pour mieux traiter ces patients, il est nécessaire de disposer d'outils en pratique clinique permettant de quantifier cette atteinte, et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet cela de façon non-invasive. Néanmoins, les techniques d’IRM actuellement utilisées en pratique clinique ne permettent pas de voir directement la myéline mais seulement les dégâts infligés au cerveau lors de l’atteinte de cette myéline. Depuis plusieurs années, des techniques d’IRM sont développées pour essayer de mesurer directement l’atteinte de la myéline, et il en existe aujourd’hui une qui est considérée comme la référence. Néanmoins, cette technique est complexe et nécessite une longue durée d’acquisition, rendant son utilisation en pratique clinique impossible en l’état. Nous avons donc développé une nouvelle technique d’IRM ciblant la myéline, plus simple dans sa mise en œuvre. Ce projet vise à tester cette nouvelle méthode d’imagerie, en la comparant à la technique de référence, à l’aide d’un modèle murin imitant la sclérose en plaques humaine : le modèle cuprizone. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir une nouvelle méthode d'IRM fiable, non invasive et applicable en conditions cliniques pour quantifier la myéline in vivo, ce qui fait actuellement défaut pour le suivi des patients atteints de SEP. Cette nouvelle approche sera aussi utile dans le cadre d’autres pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer. Ceci est d'autant plus important que le développement de thérapies innovantes visant à favoriser la remyélinisation (c’est-à-dire visant la réparation de la myéline atteinte, et donc la protection des neurones), devient une priorité depuis quelques années.

Procédures

Le traitement par cuprizone sera administré per os, directement incorporé au sein de la nourriture habituelle des souris, à la concentration de 0,2%. Les animaux bénéficieront de 2 à 4 sessions d’anesthésie générale gazeuse, afin de permettre leur immobilité et de réduire leur stress lors des examens par IRM. Chaque session aura une durée maximale de 2 heures.

Impact sur les animaux

L’administration du traitement par cuprizone peut entraîner chez la souris des troubles moteurs légers, à savoir principalement des troubles de la coordination et locomotion. Elle peut aussi entraîner des troubles comportementaux liés à des problèmes de mémoire et d’apprentissage, pouvant être à l’origine de comportements anxieux ou dépressifs. La cuprizone peut également avoir des effets physiologiques généraux avec une perte de poids et une baisse de l’activité. Toutefois, dès que l'on arrête de donner le produit à la 6ème semaine, le cerveau cesse d'être attaqué. Cela marque le début d'une phase de guérison où l'animal retrouve progressivement sa forme et son comportement normal. Par ailleurs, il peut y avoir un stress lié aux transports des souris entre les animaleries et la plateforme d'imagerie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de prélever et analyser leur cerveau. Cette étape est indispensable pour vérifier que les images obtenues en IRM reflètent bien la réalité biologique observée dans le cerveau.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est obligatoire pour valider la robustesse de nouveaux paramètres IRM dans des conditions biologiques réelles. Ces validations constituent une étape incontournable avant toute transposition en clinique. A ce jour, malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, aucune alternative non animale ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des mécanismes de démyélinisation et de remyélinisation in vivo.

Réduction

Le nombre de 18 souris est nécessaire et suffisant pour analyser la perte de myéline induite par le traitement à la cuprizone, la reconstitution de la myéline tout en considérant les variabilités inter-individus, aux 3 points temporels de notre étude. Le suivi longitudinal permet de réduire la variabilité inter-individuelle et le nombre total d’animaux utilisés, tout en évaluant la nouvelle technique IRM.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront prises au cours du suivi afin de réduire le stress engendré par les examens IRM répétés,les transports et les contentions multiples et les troubles induits par l'ingestion du médicament pour induire une démyélinisation . Ces mesures seront réalisées sous anesthésie générale, afin que l’animal ne bouge pas et permettra de diminuer le stress induit par le bruit des machines. L’hypothermie, induite par le passage dans la machine IRM sera prévenue par un maintien d’une température stable pendant toute la durée de l’anesthésie. Des points limites seront appliqués, conduisant selon la situation, à l’arrêt de la procédure et/ou à la mise à mort humanitaire conformément aux procédures en vigueur.

Choix des espèces

Le modèle cuprizone est le modèle de choix pour l'étude des changements du contenu en myéline dans le cerveau de souris. Il s’agira de souris femelles adultes ayant un développement cérébral achevé (âgées de 6 à 8 semaines) car la sclérose en plaques est une maladie du jeune adulte, touchant de façon prédominante les femmes.

192 souris axéniques, nées et élevées sans aucun microbe, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles reçoivent par gavage un microbiote intestinal de donneurs humains en surpoids, puis un régime riche en graisses, pour mesurer l'effet de bactéries lactiques et de lipides laitiers sur la santé métabolique. Un jeûne de six heures et un test de tolérance au glucose complètent le protocole. Le porteur décrit la souris axénique comme le seul modèle permettant d'attribuer les effets observés au microbiote transféré, sans microbiote résiduel pour brouiller les résultats.

Objectifs

Depuis quelques années, on sait que le microbiote intestinal joue un rôle dans le développement des maladies métaboliques telles que l’obésité ou le diabète de type II. Identifier des stratégies alimentaires qui permettraient de protéger le fonctionnement sain du microbiote intestinal est crucial pour contrer l’apparition de ces maladies. L’objectif de ce projet est de mettre en évidence l’impact de bactéries lactiques et de lipides laitiers d’intérêt sur la flore intestinale. Pour ce faire, ces produits ont été ajoutés aux microbiotes de donneurs humains en surpoids. Dans le cadre de notre étude, ces microbiotes modifiés vont être transférés à des souris totalement dépourvues de bactéries, soumises à une alimentation riche en graisses. Les résultats obtenus doivent permettre de mettre en évidence l’effet protecteur des bactéries lactiques et des lipides laitiers sur les désordres métaboliques et montrer, le cas échéant, que cet effet protecteur passe par une modification du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Le rôle du microbiote intestinal dans le développement des maladies métaboliques est maintenant reconnu. Trouver des moyens de moduler ce microbiote de façon favorable pourrait ainsi être une stratégie de prévention de ces pathologies. Dans ce cadre, les résultats obtenus pourraient permettre de concevoir des formulations de bactéries/lipides bénéfiques pour la santé.

Procédures

Tous les gestes techniques seront réalisés sur des animaux vigiles. Les souris seront gavées 1 fois à l’aide d’une sonde de gavage souple (durée 15 secondes maximum) pour l’inoculation du microbiote. A la dernière semaine du protocole, les souris seront soumises 1 fois à un test de tolérance au glucose. Au préalable, elles seront mises à jeun 6h. Puis elles recevront 1 gavage de glucose (durée 15 secondes maximum) pour un suivi de la glycémie pendant 2 heures durée inférieure à 10 secondes).

Impact sur les animaux

Aucune nuisance liée au régime riche en graisses n’est attendue. Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages, des pesées et des prélèvements. Les animaux seront soumis à une légère douleur au moment des prélèvements sanguins. Les animaux seront soumis à un jeûne de 6 heures ce qui entraîne un stress, ainsi qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever et analyser certains tissus (cerveau, pancréas, foie, tissu adipeux, intestin et contenu de caecum).

Remplacement

A l’heure actuelle, étudier l’effet du microbiote intestinal et d’une intervention nutritionnelle sur le développement de maladies métaboliques nécessite de recourir à l’animal car il n’existe aucun modèle in vitro ou in silico suffisamment complexe qui puisse être utilisé dans cet objectif.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après de précédentes études, 12 animaux par groupe expérimental semblent nécessaires pour obtenir des résultats rigoureux obtenus avec une intervention nutritionnelle.

Raffinement

Pour réduire au maximum le stress des animaux, ils seront habitués à être pris de leur cage au moyen d’un tunnel en plastique et à être manipulés. Un suivi visuel quotidien des animaux sera opéré et leur poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour limiter au mieux la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris. Les effets d’un régime hyperlipidique et les tests de glycémie sont bien connus chez ces rongeurs et nous pourrons comparer nos résultats à ceux d’études antérieures. De plus, la taille de ces animaux permet leur hébergement en isolateur, condition particulière permettant le maintien du microbiote étudié, empêchant l’air ambiant de le modifier. Ils seront étudiés à l’âge adulte (8 semaines), l’objectif étant d’étudier les effets du microbiote intestinal et d’une intervention nutritionnelle sur le développement des maladies métaboliques chez l’adulte. La souris axénique est un animal né et élevé en conditions stériles, totalement dépourvu de tout microorganisme. Ce modèle est indispensable à notre étude car il constitue le seul système permettant d'attribuer causalement les effets physiologiques observés aux microbiotes humains transférés. En effet, si les souris possédaient déjà un microbiote endogène, il serait impossible de distinguer les effets du microbiote transféré de ceux du microbiote résiduel de l'animal.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un traitement pendant un mois, par voie orale ou par injections quotidiennes, avant des tests de vision et d'audition sous anesthésie. Ces souris reproduisent une maladie génétique rare, la maladie de Charcot-Marie-Tooth, dont les troubles moteurs apparaissent vers six mois. Le porteur affirme que le recours à un modèle animal mammifère est "indispensable", aucun autre modèle ne présentant selon lui ces symptômes.

Objectifs

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une maladie génétique rare qui provoque une faiblesse des muscles, surtout dans les jambes et les pieds, rendant la marche difficile. Les patients peuvent aussi avoir des pieds déformés et une perte sensorielle. Une des formes les plus communes de cette maladie entraine une perte de la vue ou de l’audition. Cette maladie est causée par une mutation qui impacte le bon fonctionnement des mitochondries. A ce jour, les troubles de la vision et de l’audition n’ont pas encore été étudiés dans le modèle de souris qui reproduit cette maladie. De plus, il n’existe toujours pas de traitement efficace. C’est pourquoi nous proposons une nouvelle approche thérapeutique, en testant des molécules ciblant un récepteur clé dans le fonctionnement de la mitochondrie. Ce projet sera donc composé de deux objectifs : caractériser les troubles sensoriels du modèle souris et tester des molécules thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de caractériser la perte de vision et d'audition d'un modèle murin de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Il permettra également d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés par nos collaborateurs chimistes sur ces déficits neurosensoriels. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visée thérapeutique pour une pathologie n’ayant aucun traitement disponible à ce jour.

Procédures

Les animaux seront identifiés par marquage à l'oreille. LES MOLECULES THERAPEUTIQUES A TESTER SERONT EN PREMIERE INTENTION, DONNEES PAR VOIE ORALE, SOUS FORME DE PETITES GOUTTES DEPOSEES DELICATEMENT DANS LA BOUCHE, PENDANT 1 MOIS 6 JOURS/7, AVANT LES TESTS. SI LE GESTE N'EST PAS EFFICACE elles seront injectées quotidiennement dans le ventre en alternant la gauche et la droite, pendant 15 jours avant les tests fonctionnels. Deux tests d'évaluation de la vision seront réalisés sur animal vigile (durée 30 minutes) et sur animal anesthésié avec application d’un collyre dans l’œil pour dilater la pupille (durée 40 minutes). Le test auditif sera réalisé sous anesthésie (40 minutes).

Impact sur les animaux

La contention pour l’identification et les injections peut engendrer un léger stress et une douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des injections. Les troubles locomoteurs caractérisés qui se développent à partir de 6 mois vont entrainer une gêne pour l’animal. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi sera mise en place afin de garantir le bien-être animal. Tous nos tests d'exploration fonctionnelle sont peu douloureux et sans conséquence physiologique à part un léger stress

Devenir

A l'issue des 2 procédures, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation d'un modèle animal de la pathologie est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptômes locomoteurs rapidement. Cela permet l'élaboration plus rapide d'un traitement curatif. Les troubles sensoriels quant à eux doivent être caractériser avant de pouvoir tester un potentiel traitement. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal mammifère pour étudier les fonctions auditives pertinentes chez l’humain.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous nous sommes basés sur notre expérience sur un modèle avec des troubles sensoriels similaires associé à une analyse de puissance pour calculer le nombre d’animaux.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec des maisonnettes et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Pour éviter que ces souris ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur. Pour limiter l’agitation des souris présentant des troubles locomoteurs, l’enrichissement sera renforcé dans les cages (petites briques de bois, des frisures de papier kraft et des tubes en carton par exemple). Si nécessaire, la nourriture pourra être remplacée par du gel alimentaire. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. Tout au long du projet, une attention particulière sera portée au bien-être des animaux afin de minimiser au maximum la douleur, la détresse ou toute souffrance inutile. Les protocoles incluront l'utilisation systématique d'anesthésiques et d’analgésiques adaptés. Les points limites définis à l’avance feront l’objet d’une surveillance rigoureuse et quotidienne des animaux. Ces critères permettront de mettre un terme à l’expérimentation de manière anticipée si l’animal présente des signes de souffrance non contrôlable ou de détérioration de son état général (perte de poids significative, troubles moteurs graves, automutilation, perte d’autonomie, etc.). Le projet intègre également des techniques non invasives ou faiblement invasives ( examens auditifs/visuels) pour limiter l’impact des procédures sur les animaux.LA METHODE DE TRAITEMENT SERA RAFFINEE EN UTILISANT LA VOIE ORALE. L’euthanasie, lorsqu’elle est requise, sera réalisée selon les méthodes recommandées par les autorités compétentes (Directive 2010/63/UE), de manière rapide et sans douleur.

Choix des espèces

La pathologie étudiée est une pathologie multi-organes où les altérations locomotrices s'accompagnent de signes neurosensoriels. Un modèle de souris, permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles dans un schéma physiologique global d'évolution de la pathologie et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. Les tests neurosensoriels seront réalisés sur les souris à 3 âges différents DANS LES DIFFERENTS GROUPES afin de pouvoir déterminer à quel moment les troubles apparaissent. Une fois que le stade d’apparition des symptômes sera identifié, les tests neurosensoriels seront reproduits après administration des molécules thérapeutiques.

Exposées à l'alcool, opérées pour implanter un dispositif dans le cerveau, soumises à l'optogénétique, à des tests sociaux, à un stress de contention répété et à un isolement de dix jours, 756 souris enchaînent ces procédures dans des travaux impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour conserver leur cerveau. Ces souris portent une mutation liée à la dépendance à l'alcool chez l'humain. Une modification récente ajoute une pompe implantée sous la peau diffusant de la nicotine en continu. Le même animal traverse plusieurs de ces étapes successivement, ce qui réduit, selon le porteur, le nombre total d'animaux utilisés.

Objectifs

Les problèmes liés à la consommation d'alcool sont très courants et dangereux dans notre société. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), 5 % des décès dans le monde sont causés par une consommation excessive d'alcool. Pour mieux comprendre ce problème et trouver des solutions, il est important de savoir comment notre corps et notre environnement influencent cette dépendance. Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Toutefois, il reste difficile d'étudier ce lien chez les humains. Pour mieux comprendre, des chercheurs ont utilisé des rats qui avaient cette différence génétique. Ces rats avaient un risque plus élevé de rechute dans l’alcool après une période d’abstinence. De plus, ce gène joue un rôle important dans certaines parties du cerveau qui sont liées à la mémoire et aux relations avec les autres. Et les connexions entre ces zones du cerveau sont aussi liées à l’anxiété et au comportement social. L’objectif de cette recherche est d’étudier comment cette différence génétique affecte les émotions et les comportements sociaux, ainsi que la communication entre certaines parties du cerveau. Pour cela, nous utiliseront des souris spéciales qui ont cette même différence génétique, et les compareront à des souris normales. Nous observerons comment cela influence leurs comportements et leur consommation d'alcool, en étudiant aussi les différences entre les mâles et les femelles. Ensuite, nous enregistreront l’activité du cerveau des souris pour comprendre comment cette différence génétique change la manière dont les parties du cerveau communiquent entre elles. Puis nous essayeront de manipuler cette communication pour voir comment cela affecte les comportements sociaux des souris. Enfin, nous tenteront de remettre en place la version normale du gène dans le cerveau des souris pour voir si cela améliore leur comportement.

Bénéfices attendus

Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Mais on ne sait toujours pas vraiment comment cela fonctionne. Malgré les graves conséquences de la dépendance à l'alcool sur la société, il existe très peu de traitements qui fonctionnent bien, et la plupart des personnes dépendantes rechutent après avoir essayé d'arrêter de boire. Les personnes qui souffrent de dépendance à l'alcool peuvent avoir des comportements très différents. Par exemple, certaines peuvent être anxieuses ou avoir des comportements antisociaux. Il est cependant compliqué de savoir si ces comportements sont causés par la consommation d'alcool ou s'ils étaient déjà présents avant. Notre projet a pour but de mieux comprendre comment les émotions et les comportements sociaux sont liés à la consommation d'alcool. Nous voulons savoir si ces comportements viennent de la consommation ou s'ils existaient avant. De plus, nous voulons prendre en compte les différences entre les sexes, car les réactions des hommes et des femmes peuvent être différentes. Ce projet pourrait nous aider à plusieurs niveaux. En tenant compte des émotions et pas seulement de la quantité d'alcool consommée, nous espérons comprendre comment cette différence génétique augmente le risque de dépendance. Si nous découvrons des comportements chez les animaux qui ressemblent à ceux observés chez les humains, cela pourrait nous aider à tester des traitements adaptés aux différents types de dépendance. Cela pourrait aussi conduire à des soins plus personnalisés, qui prendraient en compte la personnalité, le type de consommation d’alcool et le sexe de chaque personne, pour une meilleure efficacité. Enfin, nous cherchons à comprendre quelles parties du cerveau sont affectées par l'alcool et comment cela influence les comportements sociaux et émotionnels. Cela pourrait permettre de créer de nouveaux médicaments pour aider les personnes à arrêter de boire et à éviter les rechutes, en fonction de leur profil émotionnel et social.

Procédures

Les animaux passeront par plusieurs étapes dans cette étude : Ils auront accès à un biberon avec une solution d'alcool, une fois par jour, pendant 6 à 12 semaines (144 animaux). Ils subiront une petite opération sous anesthésie, d'environ 30 à 45 minutes, pour implanter un dispositif dans le cerveau (468 animaux). L’activité de leur cerveau sera mesurée sous anesthésie profonde pendant environ 1 heure après avoir stimulé une région spécifique du cerveau (144 animaux). Une technique utilisant la lumière permettra d'activer ou de désactiver certaines parties du cerveau chez des animaux éveillés, pendant 3 minutes (180 animaux, dont 90 pour l'activation et 90 pour la désactivation). Ils participeront à un test pour observer leur comportement social pendant 10 minutes par jour, sur une période de 5 jours (612 animaux). Ils seront soumis à un léger stress de restriction de leurs mouvements pendant 15 minutes, jusqu’à 4 fois au total, avec au moins une semaine de repos entre chaque session (144 animaux). Un petit échantillon de sang sera prélevé sous leur mâchoire. Certains animaux auront ce prélèvement une fois (288 animaux), d'autres deux fois, avec au moins une semaine d'écart entre les deux prélèvements (252 animaux). Certains animaux seront places en isolement social dans une cage contenant une roue d'activite pendant une periode de 10 jours avant d'etre replaces en cage collective (72 animaux). MODIFICATION: CERTAINS ANIMAUX RECEVRONT UN PETIT IMPLANT SOUS LA PEAU POUR DIFFUSER UNE PETITE QUANTITE D'UNE SUBSTANCE (NICOTINE) EN CONTINU (n=24).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à plusieurs types de procédures expérimentales pouvant entraîner des nuisances de sévérité variable. Certains seront exposés de manière volontaire à une solution contenant de l’alcool sur plusieurs semaines. Cette consommation, laissée au choix de l’animal, peut induire des effets relaxants et une modification transitoire de l’état émotionnel. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale visant à accéder à des structures cérébrales. Cette procédure peut entraîner une douleur modérée et une légère perte de poids pendant quelques jours après l’intervention. Des complications peuvent survenir, telles qu’un saignement, une infection locale ou une perte du dispositif implanté, pouvant conduire à une décision de mise à mort. MODIFICATION: UNE AUTRE INTERVENTION CONSISTE A IMPLANTER SOUS LA PEAU UN DISPOSITIF PERMETTANT L’ADMINISTRATION CONTINUE D’UNE SUBSTANCE. CETTE PROCEDURE PEUT PROVOQUER UNE DOULEUR LOCALE MODEREE ET TRANSITOIRE AINSI QU’UNE LEGERE PERTE DE POIDS. ELLE PEUT EGALEMENT ENTRAINER DES MODIFICATIONS TEMPORAIRES DE L’ACTIVITE ET DE LA PRISE ALIMENTAIRE. Certains animaux feront l’objet de manipulations permettant de moduler l’activité de circuits cérébraux à l’aide de lumière. Ces manipulations peuvent induire un état anxieux léger et transitoire. D’autres procédures incluent la réalisation de tests comportementaux, pouvant générer un stress léger et de courte durée, ainsi que l’application ponctuelle d’un stress modéré. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés, entraînant une douleur brève au moment du geste. Enfin, certains animaux seront maintenus en isolement social pendant plusieurs jours, ce qui peut induire un stress modéré persistant durant toute la période d’isolement (10 jours maximum).

Devenir

A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Ce projet étudie la manière dont les souris reconnaissent les émotions et comment cela est lié à la consommation d'alcool. À ce jour, il n'existe pas d'autres méthodes pour faire ces recherches sans utiliser des animaux. De plus, nous voulons comprendre comment certaines mutations génétiques influencent ces comportements. C'est pourquoi nous devons utiliser des souris spéciales qui ont les mêmes mutations que celles que l'on retrouve chez l'humain

Réduction

Nous optimisons le nombre d'animaux utilisés en réalisant plusieurs tests sur chaque animal au lieu de multiplier les groupes. Ainsi, les animaux passeront par différentes étapes de manière séquentielle (comme des opérations, des prélèvements, ou des tests de comportement). Avant de lancer un protocole complet, nous faisons d'abord des essais sur un petit groupe de 4 à 5 animaux pour voir si cela vaut la peine de poursuivre. Cela nous aide à éviter d'utiliser trop d'animaux. Si les résultats sont prometteurs, nous passons à un groupe de 12 animaux, qui est le nombre minimum que l’on estime nécessaire pour avoir des résultats fiables. Nous vérifions également que les données sont bien réparties avant de les analyser avec des méthodes statistiques appropriées. MODIFICATION: ON AJOUTE UNE PETITE CHIRURGIE POUR PLACER SOUS LA PEAU UNE MINI POMPE QUI DIFFUSE EN CONTINU DE LA NICOTINE OU DU SERUM PHYSIOLOGIQUE, CELA LIMITE LES VARIATIONS DE CONCENTRATION DU PRODUIT DANS LE SANG ET PEUT AINSI REDUIRE LE NOMBRE DE SOURIS NECESSAIRES POUR OBTENIR DES RESULTATS FIABLES.

Raffinement

Nous ferons tout pour garantir le bien-être des animaux pendant l'étude. Lors des opérations, ils recevront une anesthésie pour les endormir et des médicaments pour soulager la douleur. Si l'opération dure longtemps, nous les hydraterons avec une injection pour qu'ils ne soient pas deshydratés au reveil. Tous les animaux vivront dans un environnement confortable, avec des matériaux pour construire des nids et des endroits où se cacher. Ils seront gardés ensemble pour maintenir leurs liens sociaux, et des techniciens vérifieront leur état chaque jour. Si un animal montre des signes de douleur, les techniciens préviendront immédiatement le responsable de l'étude pour prendre des mesures. Si nécessaire, nous donnerons des médicaments ou des crèmes pour les aider à guérir. Nous pouvons aussi leur fournir de la nourriture spéciale pour les aider à manger. Après certaines opérations, nous utiliserons des matériaux doux pour éviter d’endommager les implants. Les tests qui leur permettent d’interagir chaque jour contribuent aussi à leur bien-être. Tous ceux qui s’occupent des animaux sont formés pour le faire correctement. Enfin, si un animal doit être euthanasié, cela se fera de manière douce, sans douleur, pour minimiser ses souffrances. MODIFICATION: ON AJOUTE UNE PETITE CHIRURGIE POUR PLACER SOUS LA PEAU UNE MINI POMPE QUI DIFFUSE EN CONTINU DE LA NICOTINE OU DU SERUM PHYSIOLOGIQUE. CELA EVITE DE FAIRE DE NOMBREUSES INJECTIONS CHAQUE JOUR.

Choix des espèces

La souris est un animal souvent utilisé pour étudier le cerveau chez les vertébrés. Son système nerveux est organisé de manière similaire à celui des humains, et elle partage environ 95% de ses gènes avec nous, ce qui permet de transposer les résultats obtenus chez la souris à l'humain de manière assez fiable. De plus, la souris peut être génétiquement modifiée, ce qui nous aide à comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans de nombreuses maladies. Par exemple, grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées, nous pouvons étudier comment certaines mutations génétiques humaines affectent des molécules ou des récepteurs spécifiques dans le cerveau. Les souris adultes ont été choisies pour cette étude car elles présentent une maturation complète des systèmes physiologique et neurologique, nécessaire à l’analyse des processus socio-emotionnels. Plus spécifiquement, nous utiliserons des souris modifiées pour exprimer des mutations des récepteurs nicotiniques, liées à la dépendance à l'alcool chez l'humain. Les souris montrent également une variété de comportements sociaux et de réponses émotionnelles, ce qui en fait un modèle pertinent pour notre recherche sur les émotions et la consommation d'alcool.

Les souris dont la tumeur atteint un volume jugé hors éthique sont mises à mort avant le terme. 94 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur. Chaque animal subit deux chirurgies, l'une pour implanter des cellules cancéreuses dans le pancréas, l'autre pour exposer la tumeur à une lumière infrarouge, puis des séances d'imagerie répétées. Le projet teste si ce traitement couplé à la lumière améliore l'efficacité d'une chimiothérapie déjà approuvée dans le cancer du pancréas.

Objectifs

Le cancer du pancréas reste une problématique majeure de santé publique car il est particulièrement agressif et mortel. En France, près de 16 000 nouveaux cas ont été diagnostiqués en 2023, avec une incidence en hausse chaque année. À l’échelle mondiale, on estime qu’il y a environ 510 000 nouveaux cas par an, et il figure parmi les causes principales de décès par cancer. Ce qui rend ce cancer si problématique, c’est son diagnostic tardif : les symptômes sont souvent discrets ou non spécifiques, ce qui fait qu’une grande majorité des patients sont diagnostiqués à un stade avancé où la chirurgie - la seule option potentiellement curative - n’est plus possible. Cela se traduit par un pronostic très défavorable : le taux de survie à 5 ans est d’environ 10-11 %, bien inférieur à la plupart des autres cancers. En conséquence, il est aujourd’hui considéré comme l’un des cancers les plus meurtriers, et pourrait devenir la deuxième cause de mortalité par cancer d’ici 2030 si les progrès dans le dépistage et le traitement ne suivent pas. L’évaluation de nouvelles thérapies dans des modèles précliniques orthotopiques — c'est-à-dire des modèles animaux dans lesquels la tumeur est implantée dans l’organe d’origine (et non sous la peau) — est crucial car ces modèles mimétisent beaucoup mieux les tumeurs humaines : cela augmente la pertinence et la prédictivité des résultats avant de passer aux essais cliniques. Ce projet vise à caractériser l’efficacité d'une nouvelle thérapie dans un modèle de cancer du pancreas. Cette étude investiguera si la thérapie couplée à la lumière infrarouge améliore l'efficacité anticancéreuse du traitement standard approuvé dans le cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra potentiellement de faire émerger une nouvelle solution thérapeutique pour les patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie, ouverture et fermeture de la couche cutanée et abdominale - 5 minutes, à raison de deux fois dans la procédure. Une injection pancréatique - 30 secondes maximum, 1 injection intrapéritonéale - 30 secondes ou 1 injection intraveineuse – 1 minute. 2 pesées par semaine seront réalisées. Une anesthésie gazeuse d'une durée de 5min pour les séances d'imagerie à raison de 2 par semaine.

Impact sur les animaux

Tous les animaux subiront une première intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie gazeuse afin d’implanter des cellules cancéreuses dans le tissu d’origine, puis une seconde intervention chirurgicale afin d’exposer le pancréas et la tumeur à la lumière infrarouge, ces procédures pouvant provoquer un stress. Après la prise tumorale, les souris pourront présenter une perte de poids ainsi qu’une augmentation progressive du volume tumoral, pouvant entraîner une gêne. Les animaux recevront des injections intrapéritonéales et/ou intraveineuses pour les traitements, ce qui peut entrainer un stress. Les animaux seront régulièrement pesés et la prise tumorale sera mesurée par imagerie. La contention nécessaire à ces manipulations pourra générer un stress répété sur plusieurs semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure pour le prélèvement de la tumeur dans le cadre d’une analyse ultérieure. Les animaux seront également mis à mort si le volume tumoral atteint un volume hors éthique ou si un point limite a été atteint.

Remplacement

Ce projet vise à caractériser l’efficacité d’un traitement contre le cancer du pancréas. L’implantation dans l'organe cible permet aux cellules tumorales de se développer au sein de leur environnement d’origine, reproduisant ainsi de manière fidèle de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. À l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire les interactions complexes entre la tumeur et son environnement. En conséquence, aucune méthode alternative ne permet de remplacer l’utilisation de modèles in vivo pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Les procédures seront faites sur un nombre minimal d’animaux nécessaires afin d’avoir une prise tumorale correcte. Pour la procédure expérimentale, nous utiliserons un test statistique adéquat pour pouvoir conclure sur les résultats de l'étude. Nous avons déterminé qu'il nous faudra 94 animaux au total.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel zootechnique, qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements appropriés à la souche de souris (coton de nidation, tunnels pour jeux, maisonnette). Les procédures de greffe tumorale seront réalisées selon les bonnes pratiques de chirurgie expérimentale avec : • Des espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie • Une anesthésie et une analgésie adaptées à la procédure • Le maintien de conditions d’asepsie pendant toute la durée de la chirurgie

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est acceptée pour la recherche pré-clinique comme étant un modèle relativement prédictif de la pathologie humaine. De plus, utiliser la souris dans notre projet permet de recréer un microenvironnement tumoral similaire à celui présent chez l’Homme. Ainsi, la souris est le modèle de choix pour ce projet. Nous utiliserons des souris mâles et femelles. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 - 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Neuf séances d'imagerie sous anesthésie et une chirurgie stéréotaxique d'environ une heure trente : 5 088 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'étude injecte des vecteurs viraux dans le cerveau ou la veine pour cartographier leur diffusion selon la voie d'administration, en vue de futures thérapies géniques. Chaque animal subit aussi des prélèvements sanguins toutes les deux semaines pendant huit semaines. Leur mise à mort sert à collecter les tissus cérébraux pour analyse.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de définir de nouveaux vecteurs médicaments pouvant atteindre différentes structures du cerveau, selon différentes voies d’injection. La thérapie génique par vecteur viral a démontré durant la dernière décennie son efficacité pour le traitement des maladies d’origine génétique. Ainsi, de nouveaux médicaments ont reçu leur autorisation de mise sur le marché. Néanmoins, de nombreux défis restent à relever. Premièrement, selon la maladie ciblée il est important de redessiner une stratégie. En effet, les essais cliniques nous montrent qu’une même stratégie par vecteur viral peut avoir des effets opposés et cela même si les maladies sont proches. Deuxièmement, concernant le traitement de maladies du cerveau, le type d’injection (dans le cerveau ou dans le sang) affecte la dispersion du produit et donc, les cibles atteintes. Des études préliminaires ayant démontré l’amélioration de la distribution d’un vecteur viral modifié pour les structures cérébrales en injection locale chez la souris, nous évaluerons l’efficacité de nos candidats selon différentes voies d’injections. Ces résultats permettront d’utiliser les meilleurs vecteurs dans les meilleures conditions d’injection lors des études de preuves de concept pour le traitement de différentes maladies neurodégénératives, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats robustes. (MODIFICATION) De plus, nous effectuons une demande de modification de projet, afin d’ajouter de l’imagerie par bioluminescence et quelques modifications mineures ne modifiant pas le nombe total d’animaux impliqués (MODIFICATION).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les nouveaux vecteurs médicaments. Ainsi, lors des études de preuve de concept dans des modèles de maladies neurodégénératives, seuls les vecteurs médicaments atteignant les cibles d’intérêt de manière adéquate (temps et quantitativement) seront injectés via la route d’injection la plus pertinente, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à la définition des conditions thérapeutiques. Ce projet permettra in fine le développement de médicaments innovants pour les maladies neurologiques.

Procédures

L’injection locale dans le cerveau est réalisée sur animal préalablement anesthésié et analgésié et maintenu sous anesthésie. La tête de l’animal est maintenue en position fixe par un dispositif permettant d’établir des coordonnées précises du cerveau. Cette chirurgie est réalisée, une seule fois par animal. La durée totale de la procédure est d’environ 1h30 pour les phases de pré-chirurgie et chirurgie, puis jusqu’au réveil de l’animal. L’injection par la voie intraveineuse est réalisée sur un animal vigile sous contention après dilatation préalable des veines de la queue (chauffage). Ce geste est réalisé, une seule fois par animal. La durée maximale est de 5 minutes sous contention. Tous les animaux auront des prélèvements sanguins permettant de mesurer la réponse immunitaire à une fréquence de 1 fois toutes les 2 semaines pendant 8 semaines. (MODIFICATION) Chaque prélèvement durera 5 minutes sous contention si l’animal est vigile ou sous anesthésie s’il est effectué lors d’une session d’imagerie. L’imagerie in vivo est réalisée sur animal anesthésié a raison de 2 sessions la première semaine puis hebdomadairement jusqu’à la 8ème semaine soit 9 sessions de 30 minutes chacune (MODIFICATION) Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure.

Impact sur les animaux

La chirurgie sera associée à un risque saignement pendant la chirurgie puis de douleur et d’inconfort post-opératoire pendant quelques jours. (MODIFICATION) Les anesthésies générales nécessaires pour cette chirurgie et pour les imageries seront associées à un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de détresse cardio-respiratoire (MODIFICATION). Les prélèvements sanguins génèreront une brève douleur et un inconfort au point de prélèvement, il existe également des risques de saignement et d’hématome. (MODIFICATION) Les trois types d’injections périphériques seront associées à un stress lors de la contention et une légère et brève douleur au point d’injection (MODIFICATION).

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus d’intérêt pour nos analyses.

Remplacement

Le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation d’un virus médicament pour véhiculer un gène médicament jusqu’aux cellules à traiter. Les interactions entre le virus médicament et les différentes composantes de l’organisme (système immunitaire par exemple) ne peuvent pas être toutes reproduites simultanément dans les modèles cellulaires ou informatiques. De plus, le système nerveux est un système complexe ayant une structure tridimensionnelle particulière, ne pouvant être reproduite. Parallèlement à l’utilisation d’animaux, nous mettons en place des cultures de tissus qui nous permettront de réaliser une première sélection de nos virus médicaments, limitant ainsi le nombre d’animaux injectés.

Réduction

La stratégie choisie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés (5088). Seuls les virus médicament ayant été décrits comme efficaces dans le cerveau seront testés, réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. Par ailleurs, des mâles et des femelles seront inclus dans les études afin d’obtenir la meilleure représentativité des réponses biologiques et de réduire le nombre d’animaux sans introduire de biais et permettant ainsi d’optimiser l’élevage des animaux achetés chez les éleveurs agréés. Ces résultats seront ensuite utilisés pour alimenter les programmes d’essais de thérapie génique dans les modèles de maladies neurodégénératives. Ainsi le nombre d’animaux présentant un phénotype délétère dans les prochaines études pourra être réduit. Approche statistique : Basé sur les connaissances actuelles dans le domaine de la thérapie génique, nous avons alors utilisé un test statistique définissant un nombre de 6 souris par groupe.

Raffinement

Des études pilotes permettront de déterminer la dose optimale de virus médicament, la vitesse d’injection, le pic d’expression de nos vecteurs et le nombre de points d’injection nécessaires et suffisant pour assurer le meilleur traitement. Condition de vie des animaux : les animaux seront hébergés en groupes sociaux avec du matériel de nidification et un abri dans chaque cage afin de limiter le stress. Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée. Les souris seront pesées avant injection puis toutes les semaines afin de suivre les variations de poids. Les souris sont manipulées régulièrement pour s’habituer à l’utilisateur Procédure d’injection locale : les animaux seront traités avec des anesthésiques et analgésiques avant et jusqu’à 3 jours après la chirurgie. Toute suspicion de souffrance animale sera soumise à un examen du vétérinaire présent à l’animalerie qui validera la nécessité de mise à mort ou non de l’animal. Procédure d’injection systémique : les animaux seront placés dans un appareil de contention, sous lampe chauffante afin de maximiser la dilatation des veines de la queue et de réduire le temps de contention. (MODIFICATION) Imagerie in vivo : l’appareil qui sera utilisé intègre un système chauffant permettant de maintenir les animaux à 37-38 degrés Celsius tout au long de la session d’imagerie limitant ainsi le risque d’hypothermie lié à l’anesthésie (MODIFICATION).

Choix des espèces

Il a été démontré précédemment que la souris est un modèle prédictif du potentiel thérapeutique chez l’homme. De plus, les différents modèles de maladies neurodégénératives étants principalement murins, il est nécessaire de valider les différents paramètres dans cette espèce afin de réaliser de façon efficace et optimale le développement de nouveaux traitements. Des animaux de 8 à (MODIFICATION) 16 (MODIFICATION) semaines seront utilisés. Ce stade correspond à un plateau dans le développement du cerveau de la souris couplé à un système immunitaire mature. De plus, la taille des animaux à cet âge est adequate avec un taux de récupération post-chirurgie plus élevé (moins de surcharge pondérale et de maladies métaboliques réduisant ainsi les risques liés à l’anesthésie et à l’analgésie)

8 028 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'opiacés, d'opioïdes ou de cocaïne, jusqu'à vingt administrations, puis un candidat médicament, pour mesurer l'effet de récompense de ces drogues dans un test de préférence de place. Le porteur affirme qu'aucun test sans animal ne permet d'évaluer le caractère renforçant d'une substance. Il indique aussi qu'aucun analgésique opiacé ne sera administré, car il fausserait le protocole, les animaux traversant donc ces procédures sans cette prise en charge de la douleur.

Objectifs

Les opiacés constituent une famille de substances dérivées de l'opium, lui-même tiré de la culture du pavot (Papaver somniferum). Leur produit de référence est la morphine, à partir de laquelle est produite l'héroïne (ou diacétylmorphine). Par rapport aux opiacés, le terme "opioïde" inclut également des molécules qui ont un effet de type morphinique, mais qui sont produites par synthèse. Les opiacés et les opioïdes possèdent le même mécanisme d'action. Ces médicaments agissent sur les récepteurs opioïdes du système nerveux central pour soulager la douleur, mais ils présentent également un risque élevé de dépendance, de sensibilisation (les doses doivent être augmentées pour en ressentir les effets) et d'effets secondaires graves, notamment la dépression respiratoire pouvant aller jusqu’à la mort. Ils sont à l’origine des dizaines de milliers de morts par an dans le monde. La polyconsommation (opiacés ou opioïdes avec la cocaïne) est observée chez environ 10% des usagers de drogues par voie intraveineuse ou usagers réguliers d’opioïdes, cocaïne ou amphétamines (observatoire français des drogues et des tendances addictives). Elle permet à l’usager de gérer ou de potentialiser les effets des produits psychoactifs. Cette pratique est d’autant plus risquée que le consommateur s’expose à des dangers souvent méconnus. La mise en place expérimentale d’une dépendance par ce type de molécules se fait par l’induction d’effets gratifiants (appelé aussi mécanismes de récompenses) que l’on peut mettre en évidence chez le rongeur dans un test comportemental appelé le test de préférence de place. Dans un premier temps, nous souhaitons mettre en place le modèle chez la souris afin de mesurer l’effet gratifiant des opiacés et opioïdes. Puis de nouveaux candidats médicaments seront testés afin de permettre de développer de nouvelles molécules pour lutter contre l’addiction aux opiacés et opioïdes. Afin d’étudier l’effet de candidats médicaments sur la dépendance induite par polyconsommation de drogues, nous développerons le modèle de préférence de place en co-administrant les opiacés (ou opioïdes) et la cocaïne.

Bénéfices attendus

L'augmentation de la prescription d'opioïdes ou opiacés pour gérer la douleur chronique s'est accompagnée d'une hausse spectaculaire de leur abus, ce qui constitue aujourd'hui un problème majeur de santé publique. Des dizaines de milliers de personnes meurent chaque année dans le monde suite à la prise abusive d’opiacés ou d’opioïdes. De plus, la polyconsommation de ces substances avec la cocaïne augmente significativement le risque de mort pour les consommateurs. Ce projet est destiné à découvrir de nouveaux candidats médicaments visant à améliorer la prise en charge des patients souffrant d’addiction aux opiacés et à la cocaïne.

Procédures

Un prélèvement de sang sera réalisé en fin d'étude sur animal anesthésié en submandibulaire ou intracardiaque juste avant la mise à mort (volume maximum 1 ml/souris). Les animaux recevront selon les différentes procédures plusieurs administrations de substances addictives (Opiacé ou Opioïde et/ou Cocaïne) par voies intrapéritonéale ou sous-cutanée (2/jour de test maximum soit au total 20 d’une durée inférieure à 30 seconde) et l’administration de candidat médicament par voies orale, voies intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse (1/jour de test maximum soit un total de 11).

Impact sur les animaux

L’administration répétée d’opiacés aux doses utilisées dans la préférence de place peut induire une augmentation de l’activité locomotrice transitoire après l’injection ou à l’inverse, une sédation transitoire. Une diminution temporaire de la prise alimentaire peut également être observée. De plus, l'administration répétée de telles molécules peut induire également une sensibilisation. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaitre. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. Les tests de comportement de courte durée 30 min par jour ne provoquent pas de contrainte physique particulière.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, des prélèvements de sang et d’organes sont possiblement prévus sur les animaux pour compléter l’étude comportementale avec des études sérologique, histologique, cellulaire ou moléculaire.

Remplacement

Le développement de candidats médicaments, en amont de l’utilisation de l’animal, est réalisé en plusieurs étapes : l’identification de la cible thérapeutique (pathologie), la compréhension des voies neurobiologiques de cette pathologie (la dépendance), la découverte de composés modulant la cible thérapeutique (Hits), l’optimisation de ces composés pour améliorer leur spécificité, leur profil pharmacocinétique et leur sécurité (Hit-to-Lead), leur validation fonctionnelle in vitro (cultures de neurones, organoïdes) et leur évaluation pharmacocinétique et toxicologique in vitro. Suite à cette étape et en amont du présent projet, des études in vivo pourront également être réalisées ou sous-traitées par le donneur d’ordre afin de déterminer plus précisément leur pharmacocinétique et leur toxicité. L’ensemble de ces études permet de choisir les doses dénuées de toxicité, ainsi que la voie et le temps d’administration qui seront optimales pour le projet objet de cette DAP, la préférence de place. Si une dose du candidat médicament montre une quelconque toxicité, les doses seront revues et donc diminuées à des doses non toxiques. Le test de préférence de place permet d’évaluer un des aspects de l’addiction : le caractère renforçant positif, c’est-à-dire le plaisir induit par la prise d’un composé, et par conséquent d’évaluer la potentialité d’un produit à réduire le caractère renforçant positif du composé addictif. Il n’existe à ce jour aucun test n’utilisant pas l’animal pour évaluer cette potentialité. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. Aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Le test utilisé dans ce projet ne peut donc pas être remplacé par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Etant donné la variabilité des réponses aux candidats médicaments, 12 animaux par groupe sont prévus afin d'assurer un nombre minimum d'animaux nécessaires pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront pesés tous les jours de passage en test (c'est à dire tous les jours sauf le week-end) et leur état général sera quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance spécifique à l’étude pour détecter des signes éventuels de douleurs. Si un animal démontre un état physique dégradé (ex : perte de poids entre 11 et 15 %) mais n’atteint pas un des points limites, des procédures particulières seront mises en place (alimentation hydratée, hydrogel et Administration de Ringer Lactate). L’utilisation d’analgésique de type opiacé ne pourra pas avoir lieu dans ce projet au regard des substances psychoactives déjà utilisées. L’effet de ces analgésiques interviendrait dans le principe même du projet et pourrait créer un biais expérimental important quand à l’exploitation des résultats. Il pourrait également y avoir un risque d’overdose pour les animaux. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et l’humain fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur la dépendance aux opiacés dans toute sa complexité. Et ils sont donc nécessaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. La souche C57Bl/6 a été choisie dans ce projet car ces souris développent facilement une réponse de renforcement nette et reproductible et comparées à d'autres souches (DBA/2 et autres...) elles présentent une grande sensibilité à la récompense opioïde. Elle est la plus utilisée dans la littérature scientifique. Au minimum 6 à 8 semaines au début de l’analyse comportementale. Dans ce projet, seuls les animaux adultes sont utilisés car il n'a pas pour objectif d'étudier les effets des candidats médicaments sur l'animal à d'autres stades de développement.

Pour valider une méthode mesurant si des œufs d'Echinococcus prélevés sur des aliments restent infectieux, 90 souris reçoivent ces œufs en injection sous la peau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une masse parasitaire se développe au point d'injection sur une période allant jusqu'à quatorze semaines, avec possibles lésions ou abcès. La mise à mort est requise pour observer le développement du parasite par identification moléculaire. Le porteur signale qu'une méthode in vitro est en cours de développement au laboratoire, mais qu'elle n'est pas encore comparable.

Objectifs

Contexte : Les échinococcoses sont des maladies parasitaires transmises par les aliments d’importance majeures au niveau européen et mondial. Deux formes de ce parasite sont décrites en France, l'échinococcose alvéolaire (EA) et l'échinococcose kystique (EK). Chez l’Homme, les deux maladies ont une localisation principalement au niveau du foie mais également des poumons pour l’EK. Elles se caractérisent toutes deux par une longue période asymptomatique pouvant atteindre 15 ans, rendant presque impossible l’identification précise des sources individuelles de contamination. L'Homme se contamine par ingestion accidentelle d’œufs microscopiques du parasite disséminés dans l’environnement (aliments non cuits, sol, eau, etc…) via des selles de carnivores (essentiellement renards et chiens contaminés). En Europe, dans les salades et les baies, les taux de contamination de ces parasites sont estimés entre 0 et 7%, avec une moyenne de 1 à 5 œufs détectés. La viabilité d’œufs provenant d’aliments de consommation humaine n’a jamais pu être démontrée directement faute de méthode adaptée. Une seule étude, datant de 2015, a démontré un développement dans 100% des souris (4/4) après une inoculation en sous-cutanée de 20 œufs de parasites. Ainsi, aucune donnée n’est existante pour une quantité inférieure à 20 œufs, ni avec des œufs isolés à partir d’aliments de consommation humaine. L’objectif de l’étude : Valider la méthode de viabilité chez des souris, utilisée dans une publication de 2015, pour deux espèces principales d’échinocoques. Les œufs seront inoculés en sous-cutanée avec et sans débris d’aliments afin de reproduire les conditions de la publication et d’adapter la méthode pour répondre aux enjeux. Perspectives et enjeux globaux : L’étape suivante sera donc d’évaluer la sensibilité de cette même méthode pour de faibles quantités de parasites (5 à 1 œuf), représentatives des taux moyens retrouvés sur des aliments contaminés (salades, baies, etc…). Ainsi, cette méthode de viabilité pourrait être utilisée à partir d’aliments collectées sur le terrain pour contribuer à l’évaluation du risque de contamination alimentaire pour l’Homme.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote permettra d’évaluer pour la première fois la sensibilité de l’approche in vivo en sous-cutanée sur deux espèces d’échinocoque en présence et absence de matrice alimentaire. Les données produites serviront ensuite à mettre en place des études visant à évaluer la pertinence de l’approche in vivo pour prouver la contamination de matrices alimentaires par des œufs viables d’échinocoques pour la première fois et d’en estimer la proportion. En effet, la viabilité d’œufs d’échinocoques sur des matrices alimentaires n’a encore jamais été démontrée alors que pourtant admise d’où la classification comme parasites transmis par les aliments. Disposer de données sur la proportion d’échantillons de type salades, fraises ou myrtilles contaminés par des œufs infectieux d’échinocoques permettrait de préciser la contribution relative des aliments parmi les sources de contamination humaine et de fournir des valeurs chiffrées pour l’évaluation du risque pour l’échinococcose alvéolaire (EA) et kystique (EK).

Procédures

Identification par puce électronique et injection d'œufs de parasites pour voie sous-cutanée - anesthésie générale légère - 1 seule fois - durée =1 minute. Prise de sang totale intracardiaque par voie intercostale - anesthésie générale par voie intrapéritonéale - 1 seule fois - 5 minutes

Impact sur les animaux

Le développement d’une petite masse parasitaire sous-cutanée (au site d’injection) est attendu avec une possible faible prise de poids sur une période maximale de 14 semaines. Des lésions ou abcès transitoires peuvent être observés au site d’injection durant les semaines suivant l’injection.

Devenir

L’objectivation du développement du parasite nécessite une observation macroscopique combinée à une identification moléculaire nécessitant la mise à mort de l’animal au préalable. De plus, les animaux témoins, bien que non infectés, seront trop âgés pour être réutilisés dans d’autres procédures.

Remplacement

Une méthode alternative via la culture de cellules (in vitro) est en cours de développement au sein de notre laboratoire afin d’essayer de pallier à l’utilisation d’animaux (in vivo). Toutefois, comme il n’existe pas de bibliographie permettant de comparer les deux méthodes de viabilité (in vitro et in vivo) pour de faible quantité d’œufs d’échinocoques sur matrice alimentaire, il est nécessaire de tester parallèlement la sensibilité de la méthode de viabilité in vivo. Ainsi, nous pourrons statuer sur la méthode la plus adaptée pour répondre à nos problématiques afin d’améliorer les connaissances et la prévention.

Réduction

Le projet utilisera 90 souris sur 3 ans. En raison du manque de données dans la littérature et en se basant sur un test statistique, des hypothèses formulées et des efficacités fixées, 8 souris seront utilisées par groupe pour les modalités tests et 5 souris pour les modalités témoins. Ces effectifs ont été réfléchis pour que les résultats obtenus soient recevables statistiquement tout en utilisant un minimum de souris.

Raffinement

Afin de limiter les anesthésies, les souris subiront le même jour l’injection sous cutanée décrite dans les procédures, ainsi que la pose du transpondeur. Le transpondeur permet d’identifier l’animal mais également la prise de température simplifiée en limitant le stress. Selon les résultats de la première étape, un antibiotique dans l’eau de boisson sera utilisé dans la procédure suivante afin d’éviter une infection de type abcès suite à l’injection de matrice alimentaire. En plus de limiter la gêne de l’animal cela améliorerait les chances de développement parasitaire puisqu’un abcès pourrait nuire ou éliminer les parasites injectés. Afin d’améliorer leur bien-être, les souris seront hébergées par groupe (8 pour les tests et 5 pour les témoins) et bénéficieront d’un enrichissement (carton, abris, cellulose et bâton de bois) dans les cages. L’utilisation d’anesthésique et d’un antidouleur seront employés afin de limiter la douleur et le stress des souris lors des actes opératoires. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraînera la mise à mort compassionnelle de l'animal.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires du parasite responsable de l’échinococcoses alvéolaire (EA) sont les rongeurs sauvages mais plusieurs études ont déjà utilisé des souris comme modèle de viabilité. S’agissant du parasite responsable de l’échinococcose kystique (EK), le mouton est l’hôte intermédiaire principal. Toutefois des rongeurs, dont les souris, ont déjà été utilisés pour étudier la viabilité des œufs de ce parasite. Ainsi, pour ces deux espèces parasitaires, la souris est sensible au développement parasitaire et constitue donc le modèle de choix. De plus, pour des raisons de reproductibilité de la seule publication ayant injecté un faible nombre d’œufs d’échinocoques, les souris utilisées seront des femelles et auront entre 6 à 8 semaines. Le stade de développement des animaux n'aurait pas d'influence sur la sensibilité au parasite et le développement de la forme larvaire. Toutefois, pour des raisons de reproductibilité de la seule publication avec un faible nombre d’œufs, les souris utilisées auront 6 à 8 semaines.