Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
ONCO-SC Evaluation de thérapies cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées en sous cutané
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 5000
Près de 250 études par an, au gré des commandes des clients : 62 500 rongeurs, soit 57 500 souris et 5 000 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une société prestataire de recherche préclinique leur greffe des tumeurs sous la peau, dans la peau ou dans la graisse mammaire, puis leur administre des composés anticancéreux par le nez, la trachée, la bouche ou par injection, jusqu'à un prélèvement de sang terminal sous anesthésie profonde. Dans le résumé publié, la description des effets néfastes s'arrête au milieu d'une phrase, sur "une évolution du volume tumoral". Le porteur affirme que seuls les petits rongeurs offrent un statut immunodéprimé "indispensable à l'implantation de cellules tumorales humaines". Sur le devenir, il écrit seulement "Les animaux seront mis à mort", alors que le champ structuré déclare 3 000 souris et 200 rats réutilisés.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cette évaluation chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Implantation de transpondeur pour identifier l’animal en sous cutané, sous anesthésie générale (Isoflurane 3-5%) en conditions d’asepsie, réalisée entre 0 et 3 jours avant la greffe. Induction tumorale : Sous anesthésie Test de composés chimiques ou biologiques : - Administrations intra-nasales sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%), maximum 25µL par narine. - Administrations intratrachéales sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%). - Administrations IV, IM, IP, SC et ID sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%) si nécessaire, si possible sous contention. - Administrations PO sous contention Mesure des animaux : sous contention Prélèvements : - Sang : o prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale à l’isoflurane (exemple non exhaustif : veine faciale, jugulaire, caudale, ou sinus rétro-orbitaire). o prélèvement par piqure à la veine caudale potentiellement uniquement sous contention. o prélèvement terminal (grand volume de sang) par ponction cardiaque ou par prélèvement sinusal sous anesthésie générale profonde. Ensuite, constat de la mort de l’animal et si nécessaire dislocation cervicale. - Prélèvements de tissus (foie, cœur, poumons etc…) post mortem. Euthanasie : - Overdose d’anesthésique, confirmée par une deuxième méthode physique. Le pentobarbital sera évité en cas de prélèvement des poumons du fait de son caractère irritant. - Mise à mort par le CO2, confirmée par une deuxième méthode physique. Cette méthode sera évitée en cas de prélèvement des poumons. - Dislocation cervicale - Sur animaux inconscients, sans reprise de conscience avant de mourir : prélèvement de sang terminal et dislocation cervicale
Impact sur les animaux
Trois types de greffe pourront être faites dans ce projet : Sous cutanée, intradermique et dans la graisse mammaire. Dans chaque cas, il y aura une évolution du volume tumoral ce
Devenir
Les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individu. Près de 250 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 2 à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit. Pour des études de screening de composés ou de modèles, il sera proposé d’utiliser 1 à 3 animaux par groupe (Single Mouse Trial). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
Dans l’objectif de raffinement, toutes les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par la structure chargée du bien-être animal. Pour les nouveaux modèles la SBEA analysera les conséquences des procédures sur le bien-être des animaux, la validité des résultats scientifiques obtenus, et ils détermineront les points limites. Toutes les procédures invasives, mais aussi la plupart des procédures faiblement invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de mesure des volumes tumoraux sera adaptée à la vitesse de croissance du modèle tumoral. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal est observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance, sont suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. Trois types d’enrichissements sont systématiquement ajoutés (sizzle-dri (souris), hutte ou tunnel (rats), batônnets, nourriture dans la cage) La greffe de tumeur est une procédure de gravité modérée, réalisée sous anesthésie générale gazeuse à l’Isoflurane. Lorsque l’implantation de la greffe nécessite l’incision de la peau, la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection de buprenorphine, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. En cas de toxicité sur l’animal, afin de limiter la souffrance des animaux une procédure sous forme d’un arbre décisionnel validée par la SBEA sera suivi par l’équipe projet. Pour le raffinement, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Dans de rares cas il sera possible de travailler avec des animaux plus jeunes (4 semaines d’âge minimum pour leur réception et 6 semaines pour la manipulation).
Analyse vidéo de l’efficacité alimentaire individuelle en condition de groupe et de reconnaissance individuelle chez le bar
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
20 bars vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent un marquage externe et un accéléromètre implanté, puis sont élevés et mesurés pour tester une méthode vidéo d'évaluation de l'efficacité alimentaire en aquaculture. Le porteur qualifie les nuisances de limitées et maîtrisées, et indique tuer tous les poissons en fin d'essai pour ne pas les garder inutilement. Il juge le remplacement impossible, la mesure devant être faite in vivo sur l'espèce d'élevage.
Objectifs
L’efficacité alimentaire est le premier critère à améliorer en termes d’efficacité économique et environnementale dans tous les élevages et notamment en pisciculture. Ce caractère est cependant impossible à évaluer chez les poissons au niveau individuel car il nécessite de connaitre la ration ingérée par chaque poisson nourrit au sein d’un groupe de nombreux individus. Le projet vise à développer une méthode de quantification de l’ingéré individuel pour des poissons élevés en groupe en condition classique d’élevage, utilisant la reconnaissance d’individus par analyse vidéo et l’analyse de l’activité par accéléromètres. Dans le projet la procédure en expérimentation animale mise en oeuvre sur 20 poissons comprend: un marquage externe (marque individuelle colorée) et interne (accéléromètre), un élevage en condition normal durant 3 périodes de 2 semaines avec des mesures biométriques à intervalle régulier.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’une part la possibilité d’évaluer la prise alimentaire des poissons en condition de groupe pour calculer l’efficacité alimentaire individuelle, d’autre part la possibilité d’effectuer de la reconnaissance individuelle des poissons. La reconnaissance par intelligence artificielle permettra peut-être à terme d’enregistrer le comportement alimentaire des poissons sans avoir besoin de les marquer.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure incluant: un marquage intramusculaire, un marquage externe par et intrapéritonéal (avec une marque acoustique), suivis de 4 mesures biométriques.
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables sont a priori limités. La procédure mise en oeuvre est d'une sévérité légère et est maîtrisée par notre équipe sur cette espèce. Les conditions d'élevage en captivité ont été optimisées pour cette espèce.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure 1, afin de ne pas garder inutilement ces animaux expérimentaux
Remplacement
Le remplacement est impossible pour ces recherches qui impliquent la mesure in-vivo de l’efficacité alimentaire chez l’espèce d’intérêt aquacole Dicentrarchus labrax.
Réduction
Pour constituer une preuve de concept de la mesure de l’efficacité alimentaire par analyse vidéo le nombre de 20 individus a été choisi pour plusieurs raisons. Ce nombre est nécessaire afin d’obtenir des interactions sociales entre les individus (le bar est un animal grégaire) et suffisant pour avoir un échantillon représentatif des comportements alimentaires variés. Davantage d’individus compromettrait la capacité à évaluer l’ingéré par l’oeil humain. Moins d’individus ne permettrait pas d’effectuer des tests statistiques significatifs de corrélation entre l’ingéré estimé pour chaque poisson par les différentes méthodes.
Raffinement
Tout sera mis en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Pendant le marquage et les biométries nous utiliserons une procédure d'anesthésie optimisée pour cette espèce. Durant les phases d’élevage, les poissons seront en condition optimale d’alimentation (ad libitum alimentaire). L’alimentation sera effectuée en 4 points du bassin, créant ainsi de la variation dans l’environnement. La luminosité du bassin sera réglée afin d’optimiser l’apaisement des poissons avec l’utilisation d’un cycle correspondant à un ensoleillement avec 14 heures de jour et 10 heures de nuit comprenant une phase d’aube et de crépuscule.
Choix des espèces
Dicentrarchus larbax (bar) est une espèce importante pour la pisciculture. Explorer des moyens d'améliorer l'efficacité alimentaire de cette espèce est un enjeu majeur de développement durable de la filière. Le stade de développement des animaux utilisés est le stade adulte (350g).
Production d’anticorps polyclonaux chez le lama
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
250 lamas vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des anticorps par immunisations suivies de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la plupart sont gardés vivants et réutilisés d'une étude à l'autre, une minorité étant tuée pour prélever la quasi-totalité du sang. Les effets décrits se limitent au stress de la contention, des injections et des prélèvements, répartis sur environ vingt-cinq études par an pendant cinq ans. Il affirme qu'il n'existe "aucune méthode substitutive" et que cette production animale est "indispensable" à la recherche.
Objectifs
Les lamas sont aujourd'hui des animaux très utilisés dans la recherche basée sur les anticorps, les biotechnologies... En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, le plus faible coût de production, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de lamas. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic…
Bénéfices attendus
1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements.
Devenir
Dans certains cas (très rares chez le lama), les animaux inclus pourront être mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité de volume sanguin circulant. Dans le cas où le prélèvement terminal de la quasi-totalité du volume sanguin circulant n'est pas nécessaire (très souvent le cas), les animaux inclus pourront être gardés en vie et maintenus sur le site avec leurs congénères. Ils pourront ensuite être réutilisés dans d'autres études après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser.
Remplacement
La production d'anticorps polyclonaux nécessite une immunisation de l'animal et donc son utlisation. Il n'existe aucune méthode substitutive pour cette production qui est indispensable à l'avancement de la recherche, de la médecine, du développement de test de diagnostic...
Réduction
Le nombre d'animaux est choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Le lama permet d'obtenir des quantités de sérum suffisantes à l'atteinte des objectifs du projet, sans porter atteinte au bien-être animal. Ainsi, 1 ou 2 lamas seront immunisés par étude permettant ainsi d'obtenir une quantité suffisante de sérum. Le nombre de 2 lamas pour une étude sera choisi dans le cas de certaines études où il y a besoin de prendre en compte le facteur diversité/variation génétique qu'il peut y avoir entre 2 animaux. Un nombre de 25 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 250 lamas sur 5 ans. Sur ces 250 lamas, il y aura des possibilités de réutilisation de lamas d'une étude pour une autre étude, après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser. Dès que le caractère naïf des lamas n'est pas demandé et n'est pas utile pour l'étude, des lamas issus d'études précédentes seront utilisés dans le respect de leur bien-être et si leur état de santé le permet. Ainsi, cela permettra de réduire le nombre de lamas différents utilisés.
Raffinement
Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : pâture extérieure, litière de paille, brosse à vache, objects à manipuler...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.
Choix des espèces
Le lama sera ici utilisé pour la production d’anticorps. En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. Les animaux sélectionnés seront de jeunes adultes (entre environ 9 mois et environ 6 ans) car c'est à ce stade qu'ils sont entièrement immunocompétents.
Imagerie TEP-IRM pour l’identification des métastases chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteurs d'un cancer disséminé, ils subissent un jeûne, un prélèvement de sang et une imagerie sous anesthésie avec mise à mort avant réveil, pour valider une caméra hybride TEP-IRM de détection des métastases. Le porteur indique que les métastases peuvent toucher plusieurs organes et provoquer une perte de poids, les animaux étant suivis trois à cinq jours jusqu'à la mise à mort. Il écarte le remplacement au seul motif que l'étude des métastases ne peut s'affranchir du modèle animal.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. La mortalité des patients atteints de cancer est aujourd’hui principalement médiée par l’évolution des tumeurs primaires en maladie plus disséminées du fait de l’apparition de métastases. Il est aujourd’hui difficile en routine clinique de déceler les métastases dans toutes les parties de l’organisme en utilisant une seule technique d’imagerie. En effet, l’examen clinique de routine consiste dans la détection des cellules cancéreuses grâce à l’injection d’une petite dose d’un glucose radioactif. Les cellules cancéreuses étant très actives métaboliquement, elles vont fixer ce glucose et être détectées grâce à un examen d’imagerie TEP (tomographie par émission de positons). Cependant, On détecte aussi sur ces images des zones non cancéreuses car très consommatrices de glucose comme le cerveau ou le cœur, ou les voies d’éliminations du produit comme les reins et la vessie. Ces zones peuvent gêner à l’interprétation des images et masquer des lésions. Les caméras TEP sont la plupart du temps couplées à un scanner qui ne permet pas la détection de lésions cancéreuses. Une nouvelle technologie permettant d’obtenir un meilleur contraste au niveau des tissus mous comme l’IRM (imagerie de résonance magnétique) présenterait donc théoriquement un grand intérêt pour identifier des lésions rénales ou cérébrales non détectables en TEP. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est de montrer l’intérêt d’une caméra hybride permettant de réaliser en simultané 1/ une imagerie d’un traceur radioactif grâce à une caméra ou TEP, et 2/ une imagerie IRM dans un modèles animal de maladie métastatique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de montrer l’avantage de l’imagerie hybride TEP/IRM (en cours de développement pour des applications cliniques) dans la détection des métastases. A terme, le diagnostic des patients atteints de maladie métastatique sera amélioré. Il sera possible également de mieux suivre l’efficacité des traitements en examinant l’évolution des métastases de façon plus précise.
Procédures
les animaux subiront les actes suivant : * mise à jeun de 4-6h (avec accès à l’eau) * prélèvement d’une goutte de sang (10 à 20 µL) à la queue. * injection intraveineuse puis imagerie sous anesthésie avec euthanasie avant tout réveil
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de cancers disséminés sont susceptibles de présenter différents signes cliniques identifiés grâce à l’expérience de nos collaborateurs préparant le modèle. Ces signes sont en relation avec la localisation possible des métastases (ganglions lymphatiques, ovaires, surrénales, cerveau, os et poumons). La perte de poids est cependant le critère le plus souvent observé. Les animaux seront suivis quotidiennement de leur arrivée à leur euthanasie (3 à 5 jours maximum). Le suivi sera intensifié si des signes de détresse sont observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin d’imagerie afin de pouvoir identifier la localisation des métastases et valider notre technique d’imagerie diagnostique.
Remplacement
L’étude de la maladie métastatique et de traceurs du métabolisme ne permet pas de s’affranchir de modèles animaux.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons choisi de faire préparer le modèle par une équipe expérimentée afin de s’affranchir de l’utilisation d’animaux supplémentaires pour la mise en place du modèle. La réalisation de l’étude en 2 étapes nous permettra de stopper l’expérimentation si l’effectif est suffisant pour conclure et réduire le nombre d’animaux de moitié.
Raffinement
L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures impliquant les animaux (injection intraveineuse et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude.
Choix des espèces
Le modèle animal et les techniques d’imageries ont été développés et caractérisés chez le rat. Les rongeurs sont un modèle de choix en imagerie car leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.
FLAVOCONTROL : Phénotypage de la résistance à la flavobactériose de populations de truites commerciales pour une amélioration progressive par sélection génétique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
5 200 truites et saumons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 4 880 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont infectés par la bactérie Flavobacterium psychrophilum, par bain ou par injection, pour mesurer la résistance de populations commerciales en vue d'une sélection génétique. Le porteur indique que la bactérie peut tuer rapidement les poissons et qu'il est difficile de pratiquer une mise à mort entre l'apparition de signes cliniques et la mort. Il qualifie d'"indispensables" ces infections en milieu contrôlé et les rattache à l'amélioration des programmes de sélection des entreprises aquacoles françaises.
Objectifs
Ce projet a pour objectif le développement d’un dispositif permettant de réaliser des infections expérimentales en milieu contrôlé avec la bactérie pathogène des salmonidés Flavobacterium psychrophilum ainsi que le transfert d’innovation pour améliorer le contrôle de la flavobactériose pour les entreprises aquacoles françaises. Flavobacterium psychrophilum est un agent pathogène majeur des salmonidés (truites et saumons). On le retrouve aujourd’hui dans toutes les régions pratiquant la salmoniculture (Europe, Amérique, Asie du Nord-Est et Océanie). La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), principale espèce d’élevage en France, est très sensible à cette bactérie, aujourd’hui identifiée par les éleveurs comme la première source de nuisance d’origine pathologique dans les élevages. Dans le contexte de la maîtrise de la pathologie infectieuse en production aquacole, ce projet a comme objectif principal de développer un dispositif permettant de réaliser des infections expérimentales avec F. psychrophilum en milieu contrôlé. Ce dispositif expérimental permettra d’évaluer la résistance intrinsèque de quatre populations commerciales de truites et d’entreprendre pour 2 d’entre-elles une épreuve d’infection expérimentale à vocation de sélection pour identifier des marqueurs de résistance génétique par génotypage haut-débit. Ces expériences en milieu contrôlé sont indispensables pour contribuer à l'obtention d'un gain génétique maitrisé et permettre d'améliorer à long terme les programmes de sélection génomique sur la résistance à cette pathologie.
Bénéfices attendus
En France, la truite arc-en-ciel est la principale espèce produite. Quatre entreprises françaises ont développé des programmes de sélection et exportent du matériel génétique amélioré dans le monde entier. Ainsi, les progrès faits par les sélectionneurs français pourront potentiellement bénéficier à l’ensemble de la salmoniculture. Afin d’introduire le caractère de résistance à la flavobactériose dans les programmes de sélection des entreprises françaises, il est nécessaire de mesurer la résistance à l’infection de populations de manière maitrisée, en s’assurant notamment qu’il n’y a pas de co-infection par d’autres agents pathogènes. Ce projet s’intéresse au développement d’installations expérimentales permettant la réalisation d’épreuves infectieuses en conditions contrôlées à vocation, entre autres, de sélection génétique. Le génotypage des individus testés et celui de leurs parents donneront lieu ensuite à des analyses génétiques dans le but d’estimer l’héritabilité de la résistance à la flavobactériose, d’identifier des déterminants génétiques de la résistance et d’évaluer l’efficacité potentielle de la sélection génomique. Les retombées attendues sont une amélioration de la santé et du bien-être des poissons en élevage ainsi qu’une diminution de l’utilisation des médicaments.
Procédures
Les infections expérimentales sont réalisées soit par balnéation (une balnéation par poisson) soit par injection. Dans le cas des injections, elles sont réalisées sous anesthésie (tricaïne par bain) et une seule injection par poisson est réalisé par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. Les animaux sont mis à jeun 24 ou 48 heures avant l’infection (suivant le mode d'infection: 48h pour la balnéation et 24h pour l'injection) . Cette mise à jeun prévient toute régurgitation en cours d’anesthésie, diminue les besoins en O2 des poissons au cours des manipulations et limite l’excrétion de matières azotées lors de la balnéation durant 24h, contribuant donc à une meilleure qualité de l’eau.
Impact sur les animaux
Il est complexe de définir des points limites pour ce type d’expérimentation : le critère utilisé pour évaluer la résistance au pathogène de la population est binaire : mortalité (avec précision du temps post-contamination avant la mort) ou survie. La bactérie utilisée peut tuer rapidement les poissons contaminés sans qu’il soit possible de pratiquer une euthanasie entre l’apparition de signes cliniques (parfois peu évidents) et la mort. De plus, l’apparition de signes cliniques ne condamne pas forcément les poissons car certains sont capables de «récupérer». Néanmoins, des points limites sont definis dans ce projet pour limiter la souffrance des individus.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants afin de mettre en place une mesure individuelle de la résistance au pathogène et permettre in fine une sélection des individus génétiquement liés conservés dans le noyau de sélection. L’étude des caractères génétiques impliqués dans la résistance aux maladies infectieuses chez le poisson nécessite d’établir des liens entre génotype et phénotype (ie résistance/sensibilité). Le projet que nous menons chez la truite arc-en-ciel ne peut être réalisé sur cultures cellulaires car il est nécessaire, pour identifier des géniteurs portant des marqueurs de résistance, de soumettre les descendants à des épreuves d’infections expérimentales permettant d’obtenir des critères d'appréciation quantitative de leur résistance. Il n’existe aujourd'hui aucune alternative in vitro à l’évaluation de la susceptibilité des poissons à l’infection étudiée.
Réduction
Les résultats des expérimentations sont traités selon la méthodologie du BLUP (Best Linear Unbiaised Predictor) modèle animal. Cette méthodologie prend en compte les performances des individus testés pour estimer les valeurs génétiques de leurs collatéraux (les frères et sœurs des animaux soumis aux épreuves de sélection ) et permettre de les classer entre eux. Pour que ces estimations soient suffisamment précises, elles nécessitent un grand nombre de données et donc d’individus testés. Toutefois, le nombre d’animaux est réduit au seuil de la pertinence statistique et scientifique pour les approches utilisées. Les individus challengés dans ce projet seront issus d’un croisement de 100 mères et 100 pères. De ce fait, l’effectif total par croisement compte au minimum 20 individus par père, soit 2000 individus pour avoir des estimations de valeurs génétiques suffisamment précises. Ce nombre a été défini comme suffisant dans différentes études de simulations génétiques. En complément du nombre nécessaire à l’objectif de sélection génétique visé, une partie des poissons sera utilisée pour la réalisation de pré-tests (procédures 1 et 2) sur les différents lots à challenger afin d’évaluer la sensibilité des animaux et déterminer les conditions expérimentales optimales (doses, ...).
Raffinement
Une anesthésie par bain de tricaïne est réalisée avant de procéder à l’injection intramusculaire afin de limiter le stress des poissons. Tout au long de l'expérience, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 à 4 fois par jour (distribution, ration, Indices de conversion contrôlés=Quantité d'aliment distribué/Gain de biomasse). Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales (60g/l) sont rigoureusement respectées (loin des standards de la production). La qualité de l’eau est optimale et surveillée en permanence. Des points limites sont definis dans ce projet pour limiter la souffrance des individus.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est le modèle classique de la pisciculture continentale européenne : c’est la principale espèce d'élevage en France et c'est l'hôte naturel de Flavobacterium psychrophilum. Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants issus des partenaires privés afin de mettre en place une mesure individuelle de la résistance au pathogène et permettre in fine une sélection des individus. Pour l'évaluation de la sensibilité/résistance à l’infection par Flavobacterium psychrophilum, les animaux sont utilisés au stade alevin, soit à des stades relativement précoces (env 1 gr pour les challenges par bain et 5 à 10g pour les challenges par injection) où la sensibilité à des infections par Flavobacterium psychrophilum est maximale.
Impact du microbiote intestinal dans les maladies neurodégénératives – MICROBIOTALZ
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
1 389 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sur des souris modèles d'Alzheimer, le porteur décrit une déplétion du microbiote par antibiotiques ou laxatif pouvant provoquer des diarrhées, des prélèvements de sang et de selles, et un conditionnement par la peur reposant sur trois chocs électriques. Il indique que les souris donneuses de microbiote sont tuées d'emblée et que les receveuses le sont après les tests, pour analyse du cerveau. Le remplacement est écarté au motif que l'étude des déficits de mémoire ne peut se faire in vitro.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier le lien entre la dysbiose intestinale présente dans les souris 5xFAD, modèle transgénique de la maladie d'Alzheimer, et l'amplitude des déficits de mémoire de ces animaux. Nous souhaitons démontrer la causalité de la dysbiose intestinale sur les phénomènes mnésiques.
Bénéfices attendus
L'identification de souches causales et/ou protectrices de la pathologie constituera la base d'une prévention de la maladie d'Alzheimer basée sur la restauration d'un microbiote intestinal sain.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang (2 min) et de selles (1 min) : les fèces et environ 150μL de sang seront prélevés en sous-mandibulaire au démarrage de l'experimentation et à la fin de l'étude 60 jours plus tard.
Impact sur les animaux
La déplétion du microbiote endogène des animaux par antibiotiques ou laxatif peut induire des diarhhées qui seront toutefois temporaires car la réintroduction d'un microbiote intestinal complet traite immédiatement ces symptomes. Lors de la procedure de conditionnement par la peur, les 3 chocs électriques administrés aux animaux vont générer une douleur transitoire. Lors de la réexposition des animaux à l'environnement où ils auront reçu les chocs, un stress sera mesurable si leurs performances de mémoire ne sont pas altérées.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux donneurs de microbiotes sont mis à mort et ne rentrent pas expérimentation. A l'issue des procédures 1 à 3, les animaux receveurs sont conservés jusqu'à la fin des traitements et des tests de comportement. A l'issue de la procédure 4 (dernier test expérimental), tous les animaux sont mis à mort pour analyse de la pathologie cérébrale.
Remplacement
L’étude des déficits de mémoire nécessite l’utilisation d’animaux, ceci ne pouvant se faire sur des modèles in vitro.
Réduction
Le plan expérimental a été optimisé en déterminant qu’un nombre réduit de 12 souris receveuses par groupe était suffisant pour d’obtenir des résultats reproductibles et analysables statistiquement. Taille minimale des groupes receveurs : le nombre d’individu varie entre 9 et 22 animaux en fonction du test comportemental. Nos expériences seront réalisées sur des groupes de 12 animaux/traitement et reproduites sur 2 à 3 lots d’animaux différents soit au total 24 à 48 animaux/groupe (logiciel G*power, erreur α de 5%, puissance (1-β err prob) de 80%). Plan d'analyses statistiques (logiciel Graphpad Prism7) -Vérification de normalité des données : test de D'Agostino-Pearson -Distribution Gaussienne => analyse de variance à un facteur (ANOVA) puis test de Dunnett pour correction des comparaisons multiples par rapport à la condition Véhicule -Distribution non Gaussienne => test de Kruskal-Wallis puis test correctif de Dunn's -Niveau de significativité à p=0,05. La réalisation de plusieurs tests de mémoire durant le protocole permettra une optimisation de l'utilisation des animaux, évitant de multiplier les séries expérimentales. •Stratégie de réduction La réalisation de plusieurs tests de mémoire durant le protocole permettra une optimisation de l'utilisation des animaux, évitant de multiplier les séries expérimentales. Le suivi longitudinal des performances mnésiques produira un recueil de données multiples pour un même animal. Le projet prévoit une multiplicité d'analyses post mortem sur un même animal.
Raffinement
•Suivi des animaux Inspection - 2 à 3 fois par semaine avec prise de poids 2 fois par semaine, avant chaque injection. Une grille d’évaluation de l’état général de chaque animal sera remplie (présentée en annexe 2) avec identification de points limites où une prise en charge adaptée sera effectuée. •Hébergement et raffinement - Hébergement en cage collective contenant de l'enrichissement environnemental (matériel pour la nidification). Les animaux seront tatoués afin de pouvoir les identifier dans la cage collective. •Procédure de conditionnement à la peur - Le plan expérimental a été optimisé en déterminant qu’un nombre réduit de 3 chocs d'une durée courte de 2 secondes est suffisant pour d’obtenir des résultats reproductibles et analysables statistiquement. L'intensité des chocs sera adaptée à la taille/poids de l'animal au moment de l'expérimentation.
Choix des espèces
Les souris C57Bl/6J, utilisées dans nos études, représentent des lignées classiques pour les études en neurobiologie, principalement pour l'étude de la mémoire. La lignée de souris transgénique 5xFAD (fond C57Bl/6J) est également une lignée très utilisée pour modéliser la maladie d'Alzheimer car elle récapitule l'ensemble de la neuropathologie à l'exception de la pathologie Tau. L'extrême rapidité d'apparition des symptômes fait de cette lignée transgénique le modèle le plus adapté pour étudier une modification de l'apparition des déficits de mémoire induite par des interventions sur la composition du microbiote intestinal. Les souris Swiss présentent une alternative aux souris C54BL/6J, étant également de très bons modèles d'étude des performances mnésiques. Les études seront réalisées sur des animaux adultes car les pathologies étudiées seront des pathologies se développant à l'âge adulte.
Implication d’un récepteur à activité tyrosine kinase dans la formation du squelette craniofaciale chez le poisson zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
7 812 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés, ils subissent prélèvement de nageoire pour génotypage, bains chimiques, chocs thermiques et imageries répétées sous anesthésie, pour étudier une malformation du crâne liée au gène Fgfr3. Le porteur indique que des malformations craniofaciales, microcéphalie et scoliose, sont attendues et que les poissons dépassant les points limites seront mis à mort, l'atteinte n'étant pas présentée comme systématique. Il qualifie d'"indispensable" le développement de nouvelles thérapies et conclut au recours au poisson zèbre pour reproduire ces mécanismes.
Objectifs
Les craniosynostoses sont des maladies génétiques qui résultent d’un défaut du processus d'ossification et entrainent une fusion prématurée d’une ou plusieurs sutures crâniennes associées à des malformations crâniofaciales. Outre les problèmes esthétiques ces malformations sont responsables de troubles fonctionnels majeurs dus aux conflits de croissance entre crâne et encéphale qui provoque une hypertension intracrânienne. Aujourd’hui les traitements des craniosynostoses consistent en des interventions chirurgicales lourdes et répétées. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est indispensable et nécessite une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeux au cours de l’ossification dans des conditions normales et pathologiques. Les objectifs du projet seront de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la formation de la voûte crânienne en utilisant des poissons zèbres génétiquement modifiés. Les modèles de poisson zèbres utilisés et développés au cours de ce projet présenteront des malformations crâniofaciales mimant la pathologie humaine (microcéphalie, défaut des sutures) dont le caractère dommageable ne sera présent que tardivement au cours du développement environs 2 mois après la naissance. Les modèles de poissons zèbre développés permettront également de tester l'efficacité de différents composés pharmacologiques qui sont susceptibles de corriger ces malformations au cours de la formation de la voûte crânienne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’un point de vue fonctionnel de mieux définir le rôle de Fgfr3 dans l’ossification membranaire. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les osteochondrodysplasies liées à des mutations de fgfr3. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des craniosynostoses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients. L’établissement de ces modèles de poissons zèbres permettra d’effectuer le criblage de molécules.
Procédures
Procedure 1 à 8: Les animaux génétiquement modifiés subiront une fois dans leur vie des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour génotypage. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte par bain rapide de benzocaïne (1min), puis un segment de 2-3mm de la nageoire caudale est coupé. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Procédure 3: Les animaux seront baignés une fois dans du rouge alizarine et une fois dans de la de la calcéine pendant une nuit chacun. Procédure 4: Les poissons seront baignés 1 fois dans du tamoxifène pendant 7 heures Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 30 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 5: Les poissons seront baignés 1 fois dans de l'actiflash pendant 7 heures. Ils seront irradiés avec un laser UV 1 fois pendant 200fs sous anesthésie générale et maintenues dans de l'hydrogel durée 5 min. Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 10 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésie générale dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L) Procédure 6: Les poissons seront imagés 4 fois en 4 semaines pour cela ils seront maintenues sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 3 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 7: les poissons subiront une seule fois dans leur vie une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (benzocaïne 75mg/L) , l'anesthésie durera 5 min maximum. Procédure 8: les poissons seront soumis à un traitement pharmacologique par balnéation pendant 15 jours.
Impact sur les animaux
Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation Fgfr3 pPro262Arg, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lesion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis dans le projet seront euthanasiés. D'autre part les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs aux anesthésies répétées, aux chocs thermiques à 37°C, aux isolements nécessaires pour les acquisitions et pour le génotypage des poissons.
Devenir
l'ensemble des poissons de ce projet seront mis à morten fin de procédure
Remplacement
Pour la procédure 8, la sélection des molécules les plus spécifiques et efficaces permettant potentiellement d'améliorer le phénotype pathologique des poissons fgfr3P262R se fera au préalable in vitro afin de ne pas utiliser de poissons lors de cette étape de sélection.
Réduction
Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Les procédures d'imagerie in vivo se feront de maniere longitudinale (Un même individu est analysé à différents temps) ceci permettant d'augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d'individus analysés.
Raffinement
Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Afin d’effectuer le suivi des poissons ceux-ci seront regroupés par génotype et un dénombrement des poissons affectés par symptôme sera effectué quotidiennement. Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation fgfr3 pPro262Arg ; l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. La majorité des procédures seront pratiquées à des stades précoces (environs 6 à 10 semaines post fécondation du développement de la voûte crânienne), stade où les malformations crâniofaciales dommageables sont nulles ou très légères et ne sont pas susceptible d'induire de la souffrance. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Les poissons dont le score dépasse les points limites définis dans le projet seront euthanasiés par surdosage de benzocaïne à une concentration dans l'eau de nage de 375mg/L pour une durée de 15 min. La mort des poissons est visualisable par la perte de flottaison qui suit une période d'anesthésie qui est observée en moins de 2 minutes. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un confocal de type spinning disk permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie qui sera réalisée dans une solution de benzocaïne tamponnée à 75mg/L. Lors de l'acquisition d'images ou de l'irradiation des poissons avec un laser UV, les poissons seront maintenus dans de l’hydrogel. Ce milieu aqueux permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations. Enfin des tests préalables seront réalisés pour réduire au maximum la dose et la durée d’exposition des poissons à des composés pharmacologiques.
Choix des espèces
Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette crâniofacial et de la voûte crânienne. La voûte crânienne présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires (ossification membranaire) et moléculaires (conservation des principales voies de signalisation régulant l'ostéogénèse) impliqués au cours de son développement. De plus l’accessibilité du crâne chez le poisson zèbre et l'existence de nombreuses lignées transgéniques permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. Enfin chez le poisson zèbre, Fgfr3 est conservé et exprimé fortement au cours de la formation de la voûte crânienne, contrairement à la souris. L’analyse du phénotype squelettique se fera du stade larvaire (5jpf ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 2 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois). Une grande partie des procédures seront réalisées entre 4 semaines et 8 semaines pendant la formation de la voûte crânienne.
Etude de l’induction de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) par virothérapie dans des modèles syngéniques murins présentant des tumeurs sous-cutanées, intrapéritonéales ou pulmonaires orthotopiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées pour prélever leurs tumeurs et analyser les cellules immunitaires qui les infiltrent, 1 632 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules cancéreuses leur sont injectées sous la peau, dans l'abdomen ou dans une veine, pour faire pousser des tumeurs sous la peau, dans le péritoine ou dans les poumons, puis elles reçoivent des virus oncolytiques armés de chimiokines, dans la tumeur ou par le nez sous anesthésie, et peuvent passer en imagerie deux fois par semaine. Une tumeur qui dépasse 2 000 mm3 déclenche la mise à mort. Le porteur ne décrit pourtant qu'une "gêne physique", des "difficultés à la mobilité" et une "gêne respiratoire", et juge "primordial d'utiliser des modèles in vivo" pour valider ses virus.
Objectifs
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) représentent une cible nouvelle dont le contrôle de la formation est devenu un enjeu immunothérapeutique. En effet, les TLS sont à l’origine du développement de réponses immunitaires adaptatives in situ souvent favorables pour les patients atteints de certains cancers. Il a été montré que certaines chimiokines pouvaient être à l’origine de leur induction. Notre projet vise à évaluer la capacité de ces chimiokines, exprimées in situ par des virus oncolytiques, à induire la formation de TLS. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des virus de la vaccine dont certaines souches ont déjà montré une capacité à induire des TLS. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la capacité de nouveaux virus oncolytiques, armés avec des chimiokines, à induire des TLS et à générer une activité anti-tumorale. Nous verrons dans un second temps, s’il est possible d’augmenter leur efficacité thérapeutique en les combinant avec un inhibiteur d’immune checkpoints.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de valider chez l’animal les effets thérapeutiques de ce nouveau traitement, en vue de le transposer ensuite chez l’humain dans le but final d’améliorer le pronostic vital de patients atteints de cancers. Si un effet probant est observé, les virus armés avec les chimiokines humaines pourront être générés dans l’entreprise collaboratrice, de sorte à poursuivre le projet vers un développement clinique. Si elle s'avère bénéfique, maitriser l'induction de TLS dans le microenvironnement tumoral pourrait être une nouvelle voie de traitement des cancers. Les résultats issus de ce projet nous permettront aussi d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux et les molécules intervenant dans la néogénèse de TLS.
Procédures
Des tumeurs seront implantées chez les souris, par injection de cellules tumorales en sous-cutané, intrapéritonéal ou en intraveineuse. L'intervention n'aura lieu qu'une fois, durera moins d'une minute et sera réalisée sur souris vigile. L'administration du traitement par voie intratumorale sera aussi réalisé sur souris vigile, ne durera pas plus d'une minute et sera répété au maximum 3 fois (un jour sur deux). L'administration du traitement pas instillation intranasale se fera cette fois-ci sur souris anesthésiées et tenues à la verticale. L'opération durera environ 5 min par souris et sera répétée 1 fois par jour pendant 3 jours. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie IVIS à une fréquence de 2 fois par semaine. Pour cette opération les souris seront anesthésiées avec de l'isoflurane à 2% durant une quinzaine de minute.Toute injection intrapéritonéale d'anesthésiant ou de traitement sera réalisée sur souris vigile et durera moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les actes d'injections des cellules tumorales ou des virus oncolytiques pourront procurer un stress ponctuel (quelques minutes) dû à la contention des animaux mais sont normalement indolores et auront lieu au maximum à 4 reprises par animal et par procédure. La croissance des tumeurs sous-cutanées ou intrapéritonéales pourra générer une gêne physique et des difficultés à la mobilité. La croissance des tumeurs pulmonaires orthotopiques pourra occasionner une gêne respiratoire.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées afin de prélever les tumeurs et d’analyser l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral après chaque procédure.
Remplacement
Nos travaux portent sur l’induction de structures lymphoïdes tertiaires au sein de tumeurs. Ce mécanisme fait intervenir plusieurs paramètres dynamiques et complexes (système immunitaire, vascularisation) qui ne peuvent pas être modélisés ailleurs que dans des modèles in vivo, pas même dans des modèles d’organoïdes. De plus, dans ce projet nous souhaitons valider de nouveaux virus oncolytiques candidats. Il est donc primordial d’utiliser des modèles in vivo afin d’appréhender leurs interactions potentielles avec l’organisme hôte.
Réduction
Avant d’être testés chez l’animal, les virus oncolytiques ont été caractérisés in vitro dans plusieurs lignées tumorales murines et humaines. Seuls ceux qui ont prouvé une activité efficace in vitro seront utilisés dans ce projet. Au sein d’une même expérience nous testerons plusieurs virus avec les mêmes groupes témoins, nous réduirons également le nombre d’animaux utilisés dans le groupe non-traités. Le suivi de la croissance tumorale dans le modèle pulmonaire orthotopique se fera par imagerie IVIS, ce qui permet de faire plusieurs mesures sur un même animal sans avoir à l'euthanasier. Des prélèvements pourront être fait sur les animaux destinés à être euthanasiés, avant et après euthanasie, afin d’évaluer en parallèle la pharmacologie des virus et des substances anti-tumorales utilisés et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Ce projet implique l'utilisation de 1632 souris maximum.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés (5 souris maximum/cage) et ne seront expérimentées qu'après une semaine minimum de stabulation. Un programme d'enrichissement (placement de nids végétaux et de tunnels en carton dans les cages) lors d'expérimentations >15 jours est appliqué. La stabulation sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, 5 animaux maximum/cage de type-IIL, température de 22 °C ± 2 °C, éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 6 h à 18 h), et celles-ci recevront un régime alimentaire classique. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et animaliers pendant la durée de chaque expérience. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Les points suivants seront considérés comme limitants: tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire; toute modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos voûté); toute anomalie pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance: perte de poids supérieur ou égale à 15% du poids initial pour un animal qui ne porte pas de tumeur et supérieur ou égale à 20 % pour animal portant une tumeur (car en principe, une tumeur sous-cutanée de moins de 2000 mm3 n'excède pas 5 % du poids initial de l'animal), plaies et ulcères, fractures, détresse respiratoire ou tout signe d'essoufflement, tumeurs excédent 2000 mm3 (=(pi/6) x (longueur/2) x (largeur/2) x (épaisseur/2)). Les instillations intra-nasales (i.n.) seront réalisées sur des souris anesthésiées (kétamine par voie i.p.) puis remises dans leur cage au moment du réveil contrôlé visuellement. L'injection par voie intraveineuse (i.v.) sera réalisée dans la veine caudale préalablement dilatée par frottement à l'éthanol 70 % + exposition à une lampe chauffante. L’analyse de la croissance tumorale sera réalisée par imagerie IVIS chez des souris anesthésiées par l’isoflurane 2 %.
Choix des espèces
La souris fait partie des modèles expérimentaux les plus utilisés, il est actuellement possible d'avoir accès à un grand nombre de protocoles et de réactifs adaptés ce qui a permis de comprendre de nombreux mécanismes transposables à l'humain. Le système immunitaire humain possède de nombreuses similitudes avec celui de la souris et des travaux ont montré qu'il était possible d'observer des structures lymphoïdes tertiaires (élément primordial de nos recherches) chez la souris. Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris: les marqueurs des cellules d'intérêts de cette étude sont connus et de nombreux réactifs sont disponibles. Les animaux seront reçus à l'âge de 12 semaines, car ce stade de développement correspond à des souris sevrées, de taille adulte et qui dispose d'un système immunitaire mature.
MISE AU POINT DE LA TECHNIQUE DE BIOPSIE LONGITUDINALE DE TUMEUR GREFFEE EN SOUS-CUTANE CHEZ LA SOURIS
- Recherche appliquée
- Cancers
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau puis prélevée de façon répétée par biopsies sous anesthésie, jusqu'à un volume tumoral de 2 000 mm3 déclenchant la mise à mort. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux utilisés dans d'autres études. Il reconnaît des risques d'hémorragie, de nécrose et de dissémination tumorale liés aux biopsies.
Objectifs
L’Organisation Mondiale de la Santé a établi en 2020 que le cancer était, selon les pays et leur développement socio-économique, la 1e ou la 2e cause de mortalité avant l’âge de 70 ans, avec 10 millions de décès par an dans le monde. En France, les cancers représentent la première cause de décès chez l’homme et la deuxième chez la femme. En 2040, il est estimé que 28.4 millions de cancers seront nouvellement diagnostiqués chaque année dans le monde, soit une augmentation de 47% par rapport à 2020 (19.3 millions de nouveaux cas). Cette augmentation est principalement liée au vieillissement des populations, mais aussi à d’autres facteurs de risque (tabagisme, habitudes alimentaires, expositions aux UV, sédentarité, pollution…). Actuellement les traitements conventionnels du cancer sont la chimiothérapie et la radiothérapie qui sont associés à des effets secondaires importants et pour lesquels les patients peuvent développer des résistances. Il est donc important de pouvoir développer de nouveaux traitements ciblant spécifiquement les cellules tumorales et limitant les effets secondaires associés. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, l’efficacité anti-tumorale des composés, issus de pré-sélections grâce à des tests in vitro, est évaluée in vivo chez des souris greffées avec des cellules tumorales. Les mécanismes d’action, pharmacocinétique ou biomarqueurs, sont évalués au cours de ces études à partir de prélèvements des tumeurs. Une des limites majeures actuelles à ces prélèvements de tumeur pour caractériser les effets des traitements est qu’ils ne peuvent être effectués qu’en procédure terminale pour l’animal. Pour pallier cela, il est souvent prévu d’inclure plusieurs cohortes d’animaux qui sont alors euthanasiées à différents temps de l’étude afin d’accéder à des analyses longitudinales d’efficacité du traitement. Ces études n’étant pas menées sur les mêmes animaux, elles peuvent être biaisées par des variabilités interindividuelles et rendre difficile l’interprétation ou imposer une augmentation du nombre d’animaux par groupe pour compenser ces variabilités. Ce projet a pour but de développer une technique de biopsie longitudinale de tumeur greffée chez la souris. Ce prélèvement régulier d’un très petit échantillon de tumeur permettra de caractériser au cours du temps et sur un même animal l’évolution de la tumeur par l’étude de paramètres histologiques, pharmacocinétiques, géniques et/ou protéiques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de définir la technique la plus appropriée pour réaliser des prélèvements répétés de tumeur tout en ayant un impact minimal sur la morphologie et la croissance de la tumeur, l’évolution de la pathologie et le bien-être animal. La mise en place de biopsies longitudinales dans les études d’efficacité de traitements anti-tumoraux présente de nombreux intérêts : -Etant donné que le prélèvement est réalisé sur le même animal, nous pourrons ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études futures pour faire les analyses de biomarqueurs dans la tumeur. En effet, il ne sera plus nécessaire d’ajouter des cohortes d’animaux supplémentaires pour réaliser des prélèvements terminaux au cours du temps. -Chaque souris étant son propre contrôle, nous pouvons mieux caractériser le mécanisme d’action d’un traitement et ainsi mieux en définir l’efficacité puisque nous réduisons la variabilité interindividuelle associée aux prélèvements terminaux. -L’évolution de biomarqueurs spécifiques en réponse à un traitement peut être plus précisément définie puisque suivie sur le même animal. Ainsi les bénéfices associés à ces mises au point sont à la fois de réduction du nombre de souris utilisées et à la fois scientifiques (caractérisation des mécanismes d’action, diminution de la variabilité, suivi de biomarqueurs plus spécifiques)
Procédures
-Greffe de cellules tumorales : pour chaque animal, une injection unique sous la peau du flanc sur animal vigile. Ce geste est réalisé sans anesthésie car une contention maitrisée et un geste rapide (
Impact sur les animaux
Au cours de cette mise au point, nous serons vigilants sur les effets indésirables suivants qui peuvent survenir chez la souris : -Une perte de poids qui pourrait excéder 20% du poids initial. Le poids des animaux sera donc mesuré tout au long de l’étude (y compris avant et après biopsie) afin d’évaluer, entre autres, le rétablissement des animaux. Une biopsie ne pourra être envisagée que si la souris a récupéré son poids d’avant la biopsie précédente. Si une perte de poids d’au moins 20% du poids initial est observée, les animaux seront euthanasiés. -Il se peut que nous voyions apparaitre des nécroses soit au niveau de la tumeur, soit au niveau des points de prélèvements. Une surveillance particulière sera apportée, et les animaux présentant des tumeurs creusées, exsudatives ou des lésions/nécroses >8mm de diamètre seront euthanasiés. -Lors de la biopsie de la tumeur, l’incision faite dans la tumeur (par l’aiguille ou par le prélèvement chirurgical) pourrait entraîner une libération des cellules tumorales et provoquer une dissémination de la tumeur, entrainant la formation potentielle de métastases. Une palpation autour de la tumeur et de l'abdomen sera réalisée pour détecter l’apparition de ces métastases. La présence de métastase sera confirmée après euthanasie de la souris par une autopsie. -Enfin, un risque inhérent à toute biopsie est le risque d’induire une hémorragie. Les tumeurs étant vascularisées, il est possible d’endommager un vaisseau lors du prélèvement à l’aiguille. Aussi une vigilance particulière sera apportée au cours de l’étude et une surveillance accrue sera exercée au cours du prélèvement et pendant quelques heures suivant la biopsie.
Devenir
Lorsque la tumeur atteint un volume de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tumeur (que ce soit pour le groupe ayant eu des biopsies ou le groupe sans biopsie).
Remplacement
L’effet de traitements anti-cancéreux ciblant le système immunitaire ou spécifiquement les cellules cancéreuses ne peut être évalué qu’après un traitement aigu ou chronique de plusieurs semaines (selon le candidat médicament à tester) chez l’animal car il résulte de l’intégration de toutes les interactions métaboliques, hormonales, immunitaires et vasculaires impliquées dans le développement des cancers et de la pathologie. Une telle intégration n’existe pas pour des cellules ou organes isolés. Il n’y a donc pas à ce jour de méthodes in vitro substitutives.
Réduction
Ce projet a pour but de définir les conditions optimales de biopsie de tumeurs greffées en sous-cutanée. Il contribue ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans les futures études d’efficacité de traitement et de pharmacodynamie en permettant de réaliser des prélèvements répétés de tumeur sur le même animal. Ainsi la variabilité interindividuelle est réduite et la caractérisation des effets du candidat médicament est améliorée. Ces études seront réalisées sur des modèles déjà optimisés en termes de conditions de greffe. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est ainsi réduit. Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour définir les conditions optimales de biopsie et estimer la variabilité des paramètres mesurés. Cette étape permettra in fine d'établir le nombre d'animaux nécessaire par groupe pour les études d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. Les prélèvements répétés de tumeurs permettront d’évaluer des paramètres morphologiques (par des techniques d’histologie), des paramètres protéiques (par Western Blot ou par les techniques d’immunohistochimie), des paramètres géniques ou biochimiques.
Raffinement
Le suivi de la croissance tumorale par pied à coulisse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Elle permet une mesure rapide et régulière au cours du temps chez la souris vigile. Les tumeurs sont mesurées plusieurs fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour surveiller l’atteinte éventuelle de points limites. En cas de volume tumoral supérieur à 1500 mm3, une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel pour leur permettre d’exprimer leur instinct de nidification (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est dispersé dans la cage pour favoriser le fouissage. Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, les recommandations de la SBEA et du comité d’éthique, et les points limites, seront appliquées. Quelle que soit la méthode utilisée (prélèvement transcutané ou chirurgie), la procédure de biopsie est réalisée sur animal anesthésié et s’accompagne toujours au préalable de l’administration d’un analgésique afin de prévenir la douleur. A l’issue de la biopsie, l’animal est placé dans une enceinte chauffée pendant la phase de réveil, et surveillé pour s’assurer qu’il ne présente pas de signe de douleur. Nous nous assurerons du rétablissement de l’animal après chaque biopsie et tout au long de l’étude.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. Et la recherche en oncologie est réalisée dans sa grande majorité sur des modèles murins de greffes de cellules tumorales humaines. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.
Définition du rythme d’alimentation à appliquer pendant la période de reproduction des génitrices de truite
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
400 truites vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 40 tuées à l'issue pour prélèvement de tissus et 360 renvoyées en élevage pour la commercialisation de leurs oeufs. Un marqueur électronique leur est injecté dans le muscle dorsal et des prises de sang mensuelles sont réalisées sous anesthésie pendant six mois. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu, la truite ayant un accès veineux facile. L'étude vise à définir le rythme d'alimentation optimisant la production d'oeufs.
Objectifs
Chez une espèce saisonnée comme la truite-arc-en-ciel dont la période de reproduction se déroule en hiver, l’application d’une photopériode longue et constante en période hivernale permet induire une ponte en début d’été. Cette technique est massivement utilisée par les éleveurs français pour produire des œufs tout au long de l’année mais avec une certaine hétérogénéité de réponse et de qualité des œufs issus de ces pontes décalées. Actuellement, les recherches en nutrition aquacole portent essentiellement sur le remplacement de la farine et l’huile de poisson dans les aliments aquacoles, notamment par des matières premières d’origine végétale. Toutefois, le remplacement de la farine de poisson et huile de poisson par de nouvelles matières premières augmente le plus souvent le coût de l’aliment. Ceci est d’autant plus vrai pour la production d’œufs de truite où la qualité de l’aliment, notamment l’apport en acide gras essentiel, est primordial pour maintenir les performances de reproduction des animaux et la qualité des œufs et ces nouvelles matières premières riches en acides gras essentiels (huile de micro-algues par exemple) autre que la farine et l’huile de poisson coûtent très chères. L’alimentation avec un aliment de qualité mais coûteux pourrait être limitée à des périodes où les apports alimentaires sont déterminants dans la production d’œufs de qualité. Par conséquent, de nombreuses questions se posent quant au rythme d’alimentation à appliquer pendant le cycle de reproduction pour s’adapter au mieux aux besoins physiologiques des poissons et ainsi optimiser les performances de reproduction et la qualité des œufs (nombre, taille, qualité).
Bénéfices attendus
Cette expérimentation permettra d’identifier les périodes au cours de la vitellogénèse (accumulation et formation de substances de stockage dans un oeuf) de la truite où les apports alimentaires sont déterminants dans la production d’œufs de qualité (taille, nombre, viabilité, survie après fécondation). Ainsi cette étude permettra d’étudier les processus de stockage, de mobilisation et de transfert à l’œuf des différents nutriments au cours d’un cycle complet de vitellogénèse sous photopériode. Elle permettra d’établir le lien entre la physiologie de la nutrition (stockage, mobilisation et transfert des nutriments) et la physiologie de la croissance et de la reproduction (évolution des hormones de reproduction) au cours du cycle de vitellogénèse.
Procédures
Chaque procédure sera réalisée sous anesthésie (MS222). Un pit tag, pour permettre l'identification individuelle des femelles de truite, sera injecté en début d'expérimentation dans le muscle supérieur dorsal. Des prélèvements de sang seront réalisés une fois tous les mois (6 prélèvements maximum par individu) sur une durée d'expérimentation de 6 mois. La quantité de sang prélevée sera de 2ml sur des femelles adultes d'environ 2kg.
Impact sur les animaux
L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent aux besoins nutritionnels des poissons. Les prises de sang seront réalisées une fois tous les mois sur les animaux. L'injection du pit tag et les prélèvements de sang (2ml) seront réalisés sur des poissons de grandes tailles (environ 2kg) préalablement anesthésiés (MS222). Le pit Tag une fois injectée créera une petite blessure au niveau de la piqure, le poissons devraient cicatriser et récupérer en quelques jours (le taux d'infection avec ce type de procédure reste très faible). La prise de sang ne posera aucun effet indésirable car les vaisseaux sanguins de la truite sont d'accès facile et leur volume sanguin important. La fréquence de prélèvement (une fois tous les mois) ne créera pas non plus d'effets indésirables car la capacité de l'organisme à remplacer le volume sanguin prélevé ne sera pas impactée. Au moment de la ponte, 10 poissons par traitement (total = 40 poissons) seront euthanasiés et des prélèvements de tissus seront réalisés en vue d’analyses biologiques.
Devenir
40 poissons seront euthanasiés en fin d'expérimentation pour permettre les prélèvements de tissus en vue d'analyses biologiques. Les 360 poissons non euthanasiés repartiront dans un circuit classique d'élevage pour la commercialisation des oeufs.
Remplacement
L'étude porte sur l'impact d'une stratégie alimentaire sur la reproduction des animaux, elle ne peut donc pas être appréhendée sur lignée cellulaire ou par modélisation.
Réduction
Nous avons prévu une densité optimale d’animaux par bassin permettant d’éviter les comportements agressifs qui peuvent survenir avec un petit groupe de poissons (relation dominant/dominé). Pour une espèce comme la truite, il est nécessaire d’avoir une densité minimale d’élevage pour optimiser le bien-être de l’animal et éviter tout comportement agressif (relation dominant/dominé). La densité d'élevage utilisée au cours de cette expérimentation correspond à celle préconisée en aquaculture biologique. Les animaux après leur reproduction repartiront dans un circuit classique d’élevage. Nous avons choisi de réaliser des prises de sang au cours de l'élevage (procédures expérimentales qui restent de classe légère) pour minimiser le nombre de poissons euthanasiés pour des prélèvements biologiques. De plus, nous identifions les femelles par des pit tags pour avoir comme unité statistique un poisson et non un bassin, ce qui nous permet également de réduire le nombre d'animaux mis en expérimentation. Cependant, dans le cadre de cette expérimentation, nous allons étudier l’impact de nos traitements sur la croissance de nos animaux et nous avons donc besoin d’au minimum deux bassins par traitement pour éliminer l'effet bassin. Nous ne pouvons pas réduire plus le nombre de 100 individus par traitement car c'est le nombre minimal nécessaire pour obtenir une densité optimale au bien-être du poisson (20 à 25kg/m3 pour des génitrices, bassins de 4.5m3).
Raffinement
Les conditions d’élevage seront optimisées (biomasse faible de 20kg/m3, bassin de 4.5m3, taux de renouvellement d'eau de 200%/heure). Le taux de renouvellement d'eau important permettra de maintenir l'eau des bassins claire et sans dépôt de matière en fond de bassin ainsi qu'un taux d'oxygenation optimal. La température de l'eau variera avec la saison de 8 à 12°C, ce qui reste dans l'optimum de température pour la truite arc en ciel. Le comportement et les mortalités seront contrôlés 2 fois par jour lors de l’alimentation des animaux. Si une perte de poids anormale ou un comportement atypique étaient observés (comportement de fuite anormal pendant l’alimentation, léthargie, hyperactivité locomotrice, perte d’intégrité physique suite à un cannibalisme ou à des comportements agressifs), les animaux concernés seraient euthanasiés. La personne qui effectuera les prélèvements de sang est familiarisée avec l’espèce animale et la technique choisie. Les animaux seront manipulés avec ménagement et calme. Une faible quantité de sang sera prélevé (2mL sur des animaux de 2kg) ce qui ne provoquera pas d'effets notables sur le volume d'éjection cardiaque ou sur la pression artérielle.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale (première production piscicole française). Les animaux matures auront déjà pondu une première fois et entreront dans leur deuxième période de reproduction. Les truites ont deux ans et font 2kg
Influence de la géométrie et du fractionnement temporel dans la réponse de nouvelles techniques de radiothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
1 232 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 106 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 126 un niveau modéré. Une tumeur cérébrale leur est implantée sous anesthésie puis irradiée, parfois deux fois, avec suivi par imagerie et tests comportementaux. Le porteur décrit après irradiation des pertes de poids, une mobilité réduite et des ulcérations du crâne pendant quelques jours. L'étude explore de nouvelles techniques de radiothérapie contre les gliomes, dont les retombées cliniques sont présentées comme lointaines.
Objectifs
La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. L’alternative, moins délétère, est la nouvelle technique de radiotherapie que nous proposons. Aucun autre traitement (i.e. immunothérapie) a montré de l’efficacité dans ce types de tumeurs. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale chez des rongeurs. Nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique de ces techniques innovatrices en explorant différentes géométries d’irradiation et schémas temporels de délivrance de la dose. Par ailleurs, nous évaluerons l’impact sur les tissus sains d’une re-irradiation, nécessaire de façon très fréquente dans le traitement des gliomes, à cause de son haut taux de récurrence. De plus, des études pilotes ont montré une mémoire immunitaire à long-terme que nous cherchons à confirmer avec plusieurs types tumoraux.
Bénéfices attendus
Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques complètes qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à l'oncologie pédiatrique (système nerveux central dont les traitements sont très limités en raison du risque de complications dans le développement des nourrissons) et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les gliomes. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer d'autres techniques de RT et peut-être de changer certains des paradigmes de la RT conventionnelle. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.
Procédures
-Implantation tumorale sous anesthésie générale (45 minutes) 1056 animaux une fois. 264 animaux subiront une réimplantation sous anesthésie générale (45 minutes) -Irradiation sous anesthésie générale (30 minutes) sur 1182 animaux, une fois et 132 animaux recevront une re-irradiation. Chaque irradiation dure un maximum de 30 minutes. -Imagerie IVIS sous anesthésie générale, 2 fois, 1056 animaux. Durée anesthésie < 10 minutes -Tests de comportement sur animaux vigiles, 3 fois, 126 animaux, une durée de 2-3 heures. - Des prélèvements sanguins (3 à 4) sous anesthésie générale seront réalisés sur chaque animal. Durée de l’anesthésie (< 5 minutes)
Impact sur les animaux
Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours). Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours)
Devenir
Mis à mort des animaux pour analyses histologiques des cerveaux
Remplacement
Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. De même, les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Ce n'est donc pas possible de faire nos d’études in vitro en utilisant des organoïdes. Les organoïdes en plus sont très petits en taille pour mettre en évidences l’effet des patrons d‘irradiation en pic et vallée caractérisques de nos techniques d’irradiation Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre d’animaux par groupe à l’aide du logiciel G*power. Pour mettre en évidence une différence de 25%, biologiquement significative, entre groupes traités et groupes témoins, il nous faudra inclure 15 animaux par groupe (t-test: p
Raffinement
Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, nous veillerons 5 fois par semaine au bien-être des animaux pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de chaque procédure). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité. Pour y remédier, des aliments appétants (Dietgel recovery) sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation : une crème, l’Ialuset sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (environ 1 semaine, application quotidienne) et / ou du PicriBaume (1 fois par jour).
Choix des espèces
Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.
Comparaison du comportement, de l’état corporel et des performances de canards mulards mâles épointés et/ou dégriffés, ou non, et tests de leviers de maîtrise
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
960 canards mulards vont être utilisés, tous abattus à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit l'épointage du bec et le dégriffage par cautérisation infrarouge à un jour d'âge, puis tous sont élevés en claustration et gavés pour la production de foie gras. Le porteur reconnaît que l'épointage provoque un stress et une douleur aiguë modifiant le comportement jusqu'à deux semaines. L'étude compare ces pratiques dans le mode d'élevage qu'il décrit lui-même comme "le plus contraignant" pour l'animal.
Objectifs
En élevage le canard de Barbarie et le canard Pékin peuvent manifester des comportements anormaux, dont la cause principale n’a pas été identifiée, générant des problématiques de picage et de griffures causant des lésions et portant ainsi atteinte à leur bien-être. Les méthodes principales permettant de prévenir ou de contrôler ces comportements sont l’épointage et le dégriffage. L’épointage est réalisé par cautérisation de l’extrémité bec du caneton à 1 jour à l’aide d’un faisceau infrarouge afin de limiter sa croissance. Le dégriffage est réalisé selon le même procédé sur la pointe des griffes. Il n'existe pas de données bibliographiques sur ces problématiques chez le canard mulard, hybride issu d’un mâle Barbarie et d’une femelle Pékin. Or, ces pratiques préventives sont potentiellement douloureuses. L’objectif du premier essai est donc de caractériser et de comparer le comportement, l’état corporel et les performances zootechniques (croissance pondérale, efficacité alimentaire, poids des pièces de découpe) de lots de canards ayant été soit épointés, soit dégriffés, épointés et dégriffés ou n’ayant eu aucune intervention (lot témoin) afin d'obtenir des données liées à ces pratiques. Ces animaux seront élevés en claustration, le mode d’élevage le plus contraignant pour l’animal qui soit pratiqué en élevage, notamment lors de la mise à l’abri en période d’influenza aviaire. Un environnement contraignant devrait mettre en exerge les différences entre lots. Selon les résultats issus de ce premier essai, un second essai nous permettra de tester un levier pour limiter les effets indésirables en l’absence des pratiques d’épointage et de dégriffage (enrichissement de l'hébergement, lumières, accès extérieur, densité...). L'objectif appliqué étant de définir les modalités d'élevage les plus adaptées à la biologie du canard afin de favoriser son bien-être .
Bénéfices attendus
Le projet permettra de disposer de données spécifiques au canard mulard sur les problématiques du picage et des griffures en conditions de confinement, ce mode d'élevage étant celui devant être adopté lors des périodes d'influenza aviaire. Ces essais permettront d’évaluer, faute de données disponibles pour cette espèce et ce mode de production, les conséquences de l’arrêt de ces traitements en conditions défavorables (confinement), sans autre changement dans la conduite, dans un objectif d’amélioration du bien-être animal. En fonction des résultats obtenus, différents leviers seront in fine proposés à partir d’éléments issus de la bibliographie disponible chez d’autres espèces afin de pallier les problèmes rencontrés et l'un d'entre eux sera testé expérimentalement
Procédures
Les animaux seront soumis à des contentions (manipulation individuelle par un opérateur formé et mise en caisse adaptée à l’âge et l’espèce des animaux) nécessaires à leur pesée et à l'évaluation de leur état corporel (7 au maximum par animal au cours des 12 semaines d’élevage). La durée totale de chaque contention n'excèdera pas 30 minutes. A l'âge de 84 jours ils seront placés dans des caisses de transport et transférés de loges de 30 animaux à des parcs collectifs de 4 canards. Ce transfert n'excèdera pas 1 heure. 120 animaux seront épointés au couvoir à 1 jour d'âge par application d'un faisceau infrarouge sur la pointe du bec. 120 animaux seront dégriffés selon la même méthode, le faisceau infrarouge étant appliqué sur la pointe des griffes, parmi ces 240 animaux. 120 animaux seront à la fois épointés et dégriffés selon ces procédés.
Impact sur les animaux
En l’absence de traitement du bec, les animaux sont susceptibles d'exprimer des comportements mutuels d’arrachage des plumes (picages), pouvant amener à des lésions plus ou moins graves et donc à une altération de leur bien-être. Ce risque est généralement accru vers l'âge de 6 semaines. L'épointage est effectué au couvoir peu après l'éclosion par chauffe de la pointe du bec à l'aide d'un faisceau infra-rouge. Cette méthode inhibe la multiplication des cellules à la pointe du bec et limite son développement. L’épointage provoque également un stress et une douleur aiguë transitoires qui, chez les canards Pékin et Barbarie, se manifestent par des changements comportementaux (augmentation du repos et diminution des comportements nécessitant l'utilisation du bec tels que l’alimentation, l’abreuvement, le lissage des plumes et l’exploration) pouvant être observés jusqu'à 2 semaines après l’épointage. En l’absence de traitement des griffes et d'accès à l'extérieur pour assurer leur abrasion, les animaux sont susceptibles de se blesser mutuellement (griffures), notamment si le lot s’avère réactif à des évènements soudains (réactions au bruit notamment). Le dégriffage est une procédure similaire à l'épointage avec un traitement infrarouge sur l'extrémité des griffes afin de limiter leur croissance. Les canards en phase d’engraissement suivront une procédure de gavage, susceptible dans de rares cas où elle serait mal réalisée de générer des lésions dans leur oesophage. Le mode d’hébergement en loges collectives limitera leurs possibilités de mouvements, bien qu’en engraissement les animaux aient une activité amoindrie et plus de repos immobile lié à la digestion.
Devenir
Les animaux seront abattus en abattoir agrée en fin d'essai afin d'effectuer des mesures sur leurs performances zootechniques (poids des pièces de découpes: cuisse, magret, peau du magret, poids du foie, test de fonte).
Remplacement
Le comportement des animaux en élevage étant étudié, l’animal vivant ne peut pas être remplacé par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Réduction
960 animaux répartis en deux essais de 480 canards mulards mâles seront requis. Pour chaque essai cela représente 120 canards par modalité, soit 30 animaux par parc. Pour comparer statistiquement les modalités et détecter des différences entre-elles, un effectif minimal de 99 animaux par modalité est nécessaire, soit 25 animaux par parc. Après vérification sur des données de croissance pondérale d'un essai précédent, cet effectif permettra de différencier les lots dès un écart de moyenne de 343g. Ce projet étant le premier mesurant des paramètres liés à l'épointage et au dégriffage, un tel effectif permettra également de détecter des effets faibles lors de l’utilisation des tests statistiques. Afin de pallier les aléas expérimentaux, l'effectif par loge est fixé à 30 animaux pour s'assurer un nombre minimal de valeur pour tester statistiquement les hypothèses. L'hétérogénéité des réponses chez les canards mulards sera également prise en compte au sein de chaque modalité.
Raffinement
Les mesures de comportement seront réalisées par vidéos pour ne pas cause de stress par la présence d’un humain. Les mesures nécessitant la manipulation des animaux seront regroupées afin de limiter les contentions, qui seront réalisées sur le nombre minimal d'animaux nécessaire (25 par loge). Le transport de l'élevage à l'engraissement se fera parcs par parcs pour minimiser le temps passé en caisse de transport (moins d'1h). Les animaux seront élevés en groupe et surveillés quotidiennement. En engraissement avant chaque repas un contrôle du jabot sera effectué par le gaveur par palpation. Ce contrôle de la digestion permet de limiter le risque de blessures en limitant le volume du jabot et la dilatation de l'oesophage, en ajustant la dose d'aliment donnée. Cela permet aussi de détecter les éventuelles lésions. En cas de lésions sévères ou de perforation de l'oesophage l'animal est euthanasié car cette blessure est irréversible. Le gaveur étant entraîné à réaliser l'embucage, le nombre d'animaux lésés est rare. Le picage et les griffures pouvant occasionner des lésions sévères, une grille d’indicateurs sera mise en place afin de déterminer le point limite, c’est-à-dire le moment ou la souffrance et/ou la détresse de l’animal doit être pris en charge et des actions mises en place. La grille regroupe des critères auquel un score est attribué selon leur déviation d'un état normal (aspects : taille, poids, état du plumage, lésions ; physiologie : respiration, consommations ; comportement : agressivité, isolement, postures, boiteries, troubles de l’équilibre). Lorsque la déviation est mineure la surveillance est renforcée jusqu’à retour à un état normal. Les conditions d’ambiance pourront être modifiées (ventilation, température). En cas de déviation modérée des mesures sont prises pour atténuer la souffrance (nettoyage de la plaie, mise en infirmerie jusqu’à cicatrisation, modifications de la complexité de l’hébergement : ajout d’objets à manipuler, de litière…). En cas de déviation grave l'animal sera euthanasié si le retour à l’état normal est impossible ou nécessite un isolement prolongé, source importante de stress car le canard est un animal social. Si dans un parc au moins la moitié des animaux présentent des déviations modérées à sévères la surface de la loge pourra être doublée et le vétérinaire pourra être consulté.
Choix des espèces
Les travaux ont un objectif finalisé d’application au sein de la filière palmipède à foie gras (canard). Il n’est donc pas pertinent de choisir une autre espèce animale que le canard gras, et en l’occurrence le canard mulard mâle, espèce légalement autorisée pour la production de foie gras (règlement CE 1538/91 de la commission du 5 juin 1991, portant modalités d'application du règlement (CEE) n° 1906/90 du Conseil établissant des normes de commercialisation pour les volailles). Les animaux utilisés pour l’essai seront âgés de 1 à 94j. De 1 à 83j, ils seront élevés au sol en loges collectives de 6m². Seront suivis le comportement, l’état corporel et les performances des canards en élevage. Après transfert dans un autre bâtiment, les animaux seront engraissés par gavage de 84 à 95j en loges collectives afin de mesurer les effets potentiels des paramètres testés jusqu’à la fin du cycle de production classiquement suivi pour la production de foie gras. Seront suivis le comportement, l’état corporel et les performances des canards lors de l’engraissement par gavage. Ces âges correspondent à ceux retrouvés en élevage de canard gras standard.