Recherche appliquée

64 macaques à longue queue vont être utilisés, réutilisés après avis vétérinaire plutôt que tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque macaque reçoit trois fois une injection de curare qui paralyse sa respiration, compensée par une ventilation assistée, puis des prélèvements de sang répétés, jusqu'à cinq fois par semaine. Le projet teste des anticorps censés lever le blocage neuromusculaire après curarisation, en vue d'un usage chez l'humain. Le porteur affirme que ces réactions affectent "l'organisme entier" et que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité".

Objectifs

Les curares sont des composés fréquemment utilisés comme anesthésiants dans les services de chirurgie ou de réanimation. Leurs propriétés paralysantes induisent un blocage neuromusculaire, indépendamment de la sédation, qui facilite notamment les procédures d'intubation et évitent les réflexes musculaires lors des interventions chirurgicales. Même si les curares utilisés en anesthésie sont des molécules relativement sûres induisant peu de réactions adverses sévères (1 patient sur 10 000), il est impossible de prédire leur durée d'action. La curarisation résiduelle, qui ne peut être écartée qu'à l'aide d'un monitorage instrumental quantitatif, est une complication majeure (jusqu'à 83% des patients), responsable d'insuffisances respiratoires et de troubles de la déglutition à l'origine d'une inhalation pulmonaire de liquide gastrique, entraînant un allongement de la durée de séjour à l'hôpital, un engorgement inutile des services de réanimation et une hausse de la mortalité. Pour stopper rapidement la curarisation d'un patient, un antidote est administré après l'intervention pour lever le blocage neuromusculaire. Dans la majorité des cas de curarisation, la décurarisation est obtenue par injection d’une molécule synthétique efficace dès les premières minutes qui suivent l'injection du curare. Cependant, des réactions allergiques ayant été rapportées, ce composé est de moins en moins utilisé en routine clinique. Il est donc particulièrement intéressant d'identifier de nouvelles molécules.. Leur efficacité sera évaluée à l’aide de la méthode de « train of four », utilisée quotidiennement dans les services d’anesthésie qui permet le suivi du niveau de curarisation. Ce projet a pour objectif de caractériser la capacité d'anticorps monoclonaux à lever le blocage neuromusculaire induit par une curarisation au rocuronium. Des études chez des souris immunisées contre le rocuronium ont permis d'identifier plusieurs anticorps qui captent le rocuronium avec des affinités très élevées. Dans ce projet, l'efficacité de ces anticorps sera évaluée chez le Primate Non-Humain, pour, à terme envisager une utilisation chez l'humain, soit en urgence (échec d'intubation), soit en routine clinique afin de lever rapidement le blocage neuromusculaire. Des anticorps monoclonaux dirigés contre d’autres curares (vecuronium, atracurium, succinylcholine et cisatracurium) seront évalués selon le même schéma expérimental.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de caractériser la capacité d’anticorps à lever le blocage neuromusculaire induit par des curares utilisés en anesthésie. En effet, pour faciliter l’intubation et la chirurgie, on cherche à relâcher les muscles du patient en particulier les muscles respiratoires. Jusqu’à la fin de l’intervention médicale, l’effet des curares doit être maximal, mais le patient reste sous l’effet des curares pendant des périodes plus ou moins longues (30-90min), ce qui empêche de le réveiller de son anesthésie. Cette persistance de l’action des curare conduit à encombrer les services de réanimation. On cherche à diminuer cette durée par l’administration de composés capables de capturer le curare (« antidote ») et de lever le blocage neuromusculaire. Une conséquence à plus long terme de ce projet permettrait de limiter le temps de passage des patients en salle de réveil dans les services de réanimation. Plusieurs anticorps monoclonaux anti-curareont été identifiés à partir de souris immunisées. Leurs très fortes affinités in vitro suggèrent que des anticorps anti-curare pourraient être utilisés dans le cadre de la décurarisation soit en urgence (échec d’intubation), soit en routine clinique afin de de lever rapidement le blocage neuromusculaire.

Procédures

Ce projet contient 2 procédures pour lesquelles les animaux recevront, sous anesthésie générale, une injection de curare pour provoquer le blocage neuromusculaire. La paralysie de l'activité respiratoire provoquée par une dose proche ou supérieure à la dose nécessaire pour l'obtention d'un bloc neuromusculaire à 90 % sera compensé par la mise en place d’une ventilation assistée. Chaque animal subira une série de 3 anesthésies avec curarisation et respiration sous ventilation assistée. Cette procédure ne dépassera pas une heure. Des prélèvements sanguins seront réalisés durant les 72 heures suivant l’administration, mais des prélèvements a plus long terme sont envisageables pour évaluer la persistance du produit dans les semaines qui suivent. Des prélèvements de sang par ponction veineuse (7.5% de la volémie sanguine totale/semaine maximum), 5 fois/semaine sous anesthésie seront effectués pour le suivi clinique, hématologique et biochimique des PNH.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu de douleur particulière liée aux interventions. En cas de réaction allergique au produit injecté, un traitement corticoïde et une prise en charge symptomatique sera envisagée. Il pourrait il y avoir un syndrome fébrile d’environ 1 à 2 semaines avec fièvre, diminution de l’activité et perte d’appétit. L’utilisation d’antalgique n’est pas prévue de façon systématique mais elle pourra être mise en œuvre en fonction d’éventuels signes cliniques de douleur - non attendue - (comportement anormal de l’animal : position antalgique, poil hérissé, gémissement).

Devenir

Tous les PNH seront réutilisés après avis vétérinaire

Remplacement

Les thérapies étudiées dans ce projet font intervenir des réactions qui affectent l'organisme entier, et qui se déploient notamment dans la circulation ainsi que plusieurs tissus et organes. Il est donc impossible de les modéliser de façon pertinente ni de les étudier dans des modèles in vitro. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’ensemble des anticorps testés chez le Primate Non-Humain auront été préalablement sélectionnés in vitro sur des lignées cellulaires de muscles ou de tissus puis dans un modèle rongeur sur des critères de sécurité et d’efficacité.

Réduction

De nombreux tests in vitro ont permis de sélectionner, parmi la trentaine d’anticorps anti-rocuronium candidats, les cinq présentant la meilleure affinité. Ces cinq anticorps ont été testé en prophylaxie chez la souris pour la prévention de curarisation, afin d’en identifier deux avec le potentiel le plus important. De la même façon, les anticorps contre succinylcholine, cisatracurium atracurium et vecuronium les plus prometteurs seront sélectionnés. À partir de plus d’une centaine d’anticorps, nous réduisons ainsi le nombre d'anticorps à tester chez le primate non-humain à seulement 8. De plus, pour réduire encore d’avantage le nombre d'animaux prévu dans ce projet, la méthode choisie nous permettra de réaliser plusieurs injections séquentielles sur un même animal.

Raffinement

La méthode nécessitant une anesthésie générale par définition, les animaux ne sont pas vigiles durant la durée de l’expérience. Les mesures sont non-invasives. L’animal n’est pas euthanasié durant la procédure. Des points limites ont été définis. L’état général des animaux est suivi quotidiennement. En cas de modification du comportement un signalement est fait au vétérinaire. Nous allons observer particulièrement les réactions locales sur la peau (démangeaisons, rougeurs, gonflements). Le poids et la température seront suivi à chaque anesthésie. Les animaux seront hébergés en groupe permettant des interactions sociales pendant l’étude avec un programme d’enrichissement décrit par la structure de bien-être animal de l’établissement : distribution 2 fois par semaine d’enrichissements destructibles de type peebletoy ou sachet surprise. La structure du Bien Etre Animal pourra être alertée en cas d’évènement anormal.

Choix des espèces

Les Primates Non Humains adultes, grâce à leur proximité phylogénétique avec l'humain, leur système cardiovasculaire et leur réponse immunitaire matures, permettent de reproduire la physiopathologie observée chez l'humain en cas d’administration de curares à des doses similaires à celles administrées chez l'humain. De plus, les outils d’évaluation de l’efficacité de curarisation utilisés chez l'humain sont utilisables chez le primate en parallèle de la mise en place d’un ventilation assistée, reproduisant ainsi le contexte clinique chez l'humain.

15 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle leur impose de sévères atteintes du squelette, cyphose, scoliose et déformation de la cage thoracique, et une espérance de vie réduite par le risque de rupture de l'aorte, entre 27 et 240 jours. Elles reçoivent des injections, jusqu'à six prélèvements de sang et une biopsie de l'oreille, puis sont tuées pour analyse des organes. Le porteur annonce un bénéfice "éventuel à long terme" pour les patients atteints de cette maladie rare et affirme que le projet "ne peut pas se faire sans modèle animal".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie des os avec des troubles cardiovasculaires. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour les symptômes cardiovasculaires de la maladie.

Bénéfices attendus

Le projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d'un traitement pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucun traitement. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections traitements (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 6 prélèvements dans sa vie. Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour déterminer s'ils sont porteurs de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet a d’importantes atteintes squelettiques comprenant une sévère cyphose, une scoliose et une surcroissance de la cage thoracique ainsi qu’une espérance de vie réduite due à une importante probabilité de rupture aortique. Il est connu que l’espérance de vie de ces animaux est de 27 à 240 jours notamment à cause des problèmes vasculaires intervenant à des âges différents selon les animaux et ne pouvant donc pas être prédits. Cependant ces animaux arrivent à se déplacer et manger. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

Globalement, la construction des traitements et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents traitements produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur efficacité. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement.

Raffinement

​Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage . Chaque cage contient des enrichissements de type tige en papier, igloo et buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant du Syndrome de Marfan, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et plusieurs études démontrent que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées dans ce modèle. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 24 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

100 mulots sylvestres capturés dans la nature vont être utilisés, tous tués à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie et une injection de LPS, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le porteur anticipe une mortalité de 3 % dans les pièges et un stress lié à la capture et à l'hébergement. Il affirme que l'usage d'animaux sauvages est "requis", la réponse immunitaire des individus sauvages différant de celle des animaux de laboratoire.

Objectifs

Le concept de «One Health» postule que la santé humaine, animale et environnementale sont liées et promeut une approche systémique des questions environnementales, au profit des problématiques de santé publique associées. De nombreux changements environnementaux induits par les activités humaines (Fragmentation des habitats, pollution, zoonoses, ...) affectent les écosystèmes et la faune sauvage à l’échelle mondiale. Parmi ces menaces, l’exposition aux éléments traces métalliques (ETM) peut induire de nombreux effets toxiques à tous les niveaux d’organisation biologique (de la molécule aux services écosystémiques). L’exposition de Mammifères sauvages à des ETM toxiques a montré un effet immunosuppresseur aussi bien en laboratoire qu’en milieu naturel, les rendant potentiellement plus susceptibles aux pathogènes circulant dans l’environnement. Les performances du système immunitaire des animaux sont par ailleurs modulées par la qualité et la quantité des ressources alimentaires disponibles dans leur environnement. Les études abordant les effets des métaux sur le système immunitaire des Mammifères terrestres in natura sont rares et les mécanismes de l’immunomodulation par les métaux et par les ressources alimentaires mal connus. Des études comparatives portant sur le système immunitaire de rongeurs ont montré une différence significative des réponses immunitaires entre des groupes d’individus sauvages et de laboratoires, rendant nécessaire l’expérimentation sur le terrain, en complément d’approches en laboratoire. Dans ce contexte, l’objectif du présent projet vise à comprendre les mécanismes des impacts des métaux toxiques et de la qualité nutritionnelle sur l’état et le fonctionnement du système immunitaire de Rongeurs sauvages. Après une étude préliminaire visant à la mise au point, chez le Mulot sylvestre, de tests immunologiques développés chez la Souris domestique, le projet portera sur le site d’une ancienne fonderie de zinc (Zn) et de plomb (Pb) située dans les Hauts-de-France. Ce site se distingue par un gradient de concentrations en cadmium (Cd), Pb et Zn dans les sols : les concentrations décroissent des zones les plus contaminées, situées au pied de l’ancien site métallurgique, vers des zones peu affectées à plusieurs kilomètres de l’ancienne usine (et considérées comme « témoin » dans la présente étude).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l’impact des polluants métalliques sur le système immunitaire d’une espèce sauvage, le Mulot sylvestre. Ces résultats permettront de développer des marqueurs de toxicité non conventionnels (par opposition aux marqueurs classiquement utilisés en évaluation des risques écotoxicologiques (ERE) que sont la mortalité, la croissance ou la reproduction) qui pourront à terme être transposés dans les procédures réglementaires d’ERE. L’immunomodulation du système immunitaire par les métaux permettra également d’évaluer l’impact potentiel sur la susceptibilité de ces Rongeurs à héberger des pathogènes zoonotiques, c’est-à-dire transmissible à l’Homme (par exemple les bactéries Borrelia sp. responsables de la maladie de Lyme).

Procédures

Pour les procédures 1 et 2, une prise de sang sera réalisée sous anesthésie générale pour chaque animal. Pour la procédure 3, les animaux recevront deux prises de sang sous anesthésie générale espacées de 5 jours. La prise de sang est effectuée en insérant une pipette Pasteur dans le sinus rétro-orbitaire des Mulots sylvestres pour collecter un échantillon sanguin (~150-200 µL en fonction de la masse de l’animal considéré) par capillarité, méthode de prélèvement considérée comme la moins stressante chez des souris de laboratoire. Le volume de sang maximal prélevé est estimé à 1,5% de la masse corporelle, soit 300 µL de sang pour un individu de 20 g. La prise de sang sera réalisée 2h après une injection intrapéritonéale de LPS (500 µg/kg). A la suite de cette intervention les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Mortalité La littérature ainsi que l’expérience des personnels impliqués dans ce programme laissent envisager un taux de mortalité de l’ordre de 3%. Les causes de décès peuvent être un stress conduisant à une rupture des cervicales ou un refroidissement en période froide (peu probable au printemps) et/ou pluvieuse dans les pièges. Des arrêts cardiaques peuvent être constatés dans les pièges ou lors des manipulations. En dehors de l’arrêt des captures en cas de conditions météorologiques défavorables, ces mortalités indésirables sont difficilement totalement évitables. Stress à la capture et durant les manipulations Les captures d’organismes sauvages entrainent nécessairement un stress, réduit au minimum par la relève des pièges dès que possible le matin (les captures ayant généralement lieu la nuit). Dès que les animaux sont sortis des pièges ou des cages, et après détermination spécifique immédiate, les animaux non-cibles (Campagnols par exemple) sont immédiatement relâchés, réduisant le stress au minimum. Les animaux-cibles (Mulots sylvestres) sont immédiatement anesthésiés pour la suite des manipulations (examen morphologique pour la détermination du sexe, mesures mophométriques pour la détermination de l’âge, prise de sang, injection de LPS). Les animaux trop jeunes sont relâchés dès les mesures morphométriques permettant d’estimer leur âge, de même que les femelles gestantes. Stress durant l’hébergement L’hébergement, sous tente et avec contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie), dure de quelques heures à 5 jours maximum dans le présent projet. L’hébergement est individuel, ce qui, au printemps, correspond au comportement solitaire des Mulots sylvestres en période de reproduction et évite d’éventuels comportements antagonistes. L’observation comportementale et la pesée (permettant d’évaluer un point-limite fixé à une perte de masse de 20%) sont quotidiennes de manière à détecter un éventuel stress élevé chez les individus. L’expérience de l’équipe sur cette espèce montre que les individus tolèrent la captivité courte (5 jours) sans montrer de comportements (activité motrice, alimentaire…) dénotant un stress élevé.

Devenir

Les individus seront mis à mort pour un prélèvement d'organes. Ces organes permettront la mise au point de mesures immunologiques et la mesure de l’exposition aux métaux, grâce aux mesures des concentrations dans les tissus. Il s’agit d’une décision prise collégialement par les membres de la structure du bien-être animal de notre unité, au regard des aspects éthiques, scientifiques et logistiques.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier la réponse immunitaire d’animaux exposés à une contamination environnementale en fonction de leur charge parasitaire (helminthes intestinaux) et de la qualité nutritionnelle de leur alimentation. L’utilisation d’animaux est requise car, à notre connaissance, aucune approche de modélisation ne permettrait d’obtenir de telles données. Des études comparatives sur le système immunitaire de rongeurs ayant montré que la réponse immunitaire d’individus sauvages et d’animaux de laboratoire différaient significativement, l’utilisation d’animaux sauvages est donc aussi requise.

Réduction

La variabilité inter-individuelle des réponses immunitaires est très forte en conditions naturelles. La variabilité liée à la biodisponibilité des ETM (Capacité de transfert de l’environnement vers un organisme) conduit aussi à des concentrations variables en ETM dans les organes cibles de différents individus du même site. Sur la base de ces informations, les effectifs prévus pour les procédures 1, 2 & 3 ne peuvent être inférieurs à 20 Mulots (Procédure 1), 40 Mulots (Procédure 2) et 40 Mulots (Procédure 3) pour garantir une puissance statistique suffisante et la valorisation scientifique des résultats.

Raffinement

Suite à une procédure invasive telle qu’une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire ou une injection de LPS, les animaux sont remis en cage et observés à différents temps après la procédure pour évaluer leur état sanitaire (blessure à l’œil, comportement dénotant une diminution de la vue, apathie, manque d’appétit…). Un point-limite (perte de 20% de la masse) est évalué quotidiennement lors des périodes d’hébergement (qui n’excédent pas 5 jours dans le présent projet). Les animaux seront hébergés sous tente avec un contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie) et les anesthésies, mesures et prélèvements seront effectués dans le véhicule agréé pour expérimentation animale, donc en un lieu séparé de l’hébergement. Les animaux conservés pour les expérimentations sont hébergés entre quelques heures et 5 jours maximum en fonction de la procédure concernée. Les animaux sont hébergés dans les meilleures conditions possibles (hébergement individuel pour éviter des comportements antagonistes, cages adaptées, enrichissement). L’ensemble des procédures est effectuée par ou sous supervision directe de personnels hautement qualifiés et expérimentés dans le domaine de ce type d’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus). Il s’agit d’un Micromammifère abondant, ubiquiste, opportuniste avec un régime alimentaire varié (Majoritairement granivore). Son positionnement trophique intermédiaire le place comme une source de nourriture de premier choix pour un grand nombre de prédateurs (Rapaces et Mammifères) incluant des espèces patrimoniales (Milan royal par exemple). Leurs nombreuses utilisations dans la littérature permettent de les définir comme bio-indicateurs des impacts des activités anthropiques dans les écosystèmes, incluant la pollution environnementale. Leur facilité de capture et leur capacité à être maintenus en captivité en font un modèle biologique idéal par rapport aux objectifs scientifiques de cette étude. Les Mulots sylvestres utilisées dans la procédure 1 permettront de tester le croisement possible entre les techniques développées sur Souris et l’espèce modèle retenue dans ce projet, le Mulot sylvestre. Seuls des individus d’âge subadulte et adulte (masse supérieure à 15g) seront utilisés pour cette étude.

590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques et obèses par leur lignée db/db, elles sont exposées à des sons de forte intensité, jusqu'à 116 décibels, provoquant des pertes auditives, puis subissent des mesures d'audition sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés. Leur oreille interne est prélevée après la mise à mort, ce prélèvement ne pouvant se faire sur un animal vivant. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives validées" et conclut à la "nécessité" du recours à l'animal.

Objectifs

La transmission d’un son de l’oreille externe en signaux aux cellules ciliées, cellules sensorielles de l’oreille interne situées dans la cochlée et reliées au nerf auditif. La vibration du tympan est transmise via la fenêtre ovale au liquide de l’oreille interne via les osselets (marteau, enclume et étrier). Les ondes sonores transmises dans le liquide de l’oreille interne sont traduites en signaux électriques par les cellules ciliées. Ces signaux électriques sont transmis au cerveau par le nerf auditif. Lorsque les cellules ciliées sont lésées, par une substance chimique, un traumatisme ou par le vieillissement, la personne a une perte auditive. Plus de 90% des pertes auditives sont dues à une destruction des cellules ciliées ou du nerf auditif (Hildebrand et al., 2008; Kujawa and Liberman, 2019). Dans le cadre du diabète et plus particulièrement celui de type-2, le mécanisme conduisant à une surdité n’est pas clairement établi. Plusieurs hypothèses ont été avancées, notamment une atteinte vasculaire au niveau de la cochlée, par analogie avec la rétinopathie et la néphropathie diabétique résultant d’une altération des micro-vaisseaux sanguins avec l’épaississement du sang par l’hyperglycémie. En parallèle, le diabète de type 2 induit une inflammation systémique chronique qui à terme peut avoir des répercussions au niveau de l’oreille interne et entraîner une dégradation des cellules ciliées, ou une augmentation de la susceptibilité au bruit. Chez la souris, il a été démontré qu’un trauma acoustique modéré, provoquant une surdité temporaire chez les animaux sains, induisait une surdité permanente chez des animaux diabétiques (Han et al., 2018). Enfin, une neuropathie périphérique ciblant le nerf auditif pourrait également conduire au développement de la surdité en lien avec le diabète. Il n’existe aucun traitement pharmacologique pour la surdité et les traitements du diabète, bien que permettant un meilleur contrôle de la glycémie ils ne traitent pas le cause de l’hyperglycémie qui reste élevée avec des conséquences au long-terme. Face à l’augmentation constante de la prévalence de ces deux pathologies, la recherche d’une solution thérapeutique adaptée reste un enjeu majeur de santé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices escomptés sont de valider ou d’invalider l’efficacité de candidats médicaments dans ces indications thérapeutiques. Ceci permettra de mieux sélectionner les candidats médicaments et de concentrer la rechercher et développement uniquement sur les candidats médicaments avec un haut potentiel d’efficacité.

Procédures

Les animaux vigiles seront exposés à des sons de forte intensité 2 intensités seront testées 100 et 116dB. Trois protocoles d’exposition seront testés : 100dB durant 2 heures 100dB durant 2 heures chaque jour jusqu’à 7 jours consécutifs 116dB pendant 1 heure Des mesures d’audition seront réalisées chaque semaine sous anesthésie générale. Un prélèvement de sang sera réalisé chaque semaine (au maximum 100µl) L’administration de traitement sera réalisée. Le traitement pourra être administré chez les animaux vigiles lors des traitements administrés par voie orale, intra-péritonéale, intraveineuse, sous cutanée. Le traitement sera réalisé chez des animaux sous anesthésie générale lors des traitements par transtympanique.

Impact sur les animaux

Développement d’un diabète de type 2 et d’une obésité. Pertes auditives consécutives à l’exposition au son de forte intensité

Devenir

Les animaux sont euthanasiés car des prélèvements de l’oreille interne sont réalisés pour des analyses anatomopathologiques. Le prélèvement de l’oreille interne ne peut se réaliser sur des animaux vivants donc les animaux sont euthanasiés en vue de ces prélèvements.

Remplacement

Remplacer : le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour évaluer l’audition et développer des modèles pathologiques de trauma acoustique ou d’acouphènes. Les atteintes des cellules ne peuvent pas être étudiées via la culture cellulaire ou les modèles informatiques car nous ne pouvons pas reproduire la complexité des mécanismes conduisant aux troubles de l’audition. L’influence d’une pathologie métabolique telle que le diabète de type-2 sur la surdité est complexe, impliquant plusieurs facteurs (vasculaires, inflammatoires et modifications lipidiques) qui ne peuvent être évalués que in vivo chez l’animal. Néanmoins nous réalisons une veille bibliographique active afin de suivre les modèles de remplacement qui sont susceptibles d’être développés à l’avenir.

Réduction

Réduire : le nombre d’animaux nécessaire a été calculé, selon des méthodes de biostatistiques, en tenant compte de la variabilité des modèles et des méthodes d’induction des troubles auditifs. Cette approche nous permettra d’obtenir des résultats fiables

Raffinement

Raffinement : dans nos études, les impératifs éthiques associés, tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu, la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal, seront intégrés avec une attention particulière pour le phénotype diabétique et obèse (entre 5 et 25 semaines d’âge fenêtre d’âge des animaux inclus dans nos études). Un contrôle hebdomadaire de la glycémie et du poids des animaux nous permettra de suivre l’hyperglycémie et l’obésité dans le temps. Parmi les complications liées au diabète possiblement attendus, la polyurie (augmentation de la fréquence et du volume d’élimination urinaire), la polydipsie (augmentation de la sensation de soif) et la polyphagie (augmentation de la sensation de faim) sera prise en charge via des conditions d’hébergement adaptés (change des cages plus fréquent, mise à disposition de plus d’eau et de nourriture) . Une attention particulière sera portée aux procédures anesthétiques sur animaux obèses, par rapport au stockage de certains produits anesthésiants dans les graisses.

Choix des espèces

Le modèle de diabète chez la souris db/db est bien établi et caractérisé. Nous sommes en mesure de suivre l’évolution de l’audition chez cette espèce. C’est pourquoi nous avons choisi de travailler avec cette espèce dans le cadre de ce projet. Concernant le stade de développement nous allons inclure de jeunes adultes (développement du diabète à partir de 5 semaines et jugé non délétère selon la bibliographie de l’éleveur jusqu’à 25 semaines). Pour s’affranchir des pertes auditives liées à l’âge et se focaliser sur l’influence du diabète.

780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections dans le muscle de la patte et des prélèvements de sang au niveau de l'oeil, avant la mise à mort et le prélèvement d'organes, pour comparer des candidats vaccins contre le SARS-CoV-2 et la grippe. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance, tout en prévoyant l'exclusion et la mise à mort immédiate des souris montrant prostration ou perte de poids. Sur le remplacement, il indique que le modèle souris est adapté mais aussi "imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques".

Objectifs

Les épidémies de coronavirus et de grippe posent un problème majeur de santé publique. Ces 2 virus sont soumis à de nombreuses modifications génétiques limitant l’efficacité des vaccins actuels. Le virus SARS-Cov2 possède, entre autres, une protéine permettant l’entrée du virus dans les cellules. C’est la cible des vaccins actuels qui génèrent une réponse immunitaire générant de nombreux anticorps de courte durée de vie. Le virus possède également la nucléocapside (N) contenue à l’intérieur du virus, qui est la protéine qui mute le moins entre les différentes souches de coronavirus. Pour le virus de la grippe, il existe également une protéine très conservée, la nucléoprotéine (NP), faisant d’elles des cibles pertinentes pour l’efficacité des vaccins sur le long terme. La technologie mise au point permet aux candidats vaccins d’être très accessible aux cellules du système immunitaire pour protéger des infections. Un partenariat avec une entreprise de biotechnologie permet l’obtention de nouveaux candidats contre la Grippe ou le SARS Cov2 contenant cette technologie. Il est intéressant d’étudier si ces nouvelles formulations vaccinales sont capables de produire des anticorps permettant de lutter contre les virus, mais également de stimuler le système immunitaire afin d’obtenir une protection longue dans le temps. Plus précisément, pour le projet SARS Cov2 les réponses immunitaires sont étudiées suite à l'injection de différents candidats vaccins contenant la protéine permettant l’entrée du virus et/ou la nucléocapside. Pour le projet grippe, des formulations vaccinales avec NP sont caractérisées dans la lutte contre les épidémies saisonnières. Ces études seront réalisées chez le modèle souris. Techniquement, les formulations vaccinales à tester sont injectées dans le muscle de la patte qui est une voie utilisée pour étudier de nombreux phénomènes immunologiques. Des prélèvements de sang réalisés permettront de quantifier les anticorps générés chez les animaux, et des prélèvements d’organes, post mortem, seront étudiés pour valider si les candidats vaccins sont efficaces.

Bénéfices attendus

Les nouveaux condidats vaccins sont très prometteurs pour la santé humaine. Les vaccins récemment développés contre le SARS-CoV-2 ou produits chaque année contre la grippe saisonnière, sont majoritairement destinés à générer une réponse anticorps vis-à-vis de protéines du virus présent à sa surface. Avec l’apparition de nombreuses mutations et donc l’apparition de nouveaux variants, des formulations vaccinales, visant à développer une réponse immunitaire à long terme, pourrait permettre de pallier les problèmes des vaccins actuels. Cela permettrait de mieux traiter les patients avec un vaccin capable d’induire une protection contre différentes souches de SARS-CoV-2 et de la grippe. Selon les résultats obtenus, il pourra être envisagé de porter ce projet à plus grande échelle avec la possibilité de phases cliniques.

Procédures

Tous les animaux du projet vont recevoir 2 injections dans le muscle de la patte sans anesthésie préalable. Ces injections sont espacées de 21 ou 28 jours selon la procédure utilisée et dureront environ 5 à 10 secondes par souris. Pour 30% des animaux, 2 prélèvements de sang seront réalisés, le premier durant les phases d'immunisations, et le second au jour de sa mise à mort. 100ul de sang seront prélevés au niveau de l'oeil sur animaux vigiles. Pour 70% des animaux, seul un prélèvement de sang sera réalisé au jour de la mise à mort de l'animal. Avant chaque prélèvement de sang, une goutte d'un collyre anesthésique local (Tétracaïne) sera appliqué. Chaque prélevement durera 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble du projet aucune souffrance des animaux n'est attendue. Toutefois, si une souris présente des signes de souffrance tel que la prostration, l'absence de réponse aux stimuli extérieurs ou la perte de poids, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet sont mise à mort lors de chaque procédure.

Remplacement

La vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes et des différents tissus ciblés. Le choix du modèle souris est donc adapté, et également imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit à minima sans compromettre les objectifs du projet. Pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, des groupes de 6 souris sont nécessaires. L'analyse de puissance et l'estimation de la taille de l’échantillon se font en amont de l’expérimentation. Test d’hypothèse: est-ce que la moyenne de la population traitée avec une constructions X est différente de la moyenne de la population contrôle et de la moyenne des autres groupes immunisés. Pour les analyses des résultats et les comparaisons de plusieurs échantillons nous utilisons les Analyses de variance ou ANOVA (one-way analyses of variance) qui va consister à chercher le rapport entre la variance entre les groupes et la variance à l'intérieur des groupes. Également les tests statistiques comme des tests de comparaison de moyennes de Student, ou non paramétrique (Mann Whitney) avec un seuil minimal du risque alpha fixé à 5% peuvent être utilisés selon les comparaisons souhaitées.

Raffinement

Les souris seront acclimatées durant une semaine. L'immunisation est réalisée dans le muscle. C'est une voie permettant l'obtention d'une bonne réponse immunitaire et étant le peu invasif pour l’animal. Enfin, avant chaque prélèvement de sang, un collyre anesthésique local (Tétracaïne, une goutte) sera appliqué.

Choix des espèces

La réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro

289 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes cérébrales, puis des inhalations répétées de solvants organiques comme le toluène en chambre, avec des tests comportementaux et un test du nystagmus post-rotatoire. Le porteur indique que de fortes concentrations peuvent provoquer troubles de l'équilibre et tremblements, censés disparaître dans l'heure suivant l'exposition. Il rattache le projet à la fixation de valeurs limites d'exposition des salariés et écarte le remplacement, l'électrocorticographie n'étant pas réalisable in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la mise en place d'une méthode de suivi en temps réel de l’action des solvants organiques sur le cerveau par une mesure de l’activité cérébrale. Cette méthode d’enregistrement sans fil permettra de mesurer ces effets chez des animaux vigiles et libres de leurs mouvements lors de l’inhalation des solvants dans des chambres à atmosphère contrôlée. En outre, divers tests comportementaux seront réalisés en fin d’exposition afin de mettre en relation les modifications de l’activité du cerveau avec d’éventuelles déficiences motrices et/ou sensorielles. Ceci permettra d’avoir une vue d’ensemble sur les effets neurotoxiques aigus d’une exposition aux solvants organiques volatils.

Bénéfices attendus

L’e xposition des salariés à des solvants peut conduire à une dépression du système nerveux central et mener à une altération de leurs performances psychomotrices. L’exposition aux solvants peut donc être responsable de d’accidents du travail. Ainsi, afin de protéger la santé des salariés et limiter l’exposition de ces derniers à de fortes doses de solvant, des valeurs limites d’exposition ont été mise en place. Néanmoins, les relations doses/réponses des solvants sur l’activité cérébrale sont mal connues. Ce projet vise à proposer une méthode de mesure objective de l’effet des solvants sur le système nerveux central et d’améliorer les connaisances sur les risques liés aux expositions aiguës aux solvants organiques.

Procédures

Procédure 1 : Etude pilote (N=16) : N=12 : Chirurgie (1h) ; Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; inhalation « toluène » + électrocorticographie (4 x 8h) ; mise à mort et prélèvement de tissus N=4 : Mise à mort et prélèvement de tissus Procédure 2 : Mesure de l'activité cérébrale par électrocorticographie et analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=56) N=14 par dose de solvant : Chirurgie (1h) ; [Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; Comportement (30min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 3 : Mesure du nystagmus post-rotatoire suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : Chirurgie (45min) ; [Inhalation « contrôle » (4 x 8h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 4 : Analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : [Inhalation « contrôle » (4 x 8h); Comportement (30min); Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 5 : Prélèvement sanguin et de tissus neuronaux suite à l’exposition aux solvants (N=96) N=8 par temps de prélèvement (temps 1 : à la fin du 4ème jour des périodes « solvant » ; temps 2 : à la fin de la semaine post-exposition). Les animaux seront mis à mort par prélèvement final du sang et du cerveau (5 minutes maximum, sous anésthésie profonde). Dans le cas où les quantités de solvant dans le sang ou le cerveau sont égales à zéro après une semaine de récupération lors de la phase expérimentale 1, le nombre de rats mis à mort au temps 2 pourra être réduit à n=4 pour les expérimentations suivantes.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant. Ils pourront présenter des signes cliniques tels que des troubles de l'équilibre ou des tremblements. Ces signes cliniques devront, néanmoins, disparaître dans l'heure qui suivra la fin de l'exposition.

Devenir

La totalité des animaux prévus dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.

Remplacement

Le modèle animal est indispensable pour obtenir des résultats exploitables puisque : - notre approche expérimentale, qui vise à étudier l’activité cérébrale par électrocorticographie, n’est pas possible in vitro. - notre projet étudie les atteintes au niveau comportemental et neuro-sensoriel, expérimentations qui ne peuvent être réalisées que sur l'animal vivant.

Réduction

Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animaux requis soit réduit à son minimum. Autant que possible, l’utilisation de chaque animal a été optimisée pour récolter un maximum de mesures, à la fois fonctionnelles, comportementales et histologiques. Sont décrites ci-dessous les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux : 1) Les animaux seront leurs propres contrôles : Ils seront exposés initialement à une période de 4 jours d’air ambiant (période « contrôle ») puis 4 jours à des vapeurs de solvants organiques (période « solvant »). Les mêmes mesures fonctionnelles et comportementales seront réalisées pendant et à la fin de ces deux périodes pour comparaison. 2) Lors de la phase expérimentale 2, les effets fonctionnels et comportementaux de trois doses incrémentales du même solvant seront testés sur les mêmes animaux. Chaque exposition à une dose de solvant sera précédée d’une période « contrôle » afin de s’assurer que les animaux sont bien à leur niveau basal en terme de fonction cérébrale et de comportement. 3) Les animaux dont l'activité cérébrale sera mesurée pendant l'exposition aux solvants réaliseront également certains tests comportementaux, et seront ensuite mis à mort pour analyse histologique des tissus d’intérêt. 4) Les animaux dédiés aux tests comportementaux, mais dont l’acitivité cérébrale n’est pas enregistrée, seront également utilisés pour le dosage des solvants dans les tissus d’intérêt afin de réduire au maximum le nombre d’animaux concernés par la procédure de prélèvement seule.

Raffinement

1. Pe ndant toute la durée du projet, les animaux seront traités avec douceur et compassion par le personnel compétent. Des caresses seront prodiguées lors de chaque manipulation. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Les animaux seront hébérgés (si possible) par deux. Leur environnement sera enrichi par un tunnel en carton. 2. Concernant les chirurgies : - Afin d'atténuer la douleur, les animaux recevront un analgésique pré-opératoire et un anti-inflammatoire non stéroïdien sera délivré à l'animal (deux fois à 24h d’intervalle) après les chirurgies. - Pendant l'intervention chirurgicale : o Un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter le dessèchement oculaire o La température corporelle de l'animal sera maintenue à l’aide d’une couverture chauffante thermorégulée. - A la fin de l'intervention chirurgicale : o Une pommade sera appliquée afin d’accélérer le processus de cicatrisation. o Une injection de sérum physiologique sera faite afin de palier la déshydratation de l’animal, inhérente à la chirurgie - Suite à l’intervention : o Le réveil des animaux se fera dans une armoire chauffante ; ils bénéficieront d’une surveillance accrue avant le retour dans leur pièce d'hébergement. o De la nourriture sous forme de bouchon et sous forme gélifiée sera mise à disposition à l'intérieur de la cage. o Les animaux bénéficieront d'une période de suivi post-opératoire de 5 jours pendant laquelle ils seront observés (afin de déceler tout signe de douleur ou toute modification comportementale) et pesés quotidiennement. o Les animaux seront hébergés individuellement afin d'éviter l'exploration de sites d'incision et de suture par leurs congénères et la détérioration du dispositif implanté, mais seront mis dans des cages transparentes afin de garder un contact visuel entre eux. 3. Concernant les inhalations de solvants : - Les animaux seront habitués progressivement à être placés dans les enceintes d'inhalation afin de diminuer le stress lié à ce nouveau lieu. - Pendant la période d'exposition, les animaux seront observés toutes les 2 heures et une fiche de suivi clinique individuelle sera remplie en cas d'observation de signes de souffrance chez un animal. 4. Concernant les tests comportementaux : - Les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins deux semaines avant le début des expositions.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal s’est porté sur les rats Long Evans. En effet, le rat présente un métabolisme des solvants proche de celui de l'Homme. De plus, les tests comportementaux utilisés ici visent à évaluer les atteintes des solvants sur le fonctionnement de l’oreille interne. Les expérimentations, donc, doivent être menées sur des souches de rat pigmentées car, comme chez l'Homme, la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne (les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants). Les rats seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 3 mois) car l'oreille interne ainsi que les cytochromes présents dans le métabolisme des solvants doivent être matures.