Recherche appliquée

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).

Procédures

4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle

Raffinement

Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole

544 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un modèle de dépression obtenu par corticostérone dans l'eau de boisson pendant cinq semaines, suivi d'injections de kétamine, de chirurgies stéréotaxiques cérébrales et de la pose de canules intracérébrales. Il indique que les animaux subissent une "batterie de tests comportementaux" dont il ne précise pas le détail, avant la mise à mort pour analyser les marqueurs cérébraux. Sur le remplacement, il affirme que la dépression ne peut être reproduite sur des lignées cellulaires et que la souris en offre un modèle proche de l'humain.

Objectifs

La découverte de propriété antidépresseur de la (±)-kétamine a changé notre compréhension des troubles dépressifs majeurs et a suscité l’espoir de nouvelles avancées thérapeutiques. En effet, alors que les antidépresseurs classiques ciblant les systèmes monoaminergiques mettent des semaines à agir et sont souvent inefficaces - 30 % des patients ne répondent pas au traitement - l'administration d'une dose subanesthésique unique de (±)-kétamine provoque des actions antidépresseurs rapides et robustes chez les patients souffrant de dépression pharmaco-résistante. Si ce pouvoir antidépresseur est fermement établi, plusieurs aspects du mode d'action de la (±)-kétamine restent mal caractérisés ou controversés, et son utilisation clinique est limitée par des effets psychomimétiques indésirables sévères. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent son efficacité antidépresseur rapide et ses caractéristiques psychomimétiques afin d’identifier de nouvelles cibles pour une intervention thérapeutique sûre dans les troubles dépressifs. Nous proposons qu'en remodelant l’organisation synaptique des récepteurs NMDA du glutamate (récepteurs majeurs de la neurotransmission excitatrice), la (±)-kétamine modulerait les réseaux neuronaux soutenant la récompense et l'humeur, et soulagerait ainsi les symptômes de la dépression.

Bénéfices attendus

En utilisant une combinaison de techniques d’imagerie de super-résolution, électrophysiologie, de biochimie et de comportement, nous évaluerons l'impact de la (±)-kétamine sur la dynamique, la stabilisation et l’organisation synaptique des récepteurs NMDA dans les réseaux corticaux et hippocampiques. Nous étudierons ensuite comment les redistributions des récepteurs NMDA induites par la (±)-kétamine peuvent soutenir les changements de connectivité au sein des réseaux cortico-mésolimbiques et mettrons en œuvre des tests comportementaux pour établir si moduler l’organisation des récepteurs NMDA aux synapses contrebalance ou imite les actions antidépresseur ou psychotomimétique de la (±)-kétamine.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions: -remplacement de l'eau de boisson par une eau de boisson supplémentée avec de la corticosterone pour generer un stress chronique chimique visant à créer un modéle de depression (5 semaines), qui sera reversé par l'injection intraperitonéale de Kétamine (1 min). -Les animaux subiront une batterie de tests comportementaux pour evaluer la depression et l'impact de la ketamine ou des anticorps bloquant la mobilité des récepteurs sur la depression. (12 jours). -Des injections intracerebrales de virus par chirurgie stéréotaxique (30 min) permettant d'identifier des changements de connections entre les réseaux neuronaux de la depression. -Installations par chirurgie des guides cannules intracérébrales (1h) et injection intracerebrale de molécules visant à manipuler les réseaux neuronaux de la depression (15 min) Avec l'euthanasie, notre saisine contient 6 procedures, mais tous les animaux ne subiront pas les 6 procédures.

Impact sur les animaux

Notre modèle de dépression chez la souris repose sur l’administration chronique de corticostérone dans l’eau de boisson pendant une période de 5 semaines. Ce traitement va donc générer un comportement anxieux et dépressif. Nous mettrons en œuvre également des approches chirurgicales, soit pour injecter des préparations d'ADN, soit pour poser des systèmes médicaux à demeure (canules d’injection) permettant l’injection intracérébrale locale. Ces approches chirurgicales pourront occasionner une gêne associée à la cicatrisation et la récupération post- chirugicale. Toutes ces nuisances sont suivies et pris en charge médicalement quand cela est possible

Devenir

A l'issu de chaque procédure, les animaux sont maintenus en vie pour participer à une autre procédure ou soient euthanasiés pour réaliser l'analyse des marqueurs moléculres de la depression

Remplacement

La dépression est une pathologie complexe, faisant intervenir plusieurs régions cérébrales et plusieurs systémes de neurotransmetteur. Il est impossible de mimer les changements cérébraux sur des modèles alternatives types lignées céllulaires. Les modèles murins offrent une opportunité unique d'étudier au plus prés de la pathologie humaine la depression

Réduction

Une planification précise des expériences a également été établie afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, tout en ayant des groupes suffisamment importants pour obtenir des statistiques solides (réduction).

Raffinement

Toutes les chirurgies s'accompagnent de l'injection de substances pharmacologiques permettant de réduire durablement la douleur et les souffrances pendant la chirurgie et les jours suivants, pendant la phase de récupération. Le stress des injections intracérébrales (IC) est réduit par une manipulation quotidienne des souris pour l'entretien des guides canules. Les effets secondaires potentiels seront évalués par un suivi des prises alimentaires. Des changements dans l’interaction des animaux avec les expérimentateurs seront contrôlés quotidiennement, 3 jours avant et pendant toute la période des injections. Si ces paramètres varient, ils seront consignés et provoqueront l'arrêt des injections. Les animaux seront maintenus par 4 afin de maintenir le comportement social, pour une cabane transparente rouge et un carré de coton seront ajoutés dans la cage pour enrichir l’environnement. Si nous observons un ou plusieurs des signes cliniques tels que la perte de poids, l'absence d'appétit, l'agressivité anormale à la manipulation, poils hérissé et dos vouté, indifférence par rapport au milieu extérieur). Une fiche de suivi quotidien est initiée pour un suivi sur au moins 5 jours (cf suivi chirurgie). Si les solutions de raffinement telles que le réchauffement de l'animal, l'apport de nourriture ramollie/en gel enrichi en glucose ne changent pas durablement l'état de santé de l'animal durant les 5 jours de suivi, nous procéderons à la mise à mort de l'animal. Le responsable de l'étude est le seul à pouvoir prendre la décision de mise à mort à ce stade.

Choix des espèces

Notre projet utilise des souris C57BL/6J principalement en raison de la forte homologie dans les mécanismes de base de la depression entre l'homme et la souris. Les réseaux neuronaux et les systémes de neurotransmetteurs mis en jeu sont similaire entre la souris et l'homme. De plus, les nombreuses stratégies thérapeutiques actuelles chez l'homme ont été développé ce qui permet d'illustrer la pertinence de ce modèle La depression est une pathologie qui touche tous les ages, sans réelle prépondérence en fonction de l'âge, c'est pourquoi nos études se feront sur les souris adultes (2-4 mois)

203 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cet amendement décrit chez des souris immunodéficientes le développement d'une tumeur à la nuque, une injection sous-cutanée, huit injections intrapéritonéales et cinq séances d'imagerie, avant la mise à mort pour analyser la tumeur. Le porteur teste une thérapie cellulaire par lymphocytes T corrigés contre une immunodéficience humaine. Il indique que l'essai préclinique sur modèle animal est exigé par l'Agence nationale de sécurité du médicament avant tout essai chez l'homme.

Objectifs

Cet amendement a pour but de modifier le protocole afin d'obtenir une meilleure réponse immunitaire des lymphocytes T. Des tests préliminaires in vitro nous ont indiqué que le Blinatumomab permet d'augmenter la réponse immunitaire des lymphocytes T. Il s'agit d'un anticorps humain bi-spécifique permettant de cross-linker les lymphocytes T avec les cellules pré-cancéreuses. 1 microgramme de Blinatumomab sera donc coinjecté en même temps que l'IL2 à partir de la date d'injection des lymphocytes T. Cet anticorps n'a pas d'effet physiologique chez la souris. L'ajout de cet anticorps n'entraine pas un plus grand nombre de souris à utiliser ni d'injection supplémentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce rpojet permettaont d'évaluer l'efficaicté et l'inocuité d'un nouvrea traitement de thérapie celulaire pour le symdrome de la Pi3kinase activée (APDS1)

Procédures

Une injection sous cutanée, 8 injections intra péritonéale, 5 points d'imagerie non invasive (IVIS Spectrum).

Impact sur les animaux

En l'absence de système immunitaire, une tumeur se développera au niveau de la nuque de l'animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin d'étudier le contenu tumoral et l'infiltration des lymphocytes T.

Remplacement

La mise en place d’essais pré-cliniques sur modèles animaux, quand ceux-ci existent, est exigée par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament dans tout dossier préalable à la demande d’un nouvel essai clinique chez l’homme.

Réduction

Les prélèvements de cellules de patients sont très limités ce qui entraine un faible nombre de souris à utiliser. Des mises au point sur la quantité de cellules permettront d'ajuster le protocole.

Raffinement

Toutes les manipulations induisant de la douleur chez l’animal (injection intraveineuse, injection sous-cutanée) seront précédées par une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 2%). Un collyre à base de tétracaïne sera appliqué sur l’œil après l’injection dans le sinus rétro-orbitaire afin de limiter la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement et nous avons établi des points-limites entrainant l’euthanasie des animaux si nécessaire. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement exempt d’organisme pathogène, et avec une nourriture et une eau stérile. De plus, nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement des animaux par la mise à disposition de cotons, de bâtonnets à ronger et de maisonnettes en carton. Ces mesures permettent de maintenir les meilleures conditions de vie et de santé des souris répondant à l’impératif du raffinement.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente NSG est un modèle de choix pour tester l’efficacité de nouvelles approches de thérapie cellulaire et génique des déficits immunitaires. En effet, ce modèle est capable de permettre la greffe de tumeurs développées à partir de cellules B-EBV de patients. L’injection de lymphocytes T de ce même patient qui auront été corrigées, permettra de mesurer l’efficacité d’immunosurveillance des cellules corrigées par rapport aux cellules malades non corrigées. Le potentiel d'immunosurveillance est corrélé à la régression tumorale induite par ces cellules. La lignée NSG est commercialisée par Charles River et ne présente pas de phénotype dommageable à l’état basal. Des adultes de 6-8 semaines seront utilisés, un protocole précédemment établi (PMID : 27799161) a en effet permis de déterminer que des souris de cet âge permettent de mesurer le potentiel d’immunosurveillance de lymphocytes T corrigés.

323 rats âgés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un régime de sous-nutrition provoquant une perte de masse musculaire, testé contre un probiotique, avec prises de sang sur animal vigile. Il indique que la mise à mort se fera par prélèvement d'une grande quantité de sang sous anesthésie jusqu'à l'arrêt cardiaque, une dérogation ayant été demandée pour éviter que l'anesthésique ne fausse les mesures. Sur le remplacement, il affirme que la fonte musculaire liée à l'âge est impossible à reproduire en culture cellulaire et que le rat est "la seule option possible".

Objectifs

La proportion des personnes âgées (60 ans et plus) est amenée à représenter un tiers de la population française à l’horizon 2050. Cette population est très hétérogène et se caractérise, pour les extrêmes, par des individus en bonne santé, actifs, en bon état nutritionnel, peu sarcopéniques (perte de masse et de fonction musculaire liée à l’âge) et vivant en général chez eux. A l’inverse, il existe (au même âge) une population âgée fortement sarcopénique, généralement dépendante et vivant en institution et en état de sous nutrition chronique. C’est à cette dernière population spécifique que le présent projet s’adresse avec l’objectif de limiter, par une stratégie nutritionnelle (développement d’un aliment fonctionnel), la survenue de la fonte musculaire liée à l’âge généralement associée à l’état de dépendance. Il a été observé, par un des partenaires du projet que certains lactobacilles étaient sur-représentées chez des individus ayant subi une résection de l’intestin. Un transfert de ces bactéries à des rats axéniques a montré une augmentation de l’efficacité d’utilisation de l’énergie et de l’absorption des nutriments alimentaires chez ces animaux, associées à une stimulation de la synthèse des peptides digestifs, une augmentation du trophisme intestinal et une augmentation de l’insulino sensibilité et de l’état nutritionnel des animaux en général. En parallèle, il a également été montré par un des partenaires du projet qu’une amélioration de la santé intestinale pouvait favoriser la redistribution des nutriments énergético-azotés de l’aire splanchnique (intestin/foie) vers les tissus périphériques dont le muscle.

Bénéfices attendus

Nous voulons donc faire la preuve de concept qu’il est possible, par une sélection de bactéries avec des modèles in vitro efficaces et complémentaires (cellules intestinales en culture et C Elegans), de maximiser l’utilisation de l’énergie alimentaire (par une stimulation de l’appétit et de l’efficacité énergétique) afin d’améliorer le statut nutritionnel et l’anabolisme musculaire chez des individus en situation de sous nutrition, en particulier des populations de personnes âgées dépendantes présentant souvent un statut nutritionnel altéré et une fonte musculaire importante. Nous réalisons donc une étude sur une période de 60 jours pour étudier l'impact de notre probiotique sur la masse musculaire (effet long terme) et, sur rats Wistar âgés, une étude plus mécanistique à plus court terme (30 jours) pour évaluer l'impact du probiotique sur la synthèse protéique musculaire (élément explicatif de la fonte musculaire et fortement régulé dans les premières semaines d'altération du statut nutritionnel).

Procédures

- prélèvements de sang sur animaux vigiles pour les tests de tolérance orale au glucose (une fois au début et à la fin de l'expérience pour les animaux de la procédure 2)- Une demande de dérogation a été faite concerant la mise à mort des animaux (tous les animaux de l'étude) car la surdose d'anesthésique modofoe les paramètres biologiques que nous mesurons (notamment le métabolisme énergétique). Par ailleurs, une mise à part par inhalation de CO2, commotion cérébrale ou décapitation ne permettrait pas de réplever le sang nécessaire aux analyses. Nous prélevons donc une grade quantité de sang sous anesthésie gazeuse et la mort survient suite à un arrêt cardiaque lié à l'hypovolémie. La mort de l'animal est vérifiée par absence de battement cardiaque et de respiration. En cas de signes de vie, l'animal subit une dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

L'effet de la sous-nutrition des animaux va induire nécessairement une perte de masse globale, de masse maigre et de masse grasse des animaux. Ces composantes, mesurables au cours de l'étude, permettront d'éviter une perte de masse des animaux trop importantes sur une durée courte. les quantités ingérées seront adaptées en cas de perte trop importante de poids des animaux (voir points limites). Les probiotiques utilisés sont des bactéries de familles que l'on retrouve dans des produits laitiers fermentés, il n'y a pas de base scientifique avarée permettant d'imqginer que ces bactéries puissent générer de réponse physiologique ou métabolique délétère chez les rongeurs.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car dans tous les cas des prélèvements de tissus ou de sang sont envisagés pour pesées et mesures ultérieures

Remplacement

Cette étude vise à déterminer comment, par une stratégie nutritionnelle, il est possible de limiter la fonte musculaire liée à l'âge. Cette sarcopénie est une condition physiologique impossible à reproduire sur des modèles expérimentaux plus simples comme la culture de tissus ou de cellules. De plus, les suppléments nutritionnels (probiotiques) apportés sont connus pour avoir des effets directs sur l'intestin mais également un effet indirect sur le métabolisme musculaire. La dimension intégrant la complexité des interactions entre micobiote, tissus et organes est donc importante, ce qui ne se retrouve que chez les animaux vivants. L'utilisation d'animaux (ici rats) est la seule option possible.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupes a été optimisé pour à la fois permettre d'obtenir des données potentiellement significatives mais sans utiliser plus d'animaux que nécessaire (test de chi2 pour estimer le nombre d'individus selon le nombre de ainsi que le nombre de groupes a été limité

Raffinement

Les méthodologies employées lors des mesures réalisées ont été employées afin de pouvoir utiliser les mêmes animaux pour des mesures répétées (analyses de la composition corporelles par Echo-MRI par exemple). Cette mesure, non invasive, permet de voir un effet de traitement sur une composante que l'on peut mesurer plusieurs fois sur le même animal. Par ce biais, on gagne fortement en puissance statistique en limitant la mise à mort des animaux pour des mesures intermédiaires. Elle permet également de préciser le moment le plus pertinent pour réaliser la mise à mort relativement à l'objectif visé (ici un effet sur la masse maigre). Par ailleurs, sur ces analyses en Echo-MRI, nous avons limité le temps de séjour des animaux dans l'appareil afin de limiter le stress des animaux au cours de la mesure. Par ailleurs, les animaux bénéficient d'un environnement enrichi (jouets en Inox). Enfin, les points limites ont été clairement définis : En cas d’apparition d’un point limite (absence toilettage, pilo-érection, posture anormale, porphyrine, hypo-activité, agressivité, trychophaghie, maigreur, vocalises, hypo-réactivité, comportement de fuite, automutilation, tumeur ou perte de poids>20%) l’animalier alertera les responsables de l’étude. Nous effectuerons une observation plus poussée de l’animal. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, il pourra être apporté à l'animal des soins (nettoyage de plaie, prise d’antalgique, d’anti-inflammatoires) ou, si les soins sont inefficaces ou que les soins ne peuvent pas être apportés, les animaux sont euthanasiés par inhalation de CO2. Ci dessous la liste des points limites notables : apparence sans manipulation (manque de toilettage, piloérection, posture anormale, porphyrine), comportement sans manipulation (hypoactivité, agressivité, trychophagie, maigreur, baisse d'ingestion), apprence lors de la manipulation (diarrhées, sang dans les urines ou féces, deshydratation), comportement lors de la manipulation (agressivité, vocalisation, hypo-réactivité, fuite anormale). La liste des points limites graves : mutilation, absence d'ingestion (supérieure à 2j), tumeur, perte de poids supérieure à 20%.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des rats Wistar âgés de 6-8 ou 18-20 mois. Afin d'étudier le métabolisme musculaire et l'effet potentiellement bénéfique de probiotiques chez le sujet adulte ou âgé, nous avons besoin d'un modèle animal dont le métabolisme soit proche de l'homme, dont la durée de vie est limitée afin d'avoir rapidement des animaux âgés et de taille raisonnable. Le rat est l'animal le plus approprié. De plus nous avons déjà fait des études du métabolisme musculaire en situations cataboliques chez le rat Wistar au laboratoire (Mercier et al, 2002; Magne et al, 2012). L'utilisation du rat Wistar adulte et âgé dans cette étude nous permettra de comparer les données par rapport à des études précédentes. Animaux adultes ayant fini leur croissance : adultes jeunes (6-8 mois) et animaux âgés (18-20 mois) couramment utilisés dans l'ensemble des études sur le vieillissement dans le laboratoire (Dardevet et al, 2012).

394 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un régime déséquilibré de trois mois suivi d'un accident vasculaire cérébral provoqué chirurgicalement, avec injection de nanoparticules porteuses d'ARN. Il indique que l'AVC peut entraîner perte de poids, mouvements de rotation et mort prématurée, les animaux étant ensuite tués pour prélever les tissus cérébraux. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de l'ischémie ne peut s'envisager que dans un "organisme entier" et qualifie d'"indispensable" le passage à l'animal.

Objectifs

Les complications cardiovasculaires représentent l’une des premières causes de morbi-mortalité chez les patients âgés associant un vieillissement artériel et métabolique. Ce projet s’intéresse particulièrement à une pathologie ischémique dont la prévalence augmente considérablement au-delà de 60 ans : l’accident vasculaire cérébral (AVC). Chez ces patients, les perturbations métaboliques systémiques, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie qui font partie des facteurs de risque bien identifiés dans ces pathologies ischémiques, ciblent en premier lieu la monocouche endothéliale des vaisseaux. De plus, après l’ischémie, ces perturbations créent un environnement délétère qui altère la capacité à développer un réseau vasculaire collatéral nécessaire à la revascularisation post-ischémique. La revascularisation implique des phénomènes angiogéniques, processus de novo qui se produisent lors de l'expansion et la constitution du lit capillaire. Cependant, chez les patients présentant des perturbations métaboliques systémiques à l’origine de pathologies ischémiques, ce processus est nettement altéré. L’initiation d’une réponse pro-angiogénique a ainsi été identifiée comme un challenge thérapeutique chez ces patients. La demande d'amendement de ce projet concerne une mise à mort anticipée à 24h post-AVC et l'abandon d'une procédure. Cette étude permettra d'améliorer le travail préliminaire effectué lors de l'étude précédente (Projet #2020102016121286).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme.

Procédures

Le traitement protecteur sera administré à des souris par voie systémique. Il consiste à injecter des nanoparticules porteuses d’ARN inhibiteurs ciblant une protéine dans l’endothélium. Les souris seront suivies de façon longitudinale tout au long de l'étude et ce dès le début du vieillissement métabolique et artériel induit par un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides. Après 3 mois de ce régime couplé au traitement, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral ischémique en utilisant un modèle in vivo d'ischémie cérébrale.

Impact sur les animaux

Un changement de nourriture suivi d'un accident vasculaire cérébral pourront se traduire par une perte de poids et/ou par une mobilité anormale (rotations). Ces nuisances pourront se traduire par une mort prématurée.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire une étude de la protection induite par notre molécule d'intérêt

Remplacement

Après des premières étapes montrant l’intérêt d’éteindre cette protéine de l’endothélium dans un modèle de culture primaire de cellules isolées de sang de cordon humain, le projet a pour but maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale, qui met jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et de son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous possédons des expertises en modèles reconnus de vieillissement vasculaire et d'accident vasculaire cérébral ischémique. Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les données seront analysées grâce à un test de Kruskal-Wallis suivi de comparaisons multiples de Dunn.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement analgésique en pré- per- et post-opératoire. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou euthanasié selon le score.

Choix des espèces

Après des premières étapes montrant l’intérêt d’éteindre cette protéine de l’endothélium dans un modèle de culture primaire de cellules isolées de sang de cordon humain, le projet a pour but maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il est donc indispensable de passer à des études chez l’animal. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte avec des facteurs métaboliques aggravant comme le diabète, les animaux seront utilisés au stade adulte après un régime conduisant à des perturbations métaboliques systémiques. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.

6 300 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des solutions nutritionnelles et des additifs sur leur croissance en engraissement. Le porteur indique qu'ils seront exposés cinq semaines à des températures atteignant 35 degrés et soumis à des prises de sang sur animal vigile, une partie subissant des prélèvements de tissus. À la fin des essais, la plupart partiront à l'abattoir pour la consommation, ceux ayant reçu un additif non autorisé ou ayant servi aux prélèvements partant à l'équarrissage. Sur le remplacement, il affirme que la croissance ne peut pas être reproduite in vitro et conclut qu'il est "essentiel" de travailler sur l'espèce elle-même.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer l’effet de solutions nutritionnelles et additifs sur les performances zootechniques et la santé des lapins en engraissement, en conditions de challenge (température / niveaux de Matières premières) ou non.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise sur le marché d'une ou plusieurs solutions nutritionnelles ou additifs afin d'améliorer la croissance des lapins en engraissement lorsqu'ils sont soumis à des conditions de challenge.

Procédures

Tous les animaux de la procédure seront exposés à des températures élevées (maximum 35 degrés) la durée d’exposition sera de 5 semaines, avec une période d’adaptation d’une durée de 1 semaine (avec une montée progressive en température). Les prises de sang pourront être réalisées sur animal vigile. Entre 20 et 40% des animaux d’une procédure pourront être prélevés avec au moins 7 jours de récupération entre 2 prélèvements et un maximum de 6,5% de la volémie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les lapins sont susceptibles de souffrir de la chaleur comme lors de périodes estivales, dans le cas de challenge de température. Dans le cas de challenge via des additifs / ingrédients, les effets pourraient être une baisse de la consommation alimentaire avec une répercussion sur la courbe de croissance.

Devenir

A la fin de chaque essai, les animaux entreront dans le circuit de consommation pour la plupart, sauf ceux ayant reçu un additif non autorisé dans l’Union européenne et ceux sur lesquels des prélèvements de tissus seront réalisés. Ces derniers partiront à l’équarrissage.

Remplacement

L’ensemble des mécanismes et régulations physiologiques qui interviennent au cours de la croissance des animaux est extrêmement complexe et ne peut pas être modélisé ou reproduit in vitro.

Réduction

Le nombre minimal de répétitions (c’est-à-dire la cage) est estimé à 15 par traitement expérimental avec un maximum de 6 traitements expérimentaux par essai. Ceci correspond au nombre nécessaire pour obtenir une différence significative de 5% sur l’ingéré alimentaire. Dans le cas de paramètres hématologiques, les prélèvements ne seront réalisés que sur une partie des effectifs jugés nécessaires et suffisants au regard des éléments disponibles (bibliographie et expérience interne) ; le nombre d’animaux sera ainsi ajusté, en essayant de le diminuer au maximum. La distribution des données sera évaluée selon des graphiques en box plots afin d’identifier les données aberrantes. Après élimination des données aberrantes, les données zootechniques seront soumises à des analyses de variance (ANOVA) avec le traitement expérimental en effet fixe. La mortalité sera évaluée selon le test Chi-2. Le niveau de significativité est fixé à p

Raffinement

Les animaux sont placés en logement collectif ou individuel selon l’objectif de l’essai. En effet, un animal par cage permet une mesure très fine et très précise de la consommation alimentaire ; ce dispositif est utilisé surtout lorsque nous souhaitons étudier finement les effets de nouveaux additifs sur la consommation alimentaire et la croissance associée. Ces essais en logement individuel représenteront 2 essais maximum dans le projet. Mettre plusieurs animaux dans une cage permet de mieux représenter l’élevage cunicole standard en mimant les conditions d’élevage observées sur le terrain. Des chainettes seront disposées dans chaque logement, et peu importe le nombre de lapins, afin que les animaux puissent jouer avec quand ils le souhaitent. Les prises de sang décrites dans la procédure ci-après seront réalisées par un vétérinaire ou un personnel compétent et formé à l’acte ainsi qu’à la contention. L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens. Des chaînettes sont placées dans chaque cage pour que les lapins puissent jouer avec. Les interactions sociales sont possibles car les cages (y compris individuelles) ont toutes au moins 2 parois communes grillagées avec d'autres ; les lapins peuvent se voir, se sentir et se toucher.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet étant de développer des stratégies permettant de lutter contre diverses affections digestives chez le lapin de chair, il est essentiel de travailler sur cette même espèce animale. Les animaux seront utilisés entre 35 et 70 jours d’âge. Il s’agit de la période d’engraissement durant laquelle les lapins sont engraissés, correspondant à l’élevage classique des lapins de chair. Il convient donc d’étudier les animaux lors de cette période.

608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe une tumeur, puis elles reçoivent des médicaments par injection intraveineuse et intra-tumorale, avec des séances d'imagerie sous anesthésie et des prélèvements sanguins. Le projet teste des nanoparticules activées par ultrasons pour concentrer les médicaments anticancéreux au niveau de la tumeur. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour évaluer la biodistribution in vivo.

Objectifs

Aujourd'hui, de nombreux médicaments en oncologie souffrent d'une faible efficacité. Seul un pourcentage très faible de la dose atteint la cible à traiter lorsqu'ils sont administrés par voie orale ou intraveineuse, tandis que la majorité de la dose surcharge inutilement et dangereusement le corps du patient. En cancérologie, les traitements entrainent des effets indésirables difficiles à supporter pour les patients nécessitant de diminuer les doses et d’espacer les traitements. L’effet thérapeutique est alors fortement diminué. De nombreuses thérapies innovantes telles que l’ajout de transporteurs actifs tentent d’apporter une réponse à ce problème mais sont le plus souvent actives sur un nombre restreint de patients et ont un coût très élevé. Nous avons mis au point une nouvelle approche utilisant des nanoparticules pouvant être administrées chez les patients pour délivrer tout type de médicaments de façon ciblée au niveau de la tumeur. Cette délivrance peut être contrôlée par l’action d’ondes sonores (ultrasons) appliquées au niveau de la zone à traiter. Cette approche permettrait de traiter la zone cancéreuse chez un patient avec une plus grande efficacité thérapeutique tout en minimisant les effets indésirables au niveau des tissus sains. Elle permettrait ainsi d’éliminer les effets indésirables du médicament administré qui serait, de fait, mieux toléré et dont l’efficacité thérapeutique serait conservée. De nombreux médicaments utilisés aujourd’hui dans le traitement des cancers, peu tolérés en administration seule ou présentant certaines toxicités, pourraient être combinés à nos nanoparticules afin de limiter leurs effets indésirables et augmenter leur efficacité thérapeutique. Cette approche permet, en plus, d’exploiter des agents déjà développés ou en cours de développement et ayant fait leur preuve in vitro contre divers cancers avec des résultats mitigés in vivo. Nous avons montré en laboratoire (in vitro) que des ultrasons à des ondes bien précises entrainent la délivrance contrôlée de médicaments utilisés dans le traitement des cancers. Ces études en « tube à essai » sont une étape initiale importante mais doivent être validées dans un organisme vivant pour se rapprocher de la complexité rencontrée chez les patients. .

Bénéfices attendus

Ce projet avec un fort potentiel clinique doit permettre de tester cette nouvelle stratégie thérapeutique qui couple délivrance par ultrasons et médicaments anti cancéreux dans un modèle préclinique. Le recours à l’animal est indispensable pour l’évaluation in vivo sur la biodistribution et l’efficacité. Ces études auront pour but de vérifier et d’optimiser le ciblage de médicaments anti-cancéreux au niveau de la tumeur et d’étudier comment le médicament se distribue dans le reste du corps. Ces études sont une étape clé pour continuer le développement de cette technologie chez l’humain.

Procédures

Les effets interventions prévues sur les animaux sont listés ci dessous : o L’injection des médicaments en intra veineux et intra tumorale (2 fois par semaine maximum) peut induire une courte douleur (moins de 5min) qui sera réduite via l’utilisation d’anesthésiant local (Xylocaïne, gel 2%). Les injections de médicaments ne seront réalisées que sur une durée de moins de 3 semaines. o Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (1h30 maximum) par voie gazeuse (isoflurane 1.5% à 2.5%). Lors du réveil, les souris peuvent être désorientées et stressées. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière sera prévu dans la cage propre. o Des prélèvements sanguins seront réalisés pendant les différentes procédures. Un volume maximal de 50-100µL, lors de séance d’imagerie, soit une heure et 48h après l’injection des médicaments seront réalisés (durée totale : 5minutes). L’application de gel de Xylocaine (2%), sera effectué pour atténuer la douleur. o Les tumeurs peuvent impacter la mobilité de la souris. Suite à l’injection des xénogreffes, les souris seront examinées tous les deux jours afin de vérifier que le volume tumorale n’impacte pas la mobilité de la souris. Dès l’observation de cette mobilité réduite (dans les 24h), les souris seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

La mise en place de modèles tumoraux peut induire une gêne au niveau du site d’implantation de la tumeur lors de l’injection de cellules pendant quelques heures. Une analgésie adaptée est mise en place (Xylocaine en gel) ainsi qu’un suivi régulier des animaliers. L’injection d’agents d’imagerie, toujours réalisée sous anesthésiant local (imagerie par tomographie par émission de positon, imagerie optique et /ou échographie) n’induit pas d’effets indésirables, étant donné que le traceur est à très faible dose. Le prélèvement sanguin n’est réalisé qu’une ou deux fois par semaine avec des volumes très faibles, ne perturbant pas le bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser des corrélations entre des analyses ex vivo et l’imagerie. L’analyse ex vivo est un point crucial afin de réduire dans les prochains projets le nombre d’animaux en validant la méthodologie appliquée. De plus, le volume tumoral à chaque fin de procédure serait trop important pour garantir les points limites sur le volume tumoral.

Remplacement

L’efficacité de la délivrance des médicaments augmentée par ultrasons sera dans un premier temps évalué in vitro afin de définir aux préalables les paramètres ultrasonores. La toxicité des nanoparticules et des médicaments associés seront évaluées in vitro également. Ces études sont essentielles afin de remplacer l’utilisation des animaux par des essais in vitro. De plus ces études permettent de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons pour l’évaluation sur le modèle murins.

Réduction

L’imagerie permet des études longitudinales en pharmacocinétique et par conséquent ne nécessite pas l’utilisation d’animaux à chaque temps, réduisant drastiquement le nombre de groupe d’animaux nécessaires pour des études classiques en pharmacologie. Chaque donnée d’imagerie, individuellement ou globalement, permettront après analyses de définir la distribution des agents thérapeutiques de manière longitudinale en gardant la puissance statistique de l’étude.

Raffinement

Toutes les interventions invasives, à savoir, les injections systémiques ou intra-tumorales seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse, complétées par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liés aux interventions. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Ce projet a comme objectif de suivre et d’évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique sur la délivrance de médicaments anti-tumoraux associés à des nanoparticules augmentée par ultrasons. La souris est l’animal de choix pour la mise en place de modèle tumoraux, ayant une taille adaptée pour la manipulation. Les modèles sous-cutanés sont largement utilisés pour examiner rapidement de larges cohortes de tumeurs relativement homogènes dont la croissance et la réponse aux médicaments délivrés de façon standard ont déjà été évaluées.