Recherche appliquée

Les souris retenues sont sensibles au SARS-CoV-2 et développeront des symptômes généralisés après inoculation. 192 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une puce télémétrique leur est implantée, elles sont infectées puis suivies quinze jours avec des prélèvements sanguins à la lancette, une perte de poids et une chute de température étant attendues, et leurs cerveaux, poumons, intestins, rate et sang sont prélevés après la mise à mort. Le porteur écrit que 200 souris correspondent au "nombre minimal nécessaire", alors que le tableau des gravités n'en déclare que 192.

Objectifs

Les conjugués peptide-porphyrine sont des médicaments antiviraux à très large spectre capables de pénétrer dans le cerveau et le placenta, et donc de protéger le système nerveux central et les fœtus contre l'action des virus. Ils doivent leur large spectre d'activité à la cible particulière qu'ils visent dans la structure virale : l'enveloppe lipidique. Cette classe de composés compromet l'intégrité des enveloppes et les virus sont incapables de réparer les dommages, ce qui entraîne une perte de fonctionnalité. La preuve de concept a été établie in vitro avec les virus SARS-CoV-2 et Zika et in vivo avec le virus Zika. Il est nécessaire de valider l'activité antivirale des conjugués contre le SARS-CoV-2. Dans ce cadre, les trois conjugués préalablement validés pour leur efficacité contre plusieurs souches de SARS-CoV-2 sont des candidats prometteurs pour une visée thérapeutique. Il est nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ces antiviraux injectés à plusieurs temps à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 devraient initier une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de signes cliniques.

Bénéfices attendus

La validation des antiviraux testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’améliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19.

Procédures

Tous les animaux, soit 192 souris. Des prises de sang seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une lancette (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Administration des anti-viraux ou placebo sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique antivirale (5 minutes par animal, 8 fois). Challenge infectieux sous anesthésie générale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptômes généralisés mais avec une faible mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire ainsi qu’une perte de température est attendue suivi d’une survie de 15 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon les observations biquotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie sous-cutanée pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantation de la puce télémétrique. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal. La prise de sang peut aussi engendrer un stress et une douleur légère au point de prélèvement lors de l’utilisation de la lancette.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (cerveaux, poumons, intestin, rate, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le suivi des antiviraux dans les tissus, pour le recrutement cellulaire et la réponse immunitaire induite.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. Cette taille d’échantillon de 12 souris permet de détecter un effet modéré. Au total, 200 souris sont prévues pour ce projet, ce qui correspond au nombre minimal nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques (efficacité antivirale) tout en respectant le principe de réduction des 3R.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe social, dans des cages respectant les surfaces réglementaires et dans un environnement enrichi par différents types comme de la cellulose ou du sizzle, des bâtonnets de bois et des tunnels ou maisonnette/dôme… Les animaux sont transportés via un transporteur agréé dans un véhicule adapté et respectant au mieux les conditions et paramètres environnementales jusqu’à leur acheminement dans leur lieu d’hébergement définitif où ils sont ainsi manipulés pour les déplacer de la boite de transport vers la cage d’hébergement. Lors de cette manipulation, il est implanté la puce télémétrique. Ensuite vient la phase d’acclimatation où les animaux vont s’habituer progressivement à leur nouvel environnement et à la visite quotidienne des techniciens animaliers. Dès leur arrivée et pendant l’acclimatation, une récompense alimentaire sera distribuée aux animaux de type, graine à décortiquer, popcorn... Puis durant la procédure après chaque manipulation sur l’animal, afin de récompenser et favoriser l’acceptation des gestes. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites via un suivi clinique. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les injections pour les anesthésies et les traitements seront réalisés par voie sous-cutanée, moins nocive que la voie intrapéritonéale, tout en maintenant une efficacité comparable. L’euthanasie au pentobarbital pouvant provoquer des douleurs, les animaux seront anesthésiés avant l’injection létale. Les prélèvements de sang seront espacés de plus d’une semaine.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris humanisée est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.

Pour cribler jusqu'à douze candidats médicaments par cible et sur trois cibles au maximum, 6 000 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par injection dans la veine de la queue sur animal vigile, un poinçonnement auriculaire sans anesthésie, puis des prélèvements sanguins une à deux fois par semaine et un prélèvement de moelle osseuse deux fois par mois. Le porteur fixe la mise à mort à 80 % de cellules humaines détectées dans le sang ou à 20 % de perte de poids. Le criblage doit aboutir à un candidat principal mené en développement réglementaire et à une estimation de la dose pour la première injection chez l'être humain.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données d’efficacité antitumorale lors d’administration par voie intraveineuse de candidats médicaments de thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC), dans des souris immunodéficientes porteuses de xénogreffes de lignées cellulaires leucémiques humaines. Ces composés étant majoritairement cross-réactifs humains/souris avec le même profil d’expression dans les deux espèces), les résultats chez la souris permettront de modéliser l’efficacité chez l’humain. Ces données d’efficacité en escalade de dose permettront d’effectuer une étude de criblage de candidats médicaments en fonction de leur cible, de leur niveau d’expression et des indications thérapeutiques pertinentes. Ces données permettront de sélectionner un candidat principal à mener en développement réglementaire et de contribuer à l’évaluation les doses minimales efficaces antitumorales (MED) pour la première injection chez l’homme. Ce projet est divisé en 2 procédures consécutives et interdépendantes pour chaque cible (répétables jusqu’à 3 cibles) : # Procédure-1 : Consiste en une Tumorogénèse sur différents modèles de xénogreffe tumorale issue de lignée cellulaire cancéreuse humaine (CDX – jusqu’à 10 modèles). Différents protocoles de la littérature seront testés en termes d’expression de la cible, de dispersion des courbes de croissance et d’homogénéité de croissance tumorale. # Procédure-2 : A l’issue des procédures de mise au point et de sélection des modèles CDX en termes de croissance tumorale, cette deuxième procédure (cœur du projet), consiste à cribler différents candidats médicaments (jusqu’à 12 par cible), en face de contrôles positifs et négatifs, à différentes doses et fréquences, sur 1 à 5 modèles CDX validés et sélectionnés précédemment.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas, leucémies…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Cette étude permettra ainsi d’évaluer la dose minimale efficace antitumorale (MED), qui, en comparaison avec la dose maximum tolérée (MTD - étude séparée), définiront les bornes de la fenêtre thérapeutique. Ces études permettront ainsi de cribler les molécules sur leur fenêtre thérapeutique la plus grande et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser dans les modèles pré-cliniques et cliniques. La première procédure permettra de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La deuxième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans la procédure précédente.

Procédures

# Après une semaine d'adaptation à l'environnement, les souris seront identifiées : - Soit par poinçonnage auriculaire sur souris vigiles (2-3 minutes si moins de 100 souris). - Soit par puçage électronique (injection sous-cutanée sous capsulaire du transpondeur), sous anesthésie gazeuse (4-6 minutes). # Traitement des animaux par les différents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Des échantillons de sang périphérique seront prélevés 1 ou 2 fois par semaine. Chaque prélèvement de sang cumulé ou non retirera en fonction du poids de la souris un volume qui n’excédera pas la limite de 7.5% du volume sanguin total par semaine glissante (2-3 minutes). Ces échantillons de sang pourront être analysés NFS et/ou en cytométrie de flux pour évaluer l’évolution de l’infiltration blastique. De manière plus précise, prélèvements sanguins, de préférence par micro-échantillonnage ou par échantillonnage classique (veine caudale, sinus submandibulaire ou SRO). Des prélèvements de moelle osseuse en intra-fémoral seront également réalisés, sous anesthésie générale gazeuse en alternant les sites de prélèvements entre patte arrière gauche et droite, à un intervalle de deux semaines et à une fréquence d’un prélèvement par patte (J Vis Exp. 2014 Jul 5;(89):51660. doi: 10.3791/51660). Une dose préventive de buprénorphine avant la procédure, à raison de 0,05–0,1 mg/kg par voie sous‑cutanée toutes les 6 à 12 heures, peut être utilisée pour prévenir la douleur associée à la procédure, en complément du carprofène à 5 mg/kg par voie sous‑cutanée pourra être utilisé. Les souris prélevées en intra fémoral sont ensuite anesthésiées (induction de l’anesthésie dans la boîte à 3% d’isoflurane et 3% d’oxygène puis entretien de l’anesthésie au masque à 2-2,5% d’isoflurane et 2% d’oxygène) (6-8 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort. Une nécropsie ainsi qu’un prélèvement d’organes / tumeur pourront être réalisés post-mortem sur les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que sur les animaux arrivant en fin d’expérience. En cumule toutes ces manipulations ne dureront pas plus de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésie (s'il y a lieu - puçage électronique). Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la numérotation sur animal vigile par poinçonnement auriculaire, (2) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection intraveineuse dans la veine caudale ainsi que lors (3) de l’injection par intraveineuse dans la veine caudale sur souris vigiles des candidats médicaments et (4) lors du prélèvement sanguin sur animal vigile et de moelle osseuse sous anesthésie. De façon plus particulière à cette étude (basée sur des modèles de souris dépourvues de système immunitaire et greffées en injection intraveineuse avec des cellules tumorales humaines - CDX), ces animaux seront suivis pour la croissance tumorale 1 à 2 fois par semaine par prélèvement sanguin et 2 fois par mois par prélèvement de la moelle osseuse, pour mesurer et analyser la tumeur et l'état général des animaux. Cette surveillance sera renforcée à l'approche des points limites. Les souris ayant un % de hCD45 de plus de 80% seront mises à mort par dislocation cervicale ou par augmentation progressive de la concentration en gaz carbonique (CO2).

Devenir

Pour chacune des deux procédures: - Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés.

Remplacement

Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de ces candidats médicaments anticancéreux (efficacité, stabilité dans les sérums, internalisation/vectorisation dans cellules tumorales), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique physiologique complexe est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique « first in human » dans les conditions d'injection par voie intraveineuse afin d’appréhender la dose minimale efficace anticancéreuse (MED) normalisées sur les données d’exposition pharmacocinétiques (PK). S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant majoritairement cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle murin. Également, l’implantation des cellules tumorales par voie intraveineuse est primordiale à évaluer. En effet, ces cellules sont nichées dans une matrice extracellulaire riche en molécules allant de différents métabolites et d’espèces réactives d’oxygène jusqu’à plusieurs facteurs inflammatoires, comme c’est notamment le cas de la niche ostéo-médullaire chez les patients atteints de leucémie. L’ensemble de ces acteurs cellulaires et moléculaires sont soumis à des contraintes mécaniques et à des niveaux d’oxygénation différents d’une localisation à une autre au sein de la même niche. Ainsi, l’étude d’efficacité de médicaments ciblant des cellules notamment leucémiques exige le maintien des interactions qu’il peut y avoir entre ces cellules et leur environnement, et ceci ne peut être assuré in vitro.

Réduction

La procédure-1 permettra de mettre au point les modèles et de les caractériser au mieux grâce à une tumorogénèse couplée à une étude d'efficacité, toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). Seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors de ces procédures de mise au point (tumorogénèse et étude pilote) seront utilisés par la suite. La procédure-2 s’effectue également sur un nombre limité d’animaux (qui sera adapté à la baisse en concertation avec notre structure bienêtre animal, en fonction des résultats obtenus lors de la procédure 1).Egalement, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau (Q7D x1, x2 ou x3), permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés en testant jusqu’à deux doses pour la même molécule, au plus près des résultats biologiques. L'analyse statistique des résultats obtenus par les différentes expériences se fera au moyen de tests de Student et de Mann-Whitney (comparaison de deux groupes) ou d'analyses des variances (comparaison de plusieurs groupes), et de Kaplan-Meier (analyse de survie). L'analyse du nombre minimum d'animaux à utiliser pour répondre à chaque objectif avec une puissance statistique suffisante a été implémentée grâce au logiciel G*Power (critères de calcul : effectifs d'animaux équivalents entre chaque groupe, two-tailed, alpha = 0.05). Ce nombre sera de 10 souris par groupe, et a été estimé afin de générer des résultats significatifs en restant en accord avec la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4/5 dans des cages transparentes, aux dimensions adaptées, avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels…). Les conditions sanitaires permettent que leur phénotype ne soit pas dommageable (SPF). Une période de stabulation d’au moins 7 jours avant le début du protocole permettra leur acclimatation afin de réduire le stress des animaux. L’identification des souris sera effectuée sous anesthésie gazeuse si besoin pour le puçage électronique ou par poinçonnage auriculaire. Une surveillance comportementale/physiologique poussée des animaux et la définition d’une grille de score adaptée suffisamment prédictive, permettront de prévenir toute souffrance animale. Concernant les souris ayant reçu les cellules tumorales via injection intraveineuse, l’utilisation d’une technique d'imagerie non invasive ou des prélèvements de sang 1 à 2 fois par semaine sans anesthésie sera effectué pour suivre la croissance tumorale. Les prélèvements resteront dans la limite de 7,5% du volume sanguin total par semaine glissante. Aussi, 2 fois par mois, un prélèvement de moelle osseuse sous anesthésie sera effectué pour suivre le développement leucémique et la charge tumorale. Les animaux auront reçu une dose préventive de buprénorphine avant la procédure (à raison de 0,05–0,1 mg/kg par voie sous‑cutanée pouvant être répétées toutes les 6 à 12 heures). En plus, pour prévenir la douleur associée à la procédure e plus du carprofène à 5 mg/kg par voie sous‑cutanée, pourra être utilisé. Cela permet de déterminer le plus précocement possible le début du traitement et de la réponse. Le pourcentage limite de 80% de détection de hCD45 dans le sang et perte de poids de 20% constitueront des points limites. Un système de surveillance 7/7 est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux. Les animaux inclus dans la grille de score n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés dès que nécessaire (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience sont mis à mort par dislocation cervicale si besoin sous anesthésie gazeuse ou par augmentation progressive de la concentration en gaz carbonique. Afin de s’assurer de la mort effective des animaux, une vérification de la mort (prise de pouls …) sera effectuée.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Afin d’étudier les effets de candidats médicaments sur des xénogreffes de tumeurs humaines (CDX), dans un contexte physiologique, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données allométriques permettant de transposer ces données chez l’Homme). Enfin, les candidats médicaments étudiés dans ce projet pouvant être cross-réactif entre la souris et l’humain, aucune alternative ne peux se substituer à un modèle murin. Les animaux immunodéprimés (portant la mutation Nude ou SCID et de fond génétique choisi en cohérence avec le modèle tumorale décrit dans la littérature), seront livrés à partir de 7 semaines de développement et inclus en expérience après 7 jours d’acclimatation dans l’EU. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant une allométrie pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation (animalerie SPF et expérimentation sous PSM).

Infectées par le virus de la grippe directement dans la mamelle ou par une seconde voie d'administration, 12 brebis en lactation développent une inflammation mammaire et une montée de température. Elles portent un capteur télémétrique implanté par une petite chirurgie et sont traites deux fois par jour pour rester en lactation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées en fin de projet, du fait de l'infection expérimentale. Le porteur justifie six animaux, trois par lot pour deux souches ou deux voies d'inoculation, et prévoit de recommencer l'infection en l'absence de signes, sans expliquer d'où viennent les six autres brebis déclarées.

Objectifs

Contexte et objectif : Jusqu'à récemment, les ruminants n'étaient pas considérés comme des hôtes sensibles aux virus de la grippe aviaire. Cette vision a toutefois changé à la suite d’études récentes faisant état d'infections par le virus de la grippe aviaire hautement pathogène chez des vaches laitières aux États-Unis. Ces infections se caractérisent par une réplication virale massive dans la glande mammaire, entraînant une propagation du virus au sein des troupeaux et entre ceux-ci, ainsi qu'une transmission de la vache à l'homme par le lait infecté. Un cas d'infection par le virus chez une chèvre a également été documenté aux États-Unis début 2024. Des enquêtes sérologiques démontrant la présence d'anticorps chez les caprins, les ovins et les bovins suggèrent que les espèces ruminantes sont des hôtes sensibles et peuvent agir comme des réservoirs facilitant l'émergence de nouveaux virus grippaux aviaires présentant un potentiel zoonotique (voire pandémique) accru. Cependant, le tropisme viral pour la glande mammaire, ainsi que les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire des mamelles des ruminants aux infections par le virus grippal aviaire, sont mal compris. Pour répondre à ces questions, cette proposition rassemble l'expertise de cinq équipes dans le but de : 1/ Évaluer la capacité de souches du virus Influenza A faiblement pathogène à infecter de manière productive les cellules épithéliales mammaires primaires ovines; 2/Mettre en place un modèle d'infection in vivo chez l'ovin afin d'étudier les intéractions entre le virus de la grippe et son hôte, ainsi que les défenses antivirales dans la glande mammaire des ruminants. La demande d’autorisation de projet formulée ici concerne donc le point 2.

Bénéfices attendus

Le consortium bénéficiera du partage des connaissances, des outils et des ressources afin d'anticiper le développement de solutions pour un problème émergent en matière de santé animale. Ce projet représente également une opportunité pour les équipes disposant de compétences complémentaires de nouer des collaborations et de produire des travaux préliminaires qui pourraient ouvrir la voie à des projet scientifiques plus ambitieux. Il sera tiré parti de ce projet pour mettre en œuvre et valider des modèles d'infection par Influenza chez les petits ruminants qui pourront être mis à disposition des scientifiques et d’autres parties prennantes du secteur de la santé animale. La mise en œuvre de ce projet représente ainsi une précieuse opportunité de formation pour le personnel. Enfin, le programme scientifique proposé de tester de nouveaux outils de surveillance clinique chez les moutons (capteurs de température et caméra thermique infrarouge) et de mettre en place un modèle animal original (et plus abordable) pour reproduire les infections par le virus chez les bovins ou d'autres ruminants, qui pourrait être exploité pour le dépistage de vaccins/traitements.

Procédures

Pose des capteurs télémétriques : 20 minutes par animal 2 voies d'infection : 5 minutes par animal Prises de sang : 5 minutes par animal Ecouvillons nasaux : 1 à 2 minutes par animal

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles seront soumis soit à une administration de deux souches de virus, dans un des deux quartiers sous contention, soit à deux voies d'administration d’une souche de virus, sous contention. Il est attendu que les animaux soient atteints par la maladie. Les symptômes attendus sont une inflamation localisée de la mamelle accompagnée d’une montée en températue localisée ou systémique. Il peut y avoir un stress supplémentaire lié aux des différentes interventions (traite ou contention pour observation clinique).

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet, étant donné qu’ils seront soumis à une infection expérimentale.

Remplacement

Travail in vitro : depuis plus de 20 ans, des études ont été réalisées in vitro pour mieux comprendre les mécanismes de défense de la mammelle des ruminants. Au vu de la complexité des mécanismes de la réponse immunitaire, pas reproductibles en laboratoire, la mise au point du modèle doit être réalisée chez l’espèce cible(la brebis, dans ce cas particulier). Concenant la pertinance des modèles murins comme modèle, des différences majeures entre les cycles de lactation chez les rongeurs et chez les ruminants sont amplement décrites dans la littérature. Ces différences limitent l’utilisation de la souris pour aborder des questions précises, comme la réponse innée de la mamelle contre les infections. Outre les principales différences entre la souris et la brebis, il est pertinant de souligner que chez la souris, au retrait des souriceaux, la glande mammaire entre en tarissement/involution. Ainsi, la souris doit continuer d’allaiter afin de maintenir ses glandes mammaires en lactation. Lors des infections expérimentales, la présence de souriceaux genererait leur infection par l’ingestion du lait contaminé et rendrait l’étude inviable.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, un criblage in vitro de souches sera réalisé afin de tester leurs capacités à se répliquer de manière productive dans des cellules épithéliales mammaires primaires ovines. Les résultats de ces travaux permettront ainsi de réduire le choix à 1 ou 2 souches qui seront utilisées dans les infections in vivo. Le projet visant à mettre en place un modèle d'infection in vivo chez l'ovin, nous estimons qu’il faut à minima 3 animaux par lot pour tester soit 2 souches virales, soit 2 voies d’inoculation, donc 6 animaux au total. Etant dans une démarche de preuve de concept, nous prévoyons de pouvoir reconduire l’infection au bout de quelques jours si nous ne constatons pas de signes d’infection lors de la première série d’inoculations. Ce projet constitue une étude pilote visant à évaluer pour la première fois la faisabilité du modèle expérimental proposé. Compte tenu de la taille limitée des effectifs, aucune analyse statistique n’est envisagée. Des analyses comparatives des paramètres avant et après infection seront effectuées pour chaque animal et les données individuelles seront présentées sous forme de graphiques de dispersion, afin de visualiser la variabilité interindividuelle et d’évaluer la cohérence des réponses observées. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer la mise en œuvre pratique du modèle, sa tolérance par les animaux et la pertinence des procédures expérimentales, afin d’ajuster si nécessaire le protocole avant toute étude ultérieure de plus grande ampleur

Raffinement

A partir de la période d'acclimatation, les brebis seront équipées d’un dispositif télémétrique afin de suivre la température corporelle, dispositif couramment utilisée dans nos installations. Une petite chirurgie sera necessaire pour l’implantation du capteur sur la brebis. Les données de température seront transmises à une base positionnée à proximité des animaux. Cette base est équipée d’un écran pour permettre de relever les températures enregistrées. Elle pourra également être connectée ultérieurement à un système informatique pour récupérer l’ensemble des données de températures acquises tout au long du projet. Ces données permettront de visualiser très précisement les changements de température liés à l’infection. La technologie de thermographie infrarouge (caméra thermique) sera testée pour assurer le suivi de l’inflammation et de la température au niveau de la glande mammaire. Cette approche serait une alternative moins invasive et moins contraignante pour les animaux. En effet, lors d’une mammite, une augmentation de la température au niveau local est attendue et pour l’analyser, nous devons utiliser des approches complémentaires comme la thermographie infrarouge. Cette analyse nous permettra ainsi d’évaluer la faisabilité de cette approche dans le cadre d’une inflammation contrôlée et les données générées pourrons nous aider à raffiner nos futurs modèles de mammite. Il est prévu également d’effectuer un travail de conditionnement et de renforcement positif pour les interventions prévues lors de la traite. Les animaux étant déjà présents dans notre élevage, ce travail sera mis en place et initiée sur ces animaux pour les préparer notamment aux interventions lors de la traite. Plusieurs agents de l’unité se sont formés à cette méthode. Enrichissement social : Les animaux seront hébergés en groupes. Une visite régulière des animaliers sera assurée. Une récompense alimentaire sera fournie aux animaux après les interventions.

Choix des espèces

Des enquêtes sérologiques démontrant la présence d'anticorps chez les caprins, les ovins et les bovins suggèrent que les espèces ruminantes sont des hôtes sensibles et peuvent agir comme des réservoirs facilitant l'émergence de nouveaux virus grippaux présentant un potentiel zoonotique (voire pandémique) accru. La mise en place d’un modèle infectieux sur petits ruminants est le plus pertinent et plus adapté à notre capacité actuelle de travail et d’hébergement en confinement biologique. Pour ce projet, nous avons decidé de travailler sur l’espèce ovine en tant que modèle plus abordable que l’espèce bovine pour sa facilité d’hébergement sous confinement biologique et d’approvisionnement. Cela nous permettra également d’effectuer un travail d’acclimatation et de conditionnement renforcé des animaux avant le démarrage de la procédure expérimentale. Le projet portant sur la mise en place d’un modèle d'infection in vivo chez la brebis afin d'étudier les mécanismes de défense antivirale dans la glande mammaire, les animaux utilisés seront des brebis en lactation. Les brebis seront soumises à une traite biquotidienne pour être maintenues en lactation.

Tuées à l'issue des tests pour que leurs organes soient analysés, 960 souris atteintes d'un modèle du syndrome de Wolfram vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant quinze jours consécutifs, puis passent un test de vision de trente minutes sur animal vigile et deux explorations fonctionnelles sous anesthésie, dont un test d'audition d'une heure. Ces souris perdent la vue et l'audition et développent un trouble vestibulaire qui les rend hyperactives, au point que le porteur remplace les abris en matériau dur par du carton pour qu'elles ne se blessent pas. Il conclut que tous ses tests d'exploration fonctionnelle sont indolores.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par des diabètes ,une surdité , une cécité, et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de cette maladie n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur les pertes visuelles et auditives de ce modèle murin de la maladie. MODIFICATION: ce projet prévoyait, initialement, le test de cing composés chimiques. Un nouveau composé a été identifié et semble plus prometteur que les précédents, faisant passer le nombre de composés à tester à six.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur un modèle murin de la maladie.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - tests fonctionnels d'évaluation de la vision et de l'audition sous anesthésie et sur animal vigile. Chaque animal sera identifié une fois. Les injections quotidiennes en intrapéritonéales seront effectués pendant 15 jours consécutifs. Un test de vision sur animal vigile sera effectué à un mois (test de 30min). Les animaux seront anesthésiés 2 fois, à 3 jours d'intervalle pour les tests d'exploration fonctionnelle (test de surdité, test d'une heure et test de vision, test de 30min).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Les souris vont développer en plus de la cécité et de la perte d'audition, un trouble vestibulaire qui entraine une hyper activité et qui peut générer un inconfort des souris Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi a été mise en place afin de garantir le bien être animal. Les animaux présentant au moins un des points limites seront systématiquement euthanasiés. Les injections en intrapéritonéal n'entrainent généralement pas de complication. Si l'animal présentait une perte de poids importante, ou un mauvais état du pelage, les injections seraient interrompues. Tous nos tests d'explorations fonctionnelles sont indolores.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèle murin du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle est le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies rapidement permettant l'élaboration d'un traitement curatif. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Notre expérience de plus de 20 années de mesures fonctionnelles chez la souris (vision et audition), nous montre que des lots de 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour assurer des tests statistiques fiables. Les mêmes lots d'animaux seront utilisés pour des tests de vision et d'audition afin de réduire le nombre total d'animaux, sans impacter sur leur bien être. Enfin les analyses biochimiques et histologiques seront réalisées sur les mêmes animaux.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles (vision, audition) et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. L'injection de molécule à tester sera réalisée tous les jours, pendant 2 semaines consécutives. Des tests d'audition et de vision seront réalisés à un mois, age auquel les souris perdent la vision et l'audition, afin d'évaluer l'efficacité de ces molécules sur les pertes neurosensorielles du modèle souris du syndrome de Wolfram.