Recherche appliquée

Pour tester des dispositifs censés éviter l'accumulation de liquide après une ablation du sein, 450 rats subissent une mastectomie chirurgicale de 60 à 90 minutes, puis l'implantation du dispositif pendant plusieurs semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous les rats sont tués, l'analyse histologique des tissus étant présentée comme la méthode de référence. Échographies répétées sous anesthésie courte, pansements, hébergement individuel jusqu'à quatorze jours, hématomes, œdèmes et douleurs post-opératoires figurent parmi les effets attendus. Le nombre d'études dépend, écrit le porteur, des demandes formulées par les fabricants de dispositifs médicaux, à raison d'environ une étude par an sur cinq ans.

Objectifs

Le sérome, complication fréquente après une chirurgie mammaire (jusqu’à 85 % après mastectomie), résulte de la formation d’un espace vide sous-cutané favorisant l’accumulation de liquide. Cela entraîne inconfort, soins prolongés et risques infectieux pour les patients. Ce projet vise à évaluer la tolérance (sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) de dispositifs médicaux visant à réduire cet espace et parsuite réduire l'accumulation de liquide. Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à garantir, avant la mise sur le marché, que l’utilisation du produit de santé n’altère ni l’état clinique ni la sécurité des patients, conformément aux exigences des autorités réglementaires. Cette démarche s’inscrit dans une volonté de garantir un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité, pour les patients. Les résultats obtenus à l’issue des études seront intégrés aux dossiers de soumission auprès des autorités de santé compétentes, en vue de la mise sur le marché ou du maintien de l’autorisation du produit à court terme. Le nombre d’études et de dispositifs testés dans le cadre de ce projet dépend directement des demandes formulées par les fabricants de dispositifs médicaux. Toutefois, il est raisonnablement anticipé la réalisation d’environ une étude par an, ce qui correspondrait au développement et à l’évaluation de cinq nouveaux dispositifs sur une période de cinq ans.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale consistant à une mastectomie (retrait de la glande mammaire) visant à reproduire un modèle de formation de sérome post-chirurgical (présence de liquide dans l’espace laissé vide après retrait de la glande mammaire) visant à reproduire un modèle de formation de séromes post-chirurgical (présence de liquide dans l’espace laissé vide après retrait de la glande mammaire). Un dispositif visant à réduire cette formation de liquide est implanté dans l’espace créé et est laissé chez l’animal pendant plusieurs semaines. La durée de la chirurgie est estimée entre 60-90 minutes selon la complexité du modèle. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale (inhalée ou injectable) et accompagnées d’une analgésie pré- et post-opératoire adaptée. Des examens d’imagerie non invasifs (échographie) pourront être réalisés pour évaluer la présence et le volume du sérome, avec une anesthésie courte ( 4 semaines), étant donné qu’il s’agit d’un examen court et non invasif, cet examen pourra être renouvelé chaque semaine selon les besoins, à condition que l’animal soit en bon état général.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont les suivants : - Stress lors des manipulations pour l’anesthésie et pouvant aller jusqu’à 14 jours si présence d’un pansement et mise en place d’un hébergement individuel - Douleur suite à la chirurgie. – Gêne modérée : En cas de mise en place de pansements ou de dispositifs de protection post-opératoires, pouvant limiter temporairement la mobilité ou provoquer une gêne locale - Perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie, de la chirurgie et/ou du dispositif implanté, à court terme - Hématome, œdème ou sérome non résorbé au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur.

Devenir

Afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet, des observations post-mortem sont indispensables. Pour cela, des prélèvements ciblés des tissus sont réalisés afin de procéder à des analyses histologiques, qui constituent la méthode de référence pour détecter des effets locaux tels que l’inflammation, la fibrose ou la nécrose. D'autres examens spécifiques sur les tissus prélevés, comme une observation macroscopique ainsi que la mesure du volume de sérome peuvent aussi etre réalisées. Compte tenu de la nature des interventions et des objectifs du projet, il n’est pas possible de maintenir les animaux en vie après la phase expérimentale. L’euthanasie est donc pratiquée conformément aux normes éthiques et réglementaires en vigueur.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux reste indispensable dans le cadre de l’évaluation préclinique des dispositifs médicaux, car requis par les exigences réglementaires. À ce jour, aucune méthode alternative validée (In-Vitro ou In-silico) ne permet de reproduire de manière fiable les conditions mécaniques et biologiques nécessaires à l’étude de la performance et de la tolérance locale de dispositifs destinés à un usage humain, en particulier dans le contexte de la prévention ou du traitement du sérome. La formation de sérome est un phénomène complexe impliquant des interactions mécaniques, tissulaires et immunitaires, difficilement reproductible in vitro. Les modèles cellulaires ne permettent pas de simuler la dynamique de l’espace vide sous-cutané, ni les processus de drainage, d’inflammation ou de cicatrisation associés. Donc le mécanisme de formation du sérome, complication fréquente après une chirurgie mammaire, reste difficile à modéliser. Les modèles animaux offrent ainsi une approche essentielle pour étudier ce phénomène dans des conditions réalistes. Parmi les espèces disponibles, le rat représente un modèle pertinent pour ce type d’étude en raison de sa taille adaptée, de sa bonne tolérance aux procédures chirurgicales, et de la disponibilité de données comparables dans la littérature scientifique.

Réduction

La réglementation demande d’avoir à minima 10 produits implantés par condition. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les études, plusieurs stratégies sont mises en œuvre : Mutualisation des groupes contrôle : Un même groupe témoin (utilisant un produit de référence) peut être utilisé pour comparer plusieurs groupes test recevant des produits différents. Études pilotes : Réalisées sur un nombre restreint d’animaux, elles servent à orienter les choix de développement (produit, matériel, technique chirurgicale) avant de passer à des études réglementaires plus étendues. Quand cela est possible ; implantation de plusieurs dispositifs sur le même animal réduisant de moitié le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles afin de respecter leurs besoins comportementaux et de favoriser leur bien-être. Un hébergement individuel est uniquement instauré en cas de nécessité médicale, notamment en présence d’un pansement, et limité à la durée strictement nécessaire à la cicatrisation. Les installations permettent le maintien des contacts visuels, olfactifs et auditifs entre congénères. Des enrichissements adaptés à l’espèce sont fournis de manière systématique. L’environnement est contrôlé afin de limiter le stress (ambiance sonore adaptée, manipulation douce, surveillance régulière). Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie préventive et multimodale, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires, afin de prévenir toute douleur, souffrance ou détresse. La profondeur anesthésique et les paramètres respiratoires font l’objet d’une surveillance continue pendant toute la durée de l’intervention. Des mesures spécifiques sont mises en œuvre pour limiter les risques per- et post-opératoires : maintien de la température corporelle à l’aide d’un dispositif chauffant, protection oculaire, réalisation des actes en conditions aseptiques strictes sur une zone préparée, et administration d’un agent de réversion en fin d’intervention afin de favoriser un réveil rapide et sécurisé. Une analgésie post-opératoire adaptée est systématiquement mise en place et ajustée en fonction de l’évaluation clinique quotidienne des animaux. La durée du traitement est modulée selon l’état général et les signes de douleur observés.Les animaux sont observés au minimum quotidiennement par un personnel qualifié et toutes les observations sont tracées. La fréquence de suivi et la surveillance sont approfondies en cas de signes cliniques. Lors des examens d’imagerie, une anesthésie adaptée est administrée afin de garantir l’immobilité et le confort de l’animal. Une analgésie complémentaire peut être mise en œuvre si la situation clinique le justifie.

Choix des espèces

Le choix du rat comme modèle animal repose sur plusieurs critères scientifiques et réglementaires. Il est largement utilisé en recherche préclinique grâce à sa physiologie bien connue et sa facilité de manipulation, avec une littérature abondante facilitant la comparaison des résultats. Sa taille et son anatomie permettent de reproduire des modèles chirurgicaux pertinents, tels que la mastectomie et la création de poches sous-cutanées, utiles pour étudier la formation de séromes. Le rat permet également des évaluations quantitatives fiables, tant macroscopiques qu’histologiques, essentielles pour l’analyse de la biocompatibilité (sécurité et performance). Enfin, son utilisation est acceptée par les autorités réglementaires et il présente une transposabilité partielle aux conditions humaines, notamment en matière de cicatrisation et de réponse inflammatoire. Ces caractéristiques en font un modèle pour ce projet. Il n’y a pas de spécification dans les textes réglementaire, donc des animaux adultes seront privilégié. Si pour un projet spécifique, des animaux plus jeunes seraient nécessaire, le projet sera revu par la SBEA.

Immunodéprimées par des injections répétées puis infectées par un ver parasite, par voie orale ou sous la peau, 450 gerbilles de Mongolie développent des diarrhées chroniques. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les gerbilles sont tuées, pour empêcher la dissémination du parasite dans l'environnement. L'objet est de récolter des antigènes parasitaires complets, destinés aux industriels qui développent des tests de dépistage de l'anguillulose. Le porteur écrit vouloir limiter le nombre d'animaux et prévoit une procédure pilote suivie d'une procédure de production, sans jamais expliquer d'où sort le chiffre de 450.

Objectifs

La strongyloïdose (également appelée anguillulose) est une infection humaine causée par un ver microscopique vivant dans l’intestin. L’espèce responsable chez l’Homme, Strongyloides stercoralis, toucherait entre 30 et 80 millions de personnes dans le monde. Chez la plupart des personnes, l’infection peut passer inaperçue ou provoquer des troubles digestifs modérés. En revanche, chez les patients dont le système immunitaire est affaibli, cette infection peut devenir très grave, se disséminer dans l’organisme et entraîner un risque de décès élevé en l’absence de traitement. Le diagnostic repose actuellement principalement sur des tests diagnostiques sanguins. Cependant, il n'existe pas à ce jour de test sanguin de confirmation suffisemment sensible et spécifique pour cette infection. Le développement d’un test diagnostique plus fiable nécessite l’obtention d’éléments du parasite dans leur forme complète et naturelle. Or, il n’est pas possible de maintenir durablement ce parasite en culture au laboratoire. La seule solution consiste donc à reproduire son cycle biologique chez l’animal. La gerbille est à ce jour le seul rongeur capable de permettre ce développement complet, comme l’ont montré des publications scientifiques récentes. Dans ce projet, après une diminution contrôlée des défenses immunitaires par un traitement adapté, les gerbilles seront infectées expérimentalement. L’infection entraîne principalement des troubles digestifs chroniques. Ce modèle permettra d’obtenir les éléments parasitaires nécessaires au développement d’un test diagnostique plus performant pour améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous proposons de reproduire sur un modèle animal (gerbille) un cycle biologique d'anguillulose (parasitose digestive) afin de produire des antigènes (Ag) naturels de ce parasite. Cette production d'Ag a été récemment publiée et, est un élément essentiel à la fabrication de tests de diagnostic de cette maladie humaine. Ces antigènes seront destinés aux professionnels de santé (industriels) qui développent des techniques de dépistage de cette parasitose. L’utilisation d’antigènes naturels améliore la sensibilité de ces tests par rapport aux antigènes recombinants. Les bénéfices attendus du projet seraient donc directs et immédiats : permettre la production de tests diagnostiques fiables (plus spécifiques et plus sensibles) de cette maladie et ainsi améliorer le diagnostic, la prise en charge et le traitement de patients humains infectés par ce parasite.

Procédures

Ce modèle expérimental comportera plusieurs étapes. Dans un premier temps, les défenses immunitaires des gerbilles seront temporairement diminuées à l’aide d’un traitement administré par injection. Cette étape est nécessaire pour permettre au parasite de se développer de manière comparable à ce qui peut être observé chez des patients dont le système immunitaire est affaibli. Le traitement sera administré à intervalles réguliers pendant la durée de l’expérience, en tenant compte de l’état de santé et de la tolérance des animaux. Dans un second temps, les gerbilles seront infectées par le parasite, soit par une injection sous la peau, soit par administration par voie orale. L’infection provoquera principalement des troubles digestifs, notamment des diarrhées. Enfin, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive. En cas de signes de déshydratation ou de perte de poids significative liés aux troubles digestifs, une prise en charge adaptée sera mise en place, notamment par l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson afin de limiter le risque de complications.

Impact sur les animaux

Ce projet est conçu pour accorder une attention particulière au bien-être des animaux et à la prise en charge de toute douleur ou inconfort. Plusieurs effets indésirables peuvent survenir au cours de l’étude. Tout d’abord, la diminution temporaire des défenses immunitaires nécessite des injections régulières pendant une période limitée. Ces injections peuvent provoquer un inconfort transitoire. Le développement de l’infection peut entraîner des troubles digestifs, notamment des diarrhées, susceptibles d’être inconfortables ou douloureuses. Ces signes seront surveillés attentivement et soulagés par l’administration d’un traitement antidouleur adapté dans l’eau de boisson. Dans certains cas, une déshydratation ou une perte de poids peuvent apparaître. Ces situations seront détectées précocement grâce à un suivi rapproché. Si nécessaire, le traitement diminuant les défenses immunitaires sera ajusté afin d’améliorer rapidement l’état clinique des animaux. Plus rarement, une aggravation de l’infection peut survenir et entraîner des complications sévères. Les animaux feront alors l’objet d’une surveillance quotidienne renforcée afin d’adapter immédiatement leur prise en charge (ajustement du traitement, traitement complémentaire, ou arrêt de la procédure si l’état de l’animal l’exige). L’ensemble du protocole a été conçu pour limiter autant que possible la fréquence et l’intensité des effets indésirables, et pour garantir une intervention rapide en cas de dégradation de l’état de santé.

Devenir

Une mise à mort sera systématique, elle permettra d’empêcher le risque de dissémination du parasite dans l’environnement.

Remplacement

Pour produire les éléments du parasite nécessaires au développement d’un test diagnostique fiable, le recours à l’animal est indispensable. À ce jour, il n’existe pas d’alternative permettant d’obtenir ces éléments dans leur forme complète et en quantité suffisante. La gerbille est le modèle le plus adapté, car elle est capable de développer une infection chronique comparable à celle observée chez l’être humain, ce qui permet au parasite d’accomplir l’ensemble de son cycle biologique. Les techniques de laboratoire réalisées en dehors de l’animal, comme la culture en milieu artificiel ou les méthodes de biologie moléculaire, ne permettent pas de produire un parasite complet ni d’obtenir les quantités nécessaires. Ces approches restent limitées et ne reproduisent pas l’ensemble des caractéristiques naturelles du parasite. En conséquence, la production d’un antigène complet et exploitable pour le développement d’un test diagnostique ne peut actuellement être réalisée qu’à l’aide d’un modèle animal.

Réduction

Nous sommes contraints à une production importante d’Ag tout en limitant au maximum la gravité et la souffrance de cette infection expérimentale et le nombre d’animaux utilisés. Ce cycle a été publié récemment mais cela a été dans un contexte scientifique différent. Nous allons donc essayer de l’adapter et de l’optimisser pour réduire le nombre d’animaux et réduire aussi les effets indésirables associés. En conséquence, 2 procédures se suivront, la première pilote pour valider la faisabilité de ce projet et pour définir les conditions expérimentales optimales, la seconde, identique en selectionnant les conditions optimales par rapport à la première pour la production d’antigène en quantité pour le developpement de tests diagnostiques.

Raffinement

L’expérience acquise sur ce modèle d’étude (gerbille) nous permet de définir les mesures à mettre en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. Les gerbilles seront hébergées par groupes d’individus compatibles, par fratrie de 2 minimum, dans des conditions contrôlées et avec la mise en place d’un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). L'eau et la nourriture sont mises à disposition ad libitum. Aucun des animaux ou groupe d’animaux ne sera traité différemment de ses congénères. Une fiche de suivi sera rédigée pour chaque cage avec un suivi de signes comportementaux, physiques et physiologiques. Les soins/suivi et la procédure expérimentale seront réalisés par du personnel qualifié et permanent. En effet, les gerbilles ont le temps de se familiariser avec les manipulateurs spécialement affectés à leur suivi. La détermination de point(s) limite(s) bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, permettra immédiatement de reconnaitre un animal en souffrance. Nous attacherons une grande importance à l’apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux. Dès lors que l’animal montre des signes de positivité à l’infection et de douleur (diarrhées symptomatiques), il sera traité par antalgique (paracétamol) et placé en armoire ventilé afin de ne pas stresser ses congénères non malades.

Choix des espèces

La gerbille est la seule espèce de petit rongeur connue à ce jour capable de reproduire l’ensemble du cycle naturel de ce parasite lorsque ses défenses immunitaires sont temporairement diminuées. Ce modèle permet le développement de l’infection principalement sous forme de troubles digestifs, sans autres manifestations cliniques majeures au préalable. La production des éléments parasitaires nécessaires au projet sera donc réalisée chez ces animaux, car aucune autre méthode ne permet actuellement d’obtenir un parasite complet dans des conditions comparables. Les gerbilles utilisées seront de jeunes adultes, mâles ou femelles. À cet âge, elles présentent un comportement stable, sont peu agressives et s’adaptent facilement à la manipulation, ce qui contribue à limiter le stress et à favoriser leur bien-être pendant l’étude.

112 porcs charcutiers vont être utilisés, tous tués à 110 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un transpondeur sous la peau, une à deux injections vaccinales intramusculaires et trois prises de sang de 10 ml, avec fièvre, baisse d'appétit et lésions musculaires possibles au point d'injection. La mise à mort sert à examiner l'encolure pour mesurer les dégâts locaux laissés par les adjuvants testés. Le porteur présente ces essais comme une recherche de meilleure tolérance pour la santé et le bien-être des animaux non-humains, et détaille aussitôt les gains attendus en croissance, en productivité et en homogénéité des lots.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer l’innocuité et l’efficacité de différentes formulations adjuvantes chez le porc charcutier. L’antigène utilisé (APP) présente un profil d’innocuité déjà bien établi. En revanche, l’association de cet antigène avec certains adjuvants peut induire des lésions locales, superficielles et/ou musculaires, susceptibles d’entraîner une réforme de l’animal. Le test de nouveaux adjuvants vise à diminuer ces effets. En termes d’efficacité, il est établi que les quantités d’anticorps spécifiques de l’APP sont directement associés à l’efficacité vaccinale. Le suivi de ces paramètres constitue donc des indicateurs pertinents pour l’évaluation de l’efficacité des nouveaux candidats adjuvants dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

Une meilleure tolérance et efficacité sont sans cesse recherchées pour améliorer la santé et le bien-être animal. L’optimisation des adjuvants vise avant tout à renforcer la réponse immunitaire, en stimulant plus efficacement les défenses naturelles de l’animal et en favorisant une production d’anticorps durable et protectrice. En parallèle, une meilleure immunité contribue à diminuer l’incidence des maladies cliniques et subcliniques, améliorant la croissance, la productivité et l’homogénéité des lots. Enfin, des animaux mieux protégés nécessitent moins de traitements antibiotiques, participant ainsi à la réduction de l’usage des antimicrobiens et à la lutte contre l’antibiorésistance

Procédures

Tous les actes se feront sur animal vigile : Pose de transpondeurs sous-cutanés (1 fois par animal, durée de l'acte moins de 2minutes), Injection d'un vaccin une à deux fois en fonction des groupes à J0 et J28 ( durée de l'acte moins de 2 minute par animal), prélèvements sangins à J0, J27 et J80 : 10ml (Durée de l'acte mois de 5 minutes par animal, contention comprise)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent principalement le stress induit par la manipulation et la contention des animaux, la douleur ainsi que les éventuels hématomes associés aux prélèvements sanguins, et la douleur liée aux injections intramusculaires. Des effets indésirables transitoires (fièvre, baisse de l’appétit) peuvent également survenir à la suite des injections. Par ailleurs, une gêne ou une douleur passagère peuvent être observées lors de l’implantation du transpondeur.

Devenir

Les animaux sont maintenus sous surveillance dans leur zone d'hébergement durant toute la procédure, jusqu'à leur mise à mort à J110. Un examen macroscopique des sites d'injection est alors réalisé au niveau de l'encolure. Le prélèvement de cette zone étant terminal, il ne permet pas le maintien en vie des individus.

Remplacement

Les modèles in vitro et ex vivo permettent aujourd’hui d’obtenir des informations précieuses sur les mécanismes immunologiques de base, mais ils ne peuvent pas reproduire l’ensemble de la complexité de la réponse immunitaire d’un organisme vivant. Les adjuvants agissent à plusieurs niveaux : activation de l’immunité innée, recrutement cellulaire au site d’injection, présentation de l’antigène, induction de la mémoire immunitaire… Ces processus impliquent une interaction dynamique entre cellules, tissus et médiateurs circulants, qu’aucun modèle in vitro ne peut entièrement reproduire. Les réactions locales (inflammation, nécrose, granulome) et systémiques (fièvre, baisse d’appétit, altération du comportement) ne peuvent être observées que chez l’animal entier. Ces effets sont essentiels à mesurer pour garantir le bien-être animal et la sécurité du vaccin avant toute application en élevage.

Réduction

Des études antérieures ont établi qu'un effectif minimal de sept animaux par groupe est nécessaire pour garantir la fiabilité statistique des résultats.

Raffinement

Le raffinement proposé repose sur plusieurs points essentiels destinés à optimiser le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation : 1. Conditions d’hébergement : Les animaux seront hébergés en loges sur caillebotis, équipées de chaînes et de balles servant de jouets d’enrichissement. Ils auront un accès permanent à l’eau (ad libitum) et seront nourris deux fois par jour (matin et soir). Chaque loge comprendra une zone de repos propre, distincte de la zone d’alimentation, afin de favoriser le confort et le comportement naturel des animaux. 2. Interventions et habituation Toutes les interventions seront réalisées dans le calme, avec récompense alimentaire à la clé pour limiter le stress. Une habituation progressive au jus de pomme sera mise en place dès la semaine précédant le début de l’expérimentation, afin de faciliter notamment la troisième prise de sang, identifiée comme la plus sensible. 3. Suivi sanitaire et critères de vigilance Les animaux feront l’objet d’une surveillance biquotidienne. Les paramètres suivants seront systématiquement suivis et consignés dans les données expérimentales : température, réactions au site d’injection et signes allergiques. Pour chaque critère, ainsi que pour le comportement général de l’animal, une grille de référence définit des points limites gradés et les actions de soins associées

Choix des espèces

L'objectif du projet est de tester des adjuvants pour la mise au point de vaccins porcins donc nous testons ces adjuvants sur l'espèce porcine. Les porcs seront utilisés de l'âge de 42 jours (jeune porc en croissance) à 152 jours pour coller à ce qui se fait en élevage. La primo injection du vaccin se fait souvent assez jeune (ici à 42 jours) avec un rappel 28 jours plus tard. Nous conservons les animaux jusqu'à 152 jours pour avoir un suivi de 110 jours après la primo-injection et ainsi vérifier l'innocuité du produit testés.

La production d'un médicament antirejet vendu dans plus de 80 pays repose sur 235 000 lapins, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections immunisantes, subit deux prélèvements sanguins à l'artère de l'oreille en boîte de contention, puis un prélèvement intracardiaque sous anesthésie qui dure une dizaine de minutes et le tue. Le porteur reconnaît que ces ponctions répétées provoquent une anémie de deux à six jours. Il affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer le lapin pour produire ces anticorps et rappelle que l'espèce est celle inscrite au dossier d'autorisation de mise sur le marché, ce qui verrouille le choix autant que la biologie.

Objectifs

Ce projet consiste en la production du principe actif d'un produit biologique à usage thérapeutique dit "life saving". Le médicament est un immunosuppresseur sélectif utilisé principalement pour prévenir ou traiter le rejet de greffe après une transplantation d’organe. Il s'inscrit dans un contexte de santé publique mondiale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet vise à produire le principe actif d’un médicament essentiel, distribué dans plus de 80 pays et reconnu comme un traitement vital pour de nombreux patients. Destiné à un usage hospitalier, ce médicament agit comme un immunosuppresseur sélectif, jouant un rôle clé dans la prévention et le traitement des rejets d’organes greffés, tant avant qu’après l’intervention chirurgicale. Le médicament est considéré comme un médicament « life saving », c’est-à-dire indispensable à la survie des patients greffés. Par ailleurs, ce médicament est également utilisé pour soigner l’aplasie médullaire. Classé parmi les médicaments critiques par l’Union européenne, il fait l’objet d’une obligation de stock minimal de quatre mois afin de garantir la continuité de l’approvisionnement et éviter toute rupture pour les patients.

Procédures

Il s'agit d’injections intra-veineuse et sous-cutanée, de prélèvements sanguins au niveau de l'artère à l'oreille sur des animaux vigiles sur lesquels une contention est assurée pendant toute la durée du prélèvement. Les différentes étapes sont les suivantes : - Étapes d’immunisation : Chaque animal vigile va recevoir une injection d’une suspension immunisante en 2 fois. Une première injection en sous-cutanée pour une durée de 1 minute, puis une deuxième injection 14 jours plus tard en intra-veineuse sur une durée de 1 à 2 minutes. - Phase de prélèvements sanguins : Un premier prélèvement sanguin est réalisé au niveau de l’artère médiane de l’oreille sur animal vigile placé dans une boîte à contention pour une durée moyenne de 5 à 6 minutes. Une fois le prélèvement terminé, de la colle chirurgicale est appliquée au niveau du point de prélèvement pour assurer l’hémostase. Le deuxième prélèvement est à l’identique du premier (au niveau de l’artère médiane de l’oreille sur animal vigile pour une durée moyenne de 5 à 6 minutes avec application de colle chirurgicale pour assurer l’hémostase. - Prélèvement terminal : Après une injection sur animal vigile par voie intra-veineuse d’un produit anesthésique (la contention dure environ 1 minute pour effectuer cette opération), l’animal alors sous anesthésie générale est prélevé par voie intracardiaque jusqu’à la mort de l’animal. Cette étape de prélèvement terminal dure environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole de production prévoit plusieurs étapes successives chez les animaux ; à savoir, 2 étapes d’immunisation, 2 étapes de prélèvements sanguins et 1 dernière étape de prélèvement intracardiaque : 1 - Étapes d’immunisation : Les animaux vont recevoir deux injections pour stimuler le système immunitaire. Une première injection en sous-cutanée d’une suspension cellulaire, puis une deuxième administrée 14 jours plus tard en intra-veineuse. Ces injections se font dans un délai court et peuvent provoquer une légère douleur au point d’injection (liée à la pénétration de l’aiguille et à la pression exercée lors de l’injection). La douleur est généralement immédiate et de courte durée. Elle est minimisée par l’utilisation d’aiguilles adaptées à la taille de l’animal et par la réalisation des injections par du personnel formé. 2 - Phase de prélèvements sanguins : deux ponctions sanguines sont réalisées au niveau de l’artère médiane de l’oreille. La ponction entraîne une douleur légère et brève, liée à la piqûre de l’aiguille. Les animaux peuvent manifester des signes de stress lors de la contention et de la ponction. Ces réactions sont généralement limitées et ne persistent pas après la fin de la procédure. Un petit hématome peut survenir au point de ponction, mais il est généralement minime et se résorbe spontanément en quelques heures. 3 - Prélèvement terminal : Il est effectué par voie intracardiaque sous anesthésie générale. L’induction du produit anesthésique par voie intraveineuse peut provoquer une douleur légère et brève. Ces prélèvements sanguins peuvent induire une anémie (avec une durée comprise entre 2 et 6 jours). Une étude menée en interne en 2023, basée sur la mesure et le suivi du taux d’hématocrite, a permis de démontrer que cette anémie reste légère à modérée.

Devenir

À l’issue de la procédure, l'ensemble des animaux seront mis à mort lors de la prise de sang terminale par voie intracardiaque sous anesthésie générale.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de remplacer le lapin pour la production d’anticorps polyclonaux destinés à la fabrication du principe actif du médicament en raison de la complexité et de la diversité épitopique requise. En effet, la diversité et la quantité d’anticorps générés par cet animal offrent une compatibilité optimale avec un large panel de patients greffés, et ce à l’échelle mondiale. Cette complexité immunologique ne peut être reproduite par les méthodes de production in vitro actuelles. Le médicament cible plus de 80 épitopes distincts des cellules immunitaires, induisant ainsi chez le patient une immunosuppression à la fois puissante et prolongée, essentielle pour prévenir les rejets de greffe.

Réduction

La procédure expérimentale mise en œuvre a été définie dans un objectif d’optimisation du rendement en sérum par animal utilisé, tout en assurant l’obtention d’un sérum présentant la concentration requise en anticorps polyclonaux. La réalisation de prélèvements sanguins répétés, effectués dans le respect des exigences réglementaires et sous contrôle du bien-être animal, permet d’accroître la quantité moyenne de sérum collectée par animal. Cette stratégie contribue ainsi à la production d’une quantité accrue de médicament à partir d’un nombre équivalent d’animaux utilisés. Enfin, le protocole prévoit l’utilisation de lapins mâles et femelles (lapins issus de l’élevage et lapins reproducteurs réformés), permettant l’inclusion de l’ensemble des animaux élevés au sein de l’établissement et participant à l’optimisation de l’utilisation des animaux conformément aux principes réglementaires en vigueur.

Raffinement

Les lapins sont hébergés dans des cages conformes aux exigences réglementaires, avec une densité adaptée et une stabilité des groupes sociaux. Un enrichissement environnemental adapté est en place : notamment avec des galets à ronger en cellulose, une stimulation sensorielle contrôlée (radio) ainsi que des plateformes de repos. Dans la mesure du possible, un maintien des groupes constitués précocement est assuré afin de limiter l’agressivité interindividuelle. Un suivi quotidien des animaux est assuré par du personnel qualifié, formé et régulièrement habilité. Des fiches de suivi individualisées permettent de consigner les soins apportés et de documenter l’évolution de l’état de santé de chaque animal. Un suivi renforcé est mis en place durant les phases de prélèvements prévues par le protocole expérimental. L’évaluation de la souffrance animale est réalisée quotidiennement à l’aide d’un poster mis à disposition en zone d’expérimentation. Toute manifestation de souffrance dépassant ces seuils entraîne l’arrêt immédiat de l’expérimentation pour l’animal concerné. Lors de la réalisation du prélèvement intracardiaque, une anesthésie générale est effectuée avec une solution de xylazine et de kétamine adaptée au poids. Enfin, lors des prélèvements sanguins au niveau de l’artère auriculaire, une application de colle chirurgicale est réalisée.

Choix des espèces

D'autres espèces animales pourraient être utilisées (exemples : cheval, chèvre...) mais le lapin est l'animal le plus approprié parce qu'il réunit à la fois faciliter d'élevage, facilité de maintien du statut sanitaire EOPS et facilité de prélèvement et d'atteinte du volume de sérum nécessaire. De plus, le lapin est l'espèce enregistrée par les Autorités de Santé Publique Internationales dans le dossier d'Autorisation de Mise sur le Marché du médicament à fabriquer. On utilise exclusivement des animaux en bon état physique et bonne santé apparente pesant au minimum 2,8 kg et âgés de 14 semaines minimum au moment de la première immunisation. Il s'agit d'un âge optimal pour avoir un lapin suffisamment mâture immunologiquement et suffisamment gros pour supporter les prélèvements de sang.

Injectées ou gavées chaque jour pendant dix semaines, 190 souris porteuses de la mutation de la progéria sur un seul chromosome subissent ensuite des prélèvements sanguins sous anesthésie, des mesures de composition corporelle, des tests d'agrippement et des échocardiographies, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur change de modèle par rapport à ses études précédentes et présente ce choix comme un rapprochement des conditions humaines, tout en indiquant qu'il rendra la constitution des groupes plus simple et rapide. Les souris perdent du poids et de la force musculaire à partir de 32 semaines, pour une survie moyenne d'environ 47 semaines. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, celles utilisées pour les croisements étant tuées au plus tard à six mois.

Objectifs

Ce projet fait suite à des études qui visaient à évaluer l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS), maladie génétique extrêmement rare qui se déclare dès l’enfance et conduit à un vieillissement prématuré et une mortalité précoce. Nos études ont été réalisées sur un modèle souris portant la mutation responsable de la pathologie sur les 2 chromosomes, récapitulant le tableau moléculaire et clinique de la pathologie humaine, avec notamment un tableau clinique post-natal évoluant en quelques semaines (premiers signes cliniques à 9 semaines d'âge), permettant de tester rapidement l’efficacité d’une molécule sur plusieurs paramètres. Grâce à ce modèle, nous avons pu obtenir des données pré-cliniques dans plusieurs organes d’intérêt et définir les doses minimales permettant d'obtenir un effet thérapeutique. Cela n’aurait pas été possible avec le modèle ne portant la mutation que sur un seul chromosome, qui ne présente les premiers signes cliniques qu'à l'âge de 41-43 semaines. Cependant, la mutation n'est présente que sur un seul chromosome en clinique humaine. Il nous semble donc pertinent d’utiliser le modèle souris avec la mutation sur un seul chromosome pour nous rapprocher davantage des conditions humaines. L’utilisation de ces souris présente plusieurs avantages : 1) La constitution des groupes de souris sera plus simple et rapide; 2) Le tableau clinique est moins sévère en début de vie, réduisant les impacts sur les animaux; 3) Les quantités de protéines toxiques étant moins importantes, il sera possible de comparer plus facilement différentes voies d'administration, tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires, les doses et fréquences de traitement ayant été ajustées en fonction des études préliminaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra : - d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine, dans un modèle de souris portant la mutation sur un seul chromosome; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule thérapeutique et de comparer les résultats obtenus avec ceux obtenus dans le modèle étudié précédemment, portant la mutation sur les 2 chromosomes. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir une preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.

Procédures

Injections ou gavage oral (1X/jour ou 1X/semaine, sur une durée maximale de 10 semaines; durée de chaque administration: environ 1min). Prélèvements sanguins (sous anesthésie, durée 3-5 min par prélèvement). Mesure de la composition corporelle, méthode non-invasive (3 fois; durée 3 min). Test d'agrippement, méthode non-invasive (3 fois; durée 5 min). Analyse cardiaque par échocardiographie en combinant l'ECG (3 fois, sous anesthésie; durée 15 minutes)

Impact sur les animaux

Le modèle animal utilisé présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris portant la mutation sur un seul chromosome présentent un léger décrochage dans les courbes de poids à partir de 32 semaines, puis une perte de poids plus importante à partir de 41-43 semaines, accompagnée d'une baisse de la force musculaire et d'une diminution de la fréquence cardiaque. La moyenne de survie de ces souris est de 47 semaines environ d'après la littérature. Après raffinement, notamment l'ajout de nourriture en gel, la perte de poids devrait être limitée, sachant que les procédures seront réalisées avec des animaux de moins de 43 semaines, donc avant apparition des signes cliniques sévères (à 45 semaines). Les animaux subiront des injections, induisant une douleur légère de courte durée; ou des gavages, de douleur légère de courte durée liée à la contention et pouvant potentiellement entrainer des irritations; des pesées, sans douleur hormis la préhension pour sortir l'animal de la cage (test non invasif); des prélèvements sanguins, de douleur légère, pouvant potentiellement entrainer une baisse du volume sanguin; des mesures de la composition corporelle, de douleur très légère liée à la contention (test non invasif); des tests d'agrippement, de douleur très légère liée à l'agrippement en soi sur une grille (test non invasif); et des analyses cardiaques par echocardiographie ou ECG, de douleur légère liée à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux expérimentaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses protéiques. Les animaux utilisés pour réaliser les croisements seront gardés en vie, puis euthanasiés à l'age de 6 mois maximum.

Remplacement

Notre projet s’inscrit dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients HGPS. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes métaboliques qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Il nous est nécessaire de disposer d'un organisme entier pour pouvoir mieux comprendre la pathologie de la progéria. Le seul mammifère modèle de la maladie qui nous permet de réaliser des essais pré-cliniques en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme est la souris. Il existe aussi un modèle de porc, cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’évaluation de différentes voies d'administration comporte 8 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement. La deuxième cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, paramètres cardiaques), qui seront analysées à l'aide de tests statistiques adéquats (mesures simples ou répétées). Pour l’ensemble des cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, l’apparence physique. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray cutané seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés chaque semaine et observés quotidiennement. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gel, facile à ingérer par les souris afin d’éviter toute malnutrition. Lors des prélèvements sanguins, une compensation du volume prélevé sera effectuée avec du sérum physiologique.

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de la pathologie HGPS, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Nous utiliserons des males portant la mutation sur un chromosome, agés de 8 semaines a minima pour générer les cohortes expérimentales. Les animaux seront traités de l’âge de 5 à 9 semaines, dans les études de pharmacocinétique et d'évaluation de l'effet du traitement sur la quantité de progérine. Nous utiliserons des animaux de 32-43 semaines pour évaluer l'effet du traitement sur les symptomes cliniques qui commencent à apparaitre à 41-43 semaines environ, hormis un léger décrochage dans la courbe de poids qui peut être noté à partir de 32 semaines.

Souris porteuses de maladies génétiques par construction et souriceaux nouveau-nés composent les groupes de ce projet, la souche étant choisie selon le modèle pathologique visé. 3 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les injections peuvent être répétées chaque semaine pendant 24 semaines, les chirurgies durent de 30 minutes à une heure, et les prélèvements sanguins peuvent atteindre deux par jour sur 48 heures. Le porteur signale que manipuler les nouveau-nés peut entraîner leur rejet par la mère et que les injections provoquent œdèmes et réactions inflammatoires locales, avant la mise à mort qui permet d'analyser muscles, cœur, cerveau, foie, rein et moelle épinière.

Objectifs

Notre équipe développe des molécules innovantes pour la thérapie génique et la modulation de l’expression des gènes. Nos efforts se concentrent sur des maladies génétiques, notamment neuromusculaires, neurodégénératives et des épilepsies infantiles. Ces maladies sont particulièrement difficiles à traiter, car elles exigent que le médicament atteigne l'ensemble du corps ou atteignent le cerveau et la moelle épinière. Notre objectif est d’identifier les médicaments les plus efficaces et adaptés à chaque type d’organe, afin que ces thérapies puissent, un jour, être utilisées chez les patients.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement des maladies génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules atteignant au maximum les organes ciblés avec le moins d’effets secondaires.

Procédures

Chaque animal est soumis à un seul type d'injections avec une seule et même molécule afin d’évaluer le meilleur transport dans les organes ciblés. Les injections se feront en moins de 1 minute et pourront être répétées chaque semaine pendant 24 semaines maximum. Les chirurgies dureront entre 30 minutes et 1 heure. Les injections chroniques prennent 5 minutes et pourront être répétées toutes les 2 semaines, sur une période maximale de 24 semaines. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins (durée du prélèvement : 1 minute, 2 fois par jour maximum, sur 48h maximum).

Impact sur les animaux

La manipulation des nouveau-nés peut entrainer leur rejet par la mère. Les injections sous la peau induisent un stress et une douleur légère de courte durée aux animaux, quel que soit leur âge, et peuvent entraîner certains effets indésirables, tels que la formation d’œdèmes et des réactions inflammatoires locales. Chez les jeunes souriceaux, selon leur localisation, les injections peuvent induire une douleur modérée sur de courte période. La chirurgie peut entrainer une douleur post opératoire modérée et de courte durée.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’analyser les différents tissus (muscles squelettiques, cœur, cerveau, foie, rein, cerveau, moelle épinière ...).

Remplacement

La recherche en bioinformatique de molécules et les analyses réalisées sur des cellules de malades permettent d’effectuer une première sélection. Cependant, aucun modèle cellulaire ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est donc indispensable de mener ces études dans un modèle animal, la souris, qui permet d’évaluer des paramètres essentiels tels que la distribution du traitement dans les tissus ciblés et sa durée de vie.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, notre objectif principal est de déterminer la distribution des molécules, c’est-à-dire de mesurer leur répartition dans différents tissus. Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats représentatifs et fiables. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

La fréquence des injections pourra être réduite si les résultats initiaux indiquent une accumulation suffisante et une demi-vie prolongée de la molécule. De la nourriture en gelée sera mise à disposition dans les cages des individus jeunes, fragiles ou ayant subi une procédure, afin de faciliter leur prise alimentaire. De plus, toutes les interventions douloureuses seront précédées de l'administration d’un antidouleur et se feront sous anéesthésie. Un suivi, accompagné d’une grille d’évaluation, sera assuré tout au long de la procédure et des mesures seront prises afin d'éviter toute souffrance inutile (utilisation de points limites ou critère d’arrêt précoce). Chez les souriceaux, le temps passé hors du nid sera strictement limitée. Des précautions spécifiques seront mises en œuvre pour éviter un rejet maternel.

Choix des espèces

Nous travaillerons sur des souris, car elles présentent une grande similitude génétique avec l’humain (environ 95 % de conservation des gènes). De plus, il existe des modèles pathologiques des maladies que nous ciblons avec nos molécules. Ces modèles permettront ensuite de tester l’efficacité des molécules thérapeutiques. La souche employée sera choisie en fonction du modèle pathologique spécifique, parmi les différentes souches existantes. Nous utiliserons à la fois des souris adultes et des nouveau-nés, afin de tester nos molécules à des stades de développement correspondant à la période précédant ou accompagnant l’apparition des symptômes des maladies sur lesquelles nous travaillons.

Déplacées à pied entre quatre établissements utilisateurs, dans une cage fermée glissée dans un double emballage opaque, les souris de ce volet passent d'un site à l'autre selon l'étape du protocole. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester la modulation d'un gène de cellules non neuronales dans deux modèles d'ataxie cérébelleuse. Prélèvement de tissu à l'oreille dans les deux premiers établissements, chirurgie d'une heure et injection d'un vecteur dans le cervelet dans le troisième, tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, puis injection d'un fixateur dans le quatrième pour une partie des animaux. 52 femelles rejoignent un projet d'élevage pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres sont tuées pour prélèvement de tissus.

Objectifs

Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.

Bénéfices attendus

Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).

Impact sur les animaux

Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.

Réduction

Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.

Raffinement

Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.

Une biopsie de la queue, quatre prélèvements sanguins et jusqu'à sept injections par animal, puis un diabète déclenché par une molécule synthétique : 3 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les manipulations commencent dès l'âge de dix jours, et les animaux qui présentent déjà des signes de la maladie sont mis à mort. L'objectif déclaré est une thérapie cellulaire, des cellules injectées venant compenser un défaut immunitaire. La maladie n'est nommée nulle part dans la description, réduite à "la maladie métabolique d'intérêt", pas davantage que les cellules thérapeutiques ou la molécule qui déclenche l'hyperglycémie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une thérapie cellulaire contre contre le diabète, une maladie métabolique pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitement permettant une guérison des patients. Le développement d’une thérapie pour cette maladie est important car elle est de plus en plus fréquente, en particulier chez les enfants, et affecte très négativement la qualité de vie des individus atteints. Il a été montré que certaines cellules fonctionnaient de manière anormale dans cette maladie. Il est donc possible que l’injection de cellules compensant pour ces défauts puissent guérir cette maladie. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris développant cette maladie pour mieux caractériser les mécanismes impliqués dans cette maladie, et pour développer une thérapie cellulaire. Les résultats obtenus doivent permettent de développer une thérapie cellulaire pour cette maladie chez l’humain.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est le développement d'une thérapie cellulaire pour la maladie métabolique d'intérêt.

Procédures

Identification d'un animal : 1 fois ~10 secondes et 1 fois ~5 secondes. Prélèvement sanguin : 4 fois ~15 secondes. Anesthésie (lors de la mise à mort): 1 fois ~15 minutes. Injections de deux types: répétées (7 fois) ~10 secondes/injection ou 1 fois ~45 secondes. Ces interventions se font sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Injection intra-péritonéale = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection intra-veineuse = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement sanguin = douleur légère, de courte durée et localisée. Biopsie caudale = douleur modérée, de courte durée et localisée. Identification = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle : développement du diabète immuno-dépendant: hyperglycémie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecte des tissus d'intérêt.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie du de la maladie métabolique d'intérêt, seuls les modèles souris sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre les cellules circulant dans le sang et l'organe métabolique cible. Une veille bibliographique sera mise en place pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Les molécules qui seront utilisées pour produire les cellules thérapeutiques ont été soumises à de nombreux tests pour sélectionner les plus prometteuses. Le protocole de production de ces cellules thérapeutiques a été optimisé.

Réduction

Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Des approches sophistiquées d’analyse ont été établies pour réduire le nombre d’animaux à utiliser pour obtenir un maximum d’information. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Le protocole d'induction de la maladie métabolique été raffiné et permet de ne pas utiliser d'immunisation mais seulement une injection de molécule synthétique afin de réduire la souffrance des souris. Dans ce projet, ce protocole sera raffiné davantage pour minimiser la dose de molécule synthétique à injecter. L’induction simultanée de la maladie chez les animaux permet un suivi plus précis des animaux en cours de procédure et permet une détection précoce pour éviter toute souffrance. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs.

Choix des espèces

La souris est le plus petit mammifère permettant d’étudier le développement de la maladie métabolique d’intérêt. C’est également l’espèce dont la connaissance génétique approfondie permet les modifications nécessaires à la création d’un modèle présentant des caractéristiques biologiques proches de celles de l’humain. Ce modèle expérimental permet de tester une approche thérapeutique pouvant être rapidement appliquée chez l’Homme. Par ailleurs, la large gamme d’outils disponibles pour analyser précisément les réponses observées fait de la souris l’espèce la plus appropriée pour ces recherches. Les animaux sont utilisés à partir de l’âge de dix jours pour réaliser les gestes d’identification ainsi que les prélèvements nécessaires à certaines analyses. À partir de quatre semaines, un prélèvement sanguin est effectué afin de confirmer les caractéristiques génétiques des individus. Cet âge est choisi pour garantir que les animaux aient une taille suffisante et que ces manipulations puissent être réalisées sans compromettre leur bien-être. Entre sept et quatorze semaines, les souris peuvent recevoir un traitement destiné à induire la maladie étudiée, période correspondant à une phase de maturité adaptée à l’analyse des mécanismes impliqués. Les animaux présentant déjà des signes de la maladie seront mis à mort.

Irradiation du corps entier pour 192 d'entre elles, injection intraveineuse dans la queue sur animal vigile pour 864, injections intrapéritonéales répétées sur plusieurs semaines pour 432 : 4 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par une bactérie ou un virus, puis exposées à un second événement infectieux ou cancéreux pour observer ce que devient leur immunité pulmonaire. Le porteur écrit que "les procédures n'entrainent pas de douleur résiduelle", tout en prévoyant une ou plusieurs injections de morphinique selon les scores relevés dans la grille de surveillance. Le dépôt d'un brevet figure parmi les finalités annoncées.

Objectifs

Notre laboratoire a montré que suite une infection bactérienne pulmonaire, une cicatrice immunitaire se mettait en place, avec l’apparition d’une population de globules blancs associés au tissu. Nous avons montré que ces cellules jouaient un rôle majeur dans la défense anti-cancéreuse pulmonaire. Les objectifs du projet sont 1) de comprendre les mécanismes qui permettent à ces cellules de rester dans le poumon après une infection bactérienne ou virale et 2) de comprendre leur rôle dans la réponse immunitaire à un 2ème évènement inflammatoire (infectieux ou cancéreux).

Bénéfices attendus

Notre projet nous permettra d’améliorer nos connaissances de l’immunité pulmonaire. Ce projet nous aidera à comprendre les modifications induites par la cicatrice immunitaire pulmonaire créée lors de la 1ère infection sur les fonctions des globules blancs et les conséquences de ces modifications au cours d’une 2ème infection ou dans un modèle de cancer pulmonaire. Ceci nous permettra en finalité la valorisation (brevet) et la mise en place de traitements adaptés pour lutter contre le cancer et les infections bactériennes et virales.

Procédures

Tous les animaux de ce projet sont soumis à une injection sous anesthésie générale. 192 des animaux sont soumis à une administration unique par voie intraveineuse sous anesthésie générale. 192 animaux sont soumis à une irradiation sur corps entier. La moitié des animaux sont soumis à une ou plusieurs injections intrapéritonéales sous anesthésie générale. 864 animaux sont soumis à une injection intra-veineuse par voie caudale sur souris vigile. 432 animaux sont soumis à plusieurs injections intrapéritonéales sous anesthésie générale sur plusieurs semaines. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques peuvent être réalisées.

Impact sur les animaux

Les modèles d’infections respiratoires aigües induisent des effets indésirables transitoires 2-3 jours après l’infection bactérienne ou 8-9 jours après l’infection virale. L’administration par la trachée ou par voie intra-veineuse peut entraîner une légère gêne aux animaux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Les multiples interactions entre les cellules nous obligent à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.

Réduction

LLe nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le nombre indiqué est un nombre maximum de souris et toutes ne seront pas forcément utilisées. Une partie des analyses sera conditionnée aux résultats obtenus sur l’étape d’avant.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d'un antalgique afin d’anesthésier localement la trachée.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche.