Recherche appliquée

Transportées à pied d'un bâtiment à l'autre dans une cage placée en double emballage opaque, 360 souris circulent entre les quatre établissements utilisateurs de ce projet sur l'ataxie cérébelleuse. Elles subissent un prélèvement d'oreille, une chirurgie d'une heure sous anesthésie, des tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, puis pour une partie d'entre elles une dernière chirurgie d'injection de fixateur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 52 femelles passent par un projet d'élevage pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres sont tuées pour prélèvement de tissus. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'un axe d'études comportementales rend impossible de se passer du modèle animal, et que les réseaux neuronaux visés ne se reproduisent pas en culture cellulaire.

Objectifs

Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.

Bénéfices attendus

Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).

Impact sur les animaux

Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.

Réduction

Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.

Raffinement

Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.

Biopsie de l'oreille, chirurgie d'une heure sous anesthésie, puis pour une partie des animaux une seconde chirurgie avec injection d'un fixateur pour prélever les organes : 360 souris passent par ces étapes réparties sur quatre établissements utilisateurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 308 sont tuées à l'issue, 52 femelles étant d'abord réutilisées pour la reproduction dans un projet d'élevage avant d'être tuées elles aussi. Le projet porte sur deux modèles d'ataxie cérébelleuse, dont l'un perd du poids dès vingt semaines d'âge. Les tests comportementaux, répétés jusqu'à cinq fois, sont qualifiés de non invasifs et indolores sans qu'aucun ne soit nommé.

Objectifs

Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.

Bénéfices attendus

Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).

Impact sur les animaux

Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.

Réduction

Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.

Raffinement

Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.

Pour mesurer si des LED rouges ou proches infrarouges soulagent la neuropathie provoquée par les anticancéreux, 96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent huit injections de paclitaxel en vingt-cinq jours sous sédation légère, puis passent cinq minutes par séance dans un box de plexiglas, appareil allumé pour la moitié des groupes et éteint pour l'autre. Le porteur écrit que l'induction de la neuropathie est "une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l'étude", et suit chaque semaine par des tests comportementaux l'allodynie tactile et thermique qu'elle provoque. Une grille de points limites explore diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratation, perte de poids, pelage et locomotion, et retire du projet pour mise à mort rapide les rats dont le score l'exige.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques (taxanes, sels de platine…). La neuropathie périphérique chimio-induite se caractérise par des symptômes sensitifs distales et symétriques (picotement, douleur neuropathique, engourdissement), altérant la qualité de vie des patients, et pouvant perdurer longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique est très limitée, car aucun traitement préventif n’est recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée pour traiter les douleurs neuropathiques associées. La littérature scientifique souligne aujourd’hui l’intérêt de la photobiomodulation dans le traitement des douleurs neuropathiques et de la neuropathie périphérique chimio-induite. La photobiomodulation est une technique non invasive qui utilise des lumières rouges ou proches infrarouges de faible intensité (LED), pour stimuler l’activité cellulaire en agissant principalement sur les mitochondries ; cette lumière déclenche une série de réactions biochimiques bénéfiques telles que l’augmentation de la production d’énergie cellulaire, la modulation de l’inflammation, la stimulation de la régénération tissulaire et de la synthèse de collagène, sans effet thermique ni endommagement des tissus. L’objectif du projet sera de mesurer les effets préventifs et analgésiques de la photobiomodulation sur un modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier une nouvelle stratégie de prise en charge de la neuropathie périphérique chimio-induite utilisant la photobiomodulation. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge de la neuropathie périphérique chimio-induite est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et seule la duloxétine avec un niveau de recommandation modérée pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathie périphérique chimio-induite, avec une technique non-invasive.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections intraveineuses sous sédation légère. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours, et pour une durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux seront exposés à la procédure de photobiomodulation (2 groupes d’animaux avec un appareil éteint et 2 groupes d’animaux avec un appareil allumé). La procédure de photobiomodulation durera 5 min, et durée pendant laquelle les animaux seront dans des box en plexiglass transparent permettant aux animaux de se toiletter, de se voir et de se sentir. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront en moyenne 5 à 10 min par animal. Il n’y aura aucun prélèvement sanguin durant les procédures. Un seul prélèvement sanguin total sera réalisé en fin de procédure sous anesthésie profonde et avec analgésie, à la suite de quoi les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie périphérique chimio-induite chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La neuropathie périphérique chimio-induite sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées de paclitaxel seront responsables d’une réduction du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg et mesure bi-hebdomadaire), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au paclitaxel. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille (voir annexe), et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide.

Devenir

Les expérimentations conduiront à l'euthanasie des animaux pour permettre des analyses biologiques sanguines et tissulaires afin d'optimiser l'emploi des animaux à des fins de recherche.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur des cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie périphérique chimio-induite, qui n'est-elle-même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité à 12 par groupe, afin de respecter le principe de réduction tout en garantissant la robustesse scientifique de l’étude. Dans ce type d’étude exploratoire, une diminution plus importante du nombre d’animaux ferait courir un risque élevé de ne pas pouvoir conclure, ce qui entraînerait une perte de valeur scientifique et une utilisation inutile des animaux. Le nombre retenu permet de réaliser des analyses statistiques fiables, fondées sur des tailles d’effet attendues suffisamment larges pour mettre en évidence des différences pertinentes entre les groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe avec un enrichissement de l’environnement (cylindres en plastique et en carton) afin de favoriser les interactions sociales et les comportements de jeu, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être tout au long de l’étude. Les injections de produits à l’étude seront réalisées sous sédation légère. L’exposition des animaux à la photobiomodulation n’imposera aucune contention. Les animaux seront dans des box individuels en plexiglass et sans contention pendant 5 minutes. Les box seront transparents et ouverts, permettant aux animaux de se voir et se sentir, ce qui limitera l’isolement des animaux. Enfin, lors du prélèvement sanguin en point final, les animaux seront sédatés profondément avec une analgésie.

Choix des espèces

Le choix du rat plutôt que la souris se justifie d’abord par sa taille, qui permet de prélever une quantité plus importante de matériel biologique par individu et donc de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en répondant aux objectifs scientifiques. La souche Sprague-Dawley, connue pour son comportement calme et sa bonne maniabilité, est particulièrement adaptée aux tests comportementaux de la douleur, contrairement à des souches plus actives comme Lou ou Wistar qui peuvent introduire davantage de variabilité dans les mesures. L’utilisation de cette souche s’appuie également sur l’expertise existante et des données antérieures au sein du laboratoire, ce qui renforce la robustesse et la comparabilité des résultats. Les animaux seront utilisés à un âge correspondant à de jeunes adultes (environ 9 semaines), ce qui est cohérent avec la plupart des études publiées et facilite la comparaison avec la littérature ainsi qu’avec les données internes. Le recours à des animaux plus âgés pourrait mieux refléter la situation clinique en oncologie (cancers touchant majoritairement des sujets seniors), mais leur coût élevé et leur moindre utilisation dans les modèles précliniques limitent cette option. Des mâles et des femelles seront inclus afin de refléter la réalité clinique des traitements par paclitaxel, administrés aussi bien chez les hommes que chez les femmes, et de prendre en compte d’éventuelles différences liées au sexe dans les réponses aux traitements.

Cent jours de croissance tumorale, mesurée au pied à coulisse jusqu'à trois fois par semaine : 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées sous la peau, ou des fragments de tumeur y sont implantés par chirurgie, puis les traitements sont administrés en intraveineuse ou dans l'abdomen une fois par semaine pendant trois semaines. Le porteur indique que la tumeur peut gêner la locomotion et que la peau qui la recouvre peut s'ulcérer voire se nécroser, et que le regroupement des cages impose un changement de groupe social. Les souris sont utilisées à 5 ou 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale, et le porteur chiffre son "besoin" à 10 animaux pour chacun des 12 groupes de traitement de chacun des trois modèles de cancer, plus 40 en marge.

Objectifs

Le projet présenté vise à étudier l’efficacité de molécules immunostimulantes, lorsqu’elles sont administrées seules ou en combinaison avec des traitements de référence en immunothérapie, dans différents types de cancers. L’immunothérapie consiste à activer le système immunitaire lorsque celui-ci est désactivé par la tumeur. Plusieurs anticorps ont ainsi été approuvés pour le traitement de diverses tumeurs, permettant au système immunitaire d’être à nouveau activé et fonctionnel pour détruire les cellules tumorales et constituant une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Cependant, un nombre croissant d’observations réalisées chez les patients mettent en évidence un phénomène de résistance aux anticorps, la recherche se concentre donc maintenant à contourner ou reverser cette résistance grâce à de nouveaux traitements. Les molécules que l’on souhaite tester sont dites immunostimulantes car elles ont été créées de façon à stimuler directement la réponse immunitaire afin d’engendrer une mort des cellules tumorales. Au sein de notre laboratoire nous possédons des modèles de cancer chez la souris, étant peu ou non répondeurs à l'immunothérapie : cancer colorectal, lymphome et cancer du sein triple négatif, c'est donc sur ces modèles que nous souhaitons travailler. Nous cherchons à voir si les molécules que l'on souhaite tester, seules sont capables de rétablir un mécanisme antitumorale et à quel point, et si en combinaison avec les anticorps de référence, ceux-ci sont plus efficaces.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patients atteints de cancer, étant peu ou non répondeurs aux traitements de référence.

Procédures

Injection de cellules cancéreuses en sous-cutané (réalisée une fois au début de l'expérimentation, quelques secondes) OU IMPLANTATION DE MORCEAUX DE TUMEURS PAR CHIRURGIE SOUS CUTANE (UNE FOIS AU DEBUT DE L'EXPERIMENTATION, QUELQUES MINUTES). Mesures tumorales au pied à coulisse et pesées 3x/semaine maxmimum pendant 100 jours (quelques secondes). Une homogénéisation des groupes de traitements sera réalisée lorsque le volume tumoral moyen de début de traitement sera atteint, celle-ci pouvant entrainer un changement de cage et de groupe social pour les individus, ceux-ci ne changeant plus jusqu'à la fin d'étude. Injection des traitements en intraveineux (quelques secondes, 1 fois par semaine pendant 3 semaines) et/ou injection de traitement en intrapéritonéal (quelques secondes, 1 fois par semaine pendant 3 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir une injection de cellules en sous cutané qui entraine un stress à la contention, une douleur à l’injection, la tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion. CERTAINS ANIMAUX VONT SUBIR UNE INJECTION D'ANALGESIE AVANT CHIRURGIE CE QUI PEUT GENERER UN STRESS A LA CONTENTION ET UNE DOULEUR A L'INJECTION SOUS CUTANE, PUIS UNE CHIRURGIE SOUS CUTANEE FAITE SOUS ANESTHESIE GAZEUSE GENERALE QUI ENTRAINE UN STRESS AU REVEIL. L'homogénéisation nécessite un réallotement des souris qui induit un changement d’environnement et de groupe social, ce qui peut provoquer un stress et une réacclimation durant la première semaine. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse. La peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. L’administration des traitements une fois par semaine par voie intraveineuse et/ou par voie intrapéritonéale va entrainer du stress à la contention, au contact de l'eau et de la douleur peut être ressentie à l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes, organes qui seront utilisés par la suite pour différentes analyses.

Remplacement

Les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon statistiquement fiable à une meilleure efficacité de nos molécules administrées seules ou en combinaison avec les traitements de référence. Grâce à un outil statistique et connaissant nos modèles (ayant une réussite de prise tumorale de 75%), ceci nous a permis de savoir que nous avons besoin pour chaque modèle, pour étudier nos 12 groupes de traitement, de 10 souris par groupe, d'une marge de 40 souris en plus, ce qui nous amène à 480 animaux au total.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet en les pesant plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement (week-ends et jours fériés inclus) par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de surveillance de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé trois fois par semaine et si nécessaire, afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe clinique afin d’appliquer les meilleures mesures. Un analgésique sera administré aux souris si signes de douleur et lors du prélèvement sanguin terminal. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements appropriés à la souche de souris (coton de nidation, tunnels pour jeux, maisonnette).

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développé dont ceux que l’on souhaite étudier. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Irradiés éveillés pendant cinq minutes pour vider leur moelle osseuse, injectés de cellules leucémiques dans la veine de la queue, puis de lymphocytes T trois à cinq jours plus tard, 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent jusqu'à quatre prélèvements de sang à la mâchoire, jusqu'à trois ponctions de moelle dans le fémur sous anesthésie, et un traitement quotidien par gavage pendant sept jours ou par injection abdominale pendant cinq, parfois les deux le même jour. Le porteur indique que la leucémie greffée provoque au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, une prostration, une déshydratation ou une hypothermie. Trois jours après la fin du traitement, toutes sont tuées pour prélever la moelle osseuse et y observer la réaction des lymphocytes T contre la leucémie.

Objectifs

Les leucémies aigües myéloïdes (LAM) sont des maladies affectant la moelle osseuse puis d’autres organes par la suite comme la rate ou le foie. Afin de freiner cela, il existe le traitement par chimiothérapie qui peut permettre une rémission complète mais souvent va progresser vers une LAM récidivante réfractaire à de nouvelles tentatives de chimiothérapie. En plus de la chimiothérapie il est possible d’effectuer des greffes de moelle osseuse, provenant d’un donneur compatible. Ce traitement induit une réponse de la partie de l’organisme greffée (ici de la moelle osseuse) contre la leucémie (Greffon contre la leucémie, GVL) afin d’éliminer les cellules leucémiques résiduelles. Cependant, la greffe ne permet pas toujours de guérir le patient (i) lorsqu’il n’y a pas une réponse suffisamment forte de l’organisme contre la leucémie ou (ii) lorsqu’il y a une réaction de la partie greffée contre l’hôte. Le projet vise donc à comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse GVL dans les LAM. Pour cela un modèle a été mis en place, en injectant des cellules sanguines (ou blastes) leucémiques provenant de souris malades, suivi de lymphocyte T (globule blanc qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire) reconnaissant les blastes. Nous avons pu valider la réponse bénéfique GVL dans un modèle préclinique, de par l’amélioration de la survie des souris recevant cette double transplantation. Le modèle étant un modèle de souris ayant été irradié afin de « faire de la place » dans la moelle osseuse et permettre aux cellules leucémiques de s’y développer. Après l’étude de molécules utilisées chez les patients, nous avons pu mettre en place l’utilisation de celles-ci avec la réponse GVL dans les LAM. Nous souhaitons à présent les valider et les définir et pourraient améliorer l’efficacité de la réponse GVL.

Bénéfices attendus

L’effet thérapeutique de la greffe de moelle osseuse est compromis dans plus de 40% des cas de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec une réponse immunitaire s’appelant : greffon contre la leucémie (GVL) insuffisante. Une meilleure compréhension des différents mécanismes est donc indispensable pour concevoir des immunothérapies (traitements) rationnelles et efficaces pour un traitement à long termes des LAM. Notre projet se propose d’identifier et de caractériser les potentiels acteurs de l’effet GVL afin d’optimiser la réponse immunitaire du greffon médiée par les lymphocytes T toxiques vis-à-vis des cellules leucémiques.

Procédures

Les animaux vigiles (c’est-à-dire non endormis) seront tout d’abord préconditionnés par irradiation (durée: 5 minutes) pour éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse (veine de la queue; durée: 1 minute). Trois à 5 jours après injection des blastes, les souris seront injectées en une seule fois les cellules T immunitaires par voie intraveineuse dans la veine de la queue (durée: 1 minute). Des prélèvements de sang au niveau de la mâchoire de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer l’évolution de croissance tumorale. Nous ferons également une ponction de cellules dans l’os du fémur d’environ 5 minutes (8 à 10 jours après l'injection des cellules cancéreuses et au maximum 3 prélèvements sur la durée de la procédure expérimentale) ; les animaux étant placés sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux recevront un traitement journalier par voie orale en gavage (pendant 7 jours consécutifs; durée du geste: 1 minute) ou bien par une injection dans la cavité abdominale (pendant 5 jours consécutifs; durée du geste: 30 secondes). Dans le cas de combinaisons thérapeutiques, il peut y avoir deux administrations par jour, par exemple gavage et injection dans la cavité abdominale. Trois jours après la fin du traitement, les souris seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

Lorsqu’ils sont greffés, manipulés pour le suivi de prise de greffe, les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress et/ou une perte de poids. De plus, la greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement , une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. L'administration des traitements entrainera également un stress lié à la contention et une possible irritation du tube digestif dans le cas de l'administration par gavage.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse et observer la réponse contre la leucémie des lymphocytes T (catégorie de leucocytes (globule blanc)) qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire.

Remplacement

Pour identifier les molécules qui permettent une réponse contre la leucémie, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de récapituler de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier vivant. Bien que certains modèles in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses qui peut modifier leur comportement. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles animaux, ici chez la souris.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender l'apparition des signes de douleur. La mise en place d'un traitement anti-douleur, l'ajout de nourriture dans la cage ou l'arrêt des traitements testés seront réalisés. En cas d'absence d'amélioration de l'état de l'animal, celui-ci sera euthanasié. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux et le suivi clinique réalisé deux fois par semaine.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller infiltrer des organes à distance. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.