Cancers

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une implantation tumorale sous la peau, puis neuf injections dans la veine de la queue ou en intrapéritonéale sur animal vigile, avec pesée et mesure du volume tumoral trois fois par semaine jusqu'à un point limite fixé sur ce volume. Le projet teste si l'ajout d'un stimulateur de l'immunité innée renforce l'effet d'un anticorps que le porteur décrit déjà comme "très efficace" contre le mélanome, les retombées pour les patients en échec thérapeutique étant renvoyées à un élargissement futur des pistes de recherche clinique. Sur le remplacement, il indique que l'efficacité de chaque composé a déjà été validée avant le passage à l'animal, et affirme que seule l'évaluation de leur combinaison sur un "organisme entier" reste possible chez la souris.

Objectifs

Même si les traitements d’immunothérapie ont amélioré les chances de survie pour les personnes atteintes d’un mélanome (cancer de la peau), certains patients ne répondent toujours pas à ces traitements. Pour aider ces patients, de nouvelles stratégies sont en cours de développement. Parmi elles, un anticorps qui agit comme un "pont" entre les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses. Il reconnaît une protéine souvent présente sur les cellules de mélanome et aide les cellules immunitaires à mieux attaquer et détruire ces cellules cancéreuses. Ce traitement s’est montré très efficace pour freiner la croissance des tumeurs. D'autres substances sont testées pour booster encore plus cette réponse immunitaire, comme une version modifiée de l’interleukine-2 ou l’anti-PD1. Elles aident à activer les cellules immunitaires qui combattent les tumeurs, sans stimuler celles qui pourraient freiner cette réponse. L’ajout d’un stimulateur de l’immunité innée (appelé agoniste TLR4) permettrait de renforcer l’effet des autres traitements. Cette étude cherche donc à voir si une combinaison de tous ces éléments peut mieux activer les défenses immunitaires contre le mélanome chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet va renseigner si l’injection d’un agoniste TLR4 en combinaison avec un anticorps et des stimulants est possible, et s’il améliore leurs effets. Cela va permettre l’élargissement des pistes d’études en recherche clinique, et également de proposer des alternatives aux patients atteints de mélanomes qui ne répondent plus aux thérapies.

Procédures

- 1 chirurgie (animal sous anesthésie générale) – durée 5 min - contention + injection du composé immunostimulant dans la veine de la queue et/ou en intra-péritonéale (animal vigile) – durée

Impact sur les animaux

- Stress lié à la contention, aux mesures des volumes tumoraux et pesées (durée de quelques minutes, 3 fois/semaine) - Douleur lors d’injection des traitements dans la veine de la queue et/ou en intra-péritonéale (durée de quelques minutes, 3 fois) - Douleur post-chirurgicale après implantation sous la peau et suture. - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite.

Devenir

Les animaux seront à mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité des différents composés testés ont été préalablement validées. Le modèle animal doit être utilisé pour évaluer l’effet de combinaison de ces composés sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion d’un composé dans le sang et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire activée, sa migration et son effet sur la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.

Réduction

Selon les précédentes expériences, le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a pu être déterminé grâce à un logiciel statistique, en tenant compte du pourcentage de prise tumorale.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement critères physiques, ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels sera annotée sur une fiche de suivi, et comparée à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Les souris seront sous anesthésie générale et un antidouleur leur sera administré avant et après implantations des tumeurs. Lors de l’anesthésie, les yeux seront protégés du dessèchement et la baisse de température corporelle sera palliée. Les copeaux de litières seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs. Les souris seront randomisées par marquage à la queue (feutre de couleur) afin d’éviter le stress des changements de cages/congénères. Lorsque cela est possible, les traitements seront mélangés pour réduire le nombre d’injection à 1 au lieu de 2.

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs, et permettent de constituer des groupes avec un nombre de souris suffisant, compatibles avec des résultats suffisamment représentatifs. Les souris seront utilisées entre 5 et 10 semaines. Cette tranche d’âge permet aux souris d’avoir un système immunitaire mature tout en ayant une prise tumorale optimale. Des femelles et des mâles seront utilisés afin d'avoir une bonne représentation de l'effet du médicament.

Une injection de cellules tumorales sous l'omoplate, puis deux séances d'imagerie sous anesthésie dont une de deux heures : six souris ouvrent ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent ensuite six rats, opérés une heure sous anesthésie pour qu'on leur greffe une tumeur dans le cerveau, puis passés trois fois à l'imagerie. Les douze animaux, tous immunodéficients pour accepter les cellules humaines, sont tués à la fin pour vérifier où le traceur radioactif s'est fixé dans leur corps. Le porteur annonce commencer par trois mâles et n'inclure les trois femelles, puis la phase chez le rat, que si les résultats sont concluants, ce qui pourrait ramener le total à trois animaux.

Objectifs

Les glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus graves chez l’adulte. Ils sont très difficiles à soigner, car certaines cellules résistent aux traitements et provoquent souvent des rechutes. Pour mieux lutter contre ces cellules résistantes, il est nécessaire de les repérer plus précisément. Une des méthodes actuelles utilise des anticorps, qui sont des composés capables de reconnaître les cellules cancéreuses. Mais ces anticorps sont souvent trop gros pour passer la barrière naturelle qui protège le cerveau. Cela limite leur efficacité. Ce projet s’intéresse à une version plus petite de ces anticorps, appelée fragment d’anticorps, qui pourrait mieux atteindre les cellules malades. En y ajoutant un élément radioactif, ces fragments peuvent être utilisés pour les rendre visibles grâce à une technique d’imagerie médicale appelée TEP (Tomographie par Émission de Positons). L’objectif est de tester ce nouveau fragment pour voir s’il permet de mieux détecter les cellules cancéreuses résistantes dans les glioblastomes. Si cela fonctionne, cela pourrait aider les médecins à suivre plus précisément l’évolution de la maladie et à adapter les traitements à chaque patient. À long terme, cela pourrait améliorer la prise en charge et les chances de survie des personnes atteintes de ce cancer.

Bénéfices attendus

En permettant une détection plus précoce et plus précise des cellules cancéreuses résistantes, les agents d’imagerie développés en amont de ce projet pourraient aider à mieux évaluer la progression de la maladie et à adapter les traitements de manière plus ciblée. À terme, cela pourrait contribuer à une prise en charge plus personnalisée des patients et à une amélioration de leur pronostic.

Procédures

Une injection sous-cutanée de cellules tumorale pour les souris (5min). Une chirurgie de greffe tumorale intracérébrale pour les rats (1h). / 2 examens d'imageries de 10min et 2h pour chaque souris et 3 examens d'imagerie de 15min, 20min et 2h pour chaque rat, sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Chez la souris, la tumeur implantée sur l’omoplate peut gêner légèrement la locomotion. La mesure de la taille de la tumeur sur animal vigile peut induire un stress modéré. Le jeûne avant l'esamen d'imagerie peut entraîner une hypoglycémie. Les examens d’imagerie nécessitent des anesthésies répétées, de durée variable selon le protocole. Chez le rat, l'implantation de la tumeur peut entraîner des effets secondaires, notamment neurologiques. Les anesthésies seront également répétées et plus longues que chez la souris. Chez les deux espèces, les injections répétées dans la veine caudale peuvent provoquer une inflammation locale, une douleur transitoire.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés afin d'évaluer la fixation du fragment d'anticorps radioactif (diagnostic) dans le corps entier de l'animal.

Remplacement

Des études de biologie cellulaire en laboratoire ont été réalisées au laboratoire et ont montré des résultats prometteurs, néanmoins l’évaluation dans l'organisme du devenir du fragment d'anticorps reste indispensable. En effet, les modèles cellulaires actuellement disponibles ne reflètent pas fidèlement la distribution observée dans un organisme entier. Il est crucial de vérifier que ce produit se fixe bien sur la tumeur, sans accumulation dans d’autres organes, à l’exception de ceux impliqués dans son élimination (comme les reins). Par ailleurs, nos modèles de cellules sont enrichis en cellules souches cancéreuses. Cependant, la proportion de ces cellules varie considérablement d’une tumeur à l’autre. Ainsi, seule une évaluation dans un organisme vivant permet de juger de manière fiable le comportement et la spécificité du composé. De plus, pour savoir si le composé expérimental peut traverser la barrière protectrice du cerveau, il est indispensable d’utiliser un modèle animal de tumeur intracérébrale.

Réduction

Cette étude est conçue comme une étude exploratoire, en 2 phases, visant à évaluer le potentiel de fixation du fragment d'anticorps radioactif au niveau de la tumeur sous-cutanée puis intra-cérébrale. Phase 1 : Tumeur sous-cutanée chez la souris. Le nombre d’animaux a été strictement limité à six souris nude (trois mâles et trois femelles). Toutefois, seuls les mâles seront utilisés dans un premier temps (car le glioblastome a une prévalence masculine). Si les résultats obtenus sur les mâles sont concluants, les femelles seront incluses. Dans le cas contraire, les femelles ne seront pas testées et l'étude s'arrêtera, réduisant le nombre d’animaux à 3 au lieu de 6. Phase 2 : Tumeur intracérébrale chez le rat. Le nombre d’animaux a été strictement limité à six rats (trois mâles et trois femelles). Cependant, l’utilisation de ces animaux dépendra des résultats obtenus durant la phase 1. Si les résultats de la phase 1 ne sont pas concluants, la phase 2 ne sera pas initiée et les 6 rats nude ne seront donc pas utilisés. Cette approche progressive,permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés, tout en obtenant des données préliminaires essentielles pour orienter les étapes expérimentales ultérieures. Chaque animal sera son propre contrôle car le côté controlatéral pourra être utilisé comme référence de tissu sain.

Raffinement

Le transport des rats entre l’animalerie et le site d’imagerie, situé à proximité de la plateforme, sans passage à l’extérieur, sera réalisé en maintenant une température optimale par l’intermédiaire de bouillotes chauffantes placées sous les cages. Un suivi quotidien sera assuré pour tous les animaux, avec une attention particulière portée à l’état général, au comportement, à la mobilité et à l’alimentation-hydratation ainsi qu’à la vérification du bon état de la plaie. Des points limites précoces ont été fixés (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement), afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Toute altération du bien-être entraînera une prise en charge adaptée ou une euthanasie anticipée si nécessaire. Toutes les manipulations potentiellement stressantes ou douloureuses (injection du composé radioactif, imageries) seront réalisées sous anesthésie générale, garantissant l’absence de douleur et de stress. Les animaux seront sous anesthésie générale de l’injection du composé radioactif et lors des examens d'imagerie, les animaux sont placés dans un lit chauffant avec surveillance respiratoire et cardiaque et le niveau d’anesthésie sera surveillé et adapté si besoin pour garantir un état stable et sécurisé des animaux. Leur réveil se fera dans un environnement calme et sous surveillance. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté.

Choix des espèces

Souris : Au cours de projet, il est indispensable de travailler avec des souris immunodéficientes pour éviter le rejet de greffes des cellules cancéreuses humaines. Rats : Il est indispensable de travailler avec des rats immunodéficients pour éviter le rejet de greffes des cellules cancéreuses humaines. Ce choix est également motivé par la limite de la résolution des appareils d'imagerie, qui ne permettrait pas d’obtenir une qualité d’image suffisante, pour analyser correctement les lésions tumorales intracérébrales (la tumeur ayant un volume plus réduit en intracérébral) sur des animaux plus petits comme les souris. Phase 1 : Des souris de 6 semaines (stade adulte) à leur arrivée seront utilisées. Elles auront 7 semaines lors de l’implantation des cellules tumorales et entre 8-9 semaines au moment des imageries. Phase 2 : Des rats âgés de 7 semaines au moment de la greffe (6 semaines à la réception) seront utilisées à un stade où la croissance crânienne est achevée.

4 038 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales par voie sous-cutanée, intraveineuse, intracardiaque ou directement dans un organe après ouverture chirurgicale, puis sept à dix séances d'imagerie sous anesthésie, cinq à huit prélèvements sanguins après quatre à six heures de jeûne, et des pesées quotidiennes. Une partie est immunodéficiente, donc vulnérable aux infections, et le porteur prévoit une perte de poids pouvant dépasser 15 %. Les bénéfices annoncés pour les patients, une immunothérapie plus sûre et modulable, restent au conditionnel, quand le porteur écrit que la nature des prélèvements d'organes "ne permet pas la survie des animaux".

Objectifs

Les thérapies géniques et cellulaires représentent une avancée majeure dans le traitement de nombreuses maladies, notamment les cancers. Grâce à des technologies innovantes comme les cellules génétiquement modifiées, il devient possible de modifier certaines cellules pour qu’elles reconnaissent et éliminent des cellules malades dans l’organisme. Après des résultats prometteurs dans les cancers diffus, notamment certaines leucémies, ces approches sont désormais autorisées pour le traitement de cancers solides tels que le mélanome. Elles marquent ainsi une véritable révolution en immunothérapie. Malgré leur efficacité, ces thérapies ne sont pas sans risques. Leur action prolongée dans l’organisme et leur caractères difficilement réversible peuvent entrainer des effets secondaires graves. Le plus fréquent est une réaction immunitaire excessive, pouvant provoquer des troubles neurologiques voire dans de rares cas la formation de cancers secondaires liés aux cellules modifiées. Pour faire face à ces risques, des systèmes de sécurité sont actuellement en cours de développement. L’objectif est de pouvoir activer ou désactiver précisément ces traitements de façon ciblée dans le temps et dans le corps. Ces systèmes permettraient de mieux contrôler l’effet des thérapies géniques et cellulaires afin d’offrir des thérapies plus sûres aux patients.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie représente une avancée majeure dans le traitement de nombreuses maladies graves, notamment certains cancers et maladies auto-immunes. Mais ce type de traitement n’est pas sans risque. En stimulant fortement les défenses du corps, il peut entrainer des réactions indésirables parfois sévères. Il devient donc essentiel de pouvoir en contrôler précisément l’intensité et la durée. Des stratégies récentes cherchent à rendre l’immunothérapie plus sûre et plus modulable. L’une d’entre elles repose sur la thérapie génique. Elle consiste à insérer un gène dans les cellules du patient à l’aide de transporteurs, appelés vecteurs souvent des virus modifiés. Ce gène agit comme un interrupteur, permettant ainsi d’activer ou de d’arrêter le traitement si des effets secondaires apparaissent. Ces systèmes offrent un véritable progrès en matière de sécurité. Avant d’être utilisés chez l’Humain, ces dispositifs doivent être testés sur des modèles biologiques complets comme la souris. Cela permet de vérifier à la fois leur efficacité et l’absence d’effets indésirables majeurs dans un organisme vivant. A terme, ce type d’approche pourrait améliorer la prise en charge de nombreux patients pour lesquels les traitements actuels restent insuffisants. C’est le cas de certains cancers très résistants, comme le cas du cancer du foie dont le taux de survie à 5 ans est d’environ 18 pour cent. En rendant ces traitements plus contrôlables, ces avancées ouvrent la voie à une immunothérapie plus personnalisée, mieux tolérée et potentiellement accessible à un plus grand nombre de patients.

Procédures

Dans ce projet de recherche, des souris sont utilisées pour évaluer l'efficacité, la distribution et la tolérance de traitements innovants dans l'organisme en conditions saines ou pathologiques. Les animaux suivent différentes étapes expérimentales. Certains reçoivent une seule injection d'un des deux produits thérapeutiques sur souris soit vigile soit anesthésiées d'une durée inférieure à 30 secondes. Pour créer des modèles tumoraux, plusieurs méthodes sont utilisées: une injection unique de cellules tumorales disséminées (sous anesthésie, 30 secondes), injection de cellules tumorales solides (1 fois, sous anesthésie, 45 secondes) ou injection directe dans un organe (1 chirurgie par souris, moins de 20 minutes, sous anesthésie générale avec une analgésie préventive et post opératoire pendant 3 jours). Les traitements expérimentaux comprennent l'injection de cellules thérapeutiques (1 fois, sous anesthésie, 30 secondes), de vecteurs viraux (1 fois, sur souris vigile, 30 secondes) et de médicaments complémentaires (1 fois par jour pendant 3 à 5 jours, sur animal vigile, 30 secondes). Le suivi de la tumeur repose sur des mesures manuelles (1 à 2 fois par semaines, 2 minutes sur animal vigile), de l'imagerie par bioluminescence (1 à 2 fois par semaine pendant 4 à 8 semaines, soit 7 à 10 fois par animal, anesthésie légère 10 minutes accompagné de l'injection d'un agent de contraste 30 secondes et de l'échographie (1 fois, 15 minutes, sous anesthésie). Les souris subissent aussi des prélèvements sanguins hebdomadaires (5 à 8 fois sur animal vigile à jeun 4 à 6heures, 30 secondes, une pesée quotidienne (contention 30 secondes) réalisée à la suite de l'implantation tumorale (de J0 à J4 soit 4 pesées) puis tous les 2 à 3 jours (soit 2 à 3 pesées par semaine) dont la fréquence est réaugmentée à un rythme quotidien si l'état général des animaux le justifie. Une observation clinique quotidienne est également maintenue tout au long du protocole. A la fin de l'étude, les animaux reçoivent une anesthésie avec une analgésie préventive (1 injection de 30 secondes, 30 minutes avant l'anesthésie) puis le prélèvement sanguin suivi de l'euthanasie est réalisé sous anesthésie en 10 minutes. Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé dans le respect de la réglementation avec une prise en compte du bien-être de l'animal à chaque étape.

Impact sur les animaux

(i)Nuisance physiologique. Une mise à jeun de 4 à 6 heures peut être appliquée dans le cadre des modèles développés dans ce projet et est susceptible de provoquer une sensation de faim légère. L’induction des vecteurs ainsi que la progression tumorale dans certains modèles peut entrainer une perte de poids réelle supérieure à 15%. (ii)Nuisance comportementale. Les phases de contention (pesée, injection, prélevement sanguin, mesure du volume tumoral) peuvent générer un stress ponctuel ainsi qu'une douleur légère et transitoire généralement inférieur de 30 secondes. L'anesthésie gazeuse utilisée dans certaines procédures peuvent accentuer l'anxiété et provoquer une perte transitoire de chaleur corporelle. (iii)Nuisance liée au statut immunodéficient. Les souris immunodéficientes présentent une vulnérabilité accrue aux infections. (iv)Nuisance liée au développement tumoral. Le développement tumoral peut conduire à l'apparition de lésions cutanées au point d'injection ainsi qu'à des altérations du bien-être notamment au niveau du toilettage, la mobilité ou l'alimentation. (v)Nuisance liée aux interventions chirurgicales. L'anesthésie gazeuse prolongée utilisée dans certaines procédures peut entrainer une perte transitoire de chaleur corporelle. La suture peut occasionner une réaction inflammatoire locale transitoire au niveau de la cicatrice.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures expérimentales sont euthanasiés en fin d’étude. Cette euthanasie est scientifiquement indispensable car elle permet la réalisation de prélèvements d’organes et de tissus nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Plus précisément, les tumeurs sont prélevées pour des analyses histopathologiques. Le sang et la rate sont recueillis pour l’analyse phénotypique des cellules thérapeutiques administrées. Les organes sont prélevés dans leur totalité afin de permettre la validation du ciblage tissulaire spécifique des vecteurs de thérapie génique. La nature des prélèvements ne permet pas la survie des animaux. Ainsi aucun animal n’est conservé après les procédures, l’ensemble des animaux est euthanasié de manière programmée et encadrée conformément aux règles en vigueur.

Remplacement

Les thérapies géniques et cellulaires offrent des pistes très prometteuses pour soigner certaines maladies, mais elles doivent être rigoureusement contrôlées avant de pouvoir être utilisées chez l’humain. Il est notamment essentiel de vérifier si elles ciblent bien la zone souhaitée comme une tumeur ou un organe précis et de s’assurer qu’elles n’agissent pas par erreur sur d’autres parties du corps. Des premiers tests ont déjà été réalisés en laboratoire sur des cellules. Ces expérimentations ont permis d’évaluer l’expression du transgène, la viabilité cellulaire. Elles fournissent des données essentielles pour comprendre le fonctionnement initial du traitement. Cependant, ces vérifications ne peuvent pas se limiter aux expériences sur cellules. Les études réalisées chez l’animal sont indispensables pour observer la diffusion et l’action du traitement dans un organisme complet et ainsi recueillir les informations nécessaires pour juger de sa sécurité et de son efficacité avant toute application chez l’humain.

Réduction

Conformément au principe des 3R, ce projet repose sur plusieurs approches concrètes visant à réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique. Trois principaux leviers sont mobilisés pour optimiser la conception expérimentale et limiter l’impact sur les animaux. L’étude prend en compte les 2 sexes (mâles et femelles) afin d’inclure la variable sexe dans le plan expérimental, ce qui augmente la portée statistique et réduit les biais d’interprétation. Ne pas considérer cette variable peut conduire à des résultats non reproductibles ou non généralisables. Les différences de pharmacocinétique entre les mâles et les femelles peuvent également fausser des conclusions lorsqu’elles sont extrapolées d’un sexe à l’autre. Bien que cela soit contre intuitif, l’intégration des 2 sexes apporte une valeur scientifique renforcée aux données recueillies. Grâce à l’imagerie in vivo, chaque animal est utilisé de façon optimale afin d’obtenir un maximum d’informations. Les groupes expérimentaux sont conduits en parallèle, ce qui limite le recours aux groupes témoins. Chaque individu fait l’objet d’un protocole d’analyse complet permettant de rassembler un grand nombre de données tout en réduisant le nombre total d’animaux mobilisés. Ainsi 4038 animaux sont utilisés dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Des mesures précises et rigoureuses seront mises en œuvre pour assurer le bien-être des animaux. (i) Les points limites sont définis suivant une observation de signes cliniques dictant un arbre décisionnel. Les signes cliniques sont ceux altérant l’apparence physique, le poids et le comportement qui dictent l’intervention à tenir allant du soin à l’euthanasie. (ii) La gestion de la douleur se fait par administration d’analgésiques en cas de souffrance détectée. (iii) Le suivi rigoureux et proactif des animaux se fait par une surveillance quotidienne des animaux par un personnel qualifié, formé aux procédures, qui prend en charge conformément aux protocoles établis et à la grille de suivi garantissant une réponse rapide et adaptée. (iv) Dans un environnement enrichi, l’hébergement (de 2 à 5 individus par cage) en groupes sociaux compatibles des animaux favorise les comportements exploratoires et réduit ainsi le stress avec une période d’acclimatation de 10 jours avant les procédures. (v) L'anesthésie gazeuse utilisée pour certaines procédures provoque une perte transitoire de chaleur corporelle compensée par l'installation de l'animal sur un plateau chauffant pendant l'intervention puis par un réveil en cage thermostatée. (vi) Les souris immunodéficientes sont maintenues dans des conditions strictes d'hébergement et de manipulation afin de limiter les risques d'exposition aux agents infectieux.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la formation tumorale grâce son taux élevé de prise de greffe et à sa petite taille qui facilite la manipulation. La disponibilité de diverses lignées immunodéficientes permet d’utiliser des greffes d'une autre espèce sans risque de rejet tandis que les lignées dépourvues de poils facilitent le suivi visuel de la croissance tumorale. De plus, le vaste éventail de modèles génétiquement modifiés et la connaissance approfondie du génome murin permettent d’étudier en détail les mécanismes moléculaires du cancer. Le cycle de vie court de la souris favorise la constitution de cohortes pour garantir une bonne puissance statistique, et l’existence de nombreux protocoles standardisés simplifie la comparaison des résultats entre études. Enfin le comportement bien documenté des souris permet d’identifier rapidement les signes de souffrance évaluable assurant ainsi une prise en charge efficace. Les souris utilisées seront des jeunes adultes sexuellement matures âgées de 8 à 12 semaines. Ce choix correspond à une période où les fonctions physiologiques, notamment immunitaires et métaboliques, sont pleinement développées, tout en restant stables et homogènes d’un individu à l’autre. A cet âge, les animaux présentent également un comportement plus stable, ce qui réduit la variabilité expérimentale et les réactions excessives liées au stress. L’utilisation de cette tranche d’âge permet donc à la fois de garantir la maturité biologique, de limiter les biais comportementaux liés à l’anxiété et de favoriser la robustesse des résultats.

12 000 souris et 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à trente administrations d'un composé en dix jours et subir jusqu'à seize prélèvements de sang, dont le dernier est terminal. Il s'agit de mesurer ce que l'organisme tolère avant les études d'efficacité, le porteur annonçant une possible dégradation de l'état de santé, une perte de poids, une hypothermie ou une hyperthermie, une prostration et des vocalisations. L'effectif se déduit d'un maximum de 50 études de tolérabilité prévues sur la durée du projet, chiffre lui-même tiré d'une analyse rétrospective des trois dernières années.

Objectifs

Dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le domaine de l’oncologie, il est nécessaire de tester l’efficacité de nouveaux composés dans les conditions mimant au mieux la pathologie. Malgré les efforts réalisés pour mettre en place de robustes modèles in vitro et des études de modélisation sur ordinateur, le développement de modèles in vivo ayant recours à des animaux de laboratoire sont nécessaires au développement, à l’évaluation et à la sélection de nouvelles molécules candidates à de futures études cliniques(1,2). Lorsque la molécule est sélectionnée sur des critères de sélectivité et d’activité in vitro, ainsi que sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques acceptables chez l’animal, il est crucial d’évaluer la tolérance de la molécule suite à une administration unique ou répétée afin d’identifier sur de petits groupes d’animaux l’innocuité de la molécule à des doses et régimes d’administration précis dans le but de supporter les futures études d’efficacité. Le nombre estimé d'études pour l'ensemble du projet est estimé sur la base d'une analyse rétrospective qui a évalué le nombre d'études de tolérance menées au cours des trois dernières années. Au total, nous prévoyons de réaliser au maximum 50 études de tolérabilité pendant toute la durée du projet.

Bénéfices attendus

A l’origine de plus de 10 millions de décès par an, le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Les principaux traitements aujourd’hui consistent en la chirurgie et la chimiothérapie, souvent associées à une radiothérapie. Malgré ces options thérapeutiques, le nombre important de décès par an souligne l’inefficacité de ces traitements et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. La procédure qui constitue ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront d’évaluer la tolérabilité des animaux pendant les futures études d’efficacité de nouveaux candidats médicament dans le domaine de l’oncologie.

Procédures

Les gestes techniques concernant les animaux sont : - Administrations des composés à potentiel thérapeutique : une à trois fois par jour selon voie d’administration et nature du composé, sur maximum 10 jours, soit maximum 30 traitements. - Prélèvements sanguins : Sur la totalité d’une étude, un animal reçoit au maximum soit 15 prélèvements de microsampling + 1 prélèvement terminal, soit 6 prélèvements standards + 1 prélèvement terminal. o Prélèvements de sang sur animal vigile par microsampling (durée 30 secondes) : jusqu'à 5 prélèvements sur 24 heures, et maximum 15 fois par animal sur toute la durée de l’étude. o Prélèvement de sang standard sur animal vigile ou anesthésié: durée 1 minutes, maximum 6 fois par animal . o Un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie (1 min., une fois).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être stressés par les manipulations liés aux traitements et aux prélèvements auxquels ils sont soumis et peuvent ressentir une légère douleur au site d'injection ou de prélèvement sanguin. De plus, les animaux reçoivent pour la première fois un traitement à moyen terme avec de nouvelles molécules qui peuvent parfois être mal tolérées. Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure des jours de traitement : dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations, limité à une gravité modérée par l'application de points-limites anticipés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures pour effectuer des prélèvements de sang et de tissus qui feront l’objet d’analyses ultérieures (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques dans différents organes).

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés à des pathologies : une approche in vitro, basée sur l’utilisation de lignées cellulaires et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules issues de pathologies d’intérêt sont inoculées. Les modèles in vitro sont utilisés autant que possible en amont pour limiter le recours à l’animal. Cependant, les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement de la pathologie dans son ensemble, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser/simuler la tolérabilité d’un animal à un composé. L’écosystème nécessaire pour la tolérabilité intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Des tests in silico, in vitro et de pharmacocinétique in vivo permettent de sélectionner les molécules disposant d’une bonne sélectivité, activité in vitro et exposition avant d’évaluer leur innocuité et leur activité in vivo. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d'observer une activité sur les modèles qui font l’objet des procédures de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d'animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature. Des analyses de puissance statistique seront utilisées pour la détermination de la taille des groupes expérimentaux. Des analyses rétrospectives seront conduites pour s'assurer de la bonne adéquation du nombre d'animaux par groupe et de la puissance statistique recherchée et si possible voir pour réduire encore le nombre utilisé.

Raffinement

Le nombre de manipulations sur les animaux sera réduit au strict nécessaire. Les procédures les plus invasives, plus susceptibles d’engendrer un inconfort ou un stress seront réalisées sous anesthésie. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire quotidienne. Leur état de santé sera évalué à l’aide d’une grille de score basée sur des critères cliniques et comportementaux, associée à un arbre décisionnel permettant l’application de points limites adaptés. En fonction de l’évolution de l’état de l’animal, des mesures seront mises en place, telles que l’intervention du vétérinaire, l’administration d’analgésiques supplémentaires, l’ajout d’enrichissements ou d’alimentation spécifique, voire la mise à mort de l’animal si nécessaire, afin de prévenir toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles ectopiques de cancer chez la souris et le rat existent dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références, etc…) Les données de la littérature indiquent clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine du cancer. Les études de tolérabilité en amont seront donc elles-aussi réalisées avec des rongeurs adultes.

120 rats non consanguins de six à huit semaines vont être utilisés, tous tués au plus tard quatorze jours après le début de la procédure, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une administration unique du composé, en intraveineuse ou par sonde de gavage, puis subit huit prélèvements sanguins à la veine saphène sous anesthésie. Le protocole se déroule sur des animaux sains et mesure où va la molécule dans l'organisme, combien de temps elle y reste et comment elle en sort. Le porteur situe ce passage chez le rat dans une séquence qu'il décrit comme classique, la première étape sur "organisme entier" avant "d'envisager éventuellement d'autres études plus avancées chez le chien ou le primate".

Objectifs

Les cancers hématologiques comme les leucémies, les myélomes et les lymphomes, sont des cancers qui se développent à partir de cellules du sang. En France chaque année, 33 000 personnes sont touchées par ces pathologies, en particulier les enfants, jeunes adultes et personnes âgées. Ils représentent 7% des cancers. Le traitement des cancers hématologiques repose en grande majorité sur la chimiothérapie à l'heure actuelle. Ces options thérapeutiques entrainent un certain nombre d’effets indésirables et leur efficacité diffère selon les patients. Malgré ces traitements, l’espérance de vie des personnes touchées par ces types de cancer varie de 2 à 5 ans après le diagnostic. Nous nous intéressons dans ce projet à un potentiel nouvel agent anticancéreux : une enzyme en tant que voie prometteuse dans les thérapies alternatives contre le cancer. Cette enzyme offre un avantage unique, sa capacité à cibler sélectivement et à inhiber la croissance des cellules cancéreuses sans nuire aux cellules saines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine à moyen terme. En effet, il y a encore aujourd’hui des patients atteints de cancer hématologiques réfractaires aux traitements sur le marché. L’étude va permettre de développer de manière préliminaire une nouvelle molécule qui permettra au mieux de guérir les patients atteints de ce type de cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Administration des traitements : contention et injection des composés en intraveineuse (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes) ou en gavage (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes). Les prélèvements de sang seront effectués à la veine saphène (anesthésie et prélèvement d’une durée de 30 secondes).

Impact sur les animaux

Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur de quelques secondes due à l'aiguille lors de l'injection intraveineuse. Les administrations par voie orale avec sonde de gavage génèrent un stress de quelques secondes lors de la contention. Les prélèvements de sang répétés vont générer un stress lors de l’anesthésie et du prélèvement (8 prélèvements au total par animal). Aucun signe de toxicité particulière lors de l'administration du composé aux doses testées dans ce projet n’a été observé chez le rat lors de l'étude préalable de tolérance.

Devenir

Tous les animaux auront été mis à mort au plus tard 14 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai afin de pouvoir réaliser les prélèvements de sang puis d’organes prévus dans la procédure.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation de notre composé d’intérêt ont été réalisées (études de cytotoxicité) ayant permis de sélectionner les types de cancers sur lesquels il serait le plus efficace. Ensuite, le passage chez le rat a permis l’évaluation de sa tolérance sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans l’organisme nécessitent d’être étudiés et définis sur l’organisme vivant sain avant de tester dans de futurs projets son efficacité sur organisme malade. Pour cette raison nous devons effectuer cette étude chez le rat.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de manière fiable sur cette étude préliminaire qui permettra de définir le cheminement du composé dans l'organisme. Pour la comparaison des quantités maximales du composé dans le plasma entre chaque groupe traité, nous utiliserons un test statistique fiable à multiple comparaisons. Pour le choix du nombre de rat par groupe qui nous permettra de pouvoir observer des différences entre les groupes et de choisir la dose ainsi que le mode d'administration les plus adéquats chez le rat, nous avons utilisé des logiciels statistiques reconnus. Les résultats de ce projet seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les rats seront observés tous les jours par le personnel de l'animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des rats afin de détecter rapidement une souffrance, et 7 jours sur 7 dans le cadre de ce protocole par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des rats sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 rats par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, bâtonnet à ronger, tunnels pour jeux). Pour les groupes dont le composé sera administré par voie orale en gavage, des sondes de gavages en plastique flexibles évitant l'irritation et à usage unique seront utilisées.

Choix des espèces

Afin de plus tard développer cette molécule thérapeutique chez l'Homme, nous devons au préalable observer son devenir dans l'organisme chez l’animal, la première étape sur organisme entier étant classiquement réalisée chez le rat ou la souris avant d’envisager éventuellement d’autres études plus avancées chez le chien ou le primate. Pour ce faire, nous souhaitons étudier les paramètres pharmacocinétiques qui correspondent à : son absorption, sa distribution, sa métabolisation et son élimination en analysant les quantités de celui-ci dans le sang à différents temps après injection, dans les deux sexes chez le rat non consanguin. Les rats non consanguins sont utilisés pour l’évaluation toxicologique et pharmacologique des candidats-médicaments. Ainsi, les rats non consanguins présentent une plus grande diversité génétique, et sont donc plus intéressants pour les études de tolérance. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines afin que les animaux soient jeunes et en bonne santé.