Cancers

1 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous anesthésie, elles passent trois séances d'imagerie par semaine, subissent une irradiation localisée de la tumeur et, pour certaines, l'ablation chirurgicale de la tumeur primaire. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale et les traitements réduisent la mobilité et affaiblissent les animaux, et espère montrer que des modulateurs du système immunitaire rendent le cancer du sein triple négatif sensible à la radiothérapie. Cet effectif de 1 660 souris n'est adossé à aucune donnée publique, le porteur indiquant qu'un "outil informatique" a servi à le calculer.

Objectifs

Le cancer du sein est la principale cause de décès par cancer chez les femmes dans le monde. En raison du manque de cibles thérapeutiques, le cancer du sein triple négatif (TNBC) est le sous-type le plus agressif et résistant aux thérapies standard. L'un des traitements courants du TNBC est la radiothérapie, mais la radiorésistance est un obstacle majeur dans cette malignité. Parmi tous les composants du microenvironnement tumoral, les cellules du système immunitaire sont hautement recrutés lors de la radiothérapie et des données antérieures suggèrent qu'ils sont associés à la résistance des cellules tumorales. Ici, nous prévoyons de comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans la modulation de la radiorésistance du cancer du sein et de valider les mécanismes associés. L'objectif principal de ce projet est donc d'identifier de nouvelles cibles (comme récepteurs sur les cellules) pour le développement de thérapies de sensibilisation à la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Dans ce projet et à court terme, nous évaluerons l'efficacité antitumorale des modulateurs du système immunitaire dans la sensibilisation à la radiothérapie. Nous espérons démontrer la bonne efficacité de l'association de modulateurs du système immunitaire et de la radiothérapie pour obtenir des effets antitumoraux. À long terme, cette combinaison représente un modèle original et novateur de coopération thérapeutique dans la lutte contre le cancer du sein.

Procédures

Les animaux auront une injection de cellules tumorales (durée 1 minute, sous anesthésie générale). Les animaux auront 3 séances d'imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée 10 minutes) par semaine. Les animaux subiront une irradiation localisée sur la tumeur par animal sous anesthésie générale (durée 10 minutes). Au cours de chaque injection de cellules et radiotherapie, les souris seront anesthésiées (anesthésie générale). Certaines souris auront des injections de médicament (n=2, anesthésie locale, durée 1 minute). Les tumeurs primaires seront retirées de certains animaux sous anesthésie générale (n=1, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Le traitement ainsi que la façon dont croît la tumeur peuvent réduire la mobilité de la souris et affaiblir la souris, avec des retentissements locaux ou systémiques modérés. Les animaux subiront aussi du stress lors des préhensions pour examen, des injections sous anesthésie générale et des séances d'imagerie, qui leur occasionneront un stress ou une douleur légers et temporaires.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour études et examen sur tissus et sang post-mortem pour étudier les modifications/mécanismes biologiques induits par les différents traitements.

Remplacement

Les modèles animaux sont également necessaires pour étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte incluant le environnement tumoral, permettant aux cellules tumorales d'interagir avec l'environnement (incluant les cellules immunitaires dépendantes des médiateurs de type cytokine ou les cellules du reste de l'organisme). Ceci est important dans le contexte de la radiothérapie (par exemple, l'effet « bystander » de l'irradiation, c'est-à-dire les effets que les cellules irradiées peuvent exercer sur les cellules non irradiées à proximité ou à distance). Il n'existe pas de modèles de remplacement pour une telle étude.

Réduction

Les effectifs sont ramenés au minimum tout en gardant un effet statistique significatif. Un outil informatique a été utilisé pour calculer le nombre d'animaux nécessaires tout en prenant en compte des données préliminaires.

Raffinement

Toutes les interventions seront menées sous anesthésie locale ou générale. Un suivi quotidien clinique sera effectué. Des points limites précoces et précis ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Leur environnement sera enrichi. De plus, en cas de perte de poids ou de sign d'affaiblissement, les animaux auront un aliment énergétique adapté, plus préhensile.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: -La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. -Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue -Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -Les modèles de tumeur étudiés sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité. Les souris seront âgées de 6 à 8 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature. En effet, le cancer du sein apparaisse durant l'age adulte, l'utilisation de souris adulte permet donc de mimer au mieux l'environnement dans lequel se développe le cancer.

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection et un prélèvement de sang sous anesthésie locale, puis une irradiation sous anesthésie générale, à des doses variables, pour comparer la radiothérapie flash à la radiothérapie conventionnelle sur trois tissus sains : poumon, intestin, peau. Les atteintes annoncées vont de la perte d'appétit à une perte de poids "légère à sévère", avec difficultés respiratoires, isolement, diarrhée et lésions cutanées inflammées. Le porteur présente la technique testée comme "l'une des avancées les plus prometteuses en radio-oncologie" et une "véritable révolution", et juge "urgent" de lancer ces programmes précliniques.

Objectifs

Les traitements par radiothérapie conventionnelle ont la difficulté d'arriver à délivrer une irradiation localisée avec une dose suffisante pour l’éradication de la tumeur tout en préservant les tissus sains environnants. Actuellement, les techniques d’irradiation médicale permettent de limiter l’atteinte des tissus sains sans toutefois l’éviter et les combinaisons de r&diothérapie avec les médicaments de chimiothérapie tendent à exacerber les effets secondaires. La raduithérapie flash est une nouvelle technique qui consiste à délivrer une forte dose à un très haut débit de dose (4500 à 9000 fois plus élevé, et beaucoup plus rapide) permettant une réponse anti-tumorale efficace tout en épargnant les tissus sains, limitant ainsi les toxicités liées à l’irradiation. À l'heure actuelle, elle est reconnue comme l'une des avancées les plus prometteuses en radio-oncologie, à la croisée des chemins entre technologie, physique, chimie et biologie, et considérée comme une véritable révolution dans le domaine de l’oncologie. Cette nouvelle modalité d’irradiation prévoit de remplacer d’ici à 4-5 ans les séances de radiothérapieconventionnelles par un ou quelques séances d’irradiations flashs de moins d’une seconde, beaucoup plus précises et efficaces mais surtout avec une moindre toxicité sur le tissu sain. Cependant, les mécanismes biologiques restent mal compris et les limites de l’effet flash (en dose par séance, en débit de dose…) mal définis et il devient donc urgent de lancer des programmes de recherche pré-clinique et translationnelle visant à mieux comprendre et optimiser le transfert en clinique de cette nouvelle technique. Dans ce projet nous avons fixé deux objectifs: 1-Valider l'effet flash sur plusieurs modèles de toxicité radio-induite, à savoir, la toxicité pulmonaire, la toxicités intestinale et la toxicité cutanée. 2-Etudier les mécanismes biologiques impliqués dans cet effet flash.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme consistent à fournir un rationnel préclinique et une preuve de concept pour la validation de l'utilisation de la radiothérapie flash en clinique. A travers ce projet nous visons à assurer un meilleur transfert en clinique de la radiothérapie flash et en toute sécurité pour les patients.

Procédures

Les animaux auront une injection (durée 1 minute, anesthésie locale) et un prélèvement de sang (durée 1 minutes, anesthésie locale). Ils auront aussi des irradiations à des doses différentes (une fois par animal, durée de 1 à 10 minutes, sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir un inconfort et ou un stress léger lié à la manipulation des animaux pour les préparer au traitement de radiothérapie. En raison des effets secondaires de la radiothérapie, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité ou des modifications du comportement social. De plus une perte de poids légère à sévère peut être observée chez les animaux ayant reçu le traitement de radiothérapie. Les nuisances induites peuvent être différentes en fonction de l’organe/tissu irradié. Certains animaux pourront perdre présenter une perte de poids modérée après irradiation. De plus, une difficulté respiratoire peut être observée chez ces animaux, associée à un comportement d’isolement. Une diarrhée peut (rarement) survenir chez les animaux irradiés. Certains animaux pourront développer une toxicité cutanée qui se manifeste sous forme de lésions inflammées de garde léger à modéré comme celles observées chez les patients.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour analyses des effets de la radiothérapie flash sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie flash sur les tumeurs et sur les tissus sains, en comparaison avec la radiothérapie conventionnelle. Ceci exige donc un système biologique dynamique complet en interaction direct avec le microenvironnement de la tumeur. L’étude du recrutement des cellules immunitaires dans le site irradié ainsi que leurs interactions complexes nécessitent le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être modélisé in vitro ni in silico

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique a priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire et suffisant.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux principes éthiques les plus stricts pour minimiser la douleur, l'angoisse et le stress chez les animaux. Une anesthésie locale ou générale adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur des animaux. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont adultes. Les études des mécanismes biologiques, impliquant des voies de signalisation moléculaires et cellulaires différentes, nécessite d’avoir recours à un organisme adulte présentant des tissus/organes matures.

L'abdomen de chaque souris est ouvert sous anesthésie pour implanter des cellules tumorales dans la paroi du cæcum ou dans le foie, en quinze minutes. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des traitements injectés trois fois par semaine pendant trois semaines et deux séances d'imagerie hebdomadaires. Toutes sont tuées à la fin, y compris celles dont la tumeur régresse totalement et qui sont alors gardées deux mois de plus sous surveillance par imagerie. Le porteur range ces injections répétées et les anesthésies parmi les nuisances "fugaces" et "passagères", tout en reconnaissant que la croissance des tumeurs et l'apparition des métastases sont elles-mêmes sources de souffrance.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des systèmes de blocage pour inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale (ex : anti-PD1). Des thérapies ciblant l’inactivation de PD1 ont été développées pour rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements. Notre projet a pour but de démontrer que la déplétion des cellules CD4 de la souris permet à cette thérapie anti-PD1 d’être efficace contre les tumeurs implantés dans leur organe d’origine. En effet, la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 a déjà été montrée efficace dans des tumeurs implantées en sous-cutanée dans la souris. Le microenvironnement jouant un rôle important dans la réponse anti-tumorale, nous nous proposons ici d’évaluer l’efficacité thérapeutique de la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 dans un modèle de cancer du côlon et dans un modèle de métastase hépatique d’origine colique.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses anti-tumorales grâce au blocage des « immune checkpoints » a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré dû à la présence de résistances à ces thérapies. Ce projet permettra donc de montrer l’implication des lymphocytes T CD4 dans la résistance aux traitements anti-PD1 et ainsi de confirmer l’intérêt de trouver et de tester des molécules bloquant ces cellules chez l’Homme afin d’améliorer les thérapies anti-cancéreuses.

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 pour réaliser les traitements en intrapéritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans la paroi du caecum et dans le foie sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement des tumeurs primaires, ainsi que l’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes. Les injections intrapéritonéales de traitements, de luciférase et d’antibiotiques, ainsi que les injections sous-cutanées de buprénoprhines sont une source de nuisances fugaces La manipulation des souris lors des injections des traitements et lors des imageries est une nuisance. Les infections liées à la chirurgie sont un risque de fréquence rare vue les mesures mises en place (stérilité, antibiothérapie). Les anesthésies mises en place lors de la chirurgie et des imageries sont également une source de nuisance passagère.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictif, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant.

Réduction

Pour chaque traitement à tester Control, a-CD4, a-PD1 et a-CD4+ a-PD1 (4), 4 groupes de 5 souris seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité du traitement tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 4 fois de manière indépendante. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Toutes les séances d’imagerie seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Les souris recevant une chirurgie nécessitant l’ouverture de la cavité abdominale, recevront une antibiothérapie préventive avant chaque chirurgie. Les procédures telles que l’imagerie et la chirurgie abdominale sont réalisées sous anesthésie à l’isoflurane suivie d’un réveil sous lampe chauffante (EU2) ou couveuse (EU1), réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être en permanence contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge antalgique adaptée : 0.1 mg/kg de buprénorphine en pré-opératoire, de la lidocaïne en application locale sous forme de gel lors de la chirurgie et 0.1 mg/kg de buprénorphine seront injectées en sous-cutanée 2X par jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine. Les animaux seront transférés de l’EU1 à l’E2 (bâtiments situés proches l’un de l’autre) dans un sac de transport et le plus rapidement possible pour ne pas engendrer de stress.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes C57Bl/6, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée ou orthotopique de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Faire pousser sur un animal vivant des cellules tumorales de patientes, pour ensuite les cultiver en laboratoire : 75 souris immunodéficientes sont utilisées à cette fin, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau un fragment de tumeur mammaire triple négative au cours d'une intervention de dix minutes sous anesthésie générale, puis sa tumeur est mesurée deux fois par semaine. Le porteur indique que la greffe peut devenir assez volumineuse pour limiter les déplacements de la souris, réduire son appétit et lui faire perdre du poids. Il affirme que l'établissement d'une lignée cellulaire à partir de tumeurs de patientes passe nécessairement par cette amplification sur des animaux "réceptifs", c'est-à-dire dépourvus de défenses immunitaires.

Objectifs

Parmi les différents types de cancer du sein, les tumeurs triple négatives ne peuvent bénéficier de thérapie ciblée et ont le plus mauvais pronostic, de plus la chimiothérapie a une efficacité limitée. Les dérèglements d'une voie de signalisation sont fréquents mais les thérapies ciblant cette voie sont peu efficaces et donc peu utilisées. Nous proposons de dériver des organoïdes à partir de tumeurs de patients déjà établies afin de mener des recherches in vitro. Dans une étude déjà publiée, il a été mis en évidence que certaines tumeurs triple négatives hébergent des mutations provoquant une perte de fonction dans un gène suppresseur de tumeurs . Cette découverte suggère que ce sous-ensemble de patients pourrait potentiellement bénéficier d'une thérapie ciblée sur cette voie.

Bénéfices attendus

Il existe plusieurs options thérapeutiques permettant d’inhiber l’activation aberrante d'une voie de signalisation et certaines sont déjà utilisées en clinique. Cela ouvre donc de nouvelles pistes pour le traitement des patientes atteintes d’un cancer ayant une mutation dans cette voie. La création et l’étude de ces modèles aideront à la compréhension du rôle de de la voie impliquée dans le cancer du sein triple-négatif et à l’identification de thérapie ciblant sa fonction aberrante.

Procédures

Implantation d'un petit morceau de tumeur de patiente, une fois par animal, sous anesthésie générale, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeurs de patients nécessite la réalisation de procédures qui peuvent entraîner des nuisances pour les souris. Implantation de la tumeur : La greffe, peut engendrer du stress et de une douleur légère et temporaire chez l'animal. La mesure de la croissance tumorale s'effectue deux fois par semaine, lors desquels nous examinons individuellement les souris (observation du comportement et mesure de la taille tumorale). Cette observation peut entraîner un stress lors de l'intervention, mais celui-ci diminue avec le temps à mesure que nous observons une habituation chez nos souris. Si la tumeur greffée en sous-cutanée devient trop volumineuse, elle peut limiter la mobilité de la souris, affectant ainsi son comportement et son bien-être général, ceci peut aboutir à une diminution de l'appétit pouvant aller jusqu'à une perte de poids modéré.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

L’objectif de ce projet étant la mise en place de modèles cellulaires permettant par la suite d’évaluer l’effet de nouvelles stratégies thérapeutiques, cela ne peut pas être remplacé par des modèles in vitro ou in silico. En effet, l'établissement d'une nouvelle lignée cellulaire tumorale à partir de cellules de cancer de patientes passe nécessairement, au moins dans un premier temps, par une amplification des cellules tumorales sur animaux réceptifs (immunodéficients). Ceci permet de conserver les interactions entre cellules, l’architecture tissulaire de la tumeur d'origine, et d'approcher au mieux microenvironnement de la tumeur. La complexité biologique des organismes vivants est extrêmement élevée, et les interactions entre différents systèmes biologiques peuvent être difficiles à reproduire en dehors d'un organisme vivant. Les modèles animaux peuvent fournir des informations cruciales sur la physiologie, la pathologie et les mécanismes de la maladie qui ne peuvent pas être obtenues par d'autres moyens. De plus, ils peuvent souvent mieux représenter les processus biologiques humains que les modèles cellulaires ou informatiques.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance de manière à en utiliser le moins possible tout en conservant une puissance statistique satisfaisante. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Les animaux seront surveillés quotidiennement et font l’objet d’une observation clinique individuelle afin d’évaluer leur état de santé. Cette observation permettra de vérifier si l’animal se nourrit et s’hydrate bien mais aussi permet de voir l’aspect général de l’animal, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. En cas de besoin, ils reçoivent une médication contre la douleur et une surveillance renforcée afin de vérifier sa bonne alimentation et hydratation. Les animaux bénéficient d’enrichissement environnemental dans les cages d’hébergement des animaux avec la mise place de jouets, de cachettes et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant occupés durant leur période de captivité. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant au suivi régulier de l’état de santé des animaux. Des points limites précoes ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris qui sont le meilleur modèle en oncologie préclnique. Des souches immunodéficientes existe dans cette espèce et peuvent être greffées avec des tumeurs humaines. Des souris âgées de 5 à 9 semaines, jeunes adultes, seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, 1 515 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, afin d'établir un modèle d'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, chez des souris au système immunitaire intact. Une partie subit une chirurgie abdominale ou lombaire pour une injection dans le foie ou la rate, ou la greffe d'un fragment tumoral dans le foie. Toutes subissent jusqu'à dix prélèvements sanguins, vingt échographies sous anesthésie et deux séances d'IRM qui imposent un transport vers un autre établissement, et des vecteurs viraux sont injectés à des souriceaux avant la naissance puis à deux, cinq et quinze jours de vie. Le porteur écrit que le développement des tumeurs hépatiques n'entraîne pas de nuisances en soi, parce que les souris seront tuées avant que ces tumeurs ne dégradent leur état général.

Objectifs

L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.

Procédures

Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).

Devenir

Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.

Remplacement

Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.

Raffinement

Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.

Toutes tuées pour analyse de leurs organes, 1 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie sous anesthésie générale leur implante des cellules tumorales dans le pancréas, suivie d'échographies hebdomadaires sous anesthésie, d'un à deux traitements par champ électrique pulsé par semaine et d'injections intratumorales ou intrapéritonéales répétées. Le porteur indique que la croissance des tumeurs pancréatiques peut entraîner une perte de poids et des signes de souffrance, et que la chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste. Les essais chez des patients atteints de cancer du pancréas restent une perspective, et le porteur écarte les cultures cellulaires en affirmant qu'elles ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral.

Objectifs

Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic à cause d’un environnement tumoral dense empêchant la chimiothérapie d’atteindre sa cible, et d’une résistance à l’action du système immunitaire. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie et aux autres traitements d’être plus efficace. L’objectif de l’étude est d’observer si l’utilisation d’une thérapie par champ électrique pulsé permet de modifier l'environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains, en rendant les cellules tumorales plus perméables à la chimiothérapie et plus sensible à l’action du système immunitaire et ainsi améliorer l’efficacité des traitements existants. Ce projet est multi-site, l'implantation de tumeurs dans le pancréas se faisant dans l'animalerie 1, les examens et la suite du projet sont réalisés dans l'animalerie 2.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider le traitement par champ électrique pulsé et réversible ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais thérapeutiques ultérieurs chez des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Intervention chirurgicale sous anesthésie générale (15 min maximum/souris) pour l’implantation des cellules tumorales. Alternativement, injection sous-cutanée de cellules tumorales (15 sec/souris). Suivi hebdomadaire de croissance tumorale par échographie sous anesthésie (8 min/souris). 1 à 2 traitements par champs électrique pulsé et réversible une fois par semaine (3 min/souris). Pour certains animaux, injection intrapéritonéale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine) ou injection intratumorale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine). Mesures de certains paramètres par injection intra-abdominale ou injection intraveineuse (20 min/souris, sous anesthésie générale), suite à une injection sous-cutanée d’antalgique 30 min avant (10 sec/souris).

Impact sur les animaux

La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer une perte de poids et des signes de souffrance. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales cause une douleur modérée et un stress. Le suivi de la croissance tumorale hebdomadaire sous anesthésie peut causer du stress chez la souris. Les traitements par champs électrique peuvent causer un stress chez les animaux et des douleurs modérées. Les injections sous-cutanées pour soulager la douleur ou intrapéritonéales et intratumorales pour le traitement peuvent causer une douleur légère chez la souris. Les injections intrapéritonéales pour la réalisation de mesures invasives peuvent causer des douleurs et un stress pour les animaux. Le transport entre les animaleries 1 et 2 peut provoquer un stress léger. La présence de l'électrode et connecteur peuvent causer un inconfort léger chez la spuris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, pour analyses ex vivo des organes.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer les réglages à utiliser pour les champs électriques pulsés et réversibles et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral permise par un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentielles et limitant le degré de souffrance des souris, les tumeurs étant détectées très tôt.

Raffinement

Le suivi de la douleur sera réalisé une fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort de l’animal si nécessaire. Un suivi est prévu toutes les semaines en post opératoire et après injection des traitements. L’échographie sera réalisée sous anesthésie générale, à celle-ci on ajoutera une analgésie adaptée lors de la chirurgie et des traitements et mesures. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages disposant d’enrichissement. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle permettant de mimer les tumeurs du pancréas humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge adulte (8 à 10 semaines) afin de documenter l’impact des traitements sur un organisme mature.

Pour vérifier qu'éliminer un type de lymphocyte rend une immunothérapie plus efficace, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. On leur ouvre l'abdomen sous anesthésie gazeuse pour implanter des cellules tumorales dans le foie ou le cæcum, puis elles reçoivent des injections dans le ventre trois fois par semaine pendant trois semaines et passent deux séances d'imagerie hebdomadaires. Celles dont la tumeur régresse complètement sont gardées deux mois de plus avant d'être tuées. Le porteur annonce une grille d'évaluation des points limites sans en donner les seuils, tout en décrivant le développement de grosses tumeurs et de métastases comme un effet indésirable possible.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des systèmes de blocage pour inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale (ex : anti-PD1). Des thérapies ciblant l’inactivation de PD1 ont été développées pour rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements. Notre projet a pour but de démontrer que la déplétion des cellules CD4 de la souris permet à cette thérapie anti-PD1 d’être efficace contre les tumeurs implantés dans leur organe d’origine. En effet, la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 a déjà été montrée efficace dans des tumeurs implantées en sous-cutanée dans la souris. Le microenvironnement jouant un rôle important dans la réponse anti-tumorale, nous nous proposons ici d’évaluer l’efficacité thérapeutique de la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 dans un modèle de cancer du côlon et dans un modèle de métastase hépatique d’origine colique.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses anti-tumorales grâce au blocage des points de contrôle a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré dû à la présence de résistances à ces thérapies. Ce projet permettra donc de montrer l’implication des lymphocytes T CD4 dans la résistance aux traitements anti-PD1 et ainsi de confirmer l’intérêt de trouver et de tester des molécules bloquant ces cellules chez l’Homme afin d’améliorer les thérapies anti-cancéreuses.

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 pour réaliser les traitements en intrapéritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le foie ou le caecum. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables. L’injection des traitements peut générer des désagréments au moment de l’injection. Les traitements seront injectés par voie péritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. Le groupe qui aura les deux traitements n’aura qu’une seule injection IP à chaque fois. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont rares : les immunothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. L’imagerie nécessitera une injection intrapéritonéale de l’agent d’imagerie, 2X par semaine pendant 3 semaines puis 1X par semaine pendant 2 mois. Les infections liées à la chirurgie sont un risque de fréquence rare vue les mesures mises en place (stérilité, antibiothérapie). Les anesthésies mises en place lors de la chirurgie et des imageries sont également une source de nuisance passagère.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant.

Réduction

Quatre groupes (Controle, les deux traitements seuls et la combinaison de traitement) de 5 souris seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance statistique pour permettre d’évaluer l’efficacité du traitement tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées à l’expérimentation animale et à la chirurgie afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 4 fois de manières indépendantes. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Avant la chirurgie, les souris recevront une antibiothérapie préventive et une analgésie. Les procédures d’imagerie et de chirurgie abdominale seront réalisées sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée en permanence et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge analgésique adaptée en pré-opératoire, de la lidocaïne en application locale sous forme de gel lors de la chirurgie et un analgésique sera injecté en sous-cutanée 2 fois par jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence. Les animaux seront transférés de l’EU1 à l’E2 (bâtiments situés proches l’un de l’autre) dans un sac de transport et le plus rapidement possible pour ne pas engendrer de stress.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée et dans l’organe d’origine de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Pour renforcer des lymphocytes T et NK contre la leucémie aiguë myéloblastique, 144 souris NSG immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de procédure pour l'étude du sang, de la rate et de la moelle osseuse. Chacune subit une irradiation corporelle totale sous anesthésie générale, deux à cinq injections intraveineuses de cellules leucémiques ou effectrices, sept injections de luciférine, sept séances de bioluminescence et sept prises de sang par voie rétro-orbitale. La xénogreffe de cellules souches humaines peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte atteignant la peau, le foie et l'intestin, et une leucémie très avancée peut provoquer des douleurs osseuses. Le porteur indique qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré, puisqu'il interférerait avec le système immunitaire étudié, et que si des morphiniques devenaient discutables, l'animal serait tué plutôt que soulagé.

Objectifs

Ce projet vise à développer de nouvelles approches pour renforcer l’efficacité des cellules immunitaires contre les cancers du sang, en particulier la leucémie aiguë myéloblastique. Cette maladie est agressive et présente un fort risque de rechute après une greffe de moelle osseuse. Nous explorons deux stratégies complémentaires : (1) Une modification génétique : Nous modifions les cellules immunitaires pour leur faire exprimer des récepteurs spécifiques leur permettant de reconnaître et d’attaquer plus efficacement les cellules cancéreuses. (2) Une approche biochimique innovante permettant fixer chimiquement des molécules à la surface de cellules immunitaires, afin d’améliorer leur capacité à repérer et détruire les tumeurs. Avant d’envisager une application clinique, il est indispensable de valider ces stratégies dans un modèle préclinique. In vitro, ces deux stratégies se sont déjà révélées hautement efficaces. L’expérimentation animale, en particulier sur des souris immunodéficientes, est essentielle pour évaluer leur efficacité et leur sécurité dans un organisme vivant. Cette étape permettra de mieux comprendre comment ces cellules modifiées interagissent avec leur environnement et d’identifier d’éventuels verrous empêchant nos stratégies de fonctionner in vivo.

Bénéfices attendus

Les approches développées dans ce projet pourraient améliorer les traitements des cancers du sang en rendant les cellules immunitaires plus efficaces et mieux ciblées. Les bénéfices attendus incluent : (1) Une meilleure efficacité des thérapies cellulaires : Grâce aux modifications génétiques et biochimiques, les cellules immunes seront capables de reconnaître et d’éliminer plus efficacement les cellules cancéreuses, réduisant ainsi le risque de rechute. (2) Des alternatives aux traitements actuels (3) Un impact potentiel au-delà des cancers du sang : Ces innovations pourraient être adaptées à d’autres types de cancers, comme les lymphomes B ou les tumeurs solides, en ciblant des récepteurs spécifiques. (4) Des avancées pour les greffes de moelle osseuse : En exploitant les différences génétiques entre donneur et receveur, il serait possible d’optimiser l’effet anti-leucémique. Si ces stratégies se révèlent efficaces et sûres, elles pourraient être testées dans des essais cliniques chez l’homme, avec pour objectif final d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients atteints de cancers hématologiques agressifs.

Procédures

Irradiation corporelle totale sous anesthésie générale : 1 fois ; Injection intraveineuse de cellules génétiquement modifiées, sous anesthésie générale (lignées leucémiques, effecteurs) : 2 à 5 injections selon les procédures ; Injection intrapéritonéale de luciférine : hebdomadaire, 7 fois ; Bioluminescence : hebdomadaire, non invasif, sous anesthésie générale, 7 fois ; prise de sang sous anesthésie générale + locale: hebdomadaire, 7 fois

Impact sur les animaux

La gravité attendue des diverses procédures est faible à modérée (irradiation, injection intraveineuse (IV) de cellules leucémiques / lymphomateuses / ou de cellules souches hématopoïétiques, injection IV des cellules effectrices, bioluminescence et prise de sang hebdomadaire sous anesthésie par voie retro-orbitale). Nuisances prévues : - le transport et l’irradiation sur site peuvent provoquer un stress modéré et transitoire - l’anesthésie gazeuse peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux - les injections intraveineuses (cellules) et intrapéritonéales (luciférine) peuvent provoquer un stress transitoire - l’enregistrement de la bioluminescence peut provoquer un stress - les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress et une douleur - le développement de cancer du sang (leucémie et lymphome) chez la souris peut entrainer, dans de rares cas de maladie très avancée, des douleurs osseuses - la xénogreffe de cellules souches hématopoïétiques humaines peut entrainer une réaction de type maladie du greffon contre l’hôte avec atteinte cutanée, hépatique et intestinale

Devenir

La totalité des animaux ayant reçu l’injection d’une lignée leucémique ou une xénogreffe de CSH seront euthanasiés en fin de procédure, pour étude tissulaire (sang total / rate / moelle osseuse).

Remplacement

Nos travaux de recherche s’inscrivent dans une dynamique de transfert des connaissances vers la clinique avec le développement de nouvelles immunothérapies basées sur les lymphocytes pour soigner des hémopathies. La validation de nos modèles nécessite d’être éprouvée dans un modèle animal. La souris NSG immuno-déprimée est un modèle adapté qui permettra de répondre sur le gain en efficacité anti-tumorale de ces immunothérapies. Nous avons déjà validé l’efficacité de ces immunothérapies contre de nombreuses lignées leucémiques et des bastes primaires in vitro. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de leur efficacité une fois injectées dans un organisme.

Réduction

Dans le cadre de notre engagement éthique à réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins expérimentales, la détermination a priori de l'effectif des lots n'est pas réalisable compte tenu du caractère novateur et exploratoire de notre étude pilote. L'effectif des groupes sera déterminé de manière à maintenir une puissance statistique suffisante tout en minimisant strictement le nombre d'animaux utilisés. Des analyses statistiques seront effectuées a posteriori, en privilégiant des méthodes adaptées aux très petits échantillons.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Par ailleurs, chez l’humain, le développement d’une leucémie aiguë n’est généralement pas source de douleur, sauf en cas de maladie très avancée où des douleurs osseuses peuvent apparaitre. La xénogreffe de cellules souches hématopoïétiques humaines peut se compliquer de maladie du greffon contre l’hôte, avec une atteinte possible cutanée, digestive ou hépatique. Enfin, la transplantation de cellules NK humaines ne se complique pas de maladie du greffon contre l’hôte. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. L’échelle de points limite utilisée sera une échelle habituellement utilisée dans les modèles de xénogreffes. En cas d’atteinte d’un signe clinique sévère, ou de deux signes cliniques notables, l’animal sera euthanasié. L’administration d’anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce protocole car ce traitement interagirait avec le système immunitaire des souris, qui est l’objet de la présente étude. Si l’administration d’antalgiques morphiniques était amenée à être discutée (douleur forte sur leucémie aiguë avancée sans possibilité d’amélioration, signifiant l’échec du traitement), l’animal serait euthanasié.

Choix des espèces

L’objectif étant de cibler un antigène humain, l’utilisation de souris immuno-déficientes permettant l’implantation de cellules tumorales humaines est essentielle. Nous avons donc choisi de travailler sur des souris NSG. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines. Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes afin de se placer au plus près des conditions du développement tumoral chez l’humain.