Cancers

Huit injections d'anticorps en quatre semaines sur animal vigile, après une greffe de cellules de mélanome sous la peau : 352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour collecter les tissus. La tumeur qui pousse sous la peau peut s'ulcérer, et les injections répétées dans l'abdomen provoquer douleur ou ulcération au point de piqûre. L'objectif est de vérifier chez des souris au système immunitaire intact un anticorps déjà testé chez des souris dépourvues d'immunité, où il n'inhibait que partiellement la tumeur. Le porteur indique que cet anticorps a passé les tests de toxicité et est entré en essai clinique chez l'être humain pour d'autres pathologies.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du mélanome. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du mélanome dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer de la peau. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer de la peau de type mélanome est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses de mélanomes. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8-10 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

3 850 souris privées de système immunitaire complet vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées puis disséquées. Chacune reçoit sous la peau un fragment de tumeur prélevé sur un patient métastatique, quelques-unes une injection de cellules tumorales dans le cœur, et celles qui reçoivent un traitement subissent un prélèvement de sang hebdomadaire à la mandibule qui laisse des hématomes plusieurs jours. Le porteur retient des souris dépourvues de poils parce que la tumeur se suit mieux sous la peau et que les poils rayent les lames des microtomes, et prévoit 670 animaux par an rien que pour entretenir les lignées de xénogreffes. Il écrit qu'il n'est pas possible de se passer de ces greffes pour proposer des traitements personnalisés aux patients, tout en notant que ces souris sont plus exposées aux infections opportunistes.

Objectifs

Depuis ces dernières années, l’incidence des cancers augmente de par le monde. Avec l’avancé des traitements, la survie des patients s’est améliorée. Toutefois, la maladie métastatique reste un problème majeur et implique une morbidité et une mortalité importante. Dans le cancer, la maladie métastatique est un problème majeur et une cause importante de décès. Si les chiffres sont difficiles à obtenir, une étude estime que 66.7 pourcent des décès par cancers sont dues à des métastases. Leur traitement est rendu d’autant plus difficile que ces métastases ont tendance à résister aux traitements conventionnels. C'est pourquoi nous cherchons à identifier des biomarqueurs de résistance ou de toxicité aux anti-cancéreux, dans l’optique du développement de nouveaux traitements personnalisés.

Bénéfices attendus

La première partie du projet doit permettre de maintenir et de mettre en place de nouveaux modèles de xénogreffes de tumeurs humaines issues de prélèvements métastatiques de patients. Le recrutement des prélèvements métastatiques greffés est fonction de l'incidence des métastases dans chaque type de cancer. Pour le cancer du sein, qui est aujourd’hui le cancer le plus diagnostiqué et la 5eme cause de décès par cancer dans le monde, la maladie métastatique est responsable de la majorité des décès avec, pour ces cas, une médiane de survie à 5 ans de 30 pourcent. Outre les cancers du sein, les autres types de cancers très pourvoyeurs de métastases sont les cancers de la prostate, du pancréas, du poumon, du rein, le cancer colorectal et le mélanome. Le cancer du poumon, du rein et le mélanome métastatiques ont un pronostique particulièrement sombre avec une survie à 5 ans inférieure à 10 pourcent. Ces modèles de xénogreffe consistent à greffer un fragment tumoral humain sous la peau de la souris et constituent des modèles uniques et particulièrement pertinents pour l'étude de la pathologie humaine. Une fois établis, ces modèles doivent permettre de mieux comprendre les mécanismes de développement des tumeurs humaines, ainsi que permettre de proposer des traitements personnalisés aux patients. La seconde partie; qui consiste à traiter les souris xénogreffées avec des thérapeutiques déjà utilisées dans le cadre du soin, ou de nouveaux composés innovent; doit permettre de proposer des nouvelles alternatives au traitement de ces pathologie, comprendre les mécanismes d'échappement des tumeurs et, dans le cas de nouveaux composés, évaluer leur potentiel thérapeutiques en vue d'essais cliniques. L'objectif étant d'améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux utilisés sont immundéficients. Leur système immunitaire n'est pas complet ce qui limite les risques de rejets de la greffe. Tous les animaux de ce projet seront greffés avec des tumeurs humaines. La plupart recevront un fragment sous-cutané. A de rares exceptions, certains animaux pourront recevoir une injection sanguine de cellules tumorales. Dans les 2 cas, le geste s'effectue sur animal anesthésié et la durée de l'acte ne dépasse pas les 5 minutes. Les greffes sous cutanées se feront sous analgésie générale. Les injections sanguines de cellules tumorales se feront sous analgésie locale. Une partie des animaux xénogreffés sera traité afin d'évaluer l'efficacité des traitements sur la progression des tumeurs. Dans ce cas, les modalités de traitement varient. Les modalités retenues étant le gavage, l'injection intra-péritonéale et l'injection intraveineuse. Le choix des voies d'injection et des posologies étant soumis à la molécule thérapeutique employée. Les animaux en traitement seront également soumis à un prélèvement de sang hebdomadaire effectué à la mandibule. Le traitement et le prélèvement d'un animal s'effectue sur animal vigile et ne dure pas plus d'une minute.

Impact sur les animaux

La xénogreffes d'une tumeur humaine ; dans la mesure où il s'agit d'insérer un petit fragment tissulaire en sous-cutané ; est un acte peu invasif et peu douloureux. Les injections sanguines présentent un risque hémoragique au moment de l'injection. La croissance des xénogreffes sous cutanées occasionnera une gêne pour l'animal si elle est trop volumineuse. En sous cutanée, les greffes sont peu métastatiques et nous n'avons pas constaté que cela entrainait une diminution du bien-être animal. Les cellules tumorales injectées dans le sang auront une dissémination systémique entrainant la formation de tumeurs dont nous suivrons l'évolution par l'évaluation des signes cliniques de l'animal. Enfin, les traitements qui seront réalisés n'entraineront pas d'effets indésirables majeurs dans la mesure où les doses, les voies et les fréquences d'administration seront établies à partir de la pratique clinique. Les nuisances sont liées à la contention, l'insertion de la canule de gavage et la piqure à l'aiguille. Les prélèvements de sang à la mandibule occasionnent des hématomes localisés pendants quelques jours. Les souris sont immunodéficientes car athymiques, mais nous n'avons pas constaté d'impact de ce caractère sur leur qualité de vie. L'immunodéficience des animaux utilisés peut leur conférer une sensibilité aux infections opportunistes plus grandes.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation. La survenue de l'euthanasie est soumise à l'atteinte des points limites fixés. La dissection complète des animaux est systématique après l'euthanasie. Les prélèvements effectués permettent d'effectuer des analyses histologiques et moléculaires. Le recueil systématique des échantillons participe au raffinement des modèles.

Remplacement

L’objectif de notre projet est de pouvoir étudier les mécanismes de résistance aux traitements de tumeurs métastatiques de patients. Des cultures de cellules peuvent être réalisées dans certains cas mais avec des résultats très variables. Par ailleurs, la culture cellulaire sélectionne un type cellulaire, et on perd donc la richesse et l’organisation structurelle de la tumeur telle qu’elle existe chez le patient. Ceci constitue un biais analytique important car on sait qu'une tumeur est constituée d'une variété de cellules tumorales, plus ou moins sensibles aux agents thérapeutiques. Les cellules et les structures qui entourent les tumeurs jouent également un rôle dans les mécanismes de résistance. C’est pourquoi il n’est actuellement pas possible de nous passer de ces modèles de xénogreffes pour la prise en charge personnalisée des patients et la mise au point de nouveaux agents thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour maintien des lignées de xénogreffes a été évalué en fonction de notre expertise de plusieurs années dans le domaine. Pour chaque tumeur, 4 souris sont greffées pour limiter le risque d’échec de prise de greffe. Ce risque varie en fonction de l’agressivité tumorale. Nous utilisons en moyenne 670 souris pour entretenir ces xénogreffes par an. Pour 5 ans, 3350 animaux seront donc nécessaires. Pour les traitements, 10 animaux par groupes est un nombre minimum pour avoir une puissance statistique suffisante. Nous testons une dizaine d’agents ou de combinaisons d’agents thérapeutiques par an, soit 100 animaux traités par an (soit 500 pour 5 ans). Pour 5 ans, 3850 animaux seront nécessaires.

Raffinement

Pour les xénogreffes réalisées en sous-cutanée, les animaux sont anesthésiés. La technique chirurgicale de greffe est peu douloureuse mais une analgésie générale est donnée au préalable. Pour les xénogreffes de cellules tumorales en intracardiaque, les animaux sont anesthésiés durant toute la procédure. La posologie des traitements administrés aux animaux est adaptée des traitements faits chez l’homme. Les doses administrées sont donc bien en dessous des doses létales et la toxicité des molécules se rapproche des effets observés chez l’homme. Les traitements sont administrés par gavage, intraveineuse ou intrapéritonéale. Afin de limiter les nuisances subies par les animaux tout au long du projet, des points limites suffisamment précoces ont été établis. Un suivi quotidien des animaux est opéré par du personnel qualifié. Les animaux sont élevés en groupe sociaux (4-5 par cage) avec enrichissement. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel de l'animalerie et les membres de l'équipe de recherche. Les souris utilisées sont immunodéficientes mais nous n'avons pas constaté d'impact de ce caractère sur leur qualité de vie. Néanmoins, conformément aux recommandations du fournisseur, les animaux seront hébergés en cages à couvercles filtrant. Le change sera effectué sous atmosphère contrôlée et propre. Enfin, la stérilisation des consommables (litière, enrichissement, eau et nourriture) et des équipements (cages, portoirs, bouteilles, etc.) limitera le risque d'infection chez ces animaux.

Choix des espèces

Ce projet utilise des souris immunodéficientes adultes, de 6 semaines. Le caractère d'immunodéficience limite le risque de rejet de la greffe des cellules humaines Par ailleurs, le choix d’animaux dépourvus de poils nous permet de suivre plus facilement le développement sous cutané de la tumeur. L’évaluation de la taille tumorale est facilitée. L’absence de pilosité est un critère important pour les analyses histologiques. En effet, les poils ont tendance à rayer les rasoirs de microtomes. Les souris xénogreffées sont choisies jeunes adultes afin de maximiser les chances de prise de greffe. En effet, les cellules de la graisse brune situées entre les omoplates constituent un terreau nutritif pour les tumeurs xénogreffées, favorisant leur développement. Cette graisse brune disparait avec l’âge.

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

Une dizaine de séances d'imagerie sous anesthésie et une injection quotidienne dans le péritoine ou par gavage attendent chaque animal, sur quarante jours de traitement. 3 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever la tumeur, le foie, la rate et les poumons. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau puis dans le sang pour former des métastases pulmonaires, le porteur listant parmi les effets attendus l'irritation et l'infection des points d'injection, l'absence de toilettage, et pour le gavage la suffocation, le saignement et une salivation excessive. L'effectif s'appuie sur des groupes de douze animaux, sans que le RNT indique combien de groupes ni combien de molécules aboutissent à 3 264 souris.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de traitements anticancéreux sur différents cancers solides et l'apparition des méstatases (mélanome, cancers gastriques, pancréas et côlon) en utilisant des petites molécules dérivées d'antidiabétiques, seules ou en combinaison avec les thérapies actuelles qui stimule le système immunitaire. Nous allons étudier la potentialité de ces molécules à induire une mort immunogénique (=les cellules cancéreuses sécrétent des facteurs qui permettent l'activation du système immunitaire qui va les éliminer). Ceci permettra de proposer de nouvelles solutions aux patients en échec thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ces dernières années des résultats encourageants ont été obtenus un inhibiteur d'une protéine majoritairement altérée dans les mélanomes. Cependant, ces réponses restent transitoires. De nouvelles thérapies, qui réactivent la réponse immunitaire chez les patients, ont aussi été développées. Mais, seul 10 à 30% des patients répondent positivement. Il est donc important de développer de nouvelles molécules pour la mise en place de thérapies ciblées et de combiner ces nouvelles molécules avec les thérapies qui stimulent le système immunitaire, déjà utilisées chez les patients afin de voir si nos dérivés sont capables de potentialiser leurs effets. Grâce à cette étude, nous allons voir les effets de nos composés d’une part sur les tumeurs primitives (mélanome, cancer du pancréas, côlon et gastrique) et d’autre part sur les métastases pulmonaires. Et la mise en place d’une immunité anti tumorale permettra de proposer un nouveau moyen d’éliminer les cellules cancéreuses.

Procédures

Les animaux subiront : - 1 injection sous cutanée de cellules tumorales (5 secondes) - 1 injection/ jour dans le péritoine avec nos molécules ou 1 traitement oral/ jour avec nos molécules (5 secondes) pendant la durée du traitement. - 1 injection en intra veineuse de cellules tumorales (10 secondes) - 1 injection/ jour dans le péritoine avec nos molécules ou 1 traitement oral/ jour avec nos molécules (5 secondes) pendant la durée du traitement L’imagerie des animaux se fera le jour de l’injection des cellules, le lendemain puis tous les 4 jours pendant la durée du traitement. Les souris seront endormies (par inhalation) pendant environ 15 min et subiront une injection dans le péritoine (5 secondes) pour chaque imagerie. Les animaux subiront environ 10 imageries (pour un traitement de 40 jours) - 2 injections en sous cutané des cellules tumorales (5 secondes/ injection) 7 ou 8 injections dans le péritoine (5 secondes/ injection) Aucun prélèvement ne sera effectué sur les souris vigiles.

Impact sur les animaux

Lors des injections des cellules tumorales en sous-cutané, il peut y avoir un risque d’irritation et de gonflement aux zones d’injection. Pour les traitements en injection dans le péritoine, il peut y avoir un risque d’irritation, gonflement, infection aux zones d’injection et absence de toilettage. Pour les traitements oraux, les risques sont la suffocation, saignement et salivation excessive. Pour l’étude des métastases, lors de l’injection intra-veineuse, il peut y avoir gonflement, irritation et infection à la zone d’injection, et absence de toilettage. Lors de l’anesthésie gazeuse pour imager les souris, il peut y avoir hypothermie et prostration au réveil.

Devenir

A la fin de chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort. Nous prélèverons la tumeur et les organes (foie, rate, poumons) afin de réaliser les études qui nous apporterons le plus de renseignements possibles sur le fonctionnement de nos nouvelles molécules thérapeutiques.

Remplacement

Nous avons tout d’abord caractérisé et testé nos composés in vitro et sélectionné les plus efficaces sur les cellules tumorales et l’innocuité sur les cellules normales. Il est maintenant nécessaire de passer chez le rongeur afin d’avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer lesquels de ces traitements sont les plus efficaces avec les modèles cancéreux utilisés (mélanome, cancer du côlon, gastrique et pancréas) sur les tumeurs primaires, les métastases et la mise en place d’une immunité antitumorale. Le passage chez l’animal est crucial avant le développement potentiel de ces molécules chez l’homme, ce qui permettrait une alternative à l’échec thérapeutique des traitements actuels.

Réduction

Avant le début de l’étude, il est important de faire des statistiques prédictives. Il s’agit de trouver le nombre d’animaux minimum à utiliser pour avoir des résultats significatifs. Pour notre étude, des groupes de 12 animaux seront adaptés à ces exigences.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo, tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid). Elles seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris par cage. Le suivi quotidien qui est réalisé permet de prévenir toute souffrance ou mal être. L’intervention se fait immédiatement. De plus, lors ce suivi, nous mesurons les tumeurs ainsi que le poids des souris, 3 fois / semaine. Pour la procédure qui nécessite une anesthésie gazeuse : les animaux seront mis sur un tapis chauffant le temps de leur réveil, afin d’éviter l’hypothermie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l'homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi, ainsi qu'une faible taille, ce qui permet d'avoir des conditions d'hébergement plus faciles. Par ailleurs la souris est un modèle reconnu et déjà validé pour l'étude du développement tumoral et de la mise en place d'une immunité antitumorale. Dans notre étude, les souris sont utilisées à 6 semaines. Elles sont commandées à 5 semaines et acclimatées pendant 1 semaine dans notre animalerie. La croissance tumorale est optimale chez les souris de cet âge et ceci est cohérent avec les expériences déjà effectuées au laboratoire ainsi qu’avec les données de la littérature.

Les souris de ce projet subissent une biopsie du bout de la queue pour le génotypage, jusqu'à cinq ponctions de sang dans la joue sur animal vigile et, pour une partie d'entre elles, une injection de cellules leucémiques dans la veine caudale. 8 570 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles qui développent la leucémie montrant fatigue et perte de poids quand les cellules cancéreuses dépassent 80 % des cellules du sang. Le porteur écrit qu'une partie des souris issues des croisements sera replacée dans l'élevage pour réduire le nombre d'animaux utilisés, et écrit aussi que tout animal inclus dans l'étude sera mis à mort. Les souris immunodéprimées, précise-t-il, "ne pourraient être remises en liberté" à l'issue du projet.

Objectifs

Les leucémies aiguës sont des cancers du sang très agressifs qui affectent principalement les enfants et les jeunes adultes. Ces cancers ont souvent un mauvais pronostic. Une des causes fréquentes de cette maladie est l'expression anormale d'une protéine spécifique, trouvée dans 25 à 50 % des cas. Cette protéine collabore avec une autre pour contrôler de nombreux gènes, mais son rôle exact dans la leucémie reste inconnu. Pour mieux comprendre la maladie et trouver de nouveaux traitements, des souris portant une combinaison de ces deux facteurs seront générées. De plus, le rôle d'un élément régulateur sera recherché grâce au croisement avec un autre modèle de souris transgénique. Dans ces deux modèles l'apparition de la leucémie sera suivie, les cellules et processus impliqués seront recherchés. Enfin, dans un troisième modèle, nous injecterons des cellules contrôles ou leucémiques chez des souris immunodéficientes pour étudier les mécanismes d'émergence de la leucémie.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de recréer chez la souris un type de leucémie très fréquent chez les patients. Il nous aidera à mieux comprendre les mécanismes biologiques à l'origine de cette leucémie spécifique et à voir comment les changements moléculaires se développent dans cette maladie. En comprenant mieux ces processus, nous pourrons identifier les partenaires de la protéine clé impliquée et proposer des traitements ciblés pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients.

Procédures

- Prélèvement caudal pour génotypage dans les dix jours suivant la naissance des animaux transgéniques : biopsie de la pointe extrême de la queue, 1 fois par animal, dure 2 à 3 secondes. - Prélèvements sanguins dans la veine de la joue sur souris vigile, uniquement pour une partie des animaux, de façon mensuel, hebdomadaire ou bi-hebdomadaire; maximum 5 fois/animaux; prélèvement dure moins d'une minute. - Injection de cellules dans la veine de la queue d'une partie des animaux, 1 fois/animal. L'injection dure entre 30 secondes et 1 minute.

Impact sur les animaux

La biopsie caudale et l'injection de cellules dans la veine caudale peuvent entraîner un léger saignement et une douleur légère. Les animaux au phénotype dommageable peuvent développer des signes cliniques dus à la progression de la leucémie lorsque les cellules cancéreuses représentent plus de 80% des cellules sanguines, principalement fatigue et perte de poids. Les prélèvements sanguins induisent une douleur de courte durée. La contention afin de réaliser les prélèvements sanguins et injections caudales de cellules peut entrainer un stress momentané chez les animaux. Les souris immunodéficientes présentent des altérations génétiques les rendant particulièrement vulnérables aux infections microbiennes.

Devenir

Afin de récupérer les cellules leucémiques toute souris transgénique ou ayant été injectée avec des cellules leucémiques sera mise à mort. Par ailleurs, les souris présentant une immunodepression ne pourraient être remises en liberté à l'issue du projet. Par conséquent, tout animal inclu dans cette étude sera mis à mort l'issue de cette dernière.

Remplacement

Les cellules utilisées en laboratoire pour étudier les leucémies sont différentes de celles trouvées dans le corps humain. Reproduire exactement la manière dont la leucémie se développe en laboratoire est difficile. De plus, il est compliqué d'obtenir suffisamment de cellules leucémiques directement des patients pour les études. Elles sont fragiles et ne peuvent pas survivre très longtemps en dehors du corps. Notre projet vise à comprendre comment la leucémie progresse dans différents organes comme le thymus ou la rate. Puisque nous ne pouvons pas obtenir ces échantillons directement des patients, nous utilisons des souris génétiquement modifiées pour simuler la maladie. C'est la meilleure façon de comprendre les leucémies avant de tester des traitements chez les humains.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux nécessaires au projet a été fait en tenant compte des statistiques de transmission de chacun des transgènes. Une partie des animaux issus des croisements n'auront pas le génotype souhaité et seront utilisés comme contrôle ou replacés dans l'élevage dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les effectifs ont été determinés afin d'être analysés avec des tests statistiques adaptés et permettre d'obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis et seront attentivement suivis. Pour prendre soin des souris, elles auront du coton, des bâtonnets de bois et des tunnels rouges pour jouer et construire des nids. Elles vivront en petits groupes pour éviter les disputes et le stress. Quand nous ferons des biopsies pour vérifier leurs gènes, nous désinfecterons leur queue pour éviter les infections et surveillerons la guérison. Les injections seront faites sous anesthésie locale avec des aiguilles très fines pour limiter la douleur. Les souris ayant un risque de développer une maladie seront suivies par ponction sanguine jugale afin d'anticiper et de prévenir l'apparition du phénotype dommageable induit par la leucémie. Si une souris perd trop de poids, nous lui donnerons de la nourriture spéciale. Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et au moins une fois par semaine par les responsables du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix validé scientifiquement par la littérature pour étudier la leucémie. Nous ne pouvons pas utiliser d’autres espèces animales pour mimer la leucémie. Des souris adultes seront utilisées dans ce projet.

Deux séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse de trente minutes par semaine pendant trois semaines, une injection hebdomadaire dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, neuf pesées et neuf mesures de tumeur au pied à coulisse : 248 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les tumeurs. Des cellules cancéreuses humaines leur sont greffées sous la peau du flanc gauche. Le projet met au point cinq modèles de cancer rendus luminescents, pour des études d'efficacité qui viendront ensuite. Le porteur explique avoir besoin d'animaux au système immunitaire fortement déprimé pour éviter le rejet des cellules humaines, et retient des souris de cinq à six semaines pour favoriser la prise tumorale.

Objectifs

La dissémination métastatique est une cause majeure de mortalité chez les sujets atteints de cancer. C’est un processus séquentiel dont les principales étapes comprennent le détachement de cellules cancéreuses de la tumeur primaire et l’invasion du tissu de l’hôte, leur pénétration et leur transport dans la circulation, puis leur adhérence à la paroi vasculaire de l’organe cible, leur extravasation et leur prolifération. Un cancer disséminé est le plus souvent résistant aux thérapies anti-cancéreuses actuellement disponibles car le processus métastatique est détecté tardivement et le microenvironnement des métastases renforce la résistance aux médicaments. Afin d’établir de nouveaux traitements efficaces chez les patients atteints de ces cancers,il est nécessaire de disposer de modèles animaux permettant de localiser précocement les métastases afin de pouvoir par la suite évaluer l’efficacité in vivo des différents traitements anti-cancéreux. L’imagerie du petit animal, désormais reconnue internationalement comme stratégique pour l’innovation comme pour le développement pharmaceutique, est une technologie en pleine expansion. Elle présente de nombreux intérêts, comme la détection précoce des tumeurs et des foyers métastatiques dans l’ensemble de l’animal, évitant le biais des mesures au pied à coulisse où il faut attendre que la tumeur fasse une certaine taille et qui ne permet pas le suivi des métastases.L’imagerie par bioluminescence est une approche basée sur la détection de lumière visible émise par des cellules ou des tissus exprimant la luciférase et peut être utilisée dans des études de croissance tumorale et d’études de la dissémination de métastases. Ce projet vise à développer et évaluer en suivi par imagerie par bioluminescence 5 modèles tumoraux d’indications différentes, métastatiques ou non, modifiés génétiquement afin d’exprimer le gène de la Luciférase puis injectés en sous-cutané dans des souris immunodéprimées. Les données issues de ce travail préliminaire offriront une plus grande précision sur leur localisation, la mesure uniquement des cellules tumorales vivantes (et non du tissu conjonctif) et l’identification des zones de nécrose au sein de la tumeur, procurant des informations précieuses sur la dynamique de progression de la tumeur,l'efficacité des nouveaux traitements thérapeutiques et une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’œuvre dans chaque type tumoral

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de stratégie de développement préclinique. Ce projet permettra par la suite que de nombreux traitements soient testés en clinique.

Procédures

Une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 1 injection intraveineuse à raison d’une par semaine dans la veine de la queue, 30 secondes ou 1 injection intrapéritonéale à raison d’une par semaine, 30 secondes ou 1 injection intrapéritonéale unique, 30 secondes. Au maximum 9 pesées et 9 mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de 3 par semaine. Une anesthésie gazeuse d'une durée de 30min pour les séances d'imagerie à raison de 2 par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). L’injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de la tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Les injections en intrapéritonéal et en intra-veineuse hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les traitements de référence sont très bien connus dans notre laboratoire et aucun des traitements n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris aux doses choisies. Les anesthésies liées à l'imagerie peuvent éventuellement entrainer une hypoventilation,une hypotension ou une baisse de température.

Devenir

L'ensemble des animaux des procédures 1 et 2 seront mis à mort afin de prélever les tumeurs pour analyses.

Remplacement

Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis de confirmer la bonne croissance des cellules et l’expression suffisante du gène permettant la bioluminescence des cellules tumorales, mais nous avons à présent besoin de tester notre suivi en imagerie sur un animal vivant et entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion de la luciférine dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessite de travailler sur un organisme entier et vivant. Pour cette raison nous devons effectuer ces études chez la souris.

Réduction

L’effectif des groupes a été déterminé de la façon suivante : il s'agit d'une étude préliminaire afin de déterminer la faisabilité et la pertinence du suivi ainsi que le nombre d’animaux minimum nécessaire à la réalisation de tests statistiques dans le cadre de nos futures études d’imagerie par bioluminescence. Nous estimons d’après notre connaissance des modèles et la littérature que nous aurons besoin de 8 souris par groupe pour la première procédure, et de 12 animaux par groupe pour la 2e procédure afin de pouvoir comparer l’efficacité du traitement de référence au groupe non traité et ainsi montrer que cette méthode est fiable pour un suivi d’efficacité. Nous utiliserons une analyse statistique afin de déterminer si une différence entre les deux groupes traité et non traité existe. Nous aurons donc besoin selon nos estimations de 248 animaux au total.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation de 7 jours et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en pratiquant la contention une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs ont été formés à l’utilisation de l’imager et possèdent l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi des modèles utilisés ainsi que pour l’administration de traitements en intraveineuse et intrapéritonéale. Par ailleurs, l'état des animaux sera évalué par une grille de scoring sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos voûté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les critères observables sont évalués quotidiennement, les critères mesurables (poids, taille des tumeurs) sont évalués trois fois par semaine. Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Si jugé nécessaire, un traitement antalgique ou anti-inflammatoire sera immédiatement mis en place . Il sera mis à la disposition des souris des cotons pour faire leur nid et des tunnels.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler sur des tumeurs issues de cellules humaines afin d’être au plus près de la réalité clinique, nous avons donc besoin d’animaux présentant un système immunitaire fortement déprimé afin d’éviter le phénomène de rejet. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif, la souche que nous utiliserons est un modèle qui permet une prise tumorale efficace avec de nombreuses lignées humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale. Nous priviligierons des souris femelles, mais dans un souci de comparaison de prise tumorale, nous souhaitons inclure, pour 3 lignées de tumeurs non spécifiques des femelles, et des mâles, ainsi nous pourrons complétement exclure ce sexe si pas de résultats comparables avec celui des femelles.

Tester des candidats médicaments anticancéreux avant leur passage en clinique: 7 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales de cancer du sein leur sont injectées dans le coussinet adipeux mammaire, par inoculation ou par chirurgie, puis la tumeur est suivie une fois par semaine en imagerie sous anesthésie après injection d'une sonde bioluminescente, les composés à tester étant administrés une à deux fois par jour pendant toute l'étude. Le porteur précise que la formation du personnel aux gestes techniques se fera sur des souris mortes issues d'autres projets. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne récapitule la complexité de la progression tumorale dans l'organe et conclut que cette complexité rend "nécessaire" le recours aux études in vivo.

Objectifs

Les cancers du sein font partie des maladies les plus complexes à traiter. Notre projet propose de trouver de nouvelles thérapies anticancéreuses et permettra de comprendre pourquoi on observe un échappement de la maladie lors de traitements à base d’anticorps ou de molécules pharmaceutiques mais également de proposer des stratégies pour rendre ces thérapies plus efficaces.

Bénéfices attendus

L’inoculation de cellules directement dans l’organe permet dans un premier temps de limiter la diffusion de cellules cancéreuses dans d’autres organes et de pouvoir cibler l’organe d’intérêt avec nos traitements ; L’évaluation de l’efficacité des composés sur le développement de la tumeur dans l’organe nous permettra d’orienter le traitement en clinique vers les tissus cancéreux les plus sensibles à notre composé.

Procédures

1) Injection de cellules tumorales dans l’organe d’intérêt avec acte chirurgical ou par inoculation, sous anesthésie une seule fois dans l'étude, 2) L'imagerie de la tumeur une fois par semaine se fera sous anesthésie pendant 5 min après une injection de sonde bioluminescente (100µl en sous cutanée), 3) 1 à 3 prélèvements sur 24h pourront être réalisés une fois dans l’étude avec un volume total ne dépassant pas 15% du volume sanguin de l’animal 4) Administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d'une minute par animal, une à deux fois par jour pendant la durée de l’étude.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez la souris sont dans un premier temps lié à l’injection sous analgésique dans le coussinet adipeux mammaire ou suite à la chirurgie (suivant la méthode utilisée) et donc de la cicatrisation qui en découle. Ensuite, on peut observer les effets issus directement du développement d’une tumeur au sein de son organe cible qui peut s’accompagner d’une perte de poids. On pourrait également observer les effets des composés médicaments administrés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la progression d’une tumeur dans l’organe. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'études in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments. Afin de réduire au maximum le nombre d’étude et donc le nombre d’animaux utilisés, les différentes stratégies antitumorales seront préalablement testées in vitro.

Réduction

Pour respecter le principe des 3R, nous veillerons à ce que toutes les expériences qui pourront être réalisées in vitro le soient et que ne soient testés, in vivo, que les meilleures molécules ou anticorps obtenus in vitro. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective après 5 études permettra le cas échéant de réduire le nombre d’animaux. L’utilisation de l’imagerie bioluminescente et de cellules tumorales exprimant la luciférase permettront un suivi longitudinal des animaux et donc diminuera le nombre d’animaux utilisés dans les études. Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de limiter le nombre d’animaux, la formation et la qualification du personnel réalisant ces procédures sera effectuée sur des souris mortes issues d’autres projets.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation de 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu et relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations. Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront sous surveillance quotidienne. Les animaux immunodéficient présentant un phénotype dommageable seront hébergé en portoir ventilé et manipulé sur PSM afin de limité au maximum les risques d’infection. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d'étude. La bonne connaissance des études permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique. Pour cela, un programme d’anesthésie gazeuse (isoflurane) et d'analgésie (buprénorphine) ainsi qu'une grille de score, l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel et de critère d'arrêt de souffrance sont mis en place.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour ce type de modèle et donc le plus décrit. Son utilisation permettra de bénéficier de toute la littérature scientifique déjà parue sur ce modèle utilisant cette espèce. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.

Toutes les souris de ce projet sont immunodéprimées, pour que leur organisme ne rejette pas les cellules de mélanome humain qui leur sont injectées. 144 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'injection se fait dans l'oreille sous anesthésie, puis un groupe reçoit chaque jour une application du composé étudié, également sous anesthésie, et la progression des métastases est suivie par bioluminescence après injection de luciférine, jusqu'à dix minutes d'anesthésie par séance. Un dernier groupe reçoit l'injection sans anesthésie, et toutes sont tuées pour prélever les organes et comparer la position des lysosomes dans les cellules les plus invasives.

Objectifs

La progression du cancer et la formation de métastases repose sur la capacité des cellules tumorales à envahir de nouveaux tissus. Ceci implique la dégradation de la matrice extracellulaire par l'intermédiaire d'enzymes dont un certain nombre provient d'un compartiment dégradatif, le lysosome. Notre équipe a découvert que les cellules issues des mélanomes les plus agressifs possèdent des lysosomes plus périphériques et fusionnant plus fréquement avec la membrane plasmique. Ceci s'accomagne d'une plus grande dégradation de la matrice et de propriétés invasives plus développées in vitro. Nous souhaitons désormais déterminer si il en est de même in vivo chez la souris. Ce projet vise donc à comparer les capacités d'invasion et de métastases des plusieurs lignées cellulaires humaines qui présentent différentes localisations de leurs lysosomes (naturellement ou contrôlés artificiellement).

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux contrôlant la formation des métastases. Amelioration du diagnostique du mélanome et à plus long terme des thérapies visant à limiter la dissemination métastatique.

Procédures

Un groupe subira une injection de cellules tumorales dans l'oreille (sous anésthésie, dureé 3 minutes), puis une injection de luciférine suivi d'une anésthésie pour permettre l'imagerie par bioluminescence (durée 10 minutes). Un groupe subira une injection de cellules tumorales (sous anésthésie, dureé 3 minutes), puis une injection de luciférine suivi d'une anésthésie pour permettre l'imagerie par bioluminescence (durée 10 minutes). Un groupe subira une injection de cellules tumorales dans l'oreille (sous anésthésie, dureé 3 minutes), puis une application quotidienne de du composé etudié sur l'oreille accompagnée d'une anésthésie (durée 5 minutes). Un groupe subira une injection de cellules tumorales (sans anésthésie; durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées ou intraveineuse qui peuvent entrainer une légère inflammation au point d'injection. La progression métastatique peut s'accompagner de perte de poids et de difficultés à se déplacer. Les anésthésies répétées peuvent entrainer un stress sur l'animal. L'injection du composé testé doit diminuer la formation de métastases et donc avoir un effet bénéfique sur les animaux.

Devenir

Mise à mort de l'animal afin de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses.

Remplacement

Le modèle animal est essentiel à la finalisation de ce projet, car lui seul reproduit la complexité du microenvironnement que les cellules tumorales doivent envahir pour devenir métastatiques. Notre projet s'est jusqu'ici appuyé sur une combinaison d'approches in vitro en 2D et 3D et d'expériences réalisées chez l'embryon de poisson zèbre de moins de 5 jours post-fécondation, ce qui a grandement contribué à diminuer le nombre de souris prévues.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisamment pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier des travaux réalisant des expériences similaires.

Raffinement

Des points limites ont été établis pour limiter la souffrance animale. En cas de douleur, les symptômes seront traités par analgésie. Les animaux sont anésthésiés avant injections de cellules tumorales ou de luciferin. Les souris seront hébergées en groupe de maximum 5 par cage. Les cages seront enrichies avec des dômes de carton et l'ajout de bâtonnets en ouate. Les animaux seront hébergés au minimum 1 semaines avant le début de l’expérimentation pour permettre leur l’adaptation à l’animalerie. Les animaux étant immunodéprimés, ils sont conservés dans des portoirs ventilés afin d'éviter tout risque d'infection. Ils sont également manipulés sous hotte pour les même raisons. Les animaux sont habitués aux injections avant l'expérience.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’avoir des organes très proches de ceux impliqués dans la pathologie humaine (en particulier la matrice extracellulaire). Au cours des dernières années, nous avons mis au point des outils et protocoles nous permettant de suivre par imagerie non-invasive dans la souris vivante la progression métastatique de carcinome mammaire par bioluminescence et par fluorescence. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines en début de procédure car nous avons mis au point nos protocoles et caractérisés la croissance tumorale et métastatique sur des animaux de cet âge.