Cancers

Trente semaines de gavages quotidiens et d'injections dans l'abdomen deux fois par semaine, huit prélèvements sanguins par animal : 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. S'y ajoutent la pose chirurgicale d'implants d'œstrogène, une injection de cellules tumorales humaines, une ligature vasculaire et une biopsie de la queue au sixième jour de vie. Le porteur indique que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et de passage du liquide dans les poumons, et que les tumeurs devenues volumineuses provoquent des douleurs et des difficultés à s'alimenter. Les souris des procédures d'expérimentation sont tuées pour exploration anatomique, celles de l'élevage restent en vie pour l'accouplement, à l'exception des mâles immunodéficients.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Départager trois candidats vaccins contre le cancer du sein triple négatif avant un développement chez l'humain : 46 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection unique dans le muscle de la patte, puis une prise de sang à l'œil sous anesthésie gazeuse avec collyre anesthésiant. Le porteur écrit qu'un produit ne peut pas passer en clinique sur la seule base de résultats obtenus in vitro et qu'il est donc "obligé" de recourir à un vertébré. Il annonce des points limites précoces et une surveillance de la motricité de la patte injectée, sans préciser ce qui déclencherait l'arrêt de la procédure.

Objectifs

Le développement de vaccins thérapeutiques contre le cancer, ciblant de nouvelles molécules sur les cellules tumorales (antigènes tumoraux), est indispensable afin de répondre à un besoin médical urgent pour les patients qui ne répondent pas aux traitements conventionnels. Un premier vaccin thérapeutique évalué chez la souris a donné des réponses prometteuses, mais il n’est applicable qu’à un nombre de patients restreints. L'objectif de ce projet est de développer un vaccin thérapeutique qui utilise un plus grand nombre de cibles et qui soit efficace sur une plus large population. Trois nouveaux candidats ont été conçus et nous voulons évaluer dans un modèle murin leur capacité à induire une réponse immunitaire spécifique et de comparer ces réponses à celles obtenues avec le 1er candidat vaccin. Le but de cette étude est de sélectionner le candidat le plus efficace pour poursuivre un développement clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positif, cette étude permettra La sélection d’un vaccin thérapeutique optimisé validant une nouvelle option thérapeutique pour les patients qui ont épuisé les possibilités de traitement conventionnel.

Procédures

Pour réaliser l’injection intra musculaire des candidats vaccins, la souris est maintenue environ 20 secondes. Une seule injection de 50µL est effectuée par animal. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur animaux anesthésiés , l’animal est maintenu immobile environ 50-60 secondes (15 secondes pour l’application de l’anesthésique puis 45 secondes pour le prélèvement). Une prise de température en rectal pourrait être effectuée en cas d’apparition de signes cliniques sur animaux vigiles, la souris serait maintenue en contention environ 40 secondes.

Impact sur les animaux

L’injection dans le muscle de la patte devrait entrainer une douleur temporaire légère. Le prélèvement sanguin au niveau l’œil pourrait entrainer une douleur temporaire ou une gêne pour l’animal. Il sera de ce fait effectué après anesthésie générale et application d’un collyre anesthésiant).

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes. Ces organes vont permettre d’évaluer les réponses immunitaires induites par les candidats vaccin

Remplacement

Les objectifs de ce projet étant de sélectionner le meilleur candidat d’immunothérapie pour un développement clinique d’un vaccin chez l’homme, il est donc indispensable de respecter les obligations réglementaires, à savoir qu’un produit ne peut pas passer en clinique en se basant uniquement sur des résultats générés in vitro. Ceci implique que l’évaluation de l’efficacité des candidats doit se faire dans un organisme entier. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro susceptible d’apporter le même degré d’information pour répondre à ces objectifs. L’utilisation des invertébrées ne semble pas judicieuse en raison d’un système immunitaire très différent de celui d’un vertébré. Nous sommes donc obligés de faire appel à un vertébré communément utilisé pour ce type d’étude, la souris

Réduction

L’utilisation d’un outil statistique permettant de définir le nombre d’animaux nécessaires et suffisant pour démontrer une différence entre les groupes a été utilisée. Par ailleurs, un nombre optimal d’échantillons et de données seront collectés pour chaque souris pour utiliser un nombre minimal d’animaux nécessaire pour répondre à l’ensemble des questions de l’étude.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés à minima une semaine au sein de l’animalerie avant le début de la procédure et seront gardés en groupe. Des points limites précoses ont été définis pour cette étude. La motricité des animaux sera surveillée après administration du traitement par voie intramusculaire dans la patte. Le prélèvement sanguin à l’œil se fera sur animaux anesthésiés (anesthésie gazeuse et après application d’un anesthésique local). En cas d’apparition de signes cliniques (, une prise de température sera effectuée. En cas de fièvre, une administration d’un antalgique sera effectuée.

Choix des espèces

Le modèle murin est un bon modèle pour tester les candidats vaccins car son système immunitaire est bien décrit et proche de l’homme. Des souris adultes de plus de 7 semaines seront utilisées afin de travailler sur des animaux ayant un système immunitaire mature. De plus, les réactifs nécessaires sont largement disponibles. Il n’existe donc pas de méthode alternative susceptible d’apporter le même degré d’information. En effet, l’utilisation des invertébrées ne semble pas judicieuse en raison d’un système immunitaire très différent de celui d’un vertébré. Nous sommes donc obligés de faire appel à un vertébré communément utilisé pour ce type d’étude, la souris.

Une tumeur hypophysaire est implantée par chirurgie stéréotaxique dans le crâne de chaque rat, avec une canule d'injection laissée en place pendant les soixante jours du protocole. 60 rats Wistar Furth vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils développent des symptômes d'hypertension intracrânienne quand la tumeur devient volumineuse, ressentent une gêne de type démangeaison à cause de la canule, et sont tués au soixantième jour pour peser les tumeurs et chercher des métastases par autopsie cérébrale. Le porteur qualifie cette chirurgie de "peu douloureuse" et les injections intratumorales de "non douloureux", en faisant valoir que les mêmes gestes se pratiquent chez l'être humain sous simple anesthésie locale.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier l’effet des analogues de la somatostatine sur le contrôle des tumeurs hypophysaires sécrétant l’hormone de croissance en fonction de la voie d’administration du traitement (voie orale versus traitement local intratumoral) afin de s’affranchir de l’obstacle que représente la barrière hémato-encéphalique

Bénéfices attendus

Si notre hypothèse de travail selon laquelle les analogues de la somatostatine donnés comme traitement des tumeurs hypophysaires sont relativement peu efficaces à cause de leur incapacité à pénétrer dans l'hypophyse à cause de la barrière hémato-encéphalique, les résultats de notre projet pourraient ouvrir la voie au développement d'une technique chirurgicale visant à délivrer la médicament directement dans la tumeur résiduelle et à améliorer les taux de guérison de ces patients. de guérison des adénomes somatotropes.

Procédures

Les animaux seront initialement soumis à une procédure chirurgicale (stéréotaxie) peu douloureuse (sous anesthésie générale gazeuse). A titre de comparaison, ces chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous anesthésie locale pure chez l'homme en pratique clinique courante en France. Les autres procédures comporteront des prises de sang bi-mensuelles (sous anesthésie générale gazeuse) ainsi que des injections bi-hebdomadaires sur la canule d'injection prévue à cet effet (non douloureux, mais anesthésie générale gazeuse de < 1 minute envisageable en cas d'angoisse de l'animal). Au total, chaque animal ne subira qu'une seule procédure chirurgicale initiale pour implanter la tumeur (20 minutes de chirurgie sous anesthésie générale), puis 3 prises de sang à 15 jours d'intervalle (10 minutes sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont principalement en lien avec les symptômes d'hypertension intracrâniennen lorsque les tumeurs deviennent trop volumineuses. Aussi, les animaux peuvent ressentir une gêne à type de démangeaison en raison de la canule intratumoral qui restera en place pendant toute la durée de l'expérimentation. Enfin, les injections hebdomadaires peuvent être source d'anxiété chez les animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, après 60 jours, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tumeurs hypophysaires obtenue pour les peser et les analyser sur le plan moléculaire. Aussi, une autopsie cérébrale sera réalisée à la recherche de métastases à distance.

Remplacement

L’utilisation de modèle animaux pour l’étude du développement tumoral dans son microenvironnement habituel est indispensable. L’effet de la somatostatine administré par voie systémique sur ces tumeurs est connu mais son effet après administration directement dans la tumeur n’est pas connu. Bien que les propriétés de la barrière hémato-encéphalique soient largement connues, il est indispensable de confirmer notre hypothèse dans un modèle préclinique avant d’envisager toute nouvelle procédure chez l’homme. Actuellement il n’existe pas de modèle préclinique non-animal fiable de cette barrière hémato-encéphalique.

Réduction

L'évaluation de l'effet des médicaments selon la voie d'administration nécessite de comparer le médicament à la fois à un placebo mais aussi à sa voie d'administration systémique habituelle (sous-cutanée) ce qui nécessite au moins 3 groupes. Idéalement, il serait utile de tester la voie d'administration en placebo la molécule et la voie d'administration, soit 4 groupes d'animaux. Néanmoins, on peut s'affranchir d'un groupe d'animaux si tous les animaux recoivent une injection locale et une injection sous-cutanée (de placebo ou de médicament), permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux en n'utilisant pas de 4ème groupe. D'un point de vue statistique, le nombre d'animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique à partir des différences de survie moyenne observées entre les groupes d'animaux dans notre précédente étude de survie des animaux de notre modèle expérimental en fonction de leur exposition à un médicament anti-tumoral. Le nombre d'animaux nécessaire est estimé statistiquement à 19 par groupes. Le geste technique d'insertion d'une canule d'injection intra-sellaire étant nouveau, 3 rats supplémentaires semblent nécessaires à l'optimisation de la technique opératoire. Le nombre total d'animaux nécessaire s'élève donc à 60 animaux (19 par groupe + 3 de mise au point).

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ils seront maintenus par deux minimum dans chaque cage avec de l’enrichissement du milieu par copaux de bois et tunnel en carton. Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaitre les points limites. Les animaux ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie et celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Toute procédure pouvant engendrer une douleur (prise de sang, injection) sera également effectuée sous anesthésie générale gazeuse. Tous les animaux seront opérés et surveillés par les membres de l’équipe qui a mis au point le modèle expérimental de tumeur hypophysaire orthotopique, sont habitués à ces procédures et à la reconnaissance précoce des points limites des animaux. Les points limites surveillés par l'équipe sont les suivants : hérissement du poil, isolement, aggressivité, ralentissement, inconfort. En cas d'apparition d'un de ces signes clinique, une fiche individuelle sera réalisée de manière quotidienne et ous les animaux qui présentent un score supérieur ou égal à 6/10 seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le choix d'un modèle animal de rat repose l'absence d'autre modèle expérimental préclinique de tumeur hypophysaire orthotopique. En effet, des modèles d'adénomes hypoophysaires obtenues par modifications génétiques chez la souris ne permettent ni d'étudier ces maladies dans un contexte immunologique physiologique, ni d'étudier des pathologies hypophysaires sécrétantes, ces modèles se limitant à des adénomes non-sécrétant. De plus, les adénomes hypophysaires chez l'homme sont sporadiques dans plus de 95% des cas et les modèles génétiques ne correspondent donc qu'à de rares situations cliniques chez l'homme. Le choix de cette souche spécifique de rats (Wistar Furth) est en lien avec la seule lignée cellulaire immortalisée de cellules hypophysaires somatotropes (GC) qui provient de cette souche de rat. Plusieurs tentatives de reproduction de norte modèle dans des souches plus courantes (Wistar Wi et Han) ont été réalisées, sans succès. Les procédures expérimentales débuteront entre 8 et 12 semaines après leur naissance, âge qui correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d’obtenir un environnement ostreogénique favorable au développement des tumeurs.

Irradiées pendant dix minutes pour vider leur moelle osseuse, puis injectées de cellules leucémiques dans la veine de la queue, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La maladie s'installe comme prévu et provoque au bout de quelques semaines amaigrissement, paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, prostration, déshydratation, hypothermie ou embolie pulmonaire. S'y ajoutent quatre prélèvements sanguins à la mâchoire, une ponction dans le fémur en cas de non-détection des cellules, sept jours de gavage ou cinq jours d'injections abdominales, et un prélèvement de sang au cœur sous anesthésie. Le projet vise à comprendre pourquoi la greffe de moelle échoue chez plus de 40 % des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde, retombée que le porteur situe dans la conception d'immunothérapies futures.

Objectifs

Les leucémies aigües myéloïdes (LAM) sont des maladies affectant la moelle osseuse puis d’autres organes par la suite comme la rate ou le foie. Afin de freiner cela il existe le traitement par chimiothérapie qui peut permettre une rémission complète mais souvent va progresser vers une LAM récidivante réfractaire à de nouvelles tentatives de chimiothérapie. En plus de la chimiothérapie il est possible d’effectuer des greffes de moelle osseuse, provenant d’un donneur compatible. Ce traitement induit une réponse de la partie de l’organisme greffée (ici de la moelle osseuse) contre la leucémie (Greffon contre la leucémie, GVL) afin d’éliminer les cellules leucémiques résiduelles. Cependant, la greffe ne permet pas toujours de guérir le patient (i) lorsqu’il n’y a pas une réponse suffisamment forte de l’organisme contre la leucémie ou (ii) lorsqu’il y a une réaction de la partie greffée contre l’hôte. Le projet vise donc à comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse GVL dans les LAM. Pour cela un modèle a été mis en place, en injectant des cellules sanguines (ou blastes) leucémiques provenant de souris malades, suivi de lymphocyte T (globule blanc qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire) reconnaissant les blastes (cellules immatures de la moelle osseuse qui peuvent se différencier). Nous avons pu valider la réponse bénéfique GVL dans deux modèles précliniques, de par l’amélioration de la survie des souris recevant cette double transplantation. Les deux modèles étant un modèle de souris ayant été irradié afin de « faire de la place » dans la moelle osseuse et permettre aux cellules leucémiques de s’y développer. Et un modèle avec des souris recevant des cellules leucémiques de patients. Après l’étude de nombreux gènes chez la souris, nous avons pu identifier des gènes qui modulent la réponse GVL dans les LAM. Nous souhaitons à présent les valider et les définir et en parallèle nous allons tester de nouvelles molécules qui pourraient améliorer l’efficacité de la réponse GVL.

Bénéfices attendus

L’effet thérapeutique de la greffe de moelle osseuse est compromis dans plus de 40% des cas de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec une réponse immunitaire s’appelant : greffon contre la leucémie (GVL) insuffisante. Une meilleure compréhension des différents mécanismes est donc indispensable pour concevoir des immunothérapies (traitements) rationnelles et efficaces pour un traitement à long termes des LAM. Notre projet se propose d’identifier et de caractériser les potentiels acteurs de l’effet GVL afin d’optimiser la réponse immunitaire contre les cellules leucémiques.

Procédures

Les animaux vigiles (c’est-à-dire non endormi) seront tout d’abord préconditionnés par irradiation (durée: 10 min maximum) pour éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse de quelques secondes dans la veine de la queue. Des prélèvements de sang au niveau de la mâchoire de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer l’évolution de croissance tumorale et récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-détection des cellules leucémiques dans le sang, nous ferons une ponction de cellules dans l’os du fémur d’environ 5 minutes ; les animaux étant placés sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement journalier de durée variable selon le type de thérapie par voie orale en gavage (pendant 7 jours consécutifs; durée du gavage: 30 secondes) ou bien par une injection dans la cavité abdominale en intra-péritonéal (pendant 5 jours consécutifs; durée de l'injection: 15 secondes). Dans le cas de combinaisons thérapeutiques, il peut y avoir deux administrations par jour, par exemple gavage + injection intrapéritonéale. A la fin du traitement, 3 jours après, les souris seront anesthésiées et un prélèvement de sang au niveau du cœur (durée 3 min) sera effectué.

Impact sur les animaux

Lorsqu’ils sont traités avec les différentes molécules, lors de la greffe ou lors du suivi de prise de greffe (gavage, intra-péritonéal, intra-veineux), les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. De plus, la greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie ou encore d’embolie pulmonaire . Pour les injections intraveineuses, les anesthésies ou les prélèvements sous-mandibulaires les effets indésirables sont surtout l’introduction d’une aiguille. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité ou une embolie pulmonaire. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides, d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse et observer la réponse contre la leucémie des lymphocytes T (catégorie de leucocytes (globule blanc) qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire.

Remplacement

Pour identifier les acteurs qui permettent une réponse contre la leucémie , des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de récapituler de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier. Bien que certains modèles in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses qui peut modifier leur comportement. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles animaux, ici chez la souris.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites et d’établir d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux et le suivi clinique réalisé tous les jours, 4 semaines après la greffe des cellules leucémiques permettent de recenser les différents points limites.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller infiltrer des organes à distance. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.

Les souris utilisées ici sont immunodéficientes, choisies pour ne pas rejeter les fragments de tumeurs prélevés sur des patients, certaines portant en plus un système immunitaire humain reconstitué. 13 340 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. Elles subissent une chirurgie de greffe de cinq à vingt minutes, jusqu'à deux mois de traitements par des molécules dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires, et jusqu'à dix prélèvements sanguins. Le nombre d'animaux par groupe, treize, ne repose sur aucun test statistique : le porteur le fixe à partir de son expérience et de la littérature.

Objectifs

Ce projet a déjà obtenu une autorisation de projet qui doit être renouvelée au bout des 5 ans échus. Les cancers sont en progression constante de nos jours et touchent plusieurs organes. Aux stades avancés, ils sont réfractaires à toute thérapie malgré le développement des thérapies ciblées. De nouvelles options thérapeutiques doivent donc être impérativement développées. Depuis plusieurs années, nous avons mis en place une importante plateforme de xénogreffes tumorales issues de patients (PDX Patient-derived xenograft) pour les cancers urologiques dans un premier temps du fait de notre thématique de recherche (mais d’autres domaines pourraient être testés) et de proposer ces modèles pour une évaluation fiable de candidats médicaments. L’objectif du projet est d’évaluer l’effets de candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes de tumeurs issues de patients chez la souris immunodéficiente et/ou humanisée.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de cancer.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse ou par voie fixe pour subir une chirurgie pour l’implantation de la tumeur. Ces chirurgies sont courtes et durent environ 5-20 min selon la voie choisie. Des antalgiques seront administrés aux animaux en sous-cutané pour limiter la douleur. Les animaux recevront également des traitements avec des candidats médicaments à tester (traitements pendant 2 mois maximum). Les voies et fréquences sont dépendantes de chaque protocole expérimental. Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront très rapides (environ 1 min) pour diminuer au maximum la contention des animaux et un stress possible. Les animaux pourront avoir des prélèvements sanguins sur animal vigile ou anesthésié (geste qui dure environ 1 min et 5-10 prélèvements maximum). La mesure des tumeurs se fera par palpation de la tumeur et évaluation de sa taille. Ce geste est très rapide (1 minute maximum) et ne provoque pas un grand stress à l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies et chirurgie sur les animaux peuvent provoquer du stress, une douleur, des lésions. De plus, nous greffons une tumeur cancéreuse aux animaux qui croit plus ou moins doucement selon les modèles pouvant entraîner une perte de poids des animaux, une gène…

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de tissus seront réalisés

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de certains cancers. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Les modèles expérimentaux en oncologie préclinique sont: - les lignées cellulaires in vitro et in vivo ; - les tumeurs induites chimiquement ; - les souris transgéniques ; - les xénogreffes tumorales issues de patient (PDX). Ce dernier modèle est reconnu comme le plus pertinent car il reflète l’hétérogénéité tumorale et est décrit dans la littérature. Cette approche est encore peu répandue pour la sphère urologique et la communauté scientifique manque de modèles de PDX pour évaluer les candidats médicaments. De plus, l’approche immunothérapeutique prend une grande ampleur en oncologie, ainsi il est important de développer des modèles de double humanisation (PDX implantés sur des souris humanisées) pour tester ces nouvelles immunothérapies (non réalisé à ce jour dans notre laboratoire mais en forte perspective pour les prochains mois). Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer une valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). La mesure de la croissance tumorale se fera via une méthode non invasive de palpation ou à l’aide d’un caliper pour des volumes plus importants. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. De plus, le fait de pouvoir congeler/décongeler des tumeurs issues de la biobanque et de pouvoir l’incrémenter avec des nouvelles tumeurs évite d’avoir toujours les tumeurs à amplifier dans les animaux pour les conserver, diminuant à terme le nombre d’animaux. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et principalement dans ces modèles, les publications scientifiques, 13 animaux seront utilisés par groupe expérimental car c’est le minimum requis pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes).

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et administration d’antalgiques avant et après toute chirurgie. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type igloo, morceau de bois, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes pouvant aller jusqu’à un point limite (définition de points limites adaptés). Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Du fait de la perte de poids des animaux possible en fonction de certaines tumeurs, une alimentation humide type Diet gel sera ajoutée dans la cage de ces animaux si nécessaire. Si un animal présentait un symptôme pouvant amener à un point limite, il serait hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin, soigné et pris en charge en fonction de son état (isolement en dernier recours mais possible selon l’agressivité de ses congénères). Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle expérimental décrit dans ce projet est très bien décrit dans la littérature et nécessite l’utilisation d’animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d’un tissu étranger. L’espèce de référence pour les études en oncologie préclinique est la souris du fait de sa facilité d’utilisation et des nombreux modèles de souris immunodéprimées et humanisées produits. Nous utiliserons des souris jeunes (4-6 semaines à la livraison) pour faciliter la prise de greffe pour les primo-implantations et les tests d’efficacité de candidats médicaments. Pour les études d’immunothérapie, nous utiliserons des souris d’environ 14 semaines, lorsque le système immunitaire humain est bien reconstitué.

Anesthésiées pour recevoir des cellules cancéreuses directement dans la vessie, pesées jusqu'à une fois par jour, traitées jusqu'à trois fois par semaine, puis endormies à l'isoflurane trois fois par semaine pour un suivi de la tumeur en bioluminescence, 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une greffe sous la peau pour reproduire une situation métastatique, d'autres subissent des prélèvements de sang ou l'amputation de l'extrémité de la queue, la fréquence de ces gestes dépendant des demandes des clients. Le porteur indique que la croissance tumorale peut rendre les souris incapables d'uriner et de s'alimenter, et que les anesthésies répétées constituent en elles-mêmes une nuisance. Toutes sont tuées à la fin des études pour prélever leurs organes, le modèle ne permettant pas de les réutiliser.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements pour les cancers de la vessie, dont les besoins sont non satisfaits, chez la souris dans des modèles orthotopiques (injection de cellules cancéreuses au site correspondant à celui de la tumeur d’origine). Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses de la vessie soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans la vessie par administration intravésicale. En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer le ou les composé(s) à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur, puis à mesurer la croissance tumorale, les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines et/ou tissulaires du composé d’intérêt. Les mesure de concentrations du composé permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et enfin de prédire les doses des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’homme. Le suivi de croissance tumorale permettra d’évaluer l’efficacité du ou des composé(s). Celui-ci sera réalisé par imagerie non-invasive de bioluminescence sur animal anesthésié. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront être réalisés pour des analyses ex vivo complémentaires : histologiques, par cytométrie en flux… L’ajout de tumeur ectopique (injection des cellules par voie sous-cutanée) en plus d’une tumeur orthotopique (injection par voie intravésicale) pourra être utilisé pour tester l’efficacité de molécules anticancéreuses dans un contexte de tumeurs métastatiques ; aussi appelé modèle abscopal. L’effet abscopal est la régression de la lésion métastatique (ex : s.c.) après un traitement local de la tumeur primaire (i.e. vésicale). Le suivi de la croissance de la tumeur ectopique s’effectuera par mesure non-invasive par caliper.

Bénéfices attendus

Dans les pays développés, le cancer de la vessie est au 4ème rang par sa fréquence chez l’homme et 9ème chez la femme. En France, chaque année, plus de 11 000 nouveaux cas de cancer de la vessie sont diagnostiqués et les statistiques font état de 4 500 décès annuels. Le traitement du cancer de la vessie repose aujourd’hui principalement sur la chirurgie (exérèse partielle), une ablation totale de la vessie pouvant être pratiquée en cas de cancer infiltrant. La survie nette à 10 ans des patients atteints d’un cancer de la vessie est de l’ordre de 40%. Le taux de récurrence à 5 ans est entre 31 et 78%, ce qui souligne l’inefficacité des traitements actuels et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernant tous les animaux : • Inoculation des cellules cancéreuses dans la vessie (1 fois ; 15 min à 30min) sur l’animal anesthésié par injection intrapéritonéale d’un analgésique injectable • Pesées (maximum 1 fois par jour sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Administration intrapéritonéale (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Suivi de la croissance tumorale par bioluminescence (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 15 min à 1h) sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (3-4% pour l’induction et de 1-3% pour l’entretien) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang (30 sec) : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera adaptée en fonction du volume prélevé en accord avec la consigne en vigueur. Les sites seront la veine submandibulaire sur animal anesthésié à l’isoflurane (3-4%) ou veine caudale, ou amputation unique de la queue (coupe < 2 mm sur l’extrémité non inervée de la queue) sur animal vigile. • Injection sous-cutanée de cellules cancéreuses (1 fois ; 1 min) sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (3-4% pour la l’induction et de 1-3% pour l’entretien) • Mesure de la croissance tumorale au pied à coulisse (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 1 min) sur animal vigile • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera en accord avec la consigne interne en vigueur. Les voies envisagées sur animal vigile seront les voies (30 sec) : per os, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse via la veine caudale ou intramusculaire. Les voies possibles sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (pour induction 3-4%, pour maintien 1-3%) seront intradermique (1 min), intraveineuse via le sinus rétro-orbital (30 sec) ou intravésicale (15 min à 1h).

Impact sur les animaux

Ces modèles peuvent engendrer une dégradation de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire par une perte de poids, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli) et/ou une altération des fonctions normales (impossibilité d’uriner et de s’alimenter). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Les effets indésirables possibles seront systématiquement demandés au client avant tout traitement pour les anticiper. Les animaux seront également soumis à des mesures de tumeur par bioluminesence post-administration des cellules tumorales/potentiels médicaments par voie intravésicale ce qui nécessite des anesthésies répétées. Ces anesthésies répétées peuvent constituer une nuisance notamment au travers de la contention de l’animal pour le placer dans la chambre à anesthésie ou pour l’administration de ketamine/xylazine.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …). Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.

Remplacement

Principalement 2 approches sont utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basée sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Dans le modèle orthotopique, la croissance tumorale sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence. Dans le modèle sous-cutané, la croissance sera mesurée par caliper. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié (pour l’imagerie de bioluminescence), là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base principalement sur les données de la littérature complétés d'analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux à l'aide de logiciels spécifiques, généralement basés sur des tests type test de Student bilatéral, afin que les nombres utilisés soient réduits au minimum nécessaire. Il est prévu environ 50 études (10 études par an) et 150 molécules testées au regard du nombre d’animaux utilisés. Chaque étude comportera en moyenne 5 groupes avec 10 animaux par groupe et 3 molécules à tester par étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaire de la directive n°2010/63/UE. Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinels. Les animaux seront groupés dans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations liées à l’étude sur l’animal sera réduit au strict nécessaire ( ex : pesées, bioluminescence).Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles orthotopiques de cancer de la vessie chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1/ sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2/ la disponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Le stade adulte est utilisé :les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer.

Le poids, le comportement et l'apparence des souris porteuses de tumeurs sont contrôlés chaque jour pour décider du moment de leur mise à mort. 4 011 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un groupe de 2 100 subit une injection puis un unique prélèvement sanguin sous anesthésie terminale, un autre de 1 001 reçoit une incision du flanc, une greffe de cellules cancéreuses dans la glande mammaire, huit injections du produit testé puis, deux fois par semaine pendant quatre mois au plus, une injection de luciférine suivie d'un examen d'imagerie sous anesthésie. L'objet du projet est de comparer des nanoparticules ciblant HER2 selon leur taille et leur composition, et les souris chez qui la tumeur n'a pas pris sont tuées elles aussi, parce qu'elles ont reçu des cellules tumorales.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer chez la femme en France, dont 10 à 20% sont HER2 positifs (protéine exprimée à la surface des cellules positives). Cependant, des résistances aux traitements proposés actuellement se développent, et la toxicité systémique (toxicité qui affecte l’ensemble de l’organisme) des traitements existants reste problématique. Il reste donc indispensable de chercher de nouveaux traitements contre le cancer du sein. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules associées à des nanoparticules ciblant HER2, réduisant les effets secondaires dans le traitement du cancer du sein. Nous espérons ainsi ouvrir de nouvelles pistes pour résoudre cette problématique de santé publique. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanoparticules dans l’arsenal thérapeutique actuel du cancer du sein. La comparaison des différentes nanoparticules ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanoparticules sur le ciblage de la tumeur, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanoparticules pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer du sein humain grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

- Un groupe de 700 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis 2 prélèvements sanguin à deux jours d’intervalle, sous anesthésie (durée : environ 30 secondes). Les souris subiront cette séquence d’une semaine sur 4 semaines (4 injections et 8 prélèvements au total). - Un groupe de 2100 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie terminale (sans réveil) (durée : 30 secondes). - Un groupe de 210 souris subira 2 injections de cellules cancéreuses (10 secondes chacunes) sur animal anesthésié, puis une injection du médicament (7 à 15 jours après) sur animal vigile d’une durée de 10 secondes ; puis sera observée à 7 temps différents par imagerie sous anesthésie (durée : 30 secondes) réparties sur 3 jours. - Un groupe de 1001 souris subira 1 incision sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes) suivie d’une injection de cellules cancéreuses dans la glande mamaire sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes), puis 10 à 20 jours plus tard, huit injections du médicament (10 secondes) sur animal vigile, et deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (4 mois maximum), une injection de la luciférine (nécessaire à l’imagerie) sur animal vigile (durée 10 secondes) suivie de l’examen en imagerie (durée 1 min) sous anesthésie. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs. Les animaux concernés par l’étude de la dose maximale tolérée et de toxicité et de pharmacocinétiques seront réceptionnés, hébergés, injectés et sacrifiés dans l'EU1. Dans le cadre de l’étude de biodistribution ; la réception, hébergement, la greffe et la pousse tumorale se fera dans l'EU1, puis les animaux seront transférés dans l'EU2 pour l’injection des formulations et le suivis jusqu’à euthanasie. L’ensemble des animaux de l'étude d’efficacité thérapeutique sera réalisée dans l'EU2 (réception, hebergement, greffe/pousse tumorale, injection des formulations).

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de nuisances attendues sur les souris saines autre que la toxicité éventuelle de la molécule à haute dose (perte de poids, perte de poils). Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Les nuisances attendues pour l’incision du flanc sont des douleurs au niveau de la zone incisée. Les nuisances attendues pour les souris porteuses de tumeurs sont la nuisance due à la tumeur : perte de poids, nécrose, etc. Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Après injection intraveineuse, des irritations au point d’injections peuvent apparaître et seront surveillés.

Devenir

Les souris sont prélevées post-mortem pour des analyses ultérieures, elles seront donc toutes mises à mort. Les souris dont la pousse tumorale n'a pas prise seront mises à mort car elles ont étés injectées avec des cellules tumorales.

Remplacement

Nous avons préalablement réalisé des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. En effet, cette étude préclinique, visant à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanoparticules pour le traitement du cancer du sein nécessite obligatoirement l’utilisation d’animaux entiers pour déterminer la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique et leur efficacité.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible grâce au suivi par imagerie non invasive et non irradiante (croissance tumorale et biodistribution des formulations dans les modèles de souris porteuses du cancer du sein). Une étude préliminaire, avec un nombre restreint de groupes conditionnera la suite du projet, le nombre d’animaux annoncé est donc un nombre maximum.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Un analgésique sera localement appliqué sur les sites d’ouverture de la souris. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs sera mesurée tous les 3 jours. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la structure du bien-être animale. Pour le transport des animaux, ces derniers seront installés dans des boites spécifiques assurant leur confort et leur sécurité (isolation thermique, filtre sanitaire, chaufferette) pour un temps de transport estimé entre 5 à 10 minutes. Une période d’acclimatation de 12 à 24h minimum sera observée suite à leur transferts.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La plupart des antécédents génomiques de la souris sont similaire à ceux de l’homme (env. 95%), ce qui rend les souris particulièrement utiles pour la recherche sur les maladies humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6-8 semaines, âge adulte de manière à avoir un poids corporel plutôt stable d’environ 20g.

864 souris subissent une chirurgie d'environ vingt minutes pour se voir implanter une tumeur dans le cerveau, puis deux séances d'IRM sous anesthésie. Avec les 960 autres, injectées sous la peau, 1 824 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Un groupe de 32 porte pendant six semaines un dispositif appliqué en continu sur l'abdomen, et l'ulcération ou la nécrose de la tumeur figure parmi les effets attendus. Le porteur qualifie la majorité des procédures de peu traumatisantes et annonce un vaccin thérapeutique contre le glioblastome, tumeur cérébrale pour laquelle il indique lui-même qu'aucun traitement connu ne fonctionne.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. Le succès récent de l’immunothérapie dans divers cancers a renouvelé l'intérêt pour les vaccins anti-tumoraux. Actuellement aucun vaccin a montré une efficacité dans les cancers, probablement à cause de la faible activation de lymphocytes cytotoxiques capables d’attaquer les cellules du cancer par les formulations vaccinales classiques utilisant aluminium ou émulsions comme adjuvants. Nous avons développé une formulation vaccinale innovante qui permet de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène tumoral. Notre but est de poursuivre le développement de notre formulation afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Devant la résistance du glioblastome à tout traitement connu à l’heure actuelle, la stratégie la plus prometteuse semble être l’association de plusieurs thérapies. Dans ce projet différentes combinaisons thérapeutiques de notre vaccin avec des traitements anti-cancéreux seront évaluées : chimiothérapie, traitements immunomodulants, thérapies qui permettent d’augmenter le passage de molécules thérapeutiques et lymphocytes dans le cerveau.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la validation de l’efficacité de notre vaccin innovant dans un modèle intracrânien de glioblastome et de sélectionner les meilleures stratégies thérapeutiques de combinaison du vaccin avec des traitements couramment utilisés pour le glioblastome (chimiothérapie) et d’autres traitements immunomodulateurs ou potentiellement synergiques avec l’immunothérapie.

Procédures

960 Souris subiront des injections sous anesthésie générale (durée totale de la procédure de 5 minutes) et 864 Souris une intervention chirurgicale (durée de la procédure d’environ 20 minutes). Pour l’administration des traitements, toutes les Souris auront des injections à fréquence variable selon la molécule entre une fois par jour et une seule injection dans toute la durée de l'experience (durée d’environ une minute). Un groupe de 32 Souris sera traité avec un dispositif appliqué au niveau abdominal 24/24h pendant maximum 6 semaines. Afin d’évaluer l’effet des différents traitements sur la croissance tumorale, nous réaliserons 2 IRM aux Souris avec le modèle intracérébral (864 souris). Durée totale de la procédure : environ 30 minutes. 216 Souris seront mises à mort par chirurgie terminale sans réveil sous anesthésie générale profonde et analgésie. Aucun prélèvement sera réalisé chez l’animal vivant mais toujours après mise à mort.

Impact sur les animaux

Aucune de ces lignées de Souris ne présente de phénotype dommageable à l’état basal. Concernant les injections réalisées sous anesthésie générale (injection de cellules tumorales), les animaux subiront un léger stress pour l’induction de l’anesthésie. Un effet indésirable attendu, susceptible d'entrainer une douleur modérée, est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. En ce qui concerne les injections des médicaments, les animaux subiront un léger stress pour la contention et les effets indésirables sont une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection. Les effets indésirables attendus pour le dispositif appliquant un courant sont une rougeur au niveau de la zone d’application du dispositif. Les examens d'imagerie réalisés sont non invasifs et atraumatiques et impliquent l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Néanmoins, le souris subiront un léger stress pour l’induction de l’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de limiter la souffrance (selon points limite) et aussi afin de prélever les différents organes et les analyser pour pouvoir comprendre les mécanismes d’efficacité ou échappement du cancer aux traitements.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués. Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Afin de limiter le nombre de souris avec un modèle de tumeur intracrânien, uniquement les stratégies de combinaison thérapeutique les plus prometteuses selon les résultats des modèles sous-cutanées seront évaluées dans ce modèle. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs traitements ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 1824 souris seront utilisées dans ce projet.

Raffinement

La majorité des expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes (injections sous-cutanées ou intra-péritonéales, traitements par voie orale). La bonne tolérance des formulations vaccinales a été préalablement démontrée dans notre laboratoire. Chez les animaux porteurs de tumeurs sous-cutanées, la croissance tumorale est mesurée 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. En ce qui concerne les animaux porteurs de tumeur intracrânienne, l’implantation sera réalisée sous anesthésie locale et générale et après analgésie locale. Afin de prévenir la douleur post-chirurgicale, un traitement analgésique pendant 3 jours après l’implantation sera également administré. Tous les animaux de toutes les procédures font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire, selon les points limite.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souris est bien caractérisé et de nombreux outils pour l’analyse de la réponse immunitaire aux immunothérapies sont disponibles. Les animaux seront âgés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

Injectées de cellules tumorales puis traitées tous les deux jours, une partie des souris subit aussi deux irradiations à trois jours d'intervalle, calibrées pour détruire leur moelle osseuse. 4 871 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre pourquoi les immunothérapies échouent chez une partie des patients. Toutes sont tuées, y compris les témoins sans tumeur, parce que l'étude porte sur les cellules contenues dans leurs organes. Le porteur écrit que ses procédures n'impliquent pas l'arrivée des animaux aux points limites, après avoir décrit une gêne respiratoire, une nécrose tumorale et une baisse de tonicité dans les derniers stades de la maladie.

Objectifs

Ce projet a pour but d’identifier le mode d’action des immunothérapies (IT) afin de mieux appréhender les échecs de ces traitements chez les patients/cancers non répondeurs. Dans cet objectif, il est dans un premier temps nécessaire de mieux comprendre les réactions immunitaires ayant cours durant les cancers et la façon dont elles sont modifiées par les IT. Cela devrait permettre de mettre en évidence les types cellulaires qui sont impliqués dans l’élimination de la tumeur et la façon dont ces cellules immunitaires tuent les cellules tumorales. En particulier, ce projet s’articule autour de 4 objectifs principaux : - Comprendre comment la tumeur et les IT modifient les cellules immunitaires infiltrant la tumeur - Comprendre comment la tumeur et les IT modifient la génération des cellules du SI à distance dans la moelle osseuse - Identifier les types cellulaires essentiels au fonctionnement des IT - Identifier les mécanismes d’action utilisés par le système immunitaire (SI) et activés par les IT pour lutter contre la tumeur Ce projet nécessite l'utilisation de plusieurs procédures censées reproduire a minima la diversité des cancers observés chez l’être humain. Nous nous focalisons sur trois types principaux de cancer à savoir le cancer du poumon, le cancer de la peau et les lymphomes. Ces cancers sont bien modélisés chez le petit animal et les traitements utilisés chez l'être humain fonctionnent sur les animaux. Cela permet de modéliser avec précision le contexte immunitaire de l’animal avec une certitude convenable que les effets puissent être, au moins en partie, similaires chez l’humain. Hautement translationnel, ce projet permet de tester rapidement la cohérence des résultats obtenus sur les modèles murins avec les observations réalisées sur deux cohortes de patients atteints de cancers et traités par IT. Ainsi, ce projet devrait permettre de mieux comprendre pourquoi une fraction significative de patients/cancer ne répondent pas aux IT, malgré les résultats très prometteurs observés chez les patients répondeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Premièrement, la description de nouvelles cellules dans le cancer du poumon permettra d’établir de nouvelles pistes pour le ciblage thérapeutique des immunothérapies dans cette pathologie. Deuxièmement, la compréhension des mécanismes de fonctionnement des immunothérapies permettra de mieux comprendre la réponse des patients au traitement. Ici, nous estimons qu’il est probable que nous puissions proposer un biomarqueur circulant chez les patients permettant d’évaluer rapidement leur réponse au traitement (en 1 à 2 semaines) contrairement à 2 à 3 mois actuellement. Troisièmement, la description de nouvelles molécules et mécanismes des cellules myéloïdes impliquées dans la lutte contre les cancers permettra de proposer des traitements de synergie avec les immunothérapies visant spécifiquement les cellules myéloïdes. Ces traitements pourraient grandement améliorer la réponse des patients aux immunothérapies. Dans l’ensemble, ce projet tire sa cohérence de l’approche globale qu’il propose vis-à-vis du fonctionnement des immunothérapies. Ce projet est suffisamment diversifié pour résister à l’échec potentiel d’une sous-partie.

Procédures

Les animaux anesthésiés ou vigiles pourront être injectés une fois en sous-cutané, intra-péritonéal, ou intra-veineux d’une solution de cellules tumorales. L’anesthésie prend quelques minutes à agir et l’injection quelques secondes. Les animaux pourront subir des injections intra-péritonéales (animaux vigiles ou anesthésiés) ou intra-veineuses de traitement tous les deux jours. Du sang pourra être prélevé une fois sur les animaux anesthésiés avant leur mise à mort. Ce prélèvement se fera en quelques secondes. Les animaux ne se réveilleront pas entre le prélèvement et la mise à mort. Dans certains cas, une goutte de sang pourra être prélevée deux fois à huit jours d’intervalle. Pour certaines procédures, les animaux seront irradiés (deux irradiations seront réalisées à 3 jours d'intervalle; leur durée sera mise au point durant le projet, elle doit pouvoir conduire à une myélosuppression).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont particulièrement liés à la croissance tumorale. En effet, l’ensemble des traitements utilisés ont été déjà publiés dans la littérature comme étant bien tolérés par les animaux dans les lignées de souris que nous utilisons. Néanmoins, la fréquence des injections peut tout de même entraîner une nuisance, de même que les prélèvements. Nous n’utilisons pas d’animaux ayant un phénotype dommageable, hormis une lignée qui sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection, dans une cage individuelle sur portoir ventilé, la litière sera autoclavée, l’eau et les aliments irradiés, le matériel en contact avec les animaux sera au préalable autoclavé ou décontaminé. Ainsi, hormis les nuisances sporadiques parfois observées sur les animaux sains, l’initiation des possibles nuisances se fera à partir du début des expériences et pourra donc être promptement suivie selon un tableau de suivi des points limites. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales sont comme suit : - Pour les tumeurs pulmonaires : gène à la respiration, baisse de la tonicité générale et perte de poids dans les derniers stades du cancer. - Pour les tumeurs sous cutanées : Nécrose de la tumeur, gène à la locomotion et baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie. Les procédures que nous utilisons, hormis l’étude de la survie, n’impliquent pas l’arrivée des animaux aux points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront porteurs de tumeurs. De plus les animaux “contrôles”, non porteurs de tumeur, devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentes dans les organes et devons nécessairement mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.

Remplacement

Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une modélisation in vitro, via de la culture cellulaire ou la conception d’organoïdes 3D nous le ferons, comme nous l’avons déjà fait par le passé. Cependant, ni la modélisation mathématique, ni les systèmes in vitro ne permettent d’étudier les effets du développement tumoral et les réponses immunitaires anti-tumorales induites par les tumeurs ou la vaccination. Nous nous intéressons à des cellules nouvelles non encore décrites et dont nous ne connaissons par les progéniteurs ni l’origine. Il est donc impossible de ne pas travailler sur l’animal. Dès que les cellules auront été décrites et les progéniteurs identifiés, nous tâcherons de mettre au point des méthodes de cultures in vitro pour en étudier la fonctionnalité au plus près sans impliquer les animaux dans des procédures expérimentales.

Réduction

Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animal. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées avec 7 animaux en accord avec les calculs de puissance statistique. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques. En outre, nous utiliserons des animaux mâles et femelles pour réduire le nombre d’animaux non impliqués dans des expérimentations dans les lignées de souris génétiquement modifiées. Deux irradiations seront réalisées à 3 jours d'intervalle.

Raffinement

Dans la mesure du possible, les animaux ne seront pas laissés seuls dans leur cage. Les expériences impliquant le développement de tumeurs seront pratiquées en accord avec les points limites acceptables définis dans la littérature. Afin de minimiser l'impact des procédures, nous allons anesthésier les souris avant d'injecter les tumeurs. Les signes cliniques permettant d’évaluer l’état de douleur ou détresse seront évalués tous les 3 jours afin de mettre à mort les animaux dépassant un certain niveau de souffrance défini par un point limite intégrant plusieurs critères. Pour éviter des lésions sur les tumeurs palpables, de la litière à base de cellulose sera utilisée dans les cages, dès que la taille ou l’aspect de la tumeur le nécessitera. Du Gel hydrique et/ou des réhydratations en sous-cutanée seront donnés aux animaux ayant du mal à se nourrir, s’abreuver ou avec des poils hérissés (signe d’un défaut d’alimentation). Si les animaux présentent des signes d’hypothermie, les cages seront chauffées. Des maisonnettes en carton ou des tubes (carton ou plastique) pourront être introduits dans les cages de stabulation en guise d’enrichissement. La lignée immunodéprimée à phénotype dommageable sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est très proche de celui de l’être humain. Cette espèce a une reproduction facilement manipulable avec un temps de gestation court et plusieurs individus par portée, donc des conditions d’élevage optimales. De plus, ce modèle étant très étudié, il y a une vaste expertise technique et scientifique autour de son utilisation et de nombreux outils sont déjà disponibles (anticorps, molécules inhibitrices/activatrices, modèles de souris génétiquement modifiées…). La souris est donc le modèle le plus pertinent pour notre étude. Les animaux seront mis en expérimentation à l'âge adulte à partir de 8 semaines après leur naissance et jusqu’à 25 semaines environ. Cela permettra d’étudier un système immunitaire mature proche de celui de l’être humain.