Cancers

Une greffe de glioblastome humain dans le cerveau, au moins dix séances d'imagerie sous anesthésie, dix séances de radiothérapie, douze administrations du composé testé et un test d'éviction d'obstacle trois fois par semaine : 164 souris immunodéprimées vont subir ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur cérébrale implantée provoque des effets délétères que le porteur qualifie lui-même de non réversibles, et la répétition des anesthésies peut entraîner une accoutumance obligeant à augmenter les doses administrées. L'objet du projet est de vérifier si l'augmentation d'une protéine, combinée à son activation par une molécule, ralentit la croissance tumorale et améliore la réponse aux traitements standards, les retombées annoncées pour les patientes et les patients restant renvoyées au conditionnel. 116 souris sont tuées dès l'atteinte d'un point limite, et 48 autres, dites "satellites", plus tôt encore, à la fin du schéma de traitement, pour analyser leurs tissus.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment l'augmentation de la quantité d'une protéine affecte la croissance des tumeurs cérébrales chez les souris, et favorise leur réaction aux traitements anticancéreux habituels. L'objectif final est d'appliquer cette méthode aux patients. Des études précédentes sur des données de patients ont montré que plus cette protéine est présente, meilleure est la survie des patients, surtout chez les femmes. En laboratoire, nous avons aussi observé que lorsqu'on augmente la quantité de cette protéine, le nombre de cellules tumorales diminue de moitié. De plus, nous avons constaté qu'un activateur de cette protéine a un effet antitumoral sur des tumeurs greffées sous la peau de souris, qu'elles soient mâles ou femelles. Notre objectif est maintenant d'étudier comment une augmentation de la quantité de cette protéine combinée à son activation par une molécule spécifique affecte la croissance tumorale et la réponse aux traitements anticancéreux standards dans un modèle de tumeur intracérébrale chez la souris (qui se rapproche de la réalité chez l'humain). Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour comprendre le rôle de la protéine étudiée dans l’augmentation de la survie des patients et éventuellement proposer l'utilisation de l'activateur de cette protéine pour le traitement des glioblastomes chez les patients dont la tumeur présente une forte quantité de cette protéine. Cette étape est indispensable pour soutenir le transfert clinique de nos travaux en lien avec une thèse de doctorat et les financements de la Ligue contre le cancer et du CNRS. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences d'apparition des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettrait d'apporter de nouvelles voies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des inducteurs (qui augmentent la quantité) et des activateurs (qui augmentent la fonctionnalité) de cette protéine dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimio-sensibilisation).

Procédures

- greffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min (EU1) - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections) : durée 15 min (EU2) - Traitement par radiothérapie (10 itérations) : durée 10 min pour chaque session (EU2) - Traitement par le composé d'intérêt (12 itérations) combiné ou nonà la chimiothérapie (10 itérations) : durée 1 min par traitement (EU1). - Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min (EU1)

Impact sur les animaux

La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l'implantation même du glioblastome (apparition d'une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Puis, le schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et l'imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Lorsque les sessions de bioluminescence sont le même jour que la radiothérapie, une seule anesthésie sera réalisée, l'irradiation et l'imagerie se faisant sur le même site où est hébergé l'irradiateur. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux. Les administrations quotidiennes de l'activateur de la protéine conduisent à un dérangement journalier des animaux, le cycle jour/nuit de l'animalerie étant inversé, la gêne occasionnée sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d'activité. Le site d'injection dans le péritoine sera alterné chaque jour (gauche-droite) pour éviter les réactions liées à l'injection et des aiguilles très fines seront utilisées pour l'injection.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue des procédures. Ainsi 164 souris au maximum seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 58 souris femelles et 58 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (48 souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser une analyse des tissuss pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse à un traitement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus, la mise en place d'une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires. En outre, la réponse d'une tumeur traitée par un médicament dépend de la quantité de médicament qui parvient à la tumeur. De plus, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.

Réduction

Chacune des 3 étapes sera d’abord réalisée chez des animaux femelles puisque la surexpression de la protéine d'intérêt est de bon pronostic essentiellement chez les femmes, puis éventuellement testée chez des animaux mâles pour évaluer la pertinence de cette modulation hormonale pour les hommes. Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées étape par étape, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux "femelles" associés à l'étape 1 qui concerne la comparaison in vivo de la croissance tumorale de cellules avec une forte quantité de protéine par rapport à des cellules tumorales ayant une quantité modéré de la protéine étudiée. Nous implanterons d'abord la concentration habituelle de cellules : si cette dernière offre un bon taux de prise tumorale et une croissance tumorale acceptable cette concentration sera validée et les animaux du groupe suivant ne seront pas utilisés. A l'inverse, si cette concentration s'avère insuffisante, les souris du groupe 3 seront greffées avec une concentration double. La concentration "optimale" retenue sera celle utilisée dans le reste de l'étude. Notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Concernant le nombre de souris satellites, il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs dans les tissus prélevés : ces analyses sont fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour révéler un effet, s’il existe. Ainsi on estime -à priori- que même si l’effet des traitements est faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour assurer une puissance statistique suffisante (simulation par logiciel de calcul de puissance). Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, la comparaison se fera aussi indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures d'imagerie seront réalisées en suivi de traitement. Le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé 10 animaux par groupe pour assurer une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post opératoire rigoureux) puis à la suite de la greffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de l'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Quel que soit le groupe, nous réaliserons la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).

Choix des espèces

Dans les études menées pour comprendre le développement des cancers, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 7 semaines au moment des greffes (20 à 26g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.

Aucune souris n'est gardée plus de vingt-huit jours après l'injection des cellules leucémiques, ni au-delà du point limite si elle l'atteint avant. 32 souris NSG, dépourvues de système immunitaire, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent la leucémie dans la veine de la queue, puis un traitement cellulaire une semaine plus tard, trois prises de sang caudales et des séances d'imagerie sous anesthésie après injection d'un produit dans le ventre. Le porteur décrit la maladie qu'il leur donne, poils hérissés, baisse d'activité, perte de poids et parfois début de paralysie des pattes arrière, pour comparer deux thérapies cellulaires dont l'une pourrait, à terme, persister plus longtemps chez les patients.

Objectifs

La thérapie anti-cancéreuse appelée CAR-T cells, est produite à partir des cellules du patient. Ces cellules sont modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses, ce qui permet de traiter la leucémie. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité disparait à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de ces cellules à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. De plus, nous souhaitons utiliser une nouvelle source de cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST) : celles-ci sont capables de persister à long terme chez les patients. Aussi, nous souhaitons fabriquer des cellules anti-cancéreuses à partir de ces VST. Nous obtiendrons des CAR-VST qui permettraient d’apporter un bénéfice majeur par rapport au traitement de référence par CAR-T car persistant plus longtemps dans l’organisme. Nous devons donc d’abord vérifier qu’elles sont aussi efficaces que les cellules thérapeutiques CAR-T classiques. Pour cela, nous souhaitons étudier ce nouveau traitement en comparaison au traitement actuel par CAR-T cells et montrer premièrement qu’elles sont aussi efficaces que le traitement actuel.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de déterminer si les CAR-VST possèdent un effet anti-leucémique et s’il est comparable au traitement de référence par CAR-T cells. Nous souhaitons voir un effet comparable dans cette expérimentation et valider l’acquisition de cette fonctionnalité anti-tumorale. Puis, dans une prochaine saisine, nous souhaiterions montrer que nos cellules persistent plus longuement dans un modèle de leucémie.

Procédures

-Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J0 (1min) -Une injection de cellules « traitement » à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J7 (1min) -Un prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J14, J21 et J28 (1min) Imagerie des souris par signal lumineux des cellules tumorales : -contention manuelle et injection ventrale d’un produit d’imagerie permettant de suivre les cellules leucémiques, -pendant le temps où la substance agit (10min), induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (30min max)

Impact sur les animaux

- L’injection intraveineuse est douloureuse mais de courte durée et elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction (arrêté par compression avec une compresse stérile). - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des pattes arrière. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie. Pendant la prise d'images, les souris seront endormies et ne ressentiront aucune douleur. - Le prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale sera réalisé avant l’imagerie, avec contention douce.

Devenir

Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 28 jours post injections ou en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences sur cellules pour générer des résultats sur le ciblage des cellules tumorales et valider leur potentiel anti-leucémique de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement développé dans un organisme. Cette saisine permet de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence.

Réduction

Nous utilisons un nombre de souris permettant de générer des résultats fiables et de sécuriser la mise en œuvre si des souris sont à exclure de l’étude du fait de la complexité des gestes techniques. Un effectif de 3 souris par groupe est suffisant selon la simulation d’un outil statistique (G-Power), mais nous souhaitons ajouter 2 souris supplémentaires dans les groupes traités, afin d’avoir une meilleure représentativité des échantillons et pouvoir mieux les caractériser. Nous aurons besoin de 16 souris pour cette saisine. Si les résultats ne sont pas probants, nous souhaitons répéter cette expérience une seconde fois. Cette saisine comprendra 32 souris au maximum.

Raffinement

Les souris seront logées dans une grande cage avec des jouets et des matériaux, avec 3 ou 5 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être.

Choix des espèces

La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.

Une partie des souris utilisées est irradiée du corps entier pour éliminer ses défenses immunitaires, d'autres sont immunodéficientes de naissance et développeraient des maladies hors d'un hébergement protégé. 2 580 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit des cellules tumorales sous la peau, des injections sous-cutanées, intraveineuses ou dans l'abdomen sous anesthésie, et jusqu'à six séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie, certaines étant transportées vers un autre établissement pour l'irradiation. Toutes sont tuées en fin d'étude pour que la radioactivité soit mesurée dans les organes prélevés.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour évaluer l’état d’avancement de la pathologie et permettre d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen indolore d’imagerie médicale. Nous travaillons également sur une nouvelle modalité de traitement appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV) qui utilise la même chimie que les sondes d’imagerie. Nos développent donc des solutions pour mieux détecter et traiter le cancer en « attachant» une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales. La différence réside dans le type de radioactivité utilisé : * pour la détection, on utilise de très faibles doses de radioactivité qui traverse le corps et est détectée par des caméras dédiées. * pour le traitement, on utilise de la radioactivité à très faible rayon d’action qui va détruire les cellules à proximité. Pour que le traitement par RIV soit efficace, il faut d’abord s’assurer qu’il se lie bien aux cellules tumorales, c’est pourquoi le développement de ces nouveaux traitements est souvent associé au développement d’un examen diagnostique. Il est également nécessaire de bien valider que le traitement ne va pas endommager les organes sains et qu’il exerce une action antitumorale. Nos objectifs sont donc triples : * Développer des outils diagnostiques qui serviront de socle pour déterminer si un traitement par RIV peut être développé sur une cible donnée (identifiée préalablement in vitro). * Evaluer l’efficacité antitumorale de traitements RIV visant la même cible. * En dernier lieu évaluer précisément les doses de radioactivité reçues à la tumeur mais également aux autres organes pour les extrapoler à l’homme afin de s’assurer que le traitement sera efficace sur la tumeur et sans danger sur les organes sains

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser précisément à la fois des traceurs diagnostiques d’imagerie nucléaire mais également des composés de thérapie. Il sera à terme ainsi possible de valider en amont du traitement si il se lie bien aux cellules tumorales du patient grâce à une imagerie non invasive afin de lui proposer un traitement parfaitement personnalisé par radiothérapie interne vectorisée, modalité thérapeutique actuellement en plein essor.

Procédures

* Pour certains animaux, une irradiation corps entier dans une autre EU avec transport agréé sans sortie de leur cage – une heure avec le transport. * Une injection sous-cutanée sous anesthésie – environ 5 minutes d’anesthésie et injection sur quelques secondes * Une injection intraveineuse sous anesthésie – environ 5 minutes d’anesthésie et injection sur quelques secondes * Au maximum 6 imageries sous anesthésie : au maximum 1 heure sous anesthésie pour une imagerie limitée à 55 minutes * Une injection intrapéritonéale sous anesthésie– environ 5 minutes

Impact sur les animaux

- L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu sous des conditions sanitaires strictes. - le transport pour irradiation pourrait provoquer un certain stress. - l’implantation sous cutanée de cellules tumorales va mener à une masse sous cutanée qui pourrait si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - L’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales si elle n’est pas maitrisée. - Les produits administrés pour le diagnostic ne devraient pas impacter l’état de santé des animaux car les doses sont très faibles. Pour la thérapie, les produits peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées.

Devenir

Différentes mesures de radioactivité et analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible pour les études de biodistribution et que le traitement envisagé est bien efficace sur la lignée étudiée pour les études d’efficacité.

Réduction

Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. L’effectif d’animaux dans les groupes expérimentaux a été adapté pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant l’effectif à son maximum. Par expérience, les groupes de n=5 souris sont suffisamment robustes pour permettre d’identifier le métabolisme et la pharmacocinétique dans les études de biodistribution. L’imagerie sera répétée et permettra d’éviter d’euthanasier des animaux pour chaque point de temps examiné et ainsi de réduire l’effectif d’autant. Les effectifs devront être étoffés à n=10 pour les études d’efficacité pour prendre en compte les variabilités de réponse au traitement et de pousse tumorale sur le long terme. Enfin, les 1ères données obtenues sur les études dosimétriques permettent d’optimiser les groupes avec n=7 souris pour s’assurer l’obtention de résultats interprétables. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle, permet d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque étude et d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.

Raffinement

L’imagerie utilisée dans nos études est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. La SBEA de l’établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et du nombre d’animaux par groupes. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie eux-mêmes très proches des appareillages humains, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.

Ouverture de la cavité abdominale, implantation de cellules tumorales dans le pancréas ou le cæcum, ablation de la rate pour le modèle de métastases hépatiques, fermeture : trente minutes par souris. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite transférées dans un second établissement, reçoivent une injection tous les sept jours sous anesthésie, passent une imagerie hebdomadaire, puis subissent une seconde ouverture de l'abdomen pour l'exérèse de la tumeur guidée par fluorescence, soit deux laparotomies par animal. Toutes sont tuées et autopsiées pour vérifier l'absence de reprise tumorale, au terme d'une démonstration que le porteur juge impossible autrement que sur des animaux porteurs de ces tumeurs.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation de la tumeur en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant de l’imagerie nucléaire (SPECT) avant l’opération pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (SPECT/fluorescence) afin d'améliorer l’analysé pré-opératoire de la tumeur (SPECT), la détection pendant l’opération des tumeurs et leur élimination (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). L’utilisation de ces Ac bimodaux dans des modèles de tumeurs sous-cutanées a déjà été démontré, ils permettent la visualisation et l’élimination de cette tumeur facile d’accès. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant démontrer l’intérêt de cette technologie dans des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles de cancer du côlon et du pancréas se développant sur ces organes, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. Ces travaux sont en cours de réalisation dans des souris qui sont déficientes en système immunitaire et permettent de greffer des cellules cancéreuses d’origine humaine. Pour mimer encore plus ce que nous pouvons retrouver chez l’homme, nous utiliserons dans ce projet des souris présentant un système immunitaire pour vérifier que les résultats retrouvés seront similaires à ceux obtenus dans les souris immunodéficientes. Ce projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs, le premier dans lequel sera développé les modèles tumoraux, le second dans lequel l’imagerie et la chirurgie assistée par fluorescence seront réalisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir mettre au point des modèles précliniques, chez la souris immunocompétentes, mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs se développant sur les organes et mimant ainsi des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Les bénéfices attendus par ce projet sont de pouvoir développer des modèles précliniques de modèles de cancers afin de pouvoir démontrer l’intérêt de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence après administration d’Ac bimodaux. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

- L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le pancréas ou le caecum, ou d’enlever la rate. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. - Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables, la taille de ces tumeurs sera estimée 1 fois par semaine par imagerie. - L’acte chirurgical d’exérèse nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris. Ces interventions chirurgicales pourraient également entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant chez des animaux pourvus d’un système immunitaire fonctionnel. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée, mais également dans des modèles de souris dépourvues de système immunitaire (en cours).

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les interventions chirurgicales seront précédées d’une antibiothérapie préventive. Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation du soin pré au post-opératoire. Des antalgiques sous forme injectable et sous forme de gel seront utilisés lors de la chirurgie puis sous forme injectable les jours suivant l’opération. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture gélifiée sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines. Ces souris sont largement utilisées pour l’implantation de cellules cancéreuses murines en sous-cutanée mais également dans les organes d’origine. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

246 souris reçoivent une injection de cellules tumorales de mélanome puis un gavage quotidien pendant quinze à vingt semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur tumeur est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, et une partie d'entre elles reçoit en plus une injection tous les deux à quatre jours. Le porteur indique que le gavage quotidien peut irriter le larynx et gêner la déglutition, et que la tumeur peut finir par empêcher l'animal de se déplacer, de s'alimenter et de s'hydrater. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, au terme d'une étude qui vise à confirmer chez la souris un résultat déjà obtenu en culture cellulaire.

Objectifs

Les mélanomes avec mutations activatrices d’un gène particulier peuvent être traités par des thérapies ciblées entrainant une rémission rapide chez 65-70% des patients. Cependant, la majorité des cas développent des résistances au traitement, parfois au bout d’un an seulement. Certaines cellules de la tumeur,, appelées « cellules persistantes », auraient un rôle essentiel dans le développement de ces résistances. Les « cellules persistantes » sont en effet capables de survivre aux thérapies ciblées en engageant des changements qui leur permettent de s'adapter au traitement. Or, ces cellules constituent un réel problème clinique car elles peuvent évoluer en cellules qui résistent de façon permanente à la thérapie. Cette évolution vers des cellules résistantes implique l'introduction d'erreurs dans l'ADN, appelées mutations, qui leur permettent de proliférer et de survivre malgré le traitement. Une étude a mis en évidence que, pour survivre à la thérapie ciblée, les cellules persistantes de mélanome modifient le processus qui permet aux cellules de fabriquer des protéines à partir d'une copie de l'ADN, appelée ARN messager. En effet, lors de thérapie ciblée, il y a une augmentation de la production de certaines protéines, dont l’une d’elles peut potentiellement favoriser l’introduction des erreurs dans la séquence de l'ADN. Afin d'offrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour surmonter cette résistance chez les patients atteints de mélanome, ce projet a pour objectif de démontrer que l'inhibition de la production de cette protéine peut supprimer, ou au moins retarder, la résistance aux thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Environ 50 % des mélanomes présentent une mutation activatrice d’un oncogène (gène dont l’expression favorise la survenue de cancers) particulier. L'inhibition, par thérapie ciblée, de la protéine issue de cet oncogène, permet d'obtenir des réponses thérapeutiques efficaces. Cependant, ces réponses sont souvent limitées dans le temps et la moitié des patients rechutent après 12 à 15 mois. La compréhension des mécanismes à la base de cette résistance est nécessaire, et l'identification du déterminant moléculaire de cette résistance peut offrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer le pronostic des patients. Les expériences in vitro dans les cellules de mélanome traitées par thérapie ciblée montrent un rôle de notre protéine clé dans l'augmentation de l'instabilité génétique, qui est la cause principale de la résistance aux thérapies. Ce projet a donc pour objectif de confirmer l’implication de notre protéine clé dans cette résistance dans un contexte in vivo. De plus, nos expériences in vitro ont permis d’identifier une molécule_actuellement utilisée dans des essais cliniques pour le traitement d'autres types de cancer_ qui peut empêcher les mutations lors de la réparation des dommages à l’ADN et donc limiter la résistance thérapeutique aux thérapies ciblées. Nous devons confirmer ces résultats dans un contexte in vivo. L'objectif à long terme est d'apporter des bénéfices aux patients atteints de mélanome en améliorant le taux de survie des patients .

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience- durée du geste inf à 10 sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines-durée du geste inf à 10sec)). Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour par gavage. Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois tous les 2 jours pendant 22 jours avec un second traitement (administration des traitements par injection aux animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Enfin, dans une troisième procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront aussi traités à raison d’une fois tous les quatre jours pendant 3 semaines (administration des traitements par injection i sur animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Pour tous ces animaux, la croissance tumorale sera mesurée trois fois par semaine sur animal vigile à l’aide d’un pied à coulisse (durée du geste inf à 15 sec).

Impact sur les animaux

La greffe sous-cutanée de cellules tumorales peut amener une gêne qui peut s’amplifier avec le développement de la tumeur, pouvant aller jusqu’à une modification de l’état physiologique de l’animal (manque de toilettage, prostration, difficulté à se déplacer, s’alimenter et à s’hydrater). Ces effets ne sont attendus qu’en fin d’expérience. Le gavage quotidien peut amener une irritation du larynx pouvant amener des difficultés à s’alimenter, à déglutir. L’injection des médicaments peut entrainer une gêne liée à la piqûre elle-même juste après l’injection.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements post-mortem d'organes et de tissus aux fins d'analyses.

Remplacement

Notre étude in vitro utilisant différentes lignées cellulaires de mélanome a permis de déterminer l'implication du processus de production de notre protéine d’intérêt dans la résistance acquise du mélanome à la thérapie ciblée. De plus, nos résultats obtenus in vitro ont montré que l'inhibition de ce processus peut limiter la résistance acquise. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. De plus, Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro suffisamment robuste pour tester des synergies thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d'outils statistiques.

Raffinement

Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. De plus, un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place de la procédure expérimentale pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés tous les jours lors de la procédure , qui est raffinée par l’établissement de points limites précoces, entrainant et la mise en place de soins (supplément alimentaire, administration de solutés) voire la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus précocement possible l’apparition de points limites. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.

Choix des espèces

Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. La souris est le modèle de choix pour les études de cancérologie : les souches sont parfaitement définies et la production de souris immunodéficientes nous permet de travailler sur des modèles cellulaires d’origine humaine. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et ciblée par les éventuels traitements.

Une injection sous la peau tous les deux à trois jours pendant huit semaines, trois mesures de tumeur par semaine, jusqu'à quatre prélèvements sanguins : 85 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit dans le flanc des cellules cancéreuses humaines, laisse croître une tumeur sous la peau, puis reçoit dans la veine de la queue des cellules immunitaires modifiées censées la détruire. La mise à mort sert à prélever le sang et la tumeur. Le porteur retient des souris NSG, incapables de combattre la moindre infection et maintenues en milieu protégé pour cette raison, et affirme qu'"aucune alternative non-animale n'est aujourd'hui disponible".

Objectifs

Les immunothérapies, stratégies privilégiées contre le cancer, visent à stimuler le système immunitaire du patient pour éliminer les cellules cancéreuses. Il est possible de récupérer et modifier les cellules immunitaires du patient, afin qu’elles reconnaissent les cellules cancéreuses, avant de les réinjecter au patient, avec une efficacité clinique démontrée. Nous avons généré des cellules immunitaires capables de reconnaître un sous-type de cancer du sein très agressif et d’autres cancers agressifs et capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier le potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, nous utiliserons des souris permettant l’étude de la croissance des tumeurs en présence des cellules immunitaires spécifiques de la tumeur, avec pour objectif de valider la capacité de ces cellules immunitaires à éliminer les cellules tumorales in vivo. Différents traitements de soutien aux cellules immunitaires injectées seront administrés permettront de sélectionner la condition expérimentale la plus efficace.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle opportunité thérapeutique pour les patients atteints de cancer, du sein, de l’ovaire ou de sarcome. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.

Procédures

Pour réaliser l'injection sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines, la souris est maintenue environ 15 secondes. Une seule injection est effectuée par animal. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. L’injection intraveineuse, se fera au niveau de la veine de la queue (1 min d’immobilisation). Injection sous cutanée de molécules de soutien des cellules lymphocytes ou sérum physiologique : tous les 2 à 3 jours pendant 8 semaines maximum (d'après ce qui est décrit en moyenne dans la littérature). Des prélèvements sanguins seront également réalisés sur animaux vigiles, l’animal est maintenu immobile environ 50 secondes (15 secondes pour l’application de l’anesthésique puis 45 secondes pour le prélèvement). Ces prélèvements seront réalisés 3 ou 4 fois en fonction des groupes. Les souris seront également pesées deux fois par semaine, la souris est maintenue environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Les cellules tumorales seront injectées en sous-cutané dans le flanc droit de la souris, sur animal vigile. Pour cela l’animal est tenu en contention. Le volume injecté est faibl. Une seule injection est réalisée par animal, d’une durée d’environ 15 secondes. Suite à cette injection la souris développera une tumeur. La croissance tumorale sera suivie par mesure au pied à coulisse (3x/sem, 15 sec) sur animal vigile. Le traitement consiste en une injection intraveineuse de cellules immunitaires modifiées. A ce jour, aucun effet indésirable associé au transfert de cellules immunitaires modifiées chez la souris n’a été rapporté dans la littérature. Nous n’envisageons donc pas d’effets indésirables liés à ce traitement. De même aucun effet indésirable n’a été reporté dans la littérature concernant l’injection en sous-cutanée de protéines solubles. Néanmoins, les animaux peuvent ressentir un désagrément voire une douleur modérée au moment des prélèvements sanguins qui est minorée par l’utilisation d’une anesthésie locale

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir analyser la composition du système immunitaire dans le sang et au sein de la tumeur.

Remplacement

Des expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de confirmer la fonctionnalité des cellules immunitaires générées et leur capacité à éliminer des cellules tumorales. Les animaux sévèrement immunodéprimés (NSG) correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires puisqu’ils permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires génétiquement modifiées in vivo, ce qui est un des objectifs de cette étude.

Réduction

Cette procédure devrait nous permettre de sélectionner la condition expérimentale permettant d’observer le meilleur effet de notre traitement. Cette condition sera utilisée par la suite pour évaluer d’autres candidats de thérapie cellulaire. Nous avons utilisé un outil statistique (G-power) permettant de définir le nombre minimal d’animaux nécessaires et suffisants pour satisfaire la validité scientifique de l’étude. Par ailleurs, un nombre optimal d’échantillons et de données seront collectés pour chaque animal pour utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour répondre à l’ensemble des questions de l’étude.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet n’ont pas de système immunitaire, ils sont donc incapables de lutter contre des infections virales ou bactériennes. Ils doivent être hébergés dans un environnement protégé pour éviter toutes contaminations. Les analyses de croissance des tumeurs sont non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par l’observation quotidienne des animaux par des personnes compétentes, par la pesée des animaux et la mesure du développement tumoral. Des points limites adaptés sont définis de manière objective, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Aucun effet indésirable lié à l’injection des cellules immunitaires humaines dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer une douleur, pour pallier cela les animaux sont traités par un anesthésique local quelques min avant les prélèvements.

Choix des espèces

Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes sous-cutanées et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.

Fortement immunodéprimées pour ne pas rejeter les tumeurs ovariennes humaines greffées sous la peau de leur flanc, 636 souris de cinq à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit trois injections intraveineuses d'anticorps conjugués dans la veine de la queue, et subit jusqu'à vingt-quatre pesées et vingt-quatre mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur peut gêner la locomotion et que la contention pour ces mesures génère du stress et une douleur possible au niveau de la tumeur. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever les tumeurs, l'effectif comptant 10 % d'animaux greffés en plus pour compenser les prises de greffe manquées.

Objectifs

Le cancer de l’ovaire est la 9ème cause de cancer chez la femme, le nombre de nouveaux cas diagnostiqués en 2020 en France est estimé à 5320, avec 200 000 nouveaux cas dans le monde entier. Cela en fait, en France, la 5ème cause de mortalité par cancer (CIRC, 2021). Le cancer de l’ovaire peut être asymptomatique pendant longtemps, c’est pourquoi il est malheureusement souvent diagnostiqué à un stade avancé, et le taux de survie des patientes n’est alors que de 17% à 5 ans. Malgré une efficacité initiale élevée, les types les plus courants de carcinomes ovariens rechutent fréquemment en formes résistantes aux chimiothérapies. Les anticorps conjugués à des drogues font partie d’une nouvelle classe de thérapie ciblée. Ils consistent à fixer la chimiothérapie sur un anticorps dirigé contre un récepteur exprimé à la surface des cellules cancéreuses pour la véhiculer au cœur de la tumeur. Ce projet vise à tester l’efficacité anti-cancéreuse de 9 anticorps conjugués dans 4 modèles de cancer de l’ovaire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie de traitement par les anticorps conjugués soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer de l’ovaire. Les données issues de ce travail seront totalement innovantes puisqu’elles porteront sur des composés qui n’ont jusqu’à présent jamais été évalués dans une étude d’efficacité pré-clinique dans le contexte du cancer de l’ovaire, et qui contribueront potentiellement à un meilleur pronostic et survie chez les patients atteints de cette affection.

Procédures

- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 3 injections intraveineuses d’anticorps conjugués à raison d’un par semaine dans la veine de la queue, 30 secondes. Au maximum 24 pesées et 24 mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de 3 par semaine.

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). L’injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Les injections en intra-veineuse hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Le traitement avec chacun des anticorps conjugués n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris aux doses choisies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement des tumeurs et analyses.

Remplacement

Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis d’affiner le design de l’étude en identifiant les anticorps les plus prometteurs pour cette indication mais les interactions avec la tumeur sont complexes et impactées par différents paramètres (structure cellulaire, rigidité). Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessitent de travailler sur un organisme entier et complexe. Pour cette raison nous devons effectuer ces études d’efficacité chez la souris.

Réduction

L’effectif des groupes a été déterminé grâce à un test de puissance statistique qui nous a aidé à déterminer que nous aurions besoin de 8 animaux par groupe. Nous avons également besoin de 4 animaux par groupe pour les études d’histologie. Pour les 12 groupes, il faudra donc 144 animaux. Avec une prise de greffe d’environ 90%, 10% soit 15 animaux supplémentaires par modèle seront greffés. Les études sur les différents modèles tumoraux seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation de 7 jours et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en pratiquant la contention une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs possèdent l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi du modèle de cancer de l’ovaire ainsi que pour l’administration de traitements en intraveineuse. Par ailleurs, l'état des animaux sera évalué par une grille de scoring sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos voûté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les critères observables sont évalués quotidiennement, les critères mesurables (poids, taille des tumeurs) sont évalués trois fois par semaine. Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Si jugé nécessaire, un traitement antalgique sera mis en place.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler sur des tumeurs issues de cellules humaines afin d’être au plus près de la réalité clinique, nous avons donc besoin d’animaux présentant un système immunitaire fortement déprimé afin d’éviter le phénomène de rejet. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif, cette souche étant un modèle qui permet une prise tumorale efficace avec de nombreuses lignées humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

2 710 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections de traitement et douze injections d'un traceur luminescent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour des prélèvements post-mortem. Greffées en sous-cutané ou en intraveineux avec des cellules tumorales de myélome, ces souris immunodéprimées subissent des séances d'imagerie sous anesthésie et des prélèvements sanguins, les tumeurs pouvant se nécroser, s'ulcérer au point d'injection ou gêner leurs mouvements. Les retombées annoncées, moins de toxicité pour les patients grâce à une meilleure pharmacocinétique, restent au futur, et le porteur affirme que l'animal reste "inévitable" à ce stade et que "l'animal entier" est "nécessaire".

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est une tumeur maligne caractérisée par une infiltration de la moelle osseuse. La survie à 5 ans de patients atteints de MM est de 48,5 % et malgré l'introduction de médicaments immunomodulateurs et d'inhibiteurs du protéasome, de nombreux patients présentant des caractéristiques à haut risque ont toujours de faibles taux de survie. Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive de la maladie après le traitement est un défi central pour améliorer les résultats des patients atteints de MM. Les objectifs du projet sont de développer de nouveaux nanotransporteurs pour la délivrance de molécules d’intérêts à visés thérapeutiques dans le cadre de traitement anti-cancéreux notamment dans le myélome multiple. Ces nanotransporteurs auront également la capacité d’être couplées à des molécules pour le dépistage ou le suivi du développement tumoral par imagerie chez l’Homme. Nos expertises pluridisciplinaires à l’interface entre la chimie et la biologie, nous permettent de développer des nanotransporteurs aux caractéristiques physico-chimiques divers (polymérique, lipidique et inorganique de tailles variables). Ces molécules synthétiques pourront encapsuler des agents thérapeutiques tels que des peptides, des chimiothérapies, des protéines. Les nanotransporteurs seront couplés à des molécules thérapeutiques et fonctionnalisés pour le ciblage des cellules cancéreuses ou de son environnement direct afin d’améliorer l’efficacité et la spécificité du traitement. Ils pourront également être utilisés pour l’amélioration de la sensibilité, du suivi des tumeurs et du diagnostic. Cette première partie du projet consistera à identifier via des études pharmacocinétiques sur souris saines les nanotransporteurs proposant les meilleures propriétés cinétiques ainsi que la biodistribution la plus adéquates en fonction de l’utilisation souhaitée (traitement, imagerie). Dans un second temps, nous évaluerons précliniquement sur un modèle de tumoral de myélome murin l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules formulées en nanotransporteurs.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanotransporteurs dans l’arsenal thérapeutique et diagnostic actuel du myélome. La comparaison des différentes nanotransporteurs ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanotransporteurs sur le ciblage actif, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanotransporteurs pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

Pour la mise en place des modèles tumoraux, les animaux seront soumis à une injection sous cutanée ou intra veineuse de cellules tumorales d'une durée

Impact sur les animaux

Certaines molécules envisagées sont en essais cliniques et leurs effets indésirables sont donc connus. Les nuisances dues à leurs utilisations peuvent être les suivantes : une perte de poids, un œdème, une tachycardie, une dyspnée, une hypotension, un syndrome de réponse respiratoire systémique (SIRS) ou une pneumonie (inflammation de la couche mince de tissu située entre les sacs alvéolaires). Les nuisances identifiées sur souris implantées avec des cellules tumorales sont l'apparation d'une tumeur dont la taille va augmenter si ce n'est dans les groupes traités avec les nouveaux médicaments qui s'ils sont efficaces devraient réduire la taille de ces tumeurs. En évoluant la tumeur pourrait présenter une apparence de nécrose ou s'ulcérer au lieu d’injection ou génêr l'animal dans ses mouvements. Les transporteurs de médicaments testés ont pour but d’améliorer la délivrance des traitement directement dans l’environnement tumoral par leur fonctionnalisation et de ce fait, d’en réduire les effets secondaires et en potentialisant leurs pouvoirs thérapeutiques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro déterminant la spécificité de ciblage et la cytotoxicité des nanotransporteurs ont été préalablement réalisé afin de remplacer une partie des expérimentation in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. Un modèle de greffe orthotopique est notamment important car même s’il demande un suivi tumoral par imagerie (sous anesthésie) il reste plus représentatif du microenvironnement du myélome (cancer du sang) ; l’animal entier est donc nécessaire. En effet, la pharmacocinétique des groupes de traitement cités ci-dessus et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peut être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanotransporteurs pour le traitement du myélome multiple et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérent à un organisme entier.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été calculé mathématiquement et les résultats entre les groupes d’animaux seront comparés avec des tests statistiques adaptés et robustes permettant de mettre en évidence l’effet des traitements testés sur la croissance des tumeurs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude complète de 5 nanotransporteurs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la cellule bien-être (ex : bâton à ronger, coton pour faire un nid permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels). Les animaux observeront une période d’acclimatation après réception. Un tunnel dans la cage et/ou une habituation à la contention (2-3x par semaine sur au moins 1 semaine) sera réalisée avant chaque procédure afin de minimiser le stress due à la contention lors des injections ou à leur manipulation. Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Chaque animal est étroitement suivi dès lors qu’il entre dans l’une des procédures (2 à 3 fois par semaine) afin d’identifier les signes de stress, de douleur le plus précocement possible. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin de soustraire l’animal à toute forme de souffrance en interrompant la procédure. Les données seront intégrées à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de douleur, taille de tumeur, etc.) et l’animal pris en charge selon le score obtenu.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Dans le domaine de la cancérologie , la greffe de cellules tumorales ne peut être réalisée avec succès que sur des souris immunodéprimées adultes afin d'éviter tout phénomène de rejet de la greffe de cellules tumorales ce qui permet ensuite de suivre la croissance tumorale au cours diu temps et d'évaluer l'impact de candidats médicaments sur cette croissance.