Cancers

Toutes tuées pour prélever leur tumeur, 78 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une injection de cellules cancéreuses au flanc gauche fait pousser une tumeur pancréatique, suivie de trois séances d'ultrasons sous anesthésie et de trois injections intrapéritonéales d'immunothérapie, à raison d'une par semaine. Le porteur prévoit des mesures de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine pendant trois mois au plus, et signale que des métastases pulmonaires provoqueraient un affaiblissement et des difficultés respiratoires. Il justifie le choix de la souris en écrivant qu'elle est la plus petite espèce dont les tumeurs deviennent assez grosses pour être traitées par ultrasons.

Objectifs

Alors que l’immunothérapie s’avère être un traitement efficace pour certains cancers, elle ne l’est pas pour le cancer du pancréas. Ce dernier est la deuxième cause de décès liée aux cancers en France. La chirurgie curative, à un stade précoce, est actuellement le seul traitement qui permet une survie à long terme, à environ 20% à 5 ans. L’environnement de la tumeur semble être responsable de cet échec. Il est proposé ici d’utiliser les ultrasons pour désorganiser cet environnement tumoral et permettre à l’immunothérapie de pouvoir atteindre la tumeur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie cavitation + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas pour qui le taux de survie à 5 ans est très faible.

Procédures

- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 3 traitements par ultrasons maximum 15 minutes sous anesthésie à raison d’un par semaine, - 3 injections intrapéritonéales à raison d’une par semaine dans l’abdomen, 30 secondes - 3 injections sous cutanée d’antidouleur (30 secondes) à raison d’une par semaine– Autant de pesées que nécessaires seront réalisées et mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de trois par semaines aussi longtemps que nécessaire (3 mois maximum si traitement efficace).

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). Une injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Si le modèle métastase, il entraînera une perte de poids et un affaiblissement chez les souris avec notamment difficultés respiratoires (si métastases aux poumons). Les injections intrapéritonéales hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale gazeuse et un traitement aux ultrasons une fois par semaine. Les ultrasons peuvent induire des pétéchies (présence de petites taches rouges sur la peau) dues à la cavitation, résorbées entre 2 traitements. Le traitement par immunothérapie n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris.

Devenir

Tous les animaux en études seront mis à mort pour les prélèvements de tumeurs.

Remplacement

Plusieurs informations ont été données via des études sur des sphéroïdes : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons, ce qui a permis de designer cette étude sur animal et de l’affiner. Les paramètres de traitement aux ultrasons ont été évalués par simulations informatiques. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Dans cette étude 78 animaux seront utilisés. L’utilisation de l’outil de calcul d’effectif de l’EDA (Experimental Design Assistant, NC3R) nous a permis de définir le nombre d’animaux nécessaire afin de conclure quant à l’efficacité de notre traitement. De plus, nous collecterons un nombre maximal de données par animal afin de répondre aux différentes questions de notre étude en utilisant le nombre d’animaux minimal mais suffisant.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Des points limites détectés via une grille de score permettront, en fonction des observations, la mises en place de mesures : -Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. -En prévision d’éventuelles douleurs les souris recevront une injection d’antalgique au préalable du traitement aux ultrasons. - Les animaux seront placés sur litière en cellulose pour éviter toute ulcération, irritation ou nécrose des tumeurs, si malgré la litière suite au traitement une irritation est observée on appliquera une crème localement sur 7 jours. - En cas de douleur observée via les critères de la grille de score et via la palpation on administrera un antidouleur sur 48h. Si la douleur est toujours présente alors on mettra à mort les animaux. Si les tumeurs deviennent nécrotiques les animaux seront mis à mort. Nous possédons l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi du modèle de cancer du pancréas ainsi que pour l’administration de traitements.

Choix des espèces

La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. Dans notre étude, elle est choisie car nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent. La souris est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 7-8 semaines, 7 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature.

Une partie des souris utilisées a un système immunitaire déficient, ce qui permet de leur greffer des cellules leucémiques prélevées sur des patients. 4 912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit jusqu'à sept injections intraveineuses et dix injections intrapéritonéales, 3 192 d'entre elles jusqu'à quinze gavages, 1 440 jusqu'à trois ponctions de moelle osseuse dans le fémur et 720 une injection directe dans la moelle. La leucémie provoquée peut entraîner une anémie, une grosse rate et des difficultés de locomotion quand la greffe gagne le cerveau, et le porteur prévoit de tuer l'animal dès l'apparition de signes de souffrance.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) représentent les cancers du sang les plus courants de l’adulte, mais elles demeurent très difficiles à traiter avec un taux de rechute élevé et seulement 20% de survie chez les patients agés. Au cours des 40 dernières années, les traitements pour les LAM ayant très peu progresser, il est crucial de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients, notamment après une rechute. Nos recherches ont identifié une nouvelle cible : la SUMOylation, un processus qui modifie certaines protéines. Nous avons réalisé des tests en laboratoire sur des cellules leucémiques, y compris celles résistantes aux traitements existants, ainsi que sur des cellules de patients. Nos résultats préliminaires ont montré que notre traitement ciblant la SUMOylation pourrait être prometteur pour traiter les LAM. Nous devons désormais confirmer ces résultats dans des modèles animaux, plus proches de la réalité clinique, avant de pouvoir envisager des essais sur des patients. De plus, nous avons découvert que bloquer la SUMOylation pouvait stimuler le système immunitaire pour combattre les cellules cancéreuses mais nous devons confirmer ces résultats sur des souris. Enfin, nous explorerons également si notre traitement peut être utilisé en combinaison avec d'autres médicaments déjà utilisés en clinique pour augmenter son efficacité.

Bénéfices attendus

Les LAM sont des cancers au pronostic sombre. Ce projet a pour objectif d’étudier une nouvelle approche thérapeutique consistant à cibler la SUMOylation, un processus qui modifie certaines protéines, seule ou en combinaison avec d'autres molécules déjà utilisées en clinique. La validation préclinique effectuée dans le cadre de ce projet constituera une étape essentielle au développement clinique de ces nouvelles molécules.

Procédures

En fonction de la procédure dans laquelle ils seront impliqués, les animaux pourront subir : 1- Injection intraveineuse à la veine caudale sur animaux vigiles à l’aide d’un tube à contention (durée de la procédure : 1 minute): l’ensemble des animaux inclus dans ce projet (soit 4912 souris) seront soumis à des injections en I.V., au maximum 7 fois au cours de leur vie 2- Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles (durée de la procédure : 30 secondes): l’ensemble des animaux inclus dans ce projet seront soumis à des injections en I.P., au maximum 10 fois au cours de leur vie 3- Gavage sur animaux vigiles (durée de la procédure : 30 secondes): cette intervention concernera un maximum de 3192 animaux (en fonction des combinaisons de molécules sélectionnées pour la suite du projet au cours de la procédure 1) et sera réalisée au maximum 15 fois au cours de la vie de l’animal 4- Prélèvement de moelle osseuse en intra fémoral (durée de la procédure : 2 minutes) : cette intervention concernera 1440 animaux qui seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée. Ce geste sera réalisé au maximum 3 fois au cours de la vie de l’animal et au minimum à 4 semaines d’intervalle. 5- Injection orthotopique dans la moelle osseuse en intra fémoral (durée de la procédure : 2 minutes) : cette intervention concernera 720 animaux qui seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée. Ce geste sera réalisé une seule fois au cours de la vie de l’animal. 6- Prélèvement de sang à la veine caudale (durée de la procédure : 1 minutes): Cette intervention concernera au maximum 2208 animaux et sera réalisée au maximum 7 fois (50µl de sang) au cours de la vie de l’animal et au minimum à 14 jours d’intervalle. L’ensemble de ces gestes étant parfaitement maîtrisés par le personnel amené à intervenir dans ce projet, les durées d’interventions sont très courtes ce qui limite le stress et l’inconfort des animaux.

Impact sur les animaux

La greffe de cellules leucémiques chez la souris peut induire l'apparition de symptômes tels que l'anémie, la splénomégalie ainsi que des difficultés de locomotion lorsque la greffe se localise dans le cerveau.

Devenir

Dans la mesure où nous induisons une pathologie chez l’animal qui peut induire des nuisances, les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure ou dès lors qu'un des animaux présentera des signes de souffrance.

Remplacement

Nos recherches ont montré en laboratoire l'importance de la SUMOylation, un mécanisme qui modifie les protéines, dans les Leucémies Aigues Myéloïdes (LAM), notamment en tant que cible potentielle pour des traitements. Maintenant, pour confirmer si ces observations pourraient être applicables en clinique dans le futur, nous devons nécessairement tester ces molécules sur des animaux de laboratoire dont le système immunitaire est déficient et qui portent des cellules cancéreuses de patients pour évaluer l’efficacité de nos traitements sur un organisme vivant complet plus proche de la réalité clinique. De plus, étant donné que le TAK possède des effets sur le système immunitaire, nous devons également vérifier ces résultats sur des animaux de laboratoire ayant un système immunitaire normal, pour comprendre comment celui-ci pourrait contribuer à l'efficacité du traitement contre le cancer. Si nos résultats se confirment dans ces tests, cela ouvrirait de nouvelles pistes pour traiter les patients atteints de LAM.

Réduction

Nous utilisons des cellules leucémiques luminescentes pour suivre l’évolution du cancer à l’aide d’une caméra adaptée dont nous disposons au laboratoire. Quand cela sera possible, nous utiliserons cette méthode pour suivre la progression des tumeurs. Cela nous permettra d'utiliser beaucoup moins d'animaux pour nos expériences. De plus, nous utiliserons un logiciel de calcul de statistiques qui permet d'optimiser nos groupes expérimentaux, avec un maximum de 8 souris par groupe. Cela nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés tout en étant certains que nos résultats restent fiables.

Raffinement

Les souris seront hébergées au maximum par groupe de 5 animaux par cage afin de limiter stress et angoisse et bénéficieront d'au moins 2 enrichissements/cage (coton et cabane). Lors du change, effectué de façon hebdomadaire par le même zootechnicien, la cabane et une partie du nid seront conservés afin de garder les odeurs des animaux dans la cage propre et ainsi limiter le stress. Dans les pièces de stabulation, nous diffusons des sons de nature (oiseaux, rivière, forêt) afin de limiter les variations sonores entre le jour et la nuit dans le but de réduire le stress des animaux. Pour les animaux en cours d'expérimentation et qui sont manipulés plusieurs fois par semaine, nous ajouterons une roue d'exercice par cage comme enrichissement supplémentaire, ainsi que de l’aliment et de l’eau en gel afin de favoriser l’hydratation des animaux et d’agrémenter leur alimentation. Au cours des procédures nécessitant une anesthésie, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane 2,5%. Concernant les procédures pouvant induire de la douleur (injection intra-fémorale), une analgésie à la Buprénorphine 0.05mg/kg en sous-cutané 30 minutes avant l’injection puis 12h post-injection sera administrée. Afin de réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement, y compris les weekends, et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité, isolement, hérissement des poils, dos voûté, difficulté de locomotion) seront recherchés et seront répertoriés dans la grille de scoring jointe en annexe. En fonction du score obtenu, l’animal sera maintenu sous simple surveillance, surveillance accrue (2 fois/jour) ou immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

En vue d'une utilisation clinique future, seule une étude pré-clinique menée in vivo chez la souris permettra de valider la SUMOylation comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des LAMs. Le modèle murin est particulièrement pertinent pour la réalisation notre projet. Nous utiliserons des modèles de souris immunodéprimées et immunocompétentes. En effet, les modèles immunodéprimés permettent de greffer aisément des cellules de patients et de récapituler la pathologie humaine chez la souris afin de tester l'efficacité anti-tumorale de nos molécules. Par ailleurs, il existe déjà des modéles syngéniques de LAM chez la souris qui nous permettrons d'évaluer le rôle du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale induite par l'inhibition de la SUMOylation. Les animaux utilisés auront entre 6 et 8 semaines. Ce niveau de développement permet une greffe efficace des cellules humaines et permet d'effectuer des expériences à long terme, en particulier dans le cas des patient-derived xenografts (Pdx) qui peuvent nécessiter jusqu'à 6 à 8 mois pour se développer.

2 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections de médicament et douze injections de traceur luminescent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées avec des cellules tumorales de myélome, elles subissent des prélèvements sanguins sous anesthésie et des séances d'imagerie espacées de deux à trois jours. Le porteur indique que la tumeur peut se nécroser, s'ulcérer au point d'injection ou gêner l'animal dans ses mouvements. Les retombées annoncées pour les personnes malades, moins de toxicité et une meilleure pharmacocinétique, restent au conditionnel, quand l'objectif immédiat consiste à comparer cinq nanotransporteurs.

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est une tumeur maligne caractérisée par une infiltration de la moelle osseuse. La survie à 5 ans de patients atteints de MM est de 48,5 % et malgré l'introduction de médicaments immunomodulateurs et d'inhibiteurs du protéasome, de nombreux patients présentant des caractéristiques à haut risque ont toujours de faibles taux de survie. Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive de la maladie après le traitement est un défi central pour améliorer les résultats des patients atteints de MM. Les objectifs du projet sont de développer de nouveaux nanotransporteurs pour la délivrance de molécules d’intérêts à visés thérapeutiques dans le cadre de traitement anti-cancéreux notamment dans le myélome multiple. Ces nanotransporteurs auront également la capacité d’être couplées à des molécules pour le dépistage ou le suivi du développement tumoral par imagerie chez l’Homme. Nos expertises pluridisciplinaires à l’interface entre la chimie et la biologie, nous permettent de développer des nanotransporteurs aux caractéristiques physico-chimiques divers (polymérique, lipidique et inorganique de tailles variables). Ces molécules synthétiques pourront encapsuler des agents thérapeutiques tels que des peptides, des chimiothérapies, des protéines. Les nanotransporteurs seront couplés à des molécules thérapeutiques et fonctionnalisés pour le ciblage des cellules cancéreuses ou de son environnement direct afin d’améliorer l’efficacité et la spécificité du traitement. Ils pourront également être utilisés pour l’amélioration de la sensibilité, du suivi des tumeurs et du diagnostic. Cette première partie du projet consistera à identifier via des études pharmacocinétiques sur souris saines les nanotransporteurs proposant les meilleures propriétés cinétiques ainsi que la biodistribution la plus adéquates en fonction de l’utilisation souhaitée (traitement, imagerie). Dans un second temps, nous évaluerons précliniquement sur un modèle de tumoral de myélome murin l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules formulées en nanotransporteurs.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanotransporteurs dans l’arsenal thérapeutique et diagnostic actuel du myélome. La comparaison des différentes nanotransporteurs ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanotransporteurs sur le ciblage actif, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanotransporteurs pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

Pour la mise en place des modèles tumoraux, les animaux seront soumis à une injection sous cutanée ou intra veineuse de cellules tumorales d'une durée

Impact sur les animaux

Certaines molécules envisagées sont en essais cliniques et leurs effets indésirables sont donc connus. Les nuisances dues à leurs utilisations peuvent être les suivantes : une perte de poids, un œdème, une tachycardie, une dyspnée, une hypotension, un syndrome de réponse respiratoire systémique (SIRS) ou une pneumonie (inflammation de la couche mince de tissu située entre les sacs alvéolaires). Les nuisances identifiées sur souris implantées avec des cellules tumorales sont l'apparation d'une tumeur dont la taille va augmenter si ce n'est dans les groupes traités avec les nouveaux médicaments qui s'ils sont efficaces devraient réduire la taille de ces tumeurs. En évoluant la tumeur pourrait présenter une apparence de nécrose ou s'ulcérer au lieu d’injection ou génêr l'animal dans ses mouvements. Les transporteurs de médicaments testés ont pour but d’améliorer la délivrance des traitement directement dans l’environnement tumoral par leur fonctionnalisation et de ce fait, d’en réduire les effets secondaires et en potentialisant leurs pouvoirs thérapeutiques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro déterminant la spécificité de ciblage et la cytotoxicité des nanotransporteurs ont été préalablement réalisé afin de remplacer une partie des expérimentation in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. Un modèle de greffe orthotopique est notamment important car même s’il demande un suivi tumoral par imagerie (sous anesthésie) il reste plus représentatif du microenvironnement du myélome (cancer du sang) ; l’animal entier est donc nécessaire. En effet, la pharmacocinétique des groupes de traitement cités ci-dessus et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peut être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanotransporteurs pour le traitement du myélome multiple et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérent à un organisme entier.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été calculé mathématiquement et les résultats entre les groupes d’animaux seront comparés avec des tests statistiques adaptés et robustes permettant de mettre en évidence l’effet des traitements testés sur la croissance des tumeurs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude complète de 5 nanotransporteurs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la cellule bien-être (ex : bâton à ronger, coton pour faire un nid permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels). Les animaux observeront une période d’acclimatation après réception. Un tunnel dans la cage et/ou une habituation à la contention (2-3x par semaine sur au moins 1 semaine) sera réalisée avant chaque procédure afin de minimiser le stress due à la contention lors des injections ou à leur manipulation. Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Chaque animal est étroitement suivi dès lors qu’il entre dans l’une des procédures (2 à 3 fois par semaine) afin d’identifier les signes de stress, de douleur le plus précocement possible. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin de soustraire l’animal à toute forme de souffrance en interrompant la procédure. Les données seront intégrées à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de douleur, taille de tumeur, etc.) et l’animal pris en charge selon le score obtenu.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Dans le domaine de la cancérologie , la greffe de cellules tumorales ne peut être réalisée avec succès que sur des souris immunodéprimées adultes afin d'éviter tout phénomène de rejet de la greffe de cellules tumorales ce qui permet ensuite de suivre la croissance tumorale au cours diu temps et d'évaluer l'impact de candidats médicaments sur cette croissance.

212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau une injection de cellules cancéreuses de la tête et du cou, puis pour certaines un anticorps trois fois par semaine pendant six semaines sur animal vigile, la croissance de la tumeur pouvant provoquer une ulcération de la peau. Le porteur écrit que le traitement administré a le potentiel d'améliorer le bien-être des animaux non-humains en réduisant la charge tumorale, tumeurs qu'il a lui-même greffées. Sur le remplacement, il indique que des études sur lignées cellulaires précèdent les expériences, mais qu'une validation sur "animal entier" reste requise pour reproduire la complexité du système immunitaire.

Objectifs

Les cancers de la tête et du cou sont la 8ème causes de mortalité attribuable au cancer dans le monde. De nouveaux types de traitements faisant appel à des anticorps ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour les cancers de la tête et du cou. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré dans le cancer du foie que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant ce dernier à la fois chez l’homme et la souris. L’objectif de notre projet est d’étendre nos recherches aux cancers de la tête et du cou afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps dans ces cancers.

Bénéfices attendus

Les cancers de la tête et du cou sont un grave problème de santé public. Dans les cas les plus avancés, ils répondent très mal au traitements traditionnels et l’immunothérapie n’est efficace que chez un groupe restreint de patients. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et potentiellement la survie de très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres maladies.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 3 fois par semaine pendant 6 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute. Les animaux anesthésiés subiront un prélèvement de sang unique, d'une durée de 1 minutes.

Impact sur les animaux

Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection, ou de l’inflammation. La contention des animaux peut engendrer un stress. Par ailleurs, le traitement administré a le potentiel d’améliorer le bien-être des animaux en réduisant la charge tumorale.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation sur animal entier permettant de reproduire la complexité du système immunitaire avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

Immunodéprimées pour que des cellules tumorales humaines prennent sans être rejetées, 272 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules exprimant la mésothéline sous anesthésie, puis des séances d'imagerie par bioluminescence également sous anesthésie, et 24 d'entre elles un prélèvement sanguin. Le porteur écrit qu'elles développeront une pathologie humaine potentiellement grave et que l'anesthésie, les pesées et les mesures de masse tumorale peuvent être source d'angoisse. Toutes sont tuées pour que leurs organes soient examinés en imagerie ex vivo, l'objet étant de mettre au point un agent d'imagerie servant à présélectionner les patients éligibles à une thérapie ciblée.

Objectifs

Combiner l’imagerie des tumeurs et un traitement ciblé constitue une avancée prometteuse dans le domaine de la médecine personnalisée, c'est-à-dire adaptée à chaque patient. Cette combinaison d’approches se base sur l'utilisation d’une même cible tumorale pour, à la fois, guider la pré-sélection des patients susceptibles de mieux répondre au traitement ciblé et suivre l’effet du traitement et l'évolution de la maladie. La mésothéline est une protéine présente en grande quantité dans divers cancers agressifs tels que ceux des ovaires, du pancréas, du sein triple négatif et des poumons, pour lesquels les options thérapeutiques sont limitées. En raison de sa forte expression dans les tumeurs et de son rôle dans le développement tumoral, la mésothéline est une cible intéressante. Les anticorps à un seul domaine sont des molécules attrayantes en raison de leur petite taille, de leur courte demi-vie sérique, de leur spécificité et de leur modularité. Ils sont utilisés pour développer de nouveaux traitements et des agents d’imagerie non invasive. Des anticorps à un seul domaine ciblant la mésothéline ont été utilisés pour développer des agents d'imagerie non invasive afin de faciliter le diagnostic des patients atteints de cancer sur-exprimant la mésotheline. Après une caractérisation in vitro approfondie sur des différents modèles cellulaires, la capacité des molécules candidates à cibler spécifiquement les tumeurs sera évaluée in vivo sur des modèles murins porteurs de greffes de cellules tumorales humaines exprimant la mésothéline. Ces avancées pourraient ouvrir de nouvelles perspectives dans le diagnostic et le traitement des cancers associés à la surexpression de la mésothéline.

Bénéfices attendus

Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car dans une perspective de thérapie ciblée des cancers exprimant la mésothéline, le développement d’agents d’imagerie spécifiques de la mésothéline comme test compagnon pour prédire l'éligibilité des patients, suivre la réponse au traitement, surveiller l’évolution de la maladie l’évolution ou pour guider en temps réel l’exérèse des tumeurs au cours d'une intervention chirurgicale est d'une importance croissante.

Procédures

L’ensemble des animaux recevra l’administration de candidats diagnostiques et subira une transplantation de cellules tumorales sous anesthésie (durée= 6 à 10 minutes/souris). Le ciblage tumoral par les composés sera effectué par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris). Enfin, 24 animaux sur les 272 prévus dans ce projet subiront également un prélèvement sanguin (durée = moins d’1 minute) à l’aide de matériel dédié aux rongeurs.

Impact sur les animaux

Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie humaine potentiellement grave. L’ensemble des animaux recevront des molécules candidates pour de l’imagerie optique de tumeurs. L'anesthésie des souris nécessaire à l’imagerie et à la transplantation, les pesées et les mesures de masse tumorale peuvent être source d'angoisse.

Devenir

L'ensemble des animaux de cette étude sera mis à mort à la fin des étapes expérimentales pour des raisons de caractérisations ex vivo par imagerie sur les organes.

Remplacement

Le projet in vivo est dans la continuité d’études réalisées in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez des patients. Nous avons besoin d’un modèle pertinent permettant de reproduire au mieux, non seulement la complexité du développement tumoral d’un point de vue phénoménologique, mais également la biodistribution des molécules candidates.

Réduction

Les études in vivo ne seront réalisées que sur les molécules candidates qui auront démontré une efficacité maximale in vitro. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir démontrer que l’effet de nos molécules est significatif par rapport aux groupes contrôles. De plus, lorsque ce sera possible, nous mutualiserons les groupes contrôles. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

Les procédures d’implantation des cellules tumorales et d’imagerie par fluorescence seront réalisées sous anesthésie volatile. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de coton et de dômes en carton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de tumeurs humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propres études, pour ce type de modèle d’injection de cellules tumorales humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

Dépourvues de poils par sélection, les souris SKH-1 laissent voir et mesurer les tumeurs de la peau sans rien raser. 80 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois fois par semaine pendant deux, quatre ou six mois, elles sont exposées aux UVB, en continu aux radiofréquences 5G à 26 GHz, ou aux deux, jusqu'à ce qu'apparaissent vers la seizième semaine de multiples tumeurs cutanées sur le dos, que le porteur décrit comme pouvant gêner leurs déplacements et les empêcher d'atteindre la nourriture dans la mangeoire. Toutes sont tuées pour prélever les tumeurs et la peau du dos.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet d'une exposition à la fois aux ondes radiofréquences (RF) émises par les systèmes de communications sans fil et au rayonnement solaire ultraviolet (UV) sur le développement des tumeurs cutanées chez la souris. Au cours de sa vie, l'homme est quotidiennement exposé à ces 2 types de rayonnement, possiblement cancérogène ou cancérogène connu, ce qui peut avoir des effets néfastes sur sa santé. De ce fait, l'exposition combinée et consécutive à ces deux agents physiques omniprésents dans notre environnement pourrait jouer un rôle important dans l'apparition de cancers cutanés. Avec l’arrivée de la nouvelle technologie 5G et ses fréquences plus élevées comme 26 GHz, il est crucial de savoir comment cela pourrait affecter la santé humaine, en particulier la peau. Bien qu’il soit connu que l'exposition au soleil, en particulier aux rayons UVB, endommage l'ADN et produit des substances nocives telles que des radicaux libres, nous n'avons pas encore suffisamment d'informations sur l'impact des ondes de téléphones portables à 26 GHz. Notre idée est donc que l'exposition quotidienne à ces deux facteurs pourrait potentialiser l'apparition des cancers cutanés chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de déterminer l'impact des RF sur les cancers cutanés UVB induits. Grâce à ce projet, nous espérons obtenir une réponse claire sur les RF : i) elles n'ont pas d'effet ii) elles jouent un rôle protumoral ou au contraire iii) un rôle antitumoral. Les données obtenues permettront d’améliorer la prévention concernant la survenue des cancers cutanés et diminuer leur mortalité si les RF amplifient l’effet délétère des UV. Les cancers cutanés sont visibles, affligeants, induisant un stress psychologique important. Limiter l’apparition des cancers cutanés et leurs effets secondaires, améliorera la qualité de vie des personnes touchées et diminuera le coût en terme de santé publique.

Procédures

Les animaux sont exposés aux rayons UVB 3 fois par semaine pendant moins d'une minute et/ou aux radiofréquences (RF) en continu et cela pendant 2, 4 ou 6 mois. A l'apparition des premières tumeurs, le volume tumoral est mesuré 1 à 2 fois/semaine au pied à coulisse sur souris vigile et cela jusqu'à la fin de la phase expérimentale.

Impact sur les animaux

L'exposition répétée aux UVB provoque de multiples petites tumeurs cutanées sur le dos des souris qui vont apparaitre aux alentours de 16 semaines d'irradiation. Ces tumeurs peuvent devenir gênantes pour se déplacer ou se redresser pour attraper la nourriture dans la mangeoire. Il est également possible que la co-exposition aux RF accentue le niveau de nuisance, si comme nous le supposons les RF potentialisent les effets des UVB.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et la peau du dos pour les différentes analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires in vitro ainsi que des modèles d'épidermes pigmentés humains reconstruits in vitro pour répondre à ces questions. Cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que la formation d’une tumeur, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. De nombreux articles ont mis en évidence l'importance du microenvironnement dans le processus de carcinogènése cutanée et malheureusement, il est à ce jour, très difficile de reproduire ce microenvironnement tumoral in vitro. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de ce projet a été scrupuleusement réduit au minimum en tenant compte de nos 10 ans d’expériences en matière de cancérogénèse UVB induite. En effet, les souris ne sont pas consanguines et par conséquent, nous avons toujours 2 ou 3 souris qui ne répondent pas aux irradiations ou peuvent avoir des réponses complétement atypiques par rapport au reste du groupe (croissance tumorale trop rapide ou trop lente), ce qui a été bien constaté au cours de nos précedentes expérimentations. Pour ces raisons, nous avons déterminé via des tests statistiques qu'un lot de 20 souris par condition était nécessaire pour avoir des données statistiquements exploitables à la fin de l'étude. Nous utiliserons également des lots témoins communs afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les animaux qui ne répondent pas favorablement seront néanmoins utilisés pour des prélèvements de peau et serviront de contrôle pour des analyses ultérieures.

Raffinement

Des études pilotes ont été réalisées pour raffiner l’ensemble de nos procédures expérimentales sur les animaux de manière à réduire au minimum les temps d’exposition, les temps de contention et d’isolement afin de prévenir toute douleur ou inconfort chez nos animaux. De plus, nous réalisons une surveillance quotidienne de nos animaux et nous avons mis en place des mesures conservatoires (ajout de croquettes dans les cages, biberons à longue pipette) et des points limites qui nous permettent d'agir rapidement en cas d'inconfort ou de douleur observés chez nos animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. C'est un modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain. Les souris SKH-1 sont bien connues pour l'étude de la cancérogénèse UVB-induite. Elles sont immunocompétentes et totalement dépourvues de poils ce qui rend la mesure et l'observation des tumeurs cutanées bien plus facile que sur d'autres modèles de souris. Les souris seront inclues dans le protocole expérimental à l'âge de 6 à 8 semaines. Ages auxquels elles sont considérées comme de jeunes adultes ayant atteint un poids de 20-25g, une maturité hormonale et un état métabolique stable.

Humanisées par injection de cellules souches ou de globules blancs humains, les souris de ce projet développent une maladie du greffon contre l'hôte, les cellules humaines finissant par attaquer leur organisme. 1 240 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous anesthésie générale, jusqu'à deux administrations par jour pendant huit semaines, des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital ou à la veine caudale, et une ponction intracardiaque terminale. Le porteur classe la maladie du greffon contre l'hôte en gravité modérée au motif que la perte de poids importante déclenche la mise à mort de l'animal avant la suite.

Objectifs

L'immunothérapie a révolutionné le traitement des cancers depuis 10 ans, avec des taux de survie à long terme sans précédent, mais ses bénéfices restent limités. La particularité de cette approche est qu'elle ne cible pas directement la tumeur comme les autres stratégies thérapeutiques (chimiothérapies, radiothérapie,…), mais vise à utiliser les cellules du système immunitaire pour défendre l’organisme en reconnaissant et détruisant les cellules cancéreuses grâce notamment à des anticorps qui vont réveiller le système immunitaire (anticorps inhibiteurs de points de contrôle immunitaire) ou obliger des cellules dites « tueuses » à attaquer directement les cellules cancéreuses (anticorps bispécifiques). Mais comme tous les types de tumeurs et tous les patients ne répondent pas ou deviennent résistants aux médicaments existants, il faut identifier de nouveaux traitements qui pourraient prolonger les réponses ou améliorer le taux de patients répondeurs. Il y a donc une demande importante de modèles expérimentaux plus prédictifs et pertinents, pour améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la réponse ou la résistance aux immunothérapies actuelles, et permettant d’évaluer de nouveaux traitements immunothérapeutiques. La particularité de ces traitement nécessite l'utilisation de modèles expérimentaux spécifiques possédant des cellules immunitaires capables de détruire la tumeur. Pour cela nous projetons de travailler avec deux types de modèles souris humanisées qui sont des modèles de choix pour étudier les interactions entre cellules immunitaires et cellules tumorales humaines greffées conjointement: - des souris humanisées par injection de cellules souches capable de recréer un système immunitaire humain chez la souris; - des souris humanisées à l'aide de cellules immunitaires présentes dans le sang (appelées Leucocytes ou globules blancs)

Bénéfices attendus

Ce projet a donc pour objectif le développement de modèles de souris humanisées portant à la fois un système immunitaire humain et des tumeurs humaines nécessaires pour déterminer l'efficacité d'immunothérapies (anticorps thérapeutiques) développées ou en cours de développement dans un contexte préclinique. Ces modèles devraient permettre d'identifier et d'évaluer de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de valider de nouveaux anticorps dirigés contre ces cibles afin d'améliorer la prise en charge des patients pour lesquels il n'existe pas de solutions thérapeutiques à l'heure actuelle, et/ou d'apporter de nouvelles solutions thérapeutiques à des patients pour lesquels les traitements actuels sont insuffisants.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale (greffe de tumeurs) qui dure 1 à 2 minutes. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées minimum 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale suivie jusqu’à 12 semaines. Les cellules immunitaires humaines servant à humaniser les souris seront injectées une seule fois. Selon les traitements expérimentaux, les animaux recevront au maximum 2 administrations quotidiennes pendant 8 semaines maximum. Des prélèvements de sangs seront effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques seront pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie et la chirurgie, des douleurs post-opératoires et un risque d’infection peuvent être attendus. Ces nuisances sont transitoires et peuvent donc être classées en modérées. Si ces nuisances devaient persister, elles déclencheraient l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite. Dans le cas de l’injection de cellules immunitaires humaines, les cellules humaines finissent par attaquer la souris, il s'agit de la 'maladie du greffon contre l'hôte' ou GvHD. Elle se manifeste quelques semaines après l’injection et se traduit d’abord par une perte de poids importante, puis une voussure dorsale et/ou une mobilité réduite. Cette nuisance peut être classée comme modérée dans la mesure où la perte de poids importante déclenche l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur de tumeurs, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. Leur réutilisation n'est pas possible compte tenu des procédures expérimentales que ces animaux ont subies (greffe de tumeurs, injection de cellules immunitaires humaines).

Remplacement

La production de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests pré-cliniques afin de valider leur effet antitumoral. De nombreuses lignées cellulaires originaires de tumeurs de patient ont été dérivées pour la réalisation de tests in vitro, et depuis quelques années l’utilisation de modèles cellulaires en '3D' (organoïdes) est en plein essor. Ces modèles sont très utiles mais sont plutôt utilisés en amont des tests sur les animaux dans le processus de développement de médicaments contre le cancer. Ces tests in vitro contribuent à une évaluation plus complète des candidats médicament et à une réduction de l'utilisation d'animaux dans la recherche. Cependant, il est difficile de remplacer entièrement les tests sur les animaux par des tests in vitro, d'une part car les tumeurs sont des environnements complexes et les tests in vitro ne capturent pas pleinement cette complexité. Dans le cas spécifique de ce projet utilisant des souris humanisées, il est nécessaire de pouvoir caractériser les cellules du système immunitaire capables d'infiltrer la tumeur et celles présentent dans la circulation pour comprendre l’impact d’un traitement sur les cellules immunitaires présentes et les cellules tumorales. Et ces interactions système immunitaire/tumeurs ne peuvent être évaluées de manière optimale qu'in vivo

Réduction

La connaissance parfaites des modèles de tumeurs utilisés dans ce projet permet de mettre en place une stratégie expérimentale n’utilisant que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour obtenir des résultats pertinents. Les traitements retenus pour ce projet auront été sélectionnés au préalable lors d’études de caractérisation poussées in vitro pour ne tester que des traitements potentiellement efficaces chez l'animal.

Raffinement

Lors de l’acte chirurgical, pour éviter le risque d’hypothermie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Afin d’éviter les risques d’infection en suite de chirurgie, un antiseptique (Biseptine®) sera appliquée sur la peau de l’animal préalablement à l’incision réalisée lors de la greffe. Les agrafes permettant de refermer l’incision après la greffe seront également aseptisées avec de la Biseptine®. Le matériel utilisé lors de la greffe (ciseaux, pinces, puces) sera préalablement stérilisé par autoclave. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. Si une sécheresse oculaire est observée lors des prélèvements, un protecteur oculaire (Ocry-Gel®) sera administré à l’animal.

Choix des espèces

On considère que passé l'âge de 6 mois (soit 26 semaines) les souris sortent de la catégorie "adulte mature" et commencent à montrer des signes de sénescence. Pour rester au plus près de cette catégorie d’adulte mature et du fait des contraintes de temps liées à l’utilisation d’animaux humanisés par injection de cellules souches, les animaux utilisés ne devront pas dépasser l’âge de 31 semaines. En effet, la période nécessaire au développement du système immunitaire étant de 12 à 13 semaines après injection des cellules sur des animaux de 4-5 semaines, les tumeur seront greffées sur des animaux de 17 à 19 semaines en fin de période d’acclimatation et la croissance tumorale suivie jusqu'à 12 semaines après la greffe, ce qui nous amène à un âge des animaux maximum de 31 semaines. Dans le cas des souris humanisées par injection de Leucocytes (ou globules blancs), les animaux utilisés seront tous des animaux adultes âgés de 6 semaines en fin de période d'acclimatation et âgés de moins de 13 semaines au moment de la greffe et la croissance tumorale sera suivie jusqu’à 12 semaines après la greffe. La durée de chaque procédure correspond donc au suivi de la croissance tumorale, elle est donc de 12 semaine maximum.

Greffées sous la peau du flanc avec des cellules de mélanome de l'œil, puis injectées dans l'abdomen trois fois par semaine sur animal vigile et sans anesthésie, pendant jusqu'à seize semaines, 422 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées pour récupérer les tumeurs et les organes porteurs de métastases. Le porteur décrit une croissance tumorale pouvant entraîner poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration et nécrose de la peau, auxquelles s'ajoutent rougeurs, infections et nécroses au point d'injection. Il annonce par ailleurs que la lignée cellulaire créée à cette occasion servira à des expériences in vitro permettant de "s'aligner sur le bien être animal".

Objectifs

Le mélanome oculaire est une tumeur cancéreuse de l’œil se développant à partir des cellules « les mélanocytes », responsables de la production de mélanine (le pigment de notre peau et de nos yeux). Ce cancer est le plus fréquent dans la population adulte. La majorité de ces mélanomes a pour origine l’uvée, un tissu de l’oeil. Si la tumeur primaire peut être traitée par énucléation ou irradiation, il a été mis en évidence que des micrométastases se propageaient via la circulation sanguine plusieurs années avant le diagnostic. Ces métastases sont fortement résistantes aux traitements par chimiothérapie ainsi qu’à la radiothérapie. L’absence de traitement efficace pour ces tumeurs entraine une mortalité à 90% dans les 6 mois qui suivent la découverte des métastases. Actuellement, il n’existe pas de traitement approuvé pour le mélanome uvéal métastatique. Il faut donc continuer à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression de cette tumeur pour identifier des cibles thérapeutiques et des traitements efficaces. Pour ce faire, nous avons réalisées des études du profil d’expression des gènes qui nous ont permis d’identifier de nouveaux candidats cibles intéressants. De plus, l’absence de modèles expérimentaux (cellulaires, animaux) de mélanome uvéal ne permet pas de tester l’efficacité préclinique de drogues dans un contexte de système immunitaire complet. Pour améliorer cela et pouvoir proposer des traitements personnalisés pertinents, nous désirons mettre en place un modèle de souris qui repose sur la greffe de cellules issues de biopsies de mélanome uvéal de souris dans des souris immuno-déficientes.

Bénéfices attendus

Le premier but de ce projet est de développer une lignée de cellules de mélanome uvéal murin qui sera utile à la communauté internationale. Ce modèle sera utile à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant dans ce domaine pour des études in vivo mais aussi in vitro permettant de s’aligner sur le bien être animal. Une fois ce modèle établi, il sera aussi possible d’étudier l’efficacité de certaines molécules dans des animaux ayant un système immunitaire complet dans le but de lutter contre la progression du mélanome uvéal.

Procédures

Les souris seront toutes injectées en une fois en sous-cutané (sous la peau) sur le flanc avec des cellules de mélanome uvéal murin. Après observation de la croissance tumorale, les souris sont traitées trois fois par semaine avec les différents produits décrits, par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) en alternant les côtés à chaque injection. La durée de traitement sera définie par la croissance tumorale et l’expérience sera arrêtée lorsque la tumeur aura atteint un volume défini (ou un maximun de 16 semaines après injection des cellules). Cette intervention ne nécessite pas d’anesthésie et est effectuée sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection de traitement. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des traitements pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..). Le site d’injection sera également surveillé.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses in vitro.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir complètement de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent la survie de cellules de mélanome oculaire murin fraichement isolées à partir d’une biopsie et de travailler de façon intégrée où l’écosystème tumoral est reproduit. Cependant, la nouvelle lignée cellulaire de mélanome oculaire murin pourra être utilisée pour des expériences in vitro.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) afin de réaliser des analyses in vitro. Il est fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inférieur à la fin du projet. En effet, certaines procédures ou parties de procédures pourront être abandonnées, ou le nombre d’animaux réduit, en fonction des résultats obtenus. Dans le meilleur respect du bien-être animal et dans le but de réduire, nous utiliserons des souris immunodéprimés mâles et femelles provenant de notre élevage.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et observées quotidiennement par les animaliers et de façon exhaustive deux ou trois fois par semaine par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, stress ou inconfort. Les manipulateurs, habitués à l’expérimentation sur les souris, éviteront tout dommage à l’animal lors des injections.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une petite taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les deux modèles de souris que nous utiliserons dans ce projet sont commercialisés, bien connus et de nombreuses études ont déjà été réalisées à partir de ces modèles. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.