Cancers
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- Troubles respiratoires
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- Troubles urogénitaux
Exploration du tandem CD44/E-sélectine : Implications dans la chimiorésistance et la migration des cellules de Leucémies Aiguës Lymphoblastiques T et B.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier la résistance des leucémies aiguës lymphoblastiques à la chimiothérapie. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques de patients, jusqu'à seize injections de chimiothérapie et un prélèvement de moelle osseuse au niveau du fémur, geste que le porteur décrit comme le plus invasif du protocole. L'expansion leucémique provoque une perte de poids, une augmentation de la taille de la rate et parfois une prostration avant la mise à mort. Le porteur reconnaît qu'une partie du projet est réalisable in vitro mais affirme que la migration des cellules "ne peut être jugée" que sur l'animal.
Objectifs
Les leucémies aiguës lymphoblastiques sont des cancers du sang dont le pronostic diffère grandement entre les patients jeunes et âgés. En effet, l’intensification de la chimiothérapie menée ces dernières années a permis d’améliorer la survie et la rémission des patients (superieur à 85% pour les enfants ; seulement 50% chez les adultes). L’une des explications de ces différences de survie propose que des facteurs physiologiques produits par le corps influencent la résistance des cellules leucémiques aux traitements. Si les cellules leucémiques se propagent dans la quasi-totalité des différents organes du patient, le tissu d’expansion de prédilection reste malgré tout la moelle osseuse, retrouvée dans les os. Or, la moelle osseuse est un environnement qui évolue grandement au cours du vieillissement. Il est par exemple pauvre en adipocytes (cellules graisseuses) à la naissance et devient très riche en ces cellules avec l’âge. Dans les os riches en adipocytes, les cellules leucémiques deviennent « dormantes » ce qui s’accompagne d’une résistance aux agents utilisés en chimiothérapie. Des travaux récents montrent que, dans ce contexte, les cellules leucémiques « dormantes » présentent l’expression forte d’une protéine de surface dont la fonction majeure est d’être un récepteur à une protéine exprimée à la surface des cellules endothéliales, qui tapissent les vaisseaux sanguins. Différents arguments laissent penser que cette liaison à la protéine endothéliale est utilisée par les cellules leucémiques pour échapper à la chimiothérapie. On parle alors de « niche chimiorésistante ». Notre projet a pour vocation de mieux comprendre ce mécanisme propice à la chimiorésistance des cellules leucémiques et de proposer l’inhibition de cette liaison comme piste thérapeutique. Le repositionnement d’une molécule utilisée en essai clinique sur une autre pathologie sanguine, qui empêche toutes les interactions avec la protéine des cellules endothéliales, semble être très pertinente dans notre contexte. Nous proposons donc son association à la chimiothérapie conventionnelle pour déloger les cellules leucémiques de leur niche chimiorésistante.
Bénéfices attendus
La rechute des leucémies aiguës lymphoblastiques est un enjeu majeur dont il faut améliorer la prise en charge. À ce jour, quelques thérapies innovantes commencent à émerger mais leurs limites apparaissent déjà puisque quelques cas de résistance sont relatés. L’ultime alternative proposée aux patients est la transplantation de cellules souches hématopoïétiques provenant d’un donneur compatible, qui est curative mais ne concerne qu’une partie des patients, principalement des patients jeunes. Les avancées récentes de la recherche permettent de proposer d’autres pistes thérapeutiques aux patients. Malgré tout, ces dernières présentent des limites, ainsi une meilleure compréhension de la chimiorésistance est nécessaire pour proposer de nouveaux traitements aux patients pour lesquels la réponse aux traitements conventionnels n’est pas pleinement satisfaisante. Récemment, une entreprise a développé une molécule spécifiquement dans le but d’empêcher l’interaction du couple ligand/récepteur qui nous intéresse. Cette molécule est actuellement utilisée dans un essai clinique pour son rôle pertinent permettant d’empêcher la formation de caillot sanguin dans la drépanocytose, une maladie génétique héréditaire touchant les globules rouges. La validation de l’intérêt d’inhiber cette interaction dans le cas des leucémies aiguës lymphoblastiques pourrait rendre éligible ce type de cancer du sang à un essai clinique étendu. De façon plus large, les traitements actuels proposés aux patients sont majoritairement développés pour cibler la cellule cancéreuse. Mais l’ensemble des connaissances démontre que la cellule cancéreuse communique avec son environnement cellulaire et qu’aujourd’hui, la thérapie innovante se doit d’intégrer cette vision d’ensemble. C’est exactement l’objectif de notre étude.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à : - Une injection de cellules leucémiques de patients. Cet acte, qui ne dure que quelques secondes, est effectué sous sédation. Cette injection est un acte unique dans toutes les procédures. - Selon les procédures, les souris subiront ensuite une injection d’agents utilisés en chimiothérapie conventionnelle selon le même protocole que pour l’injection de cellules leucémiques. Cet acte effectué sous sédation ne dure que quelques secondes. - Selon les procédures, les souris subiront également l’injection (durée : 5 secondes) dans la cavité abdominale, d’autres drogues utilisées en chimiothérapie conventionnelle. La molécule à tester sera quant à elle injectée en sous-cutanée (durée de l’acte : 5 secondes). L’application d’un anesthésique local précèdera l’ensemble des ces injections qui seront toutes réalisées sur des souris vigiles. Selon les procédures, le nombre d’injections va de 1 à 16. - Enfin un prélèvement de moelle osseuse sera effectué sous sédation et analgésie. Pendant l’acte, les souris sont maintenues sur un tapis chauffant afin de réguler leur température. Ce prélèvement est effectué une seule fois dans l’ensemble des procédures. L’injection en sous-cutanée de l’analgésique est effectuée juste avant la sédation. Cet acte prend 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Notre expérience dans la réalisation de protocoles similaires dans un modèle murin, nous permet de nous attendre à des nuisances modérées sur les animaux utilisés dans ce projet. Plusieurs points sont à retenir : - Puisque l’injection des cellules leucémiques et/ou de certaines drogues utilisées en chimiothérapie est effectuée sous sédation, le stress provoqué à l’animal est principalement lié à la contention avant anesthésie. C’est pourquoi nous mettons en place une autre technique pour le transfert des animaux de leur cage vers la cage de sédation, sans contention par l’intermédiaire d’un tube de transfert dans lequel viennent se loger les animaux. Malgré tout, une douleur peut être engendrée par la piqure au site d’injection, comme c'est le cas pour les patients traités par certaines chimiothérapies. - L’expansion leucémique des cellules de patients dans le modèle murin provoque à long terme une perte de poids de l’animal ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. En point ultime d’expérience, nous notons parfois une prostration/manque de mobilité de l’animal. - La chimiothérapie utilisée provoque également une perte de poids liée à l’ensemble des effets adverses des agents utilisés. - Enfin, le prélèvement de moelle osseuse est le geste le plus invasif effectué dans nos procédures. Ce geste se fait au niveau des fémurs, la mise en place d’un traitement analgésique est associé.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans nos procédures seront euthanasiés soit dès la fin des traitements soit dès apparition de signes de souffrance au cours de la courbe de survie. Notre étude porte sur l’importance de la liaison d’un couple récepteur/ligand dans la moelle osseuse des cellules leucémiques chimiorésistantes. L’euthanasie est donc nécessaire pour récupérer les cellules leucémiques retrouvées dans les différentes moelles osseuses. C’est pourquoi, lors de l’euthanasie des animaux, plusieurs os (fémurs, vertèbres thoraciques et vertèbres caudales) seront prélevés pour en extraire les cellules leucémiques et/ou pour effectuer des coupes histologiques permettant d’analyser finement la localisation des cellules leucémiques dans la moelle osseuse.
Remplacement
L’objectif de notre projet étant d’étudier les communications des cellules leucémiques avec leur environnement, en particulier dans un contexte de résistance aux traitements, aucun modèle ne représentant que partiellement un organisme ne pourra mimer l’intégralité et la complexité des interactions. Aujourd’hui, la culture in vitro de cellules leucémiques avec un autre partenaire cellulaire est maîtrisée. Cependant, ce système ne peut pas être étendu à la co-culture avec plus de deux ou trois partenaires cellulaires, et ne représente donc pas la diversité des intervenants cellulaires de la moelle osseuse. Malgré l’émergence des mini organes sur puce (« organ on chip »), il n’existe aucun modèle assez complexe pour mimer l’intégralité des interactions que nous évoquons dans notre étude. C’est pour l’ensemble de ces raisons que le modèle animal ne peut être remplacé par un modèle simplifié in vitro concernant la partie du projet qui évalue la pertinence de l’ajout d’un inhibiteur de la liaison récepteur/ligand à la chimiothérapie conventionnelle. La seconde partie du projet qui évalue la diminution de fonction du récepteur d’intérêt pour la liaison à son ligand sera menée partiellement in vitro. En effet, il est possible de modifier la fonction du récepteur des cellules leucémiques puis d’évaluer la capacité de liaison à son ligand in vitro. Malgré cette preuve de concept in vitro, l’utilisation du modèle animal ne pourra être intégralement remplacée puisque l’objectif ultime de cet axe est d’évaluer le rôle de cette interaction récepteur/ligand dans la capacité des cellules leucémiques à coloniser différent organes. Ainsi, seul le modèle animal permettra de juger de la migration des cellules leucémiques de la circulation sanguine vers la moelle osseuse.
Réduction
Afin de développer le modèle préclinique le plus pertinent possible, nous tiendrons compte de la diversité de la maladie retrouvée chez les patients et nous utiliserons trois patients représentatifs, sélectionnés parmi les centaines de profils de patients disponibles au laboratoire. Les résultats obtenus à partir de notre modèle devraient ainsi être transposables à un nombre important de patients, limitant ainsi le nombre de modèles précliniques à mettre au point. De plus, il a été montré que les cellules leucémiques extraites des fémurs et des vertèbres thoraciques sont strictement identiques. Nous prélèverons donc les cellules leucémiques de ces deux localisations sur chaque animal, pour réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de nos résultats.
Raffinement
Dans l’ensemble des procédures associées à cette demande, les animaux sont hébergés avec maximum six individus par cage. Selon les voies d’injections, elles seront pratiquées sous sédation ou non. L’application d’un anesthésique local sera utilisé pour limiter la douleur associée à la piqure. Les prélèvements de moelle osseuse seront effectués sous sédation associée à un analgésique pour limiter la douleur provoquée par le geste. Une seconde injection d’analgésique pourra-t-être administrée si les animaux présentent des signes de douleur après la durée d’action (4 heures) de la première dose. Les animaux seront surveillées quotidiennement pour détecter tout mal-être éventuel (prostration, pelage hirsute et tout autre signe comportemental). L’apparition de ces critères, notés selon une grille remplie par les animaliers ainsi que les expérimentateurs, permettra une prise de décision rapide quant à la mise en place de la stratégie à adopter pour arrêter la souffrance. Les points limites de chaque procédure ont été déterminés.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris immunodéficientes adultes que nous utilisons au laboratoire depuis de longues années, pour leur incapacité à rejeter la greffe de cellules d’une espèce étrangère, ici de cellules humaines. Outre l’absence de rejet, ce modèle est pertinent pour l’étude des cancers du sang puisqu’il est capable de récapituler l’expansion leucémique de patients dans un modèle vivant. Les cellules de patients interagissent alors avec l’ensemble des constituants cellulaires et moléculaires de l’animal au même titre qu’une cellule leucémique interagit avec son environnement chez le patient. L’utilisation d’un tel modèle permet également d’adresser une question majeure qui est celle de la diversité inter-individus pour une même maladie. En effet, le terme générique de « leucémie » intègre un ensemble de sous-groupes de leucémies. Au sein de chaque sous-groupe, il est également admis qu’il existe une multitude de sous-sous-groupes de la même pathologie. Ainsi, pour une même maladie, deux patients peuvent avoir une réponse totalement différente aux traitements. Contrairement aux modèles strictement murins dans lesquels se développent une leucémie murine, le modèle de transplantation de cellules humaines chez des souris immunodéficientes permet d’aborder la diversité inter-patients et ainsi devenir un modèle préclinique de référence. L’utilisation de souris immunodéficientes adultes permet l’étude de la maladie humaine dans un environnement murin bien défini/décrit et compris dans la littérature.
Criblage de candidats médicaments en terme d’efficacité antitumorale sur modèles de souris immunodéficientes porteuses de xénogreffes tumorales d’origine humaine.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
4 644 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour cribler des candidats médicaments anticancéreux de type anticorps-médicament. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau sur animal vigile, puis des injections intraveineuses répétées, et sont mises à mort à l'atteinte de points limites ou en fin d'étude. Le porteur précise que les souris non entrées en protocole seront "réformées" pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées. Il affirme que les preuves in vitro sont déjà faites et qu'"aucune alternative" ne peut se substituer au modèle souris pour une greffe de tumeur humaine.
Objectifs
Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet est articulé en trois procédures consécutives et dépendantes les unes des autres : La Procédure-1 permettra de déterminer les meilleurs modèles de tumeurs humaines greffées dans des souris démunies de système immunitaire par rapport à des cibles thérapeutiques choisies (CDX). La procédure-2 consiste en une étude Pilote d’efficacité antitumorale en utilisant un/des médicament/s de référence. La Procédure-3 permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les modèles sélectionnés (CDX) dans les Procédures 1 et 2.
Bénéfices attendus
Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité sont les données les plus importantes avec les données de tolérance afin de pouvoir choisir les candidat médicaments ayant la meilleur fenêtre thérapeutique (c'est à dire la meilleur efficacité pour le moins d'effets indésirables), chez les patients. ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. La première et la seconde procédure permettront de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La troisième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans les procédures précédentes.
Procédures
# Après une semaine d'adaptation à l'environement, les souris seront identifiées: - Soit par poinçonnage auriculaire sur souris vigiles (2-3 minutes si moins de 100 souris). - Soit par puçage électronique (injection sous-cutanée sous-scapulaire du transpondeur), sous anesthésie gazeuse (4-6 minutes). # Greffe tumorale sur souris vigile en sous-cutané (2-3 minutes). # Les prises de mesure seront effectuées trois fois par semaine et quotidiennement en cas d'approche des points limites. # Traitement des animaux par les differents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort.
Impact sur les animaux
# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la numérotation sur animal vigile par poinçonnage auriculaire, (2) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection sous-cutanée ainsi que lors (3) de l’injection par intraveineuse dans le veine de la queue sur souris vigiles des candidats médicaments. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue.
Devenir
Pour chacune des trois procédures: - Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. - De même, les souris non entrées en protocole seront réformés pour l’entrainement aux gestes techniques avant d’etre mises à mort. La SBEA assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.
Remplacement
Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in-vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris.
Réduction
La procédure-1 et 2 permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés en procédure-3. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des procédures 1 et 2 seront utilisés pour la procédure-3 avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs dans les procédures 2 et 3, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés.
Raffinement
Les animaux, démunis de système immunitaire, seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger), dans des conditions sanitaires permettant de ne pas etre infectées. Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure effectuées trois fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel et du volume tumoral et de la qualité de la tumeur (homogénéité, permettant la mobilité de l’animal…). Le point limite du volume tumoral sera de 1500mm3. La nécrose ou la gêne à la mobilité due à la tumeur constitueront également des points limites. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Les souris non entrées en protocole seront réformées pour entraiment des gestes techniques avant d’être mises à mort. La SBEA assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.
Choix des espèces
S’agissant d’analyses d’efficacité par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Afin d’étudier les effets de candidats médicaments sur des greffes de tumeurs humaines, , des animaux immunodéprimés (démunis de système immunitaire), sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacocinétique seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. Enfin, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif entre la souris et l’humain (cibles exprimées de façon identique entre la Souris et l’Homme), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris. Les animaux immunodéprimés (démunis de système immunitaire), seront livrés entre 7 et 8 semaines de développement et inclus en expérience entre 8 et 9 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’EU). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant une allométrie pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos condition d’hébergement et d’expérimentation (animalerie SPF) et expérimentation sous PSM (les souris ne pouront pas contracter d'infections).
Elevage de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
6000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour gérer un élevage de souris génétiquement altérées. Chaque animal subit sous anesthésie un prélèvement au bout de la queue ou de l'oreille pour son génotypage. Le porteur indique que les souris au génotype voulu sont versées en continu dans d'autres projets et que celles au génotype non requis sont mises à mort ou réutilisées. Il présente cet élevage comme une "réduction" du nombre d'animaux, tout en programmant le génotypage de 6000 individus.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la caractérisation génétique des rongeurs (souris) dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés. L'élevage est réalisé par une plateforme au service des activités de recherche utilisant des animaux à des fins scientifiques comme modèle expérimental dans le domaine des neurosciences, de la physiologie, la compréhension de la réponse immunitaire dans certaines pathologies humaines ou encore dans les mécanismes liés au développement de cancers. Certains de ces projets sont amenés à utiliser des animaux génétiquement altérés (génétiquement modifiées ou avec des mutations spontanées) en l'absence de solutions alternatives disponibles n'utilisant pas d'animaux. L'élevage des animaux génétiquement modifiés nécessite la détermination de la constitution génétique (appelé génotype) de chaque individu par une amplification précise et localisée des séquences d’ADN modifiées à partir des cellules de tissu facilement accessible et avec une approche la moins invasive possible. Cette caractérisation précoce au moment du servage ou plus tardive des animaux nés sur site, est indispensable et contribue au respect de la règle des 3R, notamment en termes de réduction.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet repose sur la réduction du nombre d'animaux utilisées. La mise en place d'une procédure de caractérisation génétique fiable et reproductible permet: d'utiliser des individus avec un génotype défini et requis dans les projets scientifiques, de maitriser la production du nombre d'individus au strict minimum et la qualité génétique des animaux élevés sur site.
Procédures
un prélèvement tissulaire (extrémité de la queue ou pavillon de l'oreille de 2mm) sous anesthésie générale pour 6000 souris; durée inférieure à 1 min.
Impact sur les animaux
Inconfort transitoire lié la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse associé à une douleur légère et transitoire liée à la biopsie.
Devenir
Les individus avec le génotype requis seront en utlisation continue dans les projets scientifiques nécessitant l'utilisation des lignées concernées. Les individus ne possédant pas le génotype requis seront mis à mort ou seront réutilisés dans des projets ne nécessitant pas de génotype particulier.
Remplacement
Les animaux élevés dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents experts scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Il n'existe pas non plus de technique in vitro ou in silico pour déterminer le génotype d'un animal sans prélèvement de son ADN contenu dans ses propres cellules. L'ADN est spécifique à chaque individu.
Réduction
La stratégie d'accouplement à la demande et non en continue (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) permet de limiter la production d'animaux au strict minimum. Cette stratégie participe fortement à la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Selon les lignées et les projets, un certain nombre d’animaux n'ont pas le patrimoine génétique requis. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype. La réutilisation participe à la réduction du nombre d'animaux utilisés globalement pour les projets scientifiques. De plus, le génotypage en amont des projets et non pas à la fin des projets scientifiques participe également à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Une alternative non-invasive pour la récupération de cellules (prélèvement buccal) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables et reproductibles. Des techniques alternatives de biopsie non invasives n'ont pas permis à ce jour d'obtenir des résultats satisfaisants. Le prélèvement de tissu pour déterminer le génotype des souris est réalisé systématiquement sous anesthésie gazeuse. Pour les jeunes individus, ce prélèvement sera réalisé à l’extrémité de la queue précocement, à l’âge de 21 jusqu'à 30 jours au moment du sevrage, avant l’ossification complète de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, un prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille en dehors de la zone cartilagineuse sera privilégié. La taille de la biopsie est réduite à son minimum. Les animaux sont hébergés en groupe social, en cage ventilée enrichie avec du matériel permettant de répondre à leurs besoins (nidification, se cacher, ronger) avec accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum.
Choix des espèces
La pertinence de l'espèce choisie a été justifiée dans les projets de recherche réalisées dans l'animalerie. Ils font appel à des souris génétiquement modifiées. Pour les individus nécessitant une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage, ils sont âgés de 21 à 30 jours maximum. Pour les individus nécessitant un prélèvement d'un morceau du pavillon de l'oreille, ils sont agés de plus de 6 semaines.
Evaluation d’un radiotraceur diagnostique et thérapeutique ciblant la béta-glucuronidase dans des modèles de glioblastomes (2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 316 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce volet, mené dans un second établissement, comprend une implantation de cellules de glioblastome dans le cerveau ou sous la peau, des séances d'imagerie nucléaire et des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, pour valider un radiotraceur de diagnostic et de thérapie. Le porteur indique surveiller troubles de la conscience et mouvements circulaires liés à la tumeur cérébrale. Il affirme qu'"aucun modèle alternatif n'est disponible" et revendique une stratégie potentiellement "universelle" pour les tumeurs solides.
Objectifs
Ce projet a pour but de développer deux molécules, complémentaires, et dédiées à la détection et au traitement des glioblastomes chez la souris. Pour cela notre stratégie repose sur la présence d’une enzyme dans les glioblastomes tumoraux, qui permettra l’accumulation des agents anticancéreux dans ces mêmes glioblastomes. Notre approche en deux étapes s’inscrit dans un contexte de médecine de précision. Une fois validée chez le petit animal, cette stratégie pourrait être appliquée chez l’homme très rapidement. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L'administration contrôlée d'agents anticancéreux améliorera l'efficacité des systèmes moléculaires proposés sur le glioblastome, et augmentera ainsi les bénéfices en termes de survie et de qualité de vie des patients. Si cette approche se révèle efficace sur ces modèles de glioblastomes, elle pourrait être mise à profit pour beaucoup d’autres types de tumeurs. Cette stratégie de prise en charge pourrait potentiellement devenir universelle, quel que soit le type de tumeurs solides.
Procédures
Pour le protocole d’implantation tumorale, qui constitue le seul acte réalisé au sein de l’établissement utilisateur secondaire, au niveau du cerveau, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité. Ces implantations seront réalisées sous anesthésie volatile, anesthésique local, analgésie par morphinique pour la chirurgie et un relai par anti-inflammatoire. Les autres actes réalisés pour ce projet se feront au sein de l’établissement utilisateur principal. Pour le protocole d’implantation tumorale sous-cutané, l’implantation tumorale sur le flan des souris se fera sous anesthésie volatile. L’acquisition des images sera réalisée chez des animaux sous anesthésie volatile pour une durée inférieure à 1h. Un onguent sera appliqué sur la cornée pour éviter toute sécheresse oculaire. Si plusieurs sessions d’imagerie sont envisagées chez une même souris, elles seront réalisées avec un écart au minimum de 2 heures pour les temps courts (1H, 4H et 6H), et de 1 jour entre 2 procédures pour les temps plus longs (24H, 48H & 96H). Un maximum de 6 acquisitions d’imagerie nucléaire (TEP ou TEMP) sera réalisé sur chaque animal. Un maximum de deux acquisitions IRM anatomique sera réalisé chez les souris porteuses de tumeurs au niveau du cerveau. Une seule chirurgie sera prévue sur chacun des animaux destinés à l’étude des glioblastomes dans le cerveau. Une seule implantation de cellules tumorales sera prévue sur chacun des animaux destinés à l’étude des glioblastomes sous-cutanés. Pour l’étude de la dose maximale tolérée, A J0 et à J14 post-injection du composé thérapeutique radiomarqué, un prélèvement de sang au niveau rétro-orbital sera réalisé, pour effectuer une numération de formule sanguine, et un dosage des enzymes hépatiques. Ce prélèvement n’excèdera pas le volume de 10 % du poids de l’animal comme préconisé pour cette espèce animale (GRICE). Un prélèvement terminal sera également réalisé post-mortem, après la mise à mort des animaux. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animaux vigiles pour toutes les autres procédures.
Impact sur les animaux
Pour le protocole d’implantation tumorale orthotopique, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité. Ces implantations entraineront un léger stress à l’implantation. On ne s'attend pas à ce que l'injection intracrânienne entraîne une mortalité aiguë. Pour le modèle orthotopique, les animaux développeront des tumeurs primaires dans le cerveau. Après l'implantation, il pourrait y avoir une réduction initiale du poids corporel, puis une reprise ultérieure du poids corporel. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour déceler tout signe de réaction altérée à la manipulation, de troubles de la conscience, de mouvements circulaires ou de stupeur. Pour le protocole d’implantation tumorale sous-cutané, l’implantation tumorale sur le flan des souris entrainera un léger stress à l’implantation. Les protocoles d’imagerie n’entraineront pas de douleur, souffrance ou angoisse supplémentaire en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intraveineuse du radiotraceur à des animaux vigiles.
Devenir
A la fin de chaque procédure (caractérisation, biodistribution, dose maximale tolérée, efficacité), les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées en particulier sur les tumeurs afin de valider et sélectionner le radiotraceur au potentiel le plus important pour l’imagerie et la thérapie des glioblastomes.
Remplacement
Aucun modèle alternatif n’est disponible actuellement pour s’affranchir de ce type d’étude. Seuls les tests in vivo pourront nous permettre de valider le meilleur candidat radiopharmaceutique pour l’imagerie et la thérapie du glioblastome. Cependant, les études préliminaires réalisées in vivo avec d’autres constructions moléculaires ont permis de se restreindre à 4 molécules candidates pour ces tests in vivo (2 molécules candidates pour le diagnostic et 2 molécules candidates pour la thérapie).
Réduction
Nous limiterons notre étude au strict minimum requis dans le nombre de souris et les différents modèles murins à utiliser afin de sélectionner et de caractériser les molécules présentant les meilleures propriétés pour l’imagerie, le diagnostic par biopsie respiratoire et la thérapie du glioblastome. Dans ce projet, ce nombre est fixé à 400 animaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie volatile, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intra veineuse de radiotraceur. Pour le protocole d’implantation tumorale au niveau du cerveau, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité, sous anesthésie volatile, anesthésique local, et analgésie par morphinique suivie d’un relai par anti-inflammatoire non stéroïdien. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance de l’animal si les tumeurs atteignent un volume impactant le bien-être animal (pour les tumeurs aussi bien sous-cutanées qu’au niveau du cerveau).
Choix des espèces
Les études précédentes utilisant notre prodrogue thérapeutique précurseur ont toutes été effectuées chez la souris. Les modèles sélectionnés sont les seuls à pouvoir permettre une expression de l'enzyme d'intérêt dans le proche environnement tumoral et ainsi déclencher l’activation de nos molécules. Ces modèles sont très pertinents vis-à-vis de la pathologie clinique puisque ce sont des modèles qui présentent des caractéristiques moléculaires invasives. Les protocoles concerneront uniquement des souris qui seront âgées entre 5 et 6 semaines au moment de leur arrivée dans le laboratoire, pour permettre une implantation et un développement tumoral optimal.
Etude de la modification des membranes cellulaires dans la neuropathie toxique induite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un anticancéreux, le bortézomib, pour induire une neuropathie, puis subit des tests hebdomadaires de sensibilité tactile et thermique évaluant l'allodynie, pour en étudier le mécanisme membranaire. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une nuisance modérée "indispensable" à l'étude et signale une possible baisse de poids. Il reconnaît que des animaux plus âgés seraient plus proches de la clinique humaine mais les écarte pour leur "coût" financier et éthique.
Objectifs
L’objectif principal de projet est d’étudier le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique, le bortézomib et de connaître l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme. Parmi les objectifs secondaires, nous souhaiterions (1) mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et (2) tenter de découvrir les facteurs prédisposant à cette pathologie expliquant pourquoi certains malades sont spécifiquement atteints.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.
Procédures
Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max).
Impact sur les animaux
L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation de l’allodynie tactile et de l’allodynie au froid, tests n’excédant pas 60 minutes et 5 minutes respectivement.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.
Remplacement
Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.
Raffinement
Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg) et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score a été construite afin d’identifier une altération trop importante de l’état de l’animal menant à l’euthanasie de l’animal en cas d’obtention d’un score supérieur à 15 (grille en annexe).
Choix des espèces
Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important (financier et éthique) et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.
Evaluation d’un radiotraceur diagnostique et thérapeutique ciblant la béta-glucuronidase dans des modèles de glioblastomes (1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 316 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une implantation de cellules de glioblastome, dans le cerveau ou sous la peau, puis des séances d'imagerie nucléaire et des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, pour évaluer un radiotraceur de diagnostic et de thérapie. Le porteur indique surveiller troubles de la conscience, mouvements circulaires et stupeur liés à la tumeur cérébrale. Il affirme qu'"aucun modèle alternatif n'est disponible" et revendique une stratégie qui pourrait devenir "universelle" pour les tumeurs solides.
Objectifs
Ce projet a pour but de développer deux molécules, complémentaires, et dédiées à la détection et au traitement des glioblastomes chez la souris. Pour cela notre stratégie repose sur la présence d’une enzyme dans les glioblastomes tumoraux, qui permettra l’accumulation des agents anticancéreux dans ces mêmes glioblastomes. Notre approche en deux étapes s’inscrit dans un contexte de médecine de précision. Une fois validée chez le petit animal, cette stratégie pourrait être appliquée chez l’homme très rapidement. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L'administration contrôlée d'agents anticancéreux améliorera l'efficacité des systèmes moléculaires proposés sur le glioblastome, et augmentera ainsi les bénéfices en termes de survie et de qualité de vie des patients. Si cette approche se révèle efficace sur ces modèles de glioblastomes, elle pourrait être mise à profit pour beaucoup d’autres types de tumeurs. Cette stratégie de prise en charge pourrait potentiellement devenir universelle, quel que soit le type de tumeurs solides.
Procédures
Pour le protocole d’implantation tumorale, qui constitue le seul acte réalisé au sein de l’établissement utilisateur secondaire, au niveau du cerveau, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité. Ces implantations seront réalisées sous anesthésie volatile, anesthésique local, analgésie par morphinique pour la chirurgie et un relai par anti-inflammatoire. Les autres actes réalisés pour ce projet se feront au sein de l’établissement utilisateur principal. Pour le protocole d’implantation tumorale sous-cutané, l’implantation tumorale sur le flan des souris se fera sous anesthésie volatile. L’acquisition des images sera réalisée chez des animaux sous anesthésie volatile pour une durée inférieure à 1h. Un onguent sera appliqué sur la cornée pour éviter toute sécheresse oculaire. Si plusieurs sessions d’imagerie sont envisagées chez une même souris, elles seront réalisées avec un écart au minimum de 2 heures pour les temps courts (1H, 4H et 6H), et de 1 jour entre 2 procédures pour les temps plus longs (24H, 48H & 96H). Un maximum de 6 acquisitions d’imagerie nucléaire (TEP ou TEMP) sera réalisé sur chaque animal. Un maximum de deux acquisitions IRM anatomique sera réalisé chez les souris porteuses de tumeurs au niveau du cerveau. Une seule chirurgie sera prévue sur chacun des animaux destinés à l’étude des glioblastomes dans le cerveau. Une seule implantation de cellules tumorales sera prévue sur chacun des animaux destinés à l’étude des glioblastomes sous-cutanés. Pour l’étude de la dose maximale tolérée, A J0 et à J14 post-injection du composé thérapeutique radiomarqué, un prélèvement de sang au niveau rétro-orbital sera réalisé, pour effectuer une numération de formule sanguine, et un dosage des enzymes hépatiques. Ce prélèvement n’excèdera pas le volume de 10 % du poids de l’animal comme préconisé pour cette espèce animale (GRICE). Un prélèvement terminal sera également réalisé post-mortem, après la mise à mort des animaux. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animaux vigiles pour toutes les autres procédures.
Impact sur les animaux
Pour le protocole d’implantation tumorale orthotopique, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité. Ces implantations entraineront un léger stress à l’implantation. On ne s'attend pas à ce que l'injection intracrânienne entraîne une mortalité aiguë. Pour le modèle orthotopique, les animaux développeront des tumeurs primaires dans le cerveau. Après l'implantation, il pourrait y avoir une réduction initiale du poids corporel, puis une reprise ultérieure du poids corporel. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour déceler tout signe de réaction altérée à la manipulation, de troubles de la conscience, de mouvements circulaires ou de stupeur. Pour le protocole d’implantation tumorale sous-cutané, l’implantation tumorale sur le flan des souris entrainera un léger stress à l’implantation. Les protocoles d’imagerie n’entraineront pas de douleur, souffrance ou angoisse supplémentaire en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intraveineuse du radiotraceur à des animaux vigiles.
Devenir
A la fin de chaque procédure (caractérisation, biodistribution, dose maximale tolérée, efficacité), les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées en particulier sur les tumeurs afin de valider et sélectionner le radiotraceur au potentiel le plus important pour l’imagerie et la thérapie des glioblastomes.
Remplacement
Aucun modèle alternatif n’est disponible actuellement pour s’affranchir de ce type d’étude. Seuls les tests in vivo pourront nous permettre de valider le meilleur candidat radiopharmaceutique pour l’imagerie et la thérapie du glioblastome. Cependant, les études préliminaires réalisées in vivo avec d’autres constructions moléculaires ont permis de se restreindre à 4 molécules candidates pour ces tests in vivo (2 molécules candidates pour le diagnostic et 2 molécules candidates pour la thérapie).
Réduction
Nous limiterons notre étude au strict minimum requis dans le nombre de souris et les différents modèles murins à utiliser afin de sélectionner et de caractériser les molécules présentant les meilleures propriétés pour l’imagerie, le diagnostic par biopsie respiratoire et la thérapie du glioblastome. Dans ce projet, ce nombre est fixé à 400 animaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie volatile, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intra veineuse de radiotraceur. Pour le protocole d’implantation tumorale au niveau du cerveau, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité, sous anesthésie volatile, anesthésique local, et analgésie par morphinique suivie d’un relai par anti-inflammatoire non stéroïdien. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance de l’animal si les tumeurs atteignent un volume impactant le bien-être animal (pour les tumeurs aussi bien sous-cutanées qu’au niveau du cerveau).
Choix des espèces
Les études précédentes utilisant notre prodrogue thérapeutique précurseur ont toutes été effectuées chez la souris. Les modèles sélectionnés sont les seuls à pouvoir permettre une expression del'enzyme d'intérêt dans le proche environnement tumoral et ainsi déclencher l’activation de nos molécules. Ces modèles sont très pertinents vis-à-vis de la pathologie clinique puisque ce sont des modèles qui présentent des caractéristiques moléculaires invasives. Les protocoles concerneront uniquement des souris qui seront âgées entre 5 et 6 semaines au moment de leur arrivée dans le laboratoire, pour permettre une implantation et un développement tumoral optimal.
Etude du mécanisme d’action de la protéine PML dans la réponse thérapeutique aux chimiothérapies dans les leucémies aiguës myeloïdes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques par injection, des prélèvements intra-fémoraux et des traitements de chimiothérapie, pour étudier le rôle de la protéine PML dans la réponse aux traitements de la leucémie aiguë myéloïde. Le porteur indique que les animaux peuvent perdre du poids et souffrir en phase finale de leucémie, ceux perdant plus de 20 % de leur poids étant alors tués, et précise que l'analgésie ne sera pas administrée pendant la phase de traitement pour ne pas fausser les résultats. Sur le remplacement, il affirme avoir testé les molécules sur cellules mais conclut à la nécessité d'un "organisme entier".
Objectifs
La protéine PML (ProMyelocytic Leukemia) peut s’assembler pour former des structures en coques sphériques appelées « corps nucléaires PML » (CN) dans le noyau des cellules. Sur ces CN s'associent des protéines partenaires qui y subissent alors des modifications. PML est impliquée dans différents mécanismes cellulaires, et peut également jouer un rôle de suppresseur de tumeur. En effet, PML est sous-exprimée ou absente dans de nombreux cancers (cancer du sein, de la prostate, du système nerveux central), en phase tardive mais aussi à des stades précoces. D’autre part, PML est sensible à l’oxydation. Lorsque la cellule est exposée à un stress oxydant, PML va déclencher une réponse de défense menant à la mort de la cellule, ce qui participe probablement à son rôle de suppresseur de tumeur. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont dues à la prolifération incontrôlée de cellules malignes immatures qui vont d’abord envahir la moelle osseuse puis d’autres organes suite à leur passage dans le sang. La leucémie aigue promyélocytaire (LAP) est une LAM particulière dans laquelle les CN PML sont anormaux. Suite au traitement par une combinaison d’acide rétinoïque et d’arsenic, les CN PML normaux se reforment entraînant la différenciation des cellules leucémiques vers un stade mature et leur élimination, permettant la guérison des patients. La LAP est la seule leucémie pour laquelle il existe un traitement ciblé. Les patients atteints d’autres types de LAM sont actuellement traités par combinaison de doxorubicine et de cytarabine, des agents de chimiothérapie large spectre. Nos résultats préliminaires montrent que PML est importante dans la réponse thérapeutique aux agents de chimiothérapie classique. Le but de ce projet est d’étudier in vivo le mécanisme par lequel la protéine PML exerce un rôle en réponse à ces agents. En effet, nous savons que PML est un senseur d’oxydation et les chimiothérapies engendrent du stress oxydant. Notre hypothèse est que la protéine PML est importante dans le déclenchement de la mort des cellules cancéreuses par ces chimiothérapies. Nous souhaitons donc étudier le rôle de PML dans la réponse aux traitements à la doxorubicine et la cytarabine dans le contexte de la LAM due à l’oncogène de fusion MLL/ENL.
Bénéfices attendus
Nous espérons pouvoir définir le rôle et les mécanismes liés à PML dans la réponse thérapeutique aux agents de chimiothérapie doxorubicine et cytarabine. Ces résultats pourraient permettre de mieux connaître le mode d'action de ces traitements très largement utilisés chez les patients, et ainsi de les optimiser et de mieux les utiliser en fonction des pathologies de chaque patient.
Procédures
Les animaux seront soumis à une première injection intraveineuse (correspondant à la greffe de cellules leucémiques), puis à un éventuel prélèvement intra-fémoral environ deux semaines plus tard. Les traitements seront ensuite administrés par injections intra-veineuses ou intra-péritonéales sur animaux vigiles pendant maximum 5 jours d'affilée (maximum trois injections lors d'une seule journée). Chacun de ces gestes ne dure pas plus de quelques minutes. D'autres prélèvements intra-fémoraux pourront être réalisés post-traitement pour monitorer la rechute, espacés de minimum deux semaines.
Impact sur les animaux
Nous avons pu constater dans certains cas une perte de poids chez des souris en cours de traitement. Cependant, ici les traitements ne dureront que 5 jours et dans la grande majorité des cas, les animaux reprennent du poids à l'arrêt du traitement. Néanmoins, si la perte de poids venait à être trop importante (plus de 20% du poids initial), nous procèderons à l'euthanasie plus précoce des animaux. L'autre effet indésirable peut être une souffrance liée à l'atteinte de la phase finale de la leucémie. Nous pouvons éviter cela de par notre bonne connaissance de la cinétique de développement de la maladie et par son monitoring via l'apparition de splénomégalie détectable par simple palpation.
Devenir
Atteints de leucémie, tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, et les organes nécessaires aux analyses ultérieures seront prélevés.
Remplacement
L’objectif du projet est de déterminer le mécanisme par lequel la protéine PML joue un rôle dans la réponse aux chimiothérapies classiquement utilisées chez l’Homme dans les cas de LAM. Nous avons au préalable testé ces molécules ex vivo sur les modèles cellulaires tels que des lignées de cellules leucémiques immortalisées ou encore des cellules souches embryonnaires de souris. Il est maintenant nécessaire d’être dans des conditions qui reproduisent au maximum celles retrouvées chez les patients comme le micro-environnement des cellules myéloïdes, les interactions avec les autres types cellulaires, ou encore la métabolisation des médicaments par un organisme entier. Enfin, PML et la mitochondrie sont deux éléments cellulaires très sensibles au stress oxydant, leur étude en modèle animal permet de retrouver le même statut de stress oxidatif que chez le patient (hypoxie notamment).
Réduction
Une estimation des effectifs nécessaires pour mener l’étude a été faite en tenant compte de données antérieures, afin de garantir l’obtention de résultats interprétables. Chaque groupe sera donc constitué de 12 à 28 souris. Nous utiliserons au maximum 768 souris sur les 3 ans que durera le projet, réparties en un groupe contrôle et 5 groupes tests (2 molécules thérapeutiques combinées, 2 inhibiteurs seuls et les combinaisons de ces différentes molécules). Quatre temps d’analyse (entre 2h et 5 jours post-traitement) seront réalisés pour chacun des 4 modèles de souris développant des leucémies.
Raffinement
Les animaux seront surveillés à l'aide d'une grille d’évaluation, tenant compte notamment de leur apparence et de leur comportement. Elle sera tenue chaque semaine de façon à définir des points limites de douleur/souffrance suffisamment précoces pour déclencher une mesure corrective (séparation en cas d'agressivité inter-individus, accès facilité à la nourriture, désinfection d'une plaie, etc.). Ce suivi clinique sera quotidien lors de la phase de traitement. L'utilisation d'antalgique ou analgésique sera possible jusqu'à la phase de croissance de la leucémie, mais ne sera pas envisageable à partir de la phase de traitement au risque d'induire un stress oxydant, auquel est très sensible la protéine étudiée.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère suffisamment proche de l’Homme pour les expériences menées dans ce projet. La grande expérience de notre laboratoire sur la protéine PML montre que PML chez l’Homme et chez la souris sont proches en séquences et en fonction. Les molécules testées sont à administrer par différentes voies, toutes disponibles sur l’espèce animale choisie. De plus, le contrôle de leur bien-être au quotidien est facilité car les signes de souffrance/douleur ont été bien caractérisés chez cette espèce. Les études passées et présentes menées dans ce domaine par la communauté scientifique sont réalisées essentiellement sur ce modèle. La composition de la moelle osseuse change avec l’âge des individus, notamment la quantité de progéniteurs. Il existe de nombreux sous-types de LAM de l’adulte, dont certains touchant des cellules à un stade précoce de leur développement. Ainsi nous utilisons des souris jeunes adultes de 6 à 8 semaines pour nos expérimentations. Nos études précédentes et celles faites dans les autres laboratoires travaillant dans ce domaine sont couramment réalisées à ce stade de développement.
Validation de l’efficacité anti-tumorale d’un CAR-T cell IL-1RAP en traitement des syndromes myélodysplasiques (2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
300 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intra-osseuse et un myélogramme transtibial, gestes que le porteur décrit comme provoquant une douleur importante justifiant l'anesthésie, avant d'être tuées à trois semaines. Le porteur teste des lymphocytes CAR-T contre un état préleucémique et indique le développement possible d'une anémie. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire in vitro cette maladie avec tous ses composants.
Objectifs
Ce projet vise à valider in vivo l’efficacité d’une approche par immunothérapie (CAR-T cells) pour traiter les syndromes myélodysplasiques (état préleucémique) en utilisant un modèle murin humanisé de syndromes myélodysplasiques. Il s'agit d'un projet multi-site qui se déroulera dans 2 animaleries différentes. Cette étude nous permettra de confirmer l'efficacité anti-tumorale des CAR-T cells contre les cellules myélodysplasiques dans un modèle in vivo de syndromes myélodysplasiques et en cas de résultats positifs de débuter un essai thérapeutique clinique. En effet, il y a peu d’alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements de première ligne.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de confirmer l'efficacité anti-tumorale des CAR-T cells contre les cellules myélodysplasiques dans un modèle in vivo de syndromes myélodysplasiques et en cas de résultats positifs de débuter un essai thérapeutique clinique. En effet, il y a peu d’alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements de première ligne.
Procédures
1) Injection intratibiale des cellules tumorales sous anesthésie et analgésie (30 s). 2) Entre 1 mois et 3 mois post greffe : Confirmation prise de la prise de greffe par mesure de la luminescence par imagerie in vivo sous anesthésie générale (5 min). Réalisation d'un myélogramme par voie transtibiale sous anesthésie et analgésie (30 s) si absence de bioluminescence. 3) Injection intracaudale à J0 du traitement et des différents véhicules (5 min). 4) J7 et J15 prise de sang par ponction veine mandibulaire pour monitoring in vivo par CMF de l'expansion des CAR-T cells (2min) 5) Mesures de la luminescence par imagerie in vivo sous anesthésie générale (5 min) à J7, J10, J14 et J21. 6) A J21 post injection du traitement les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements sanguins vont engendrer une douleur légère et de courte durée. La ponction et l'injection médullaire transtibiale va engendrer une douleur importante le temps du geste justifiant une anesthésie générale avec analgésie. Le développement du syndrome myélodysplasique peut entrainer un inconfort en rapport avec l'anémique.
Devenir
Certains animaux issus de la procédure d’élevage entreront dans la procédure d’expérimentation s’ils ont l’âge requis pour la procédure de xénogreffe au moment de la disponibilité du matériel biologique nécessaire à la xénogreffe. Tous ces animaux atteignant le point-limite et/ou maintenus aprés la dernière imagerie seront finalement mis à mort pour les analyses biologiques invasives nécessaires à l'exploitation optimale des résultats. Les autres animaux (surnuméraires, ayant dépassé l’âge pour la réalisation de la xénogreffe ou vieux reproducteurs) seront euthanasiés.
Remplacement
Il est impossible, à l’heure actuelle, de reproduire de manière in vitro une hématopoïèse clonale complète d'un syndrome myélodysplasique avec tous ses composants et leurs interactions pourétudier l’efficacité anti-tumorale de lymphocytes T modifiés. Par ailleurs, aucun modèle mathématique ou informatique ne permet actuellement d’évaluer également cette réponse.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires à cette étude a été réduit au minimum sur la base des besoins imposés par les tests statistiques que nous utiliserons. De fait, un nombre de 300 souris sera nécessaire.
Raffinement
L'ensemble des procédures pouvant s'accompagner d'une douleur/angoisse modérée, tous les efforts seront entrepris pour réduire au minimum de douleur, souffrance ou angoisse ressentie par les animaux. C'est pourquoi nous surveillerons l'état de santé des animaux tout au long des expériences afin de pouvoir intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de douleur, de souffrance ou d'angoisse. La greffe des cellules souches humaines sera réalisée par voie transtibial de même que les myélogrammes sous anesthésie générale injectable. Le projet est mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. Les personnels impliqués ont des compétences validées pour les manipulations des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement stérile (isolateur) dans un environnement enrichi et contrôlé et observés quotidiennement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. Les différents gestes chirurgicaux et les séances d'imagerie sont réalisés sous anesthésie générale. La méthode de mise à morts des animaux est réglementaire. Les animaux seront transportés dans des cages stériles prévues pour cet usage avec enrichissement de l’environnement et tout sera mis en œuvre pour limiter la durée de transport entre les 2 sites.
Choix des espèces
Il a été démontré que les souris avec ce profil particulier d'immunodépression permettent une meilleure prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques humaines. Autre avantage de ces souris, elles n'ont pas besoin d'être préparées à la greffe par un conditionnement par irradiation ou une chimiothérapie. Ce conditionnement peut augmenter la létalité de la procédure. Souris entre 8 à 10 semaines de vie. Du fait du délai de prise de greffe (entre 1 à 3 mois), l'injection doit se faire précocement.
Évaluation de l’effet thérapeutique d’un facteur régulateur de l’immunité innée dans le cancer oral.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses dans la langue puis des traitements répétés, la tumeur linguale provoquant une perte de poids et des difficultés à s'alimenter, avant leur mise à mort pour analyses. Le porteur teste une molécule d'immunothérapie contre le cancer oral et prévoit une hydratation systématique pour limiter la déshydratation. Il affirme que l'étape animale est "indispensable" et qu'un "organisme vivant intégré" est nécessaire avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
L’immunothérapie est une approche thérapeutique qui agit sur le système immunitaire d’un patient pour lutter contre sa maladie. Dans le cas du cancer, elle ne s’attaque pas directement à la tumeur, mais stimule les cellules immunitaires impliquées dans sa reconnaissance et sa destruction. Dans certains cas cette thérapie n’est pas suffisante pour induire des réponses antitumorales et traiter la totalité des patients. Cependant, d’autres voies du système immunitaire peuvent jouer un rôle critique dans le traitement du cancer. La compréhension des mécanismes activés dans ces voies ainsi que la détermination des cellules immunitaires impliquées est nécessaire. Dans notre équipe, nous avons travaillé sur les mécanismes de stimulation d’une voie de signalisation, récemment identifiée, de l’immunité innée. Cette voie induit des réponses antitumorales efficaces en synergie avec l’immunothérapie et potentiellement avec la chimiothérapie pour détruire les tumeurs. Dans ce projet, nous évaluerons l’effet thérapeutique, d’une molécule qui active cette voie de signalisation, dans différents types de cancer oraux. Cette étape de développement préclinique est indispensable pour tester l'efficacité, le mécanisme d'action ainsi que la toxicité éventuellement associée à ce type de traitement afin d’envisager une application thérapeutique en clinique chez l'homme.
Bénéfices attendus
L’immunothérapie par activation de notre voie d’intérêt permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler tous les types de tumeurs, ii) elle induit des effets toxiques chez les patients. Nous proposons donc une stratégie pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, tout en limitant les effets secondaires. Une meilleure compréhension du mécanisme d’action sous-jacent peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées par voie intra-linguale aux animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie : 10 minutes). Puis certaines de ces souris recevront ensuite le traitement par voie intra-tumorale ou sous-cutanée dans le palais de la bouche sous anesthésie (3 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie : 10 minutes). Deux prélèvements de sang seront réalisés, le premier 3h après l’administration des traitements puis le second, 17 jours après (durée du geste inférieur à 30 secondes). Certaines souris recevront également un traitement directement dans l’abdomen à raison de 2 fois par semaine pendant 3 semaines (durée du geste inf à 10 sec)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intra-linguale seront celles liées à l’injection d’un produit non toxique et non douloureux dans un site sensible sur des animaux anesthésiés. L’un des effets attendus de ces essais est la perte de poids due au développement de la tumeur dans la langue et aux difficultés à s’alimenter Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements par voie intra-linguale seront celles liées à l’injection d’un produit non douloureux dans un site sensible sur animaux anesthésiés. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale seront celles liées à la piqûre elle-même (douleur de courte durée) Lors des prélèvements sanguins, une légère douleur liée à la piqure est attendue. Cette douleur sera de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.
Remplacement
Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet découlent de résultats obtenus in vitro à l’aide de lignées cellulaire en culture. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action de nos molécules d’intérêt Néanmoins, malgré les méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en immunothérapie. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de ce traitement.
Réduction
Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous suivrons la croissance des tumeurs dans la bouche à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Les analyses des populations de cellules immunes ou la comparaison des tailles de tumeurs à des points de cinétiques précis seront évaluées à l'aide des tests non paramétriques Anova et Kruskal Wallis. Si les résultats de la procédure 1 ne sont pas concluants, tout sera arrêté et donc les autres procédures ne seront pas réalisées.
Raffinement
Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés spécifiquement au moins deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur et appliquer les points limites décrits dans la procédure correspondante et selon la grille de score fournie en annexe. Si besoin, les souris seront surveillées quotidiennement en fonction de l’évolution tumorale. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Une hydratation systématique par injection de Ringer Lactate sera mise en place pour prévenir toute déshydratation induite par le développement de tumeurs dans la bouche. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des analgésiques. Des compléments alimentaires seront mis à disposition dès la greffe des tumeurs pour habituation et afin de faciliter la prise alimentaire. Toutes les souris seront anesthésiées lors des manipulations et recevront des analgésiques pour les gestes douloureux.
Choix des espèces
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Après la démonstration in vitro et avant d'envisager une application clinique chez l'Homme en thérapie anti-cancéreuse, l'évaluation préclinique de ces traitements est nécessaire dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris. Cette étape est indispensable pour tester l'efficacité, le mécanisme d'action ainsi que la toxicité éventuellement associée à ce type de traitement. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques, permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Par ailleurs, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées qui sont disponibles. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 semaines et 6 mois) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique. Enfin, l’âge adulte permet d’étudier un système immunitaire mature.
Evaluation pharmacologique et pharmacodynamique d’anticorps innovants en cancérologie chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'anticorps expérimentaux puis de nombreux prélèvements de sang à la queue étalés sur plusieurs jours, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur décrit une douleur modérée liée aux injections et aux prélèvements, encadrée par une grille de points limites. Il affirme qu'"aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet" et rend donc "indispensable" le recours aux animaux.
Objectifs
Ces dernières années, la compréhension des différents mécanismes entrant en jeu lors d’une réponse antitumorale a mis en lumière l’équilibre entre l’activation et l’inhibition de cette réponse. Les traitements anticancers, de plus en plus ciblés, visent des gènes spécifiques de l’immunité ayant pour but de faire pencher la balance dans un sens ou dans un autre pour moduler cette réponse antitumorale. Des essais cliniques, avec notamment des molécules ciblant une voie impliquée dans l'inhibition de la réponse immunitair, ont permis d’avoir de réelles avancées dans les thérapies anticancers. Cependant les rechutes sont encore trop nombreuses et il est essentiel de chercher d’autres molécules et d’autres combinaisons thérapeutiques. Les nouvelles stratégies d’immunothérapie cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements tout en limitant les effets secondaires. Dans ce projet, nous proposons de tester in vivo de nouvelles thérapies combinatoires ciblant un récepteur inhibiteur bien connu et de nouvelles molécules du système immunitaire, dans le but d’induire une réponse antitumorale efficace et durable. Nous avons généré de nouveaux formats d’anticorps dit « bispécifiques » capables d’interagir avec deux molécules en même temps. Nous avons déjà des résultats préliminaires in vivo nous permettant de montrer que ce format améliore l’effet de la monothérapie. Nous développons sans cesse de nouveaux formats, nouvelles mutations et/ou nouvelles molécules fusionnées afin de trouver l’anticorps le plus efficace possible, et pour cela nous devons réaliser (en plus des modèles in vitro) des études chez la souris. Cette étude nous permettra d’établir tous les paramètres nécessaires pour justifier les doses et voies d’administration de ces molécules lors d’essais cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra d’établir tous les paramètres en termes de dose, voie et schéma d’administration de molécules novatrices dans le domaine de l’immunothérapie antitumorale. Ces résultats pourront ensuite servir de base pour les essais cliniques réalisés chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés à J0 pour permettre l’injection de nos molécules. Du sang au bout de la queue sera ensuite prélevé (2µL) à différents temps T0, 15min, 30min, 1h, 4h, 8h, J1, J2, J3, J6, J8 voire J11 et J15 après l’injection de nos molécules en vigile, par simple pression de la queue sur animal vigile.
Impact sur les animaux
L’administration de nos molécules et les procédures effectuées peuvent induire une douleur modérée au moment de l’injection ou des prélèvements, limitée par l’administration d’analgésique local. Une grille d’observation de points limites a été établie permettant d’évaluer régulièrement l’état général des animaux et d’intervenir rapidement si une douleur survient.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique de ce genre nouveau de médicaments et ont donc orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo des différentes molécules.
Réduction
Le nombre d’animaux à chaque étape a été calculé pour limiter la quantité, tout en conservant un nombre suffisant pour une évaluation statistique fiable. Ce nombre pourra également être réduit dans les phases #2 et #3 si certaines molécules ne montrent pas d’intérêt in vitro.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Ce protocole n’induit qu’une douleur modérée le temps de l’injection. Si jamais une douleur plus intense survient, les animaux sont surveillés régulièrement et nous pouvons donc agir rapidement pour limiter la douleur. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis de papier sont placés dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Après l’injection de nos molécules, les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil complet.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Des adultes de 7 à 12 semaines seront utilisés, car ce sont généralement l’âge des souris dans nos modèles de cancers pour lesquels la prise tumorale est la plus homogène, contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse antitumorale, et donc un stade tumoral différent.
Evaluation de la prédiction des thermothérapies percutanées dans la prostate et le foie par IRM sur modèle porcin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
50 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux castrés reçoivent des injections de testostérone toutes les deux semaines pendant trois mois pour hypertrophier la prostate, puis subissent sous anesthésie une thermoablation du foie et de la prostate par laser ou micro-ondes guidée par IRM. Le porteur indique que la testostérone peut modifier le comportement et signale que la procédure de thermoablation, terminale, ne devrait pas causer d'effets indésirables. Il valide une technique destinée à traiter des tumeurs humaines et affirme qu'aucune méthode in silico ne peut remplacer l'animal.
Objectifs
Ce projet a pour but de valider la pertinence d’une technique de thermoablation (consistant à détruire des tissus par la chaleur) par fibre laser et micro-ondes sous guidage IRM, pour traiter des tumeurs de la prostate et du foie chez l’homme. Elle présente peu de complications et un temps de récupération rapide pour les patients en comparaison de la chirurgie conventionnelle. Cependant, cette procédure interventionnelle demeure assez peu normalisée, ce qui conduit à une variabilité de l’efficacité des traitements cliniques. L’utilisation de l’IRM pour estimer la quantité de chaleur déposée permet de visualiser l’avancement de la procédure en 3D et temps réel. Cela ouvre donc la possibilité d’optimiser le traitement (de manière à recouvrir toute la tumeur en réduisant au maximum l’impact sur les tissus sains environnants). Pour cela, une étape importante consiste à valider la thermométrie IRM. Il s’agit de vérifier que les dimensions des lésions thermiques mesurées sur les données de thermométrie correspondent aux dimensions des lésions mesurées sur les tissus après prélèvement. Par nature, le porc juvénile castré possède une très petite prostate comparée à celle de l’homme mâture, ce qui complique la procédure interventionnelle. Un traitement hormonal préalable à la thérapie par laser ou micro-ondes est donc nécessaire pour induire une augmentation du volume de la prostate, afin d’obtenir un modèle animal dont les caractéristiques anatomiques sont plus proches des situations cliniques.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal attendu de ce projet est la validation des données de thermométrie pour prédire les dimensions des lésions thermiques par nécrose de coagulation lors d’ablations laser et micro-ondes réalisées sur le foie et la prostate. D’autre part, les données expérimentales obtenues dans ce projet permettront d’affiner les protocoles de thermoablation (durée et température cible) des dispositifs médicaux évalués. Ces données serviront également à raffiner les logiciels de simulation afin de réduire le nombre d’animaux à inclure dans des études ultérieures.
Procédures
Les animaux inclus dans cette étude subiront une injection intramusculaire toutes les deux semaines pendant 3 mois maximum (animaux vigiles). Une procédure d’injection minimisant le stress de l’animal sera appliquée (bolus de moins de dix secondes). Pour la procédure mini invasive de thermoablation sous IRM, les animaux seront placés sous anesthésie générale et analgésie adaptée (l’anesthésie par injection de médicaments en quelques secondes). Des aiguilles laser ou micro-onde seront insérées dans le foie et/ou la prostate, via une légère incision pratiquée sur la peau de l’animal, pour réaliser des ablations (lésions) thermiques. Pour les besoins de l’expérimentation, la procédure durera un maximum de 4h. Pour réaliser des images anatomiques, le respirateur pourra être mis en pause pour une durée de 30s.
Impact sur les animaux
Bien que l’injection de testostérone soit déjà validée en clinique humaine, l'influence de ce type d’injection chez le porc juvénile castré reste peu documentée. Les nuisances potentielles suivantes seront évaluées lors de la phase de croissance : modification du comportement (ex : agressivité envers les congénères et vis-à-vis des soigneurs/manipulateurs) et variation notable de la prise de poids par rapport aux courbes documentées pour cette espèce. La procédure expérimentale de thermo-ablation est terminale et réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Ce type de procédure est déjà en place et maitrisée par l’équipe de l’établissement utilisateur. Il n’est donc pas attendu d’effets indésirables sur cette partie de l’expérimentation.
Devenir
Après induction d’une hypertrophie de la prostate, tous les animaux vont rentrer dans un protocole de thermoablation à l’issue duquel tous les animaux seront euthanasiés afin d’explanter les tissus cibles.
Remplacement
Il est nécessaire d’évaluer in vivo l’efficacité et l’innocuité des techniques de thermoablation en vue d’une application chez l’homme. Des évaluations sur organes ex vivo ont déjà été réalisées et sont systématiquement effectuées pour chaque dispositif d’ablation avant d’envisager une évaluation in vivo. Néanmoins, ces expériences ne permettent pas d’analyser précisément l’influence de la diffusivité thermique, de la perfusion tissulaire, des mouvements (respiratoires, péristaltisme digestif), de la proximité des gros vaisseaux (artères et veines), des interfaces entre différents organes et de leur composition (infiltrats graisseux notamment) qui influent très fortement sur la distribution résultante de la température tissulaire autour du dispositif de thermoablation.
Réduction
L’évaluation préalable sur des gels et organes ex vivo permet de valider la compatibilité IRM de chaque dispositif médical de thermoablation à disposition sans recourir à une expérimentation in vivo. Une fois cette phase réalisée, les expérimentations in vivo sont réalisées avec comme objectif de valider le côté prédictif des données de thermométrie IRM et de définir les dimensions typiques atteignables pour différents protocoles (durée, température maximale) de thermoablation. La possibilité de réaliser plusieurs ablations sur un même animal (une sur la prostate et jusqu’à 3 sur le foie) permet de réduire le nombre d’animaux à inclure. Si l’utilisation de testostérone pour augmenter la taille de la prostate porcine ne permet pas d’obtenir une hypertrophie suffisante de la prostate pour réaliser des thermoablations dans cet organe, les animaux concernés seront utilisés pour réaliser des ablations thermiques sur le foie. En effet, il n’a pas été démontré dans la littérature qu’une supplémentation à court terme en testostérone provoquait des dommages hépatiques (physiologie et morphologie). Les prostates des animaux ne répondant pas suffisamment au traitement hormonal (hypertrophie insuffisante) ou n’ayant pas subi d’ablation dans cet organe pourront être prélevées pour réaliser des tests ex-vivo. Actuellement, nous n’avons pas d’estimation de la variabilité des mesures que nous observerons. Le nombre d’animaux par campagne de validation annuelle a été établi sur la base de validations précédentes réalisées sur le foie, en considérant que la variabilité des mesures sera plus faible sur la prostate. Les premières expériences nous permettront d’avoir une estimation plus précise de la variabilité de nos mesures ; il nous sera alors possible d’ajuster le nombre d’animaux requis pour les différentes campagnes, suivant une approche statistique.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement sont adaptés au projet. Les animaux seront maintenus dans un premier temps chez l’hébergeur annexe de l’EU en condition de ferme puis au sein de l’EU. Les animaux seront en hébergement collectif avec des objets d'enrichissement (Kong, balles, jouets en caoutchouc durs mastiquables...) à disposition. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale et analgésie adaptées. Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux durant les deux phases d'acclimatation d’une semaine : celle précédant les injections chez l’hébergeur et celle précédant l’expérimentation terminale réalisée sur le site de l’établissement utilisateur. Des critères d’alerte précis sont surveillés chez l’éleveur. Si l’animal présente un signe clinique ou développe un comportement agressif, la posologie sera ajustée (réduction de moitié de la dose injectée) assortie d’une surveillance accrue du comportement de l’animal. Si dans les deux semaines qui suivent, l’animal ne retrouve pas un comportement normal, le traitement sera arrêté. Le comportement des premiers animaux permettra d’ajuster si nécessaire la posologie à appliquer pour les animaux suivants. Les gestes interventionnels sont réalisés sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. Un monitoring continu des signaux physiologiques sera réalisé pendant toute la procédure et permettra d’évaluer sir les points limites prédéfinis sont atteints (plage de température corporelle physiologiques et rythme cardiaque limite).
Choix des espèces
Du fait de ses caractéristiques anatomiques (taille, structure et morphométrie des organes, stabilité génétique) et son métabolisme proche de ceux de l’homme, le porc est le modèle de référence pour l’évaluation des dispositifs médicaux d’ablation. D’autre part, les organismes de régulation des dispositifs médicaux (FDA, CE) exigent la production de résultats sur ce modèle animal pour évaluer la conformité réglementaire. Enfin, il n’existe pas à ce jour de méthode de substitution in silico permettant de s’affranchir d’une phase expérimentale sur animal vivant. L’hébergeur va directement accueillir dans son enceinte agrée des animaux âgés de 2 mois (ces animaux ayant été castrés à l’âge de 10 jours). Il sera alors nécessaire de commencer les injections sur ces animaux (entre 15-20kg), l’objectif étant de réaliser les ablations sur des cochons entre 45 et 90 kg après 3 mois de traitement. En dessous de quatre mois , les porcs risquent d’être trop petits, avec une trop petite prostate pour obtenir des résultats concluants. Au-dessus de 5 mois, les porcs risqueraient d’être trop volumineux pour réaliser les expériences sous IRM dans de bonnes conditions.
ONCO-Métastases cérébrales : Evaluation de thérapies anti-cancéreuses sur des modèles de métastases au cerveau
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 200
2 000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les cellules tumorales sont injectées par voie carotidienne pour provoquer des métastases cérébrales, suivies de traitements par diverses voies, de rayons ionisants, parfois d'un implant hormonal et de prélèvements répétés. Le porteur indique que la tumeur peut entraîner perte de poids, faiblesse musculaire et troubles de la coordination, la perte de poids servant de point limite. Cette société de recherche préclinique décrit une "demande de plus en plus importante" pour ces modèles et affirme que les méthodes 3D restent marginales et difficilement transposables.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie (Centre international de recherche contre le cancer). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, les cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente aux traitements. D’énormes progrès ont été réalisés en clinique sur les tumeurs dites primaires. En revanche, le pronostic vital des patients peut être énormément dégradé en cas de métastases. On parle de métastases cérébrales lorsqu’un cancer d’un autre organe (cancer primitif) s’est propagé au cerveau. Des métastases s’y développent fréquemment en cas de cancer du sein, de la peau ou du poumon. Parmi les cancers chez les femmes, celui au sein est le plus répandu dans les pays développés. Environ 20 % des cancers du sein développent des métastases cérébrales. Malheureusement, les traitements actuels, par radiothérapie, chimiothérapie et chirurgie, sont majoritairement vains. La présence de métastases au cerveau entraîne un mauvais pronostic de survie (6 mois en moyenne), même si le cancer primitif répond bien aux traitements. En effet, le diagnostic est généralement tardif. Pour répondre à ce besoin de nouvelles approches thérapeutiques l’objectif de ce projet est d’induire directement des métastases dans le cerveau en mimant le cheminement des cellules tumorales jusqu’au cerveau par la voie carotidienne. Ces modèles, permettront de refléter la pathologie humaine et d’évaluer des nouveaux médicaments destinés à traiter les métastases cérébrales chez l’homme. Nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison chez l’animal avant de les tester chez l’homme. Une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale. Nous estimons le nombre de projet à 5 par an soit 25 projets sur 5 ans.
Bénéfices attendus
Notre société, spécialisée en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Une demande de plus en plus importante se fait pour le traitement des métastases. Plus particulièrement ces demandes sont accès sur les métastases cérébrales qui reste à ce jour sans traitement. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Grace à ces modèles, il sera possible d’étudier les mécanismes d’expansion ou de nidification des métastases avec des traitements prophylactiques ou de croissance des métastases avec des traitement de deuxième ligne dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme. Il sera possible aussi, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre la progression des métastases.
Procédures
L’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie avec administration d’un anesthésique local et d’un anti inflammatoire (
Impact sur les animaux
La greffe des cellules nécessitera une chirurgie qui pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2 jours et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une perte de poids, des difficultés à se mouvoir, une faiblesse musculaire et des soucis de coordination. La perte de poids sera le premier symptôme observé et constituera un point limite. Pour les expériences d’activités antitumorales, les animaux recevront des traitements et/ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Il pourra aussi être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1 jour. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress pendant 1-2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.
Devenir
Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme pour étudier les modèles de métastases.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule et un groupe avec tumeur, traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas multiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de la chirurgie (risque inférieur de 5% de mortalité chirurgie par des personnels entrainés) et afin de pouvoir former des groupes homogènes il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 15% d’animaux surnuméraire. En fonction du succès des études pilotes et une fois le modèle totalement acquis, ce nombre d’animaux surnuméraire sera réduit. Le nombre d’animaux par groupe se situera entre 6 à 15 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement relevant. Il s’agit d’un nombre minimum d’animaux permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et nombre/volume de métastases déterminés par imagerie).
Raffinement
Au cours de l’expérimentation, les animaux seront maintenus dans leurs cage avec un enrichissement adapté et dans les conditions standard d’hébergement en terme de surface de cage et de nombre. Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et un suivi adapté (observations, pesées, signes cliniques) sera mise en place post chirurgie avec évaluation des lésions neurologiques 1h post chirurgie et soins post opératoire et antalgie pendant 48h post chirurgie. Cette fréquence sera augmentée pour tous les animaux dès l’apparition des premiers signes cliniques qui pourront amener aux points limites. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès qu'une perte de poids de plus de 10% sera observée sur certains animaux. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie, la pose d’implants hormonaux seront réalisés sous anesthésie avec incision cutanée et Injection locale d'antalgique. Pour la greffe, une analgésie locale avec dépôt d’anesthésiques locaux en sous-cutané au niveau de l’incision de la peau sera réalisée et les animaux recevront un opiacé et un anti inflammatoire non stéroïdien. Le lendemain, les animaux seront traités avec un antiinflammatoire). En fonction du suivi clinique et sous avis vétérinaire, le traitement à l’antiinflammatoire pourra être prolongé. La greffe sera réalisée en conditions d’asepsie. Les points limites définit par la SBEA seront appliqués.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales.