Cancers

2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est greffée, puis elles reçoivent un anticorps couplé à un métal radioactif, avec imagerie nucléaire et hébergement individuel après l'injection, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour compter la radioactivité organe par organe. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales, une déplétion des cellules sanguines lors de la recherche de la dose radioactive maximale tolérée, ainsi qu'un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression" liés à l'isolement en cage. Il conclut que l'expérimentation animale est "requise", les données précliniques étant imposées par les autorités.

Objectifs

Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un métal radioactif à un anticorps spécifique d'une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que l'anticorps puisse diriger et concentrer le métal dans les cellules cancéreuses. En fonction du métal choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Un anticorps spécifique de cette protéine a donc été développé afin de bloquer sa liaison avec ses récepteurs dans la cellule et ainsi conduire à leur mort. Cet anticorps est actuellement en cours d'investigation dans le cadre d'un essai clinique chez l'Homme. Dans le but de mieux sélectionner les patients exprimant fortement la protéine N, cet anticorps a été modifié par couplage à un métal radioactif émetteur de particules lumineuses afin de détecter sa présence par imagerie nucléaire. Ce nouvel outil devrait permettre d'inclure les patients sur la haute expression de la cible afin de les traiter avec l'anticorps seul (non radioactif) et ainsi déclencher la mort des cellules tumorales. Par ailleurs, les mécanismes d'échappement de la cellule tumorale concernant la protéine N étant déjà décrits, l'efficacité de l'anticorps non radioactif est donc limitée. C'est pourquoi l'ajout de la radioactivité est alors nécessaire afin de détruire les cellules cibles. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs agréés (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les patients pris en charge en clinique ne sont généralement pas testés pour l'expression de la cible, limitant ainsi les chances de réponse aux traitements. Dans ce présent projet, il est proposé de valider l'utilisation d'un test compagnon basé sur l'imagerie chez différents modèles tumoraux hautement représentatifs de la pathologie humaine afin de n'inclure que des patients exprimant un fort taux de la cible et d'augmenter l'effet anti tumoral des thérapies ciblées. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l'Homme à la fin de l'étude.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Interventions chirurgicales : greffe de tissu tumoral humain (1 ou 2 par animal en fonction de la greffe unilatérale ou bilatérale, durée : 5 minutes maximum). -Injection de produit en intraveineuse dans la veine caudale : 2 injections chez les souris incluses lors des expérimentations d'imagerie et de traitement. -Injection de produit en sous-cutanée : 2 injections prévues au moment de la greffe (peropératoire et post-opératoire). Des injections supplémentaires de produit analgésiant pourront être réalisées en cas de nécessité seulement et selon les conditions définies dans chacune des manipulations expérimentales. -Anesthésie gazeuse à l'isoflurane réalisée lors de la greffe, lors de chaque injection ou au moment de la mise à mort. -Imagerie Nucléaire : imagerie SPECT/CT dans les procédures d'imagerie. -Mesures du poids ainsi que du volume tumoral dans toutes les procédures (deux fois par semaine). La greffe de tissu tumoral humain sera réalisée dans l'EU1 tandis que tous les autres actes (injections de produit non radioactif, radioactif, imagerie nucléaire) seront effectués dans l'EU2. Les anesthésies gazeuses ainsi que les merures de poids et de volume tumoral pourront être effectuées dans les deux établissements utilisateurs.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : -douleurs générées post-intervention chirurgicale (incision réalisée sur la peau pour la mise en place du greffon), lors de la prise du greffon, lors de l'injection ou de l'application de produit d'analgésie ou d'antiseptsie, lors de l'injection des anticorps. -fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines dans les jours suivants l'injection de l'anticorps radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. -stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. -sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris inclue dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficicacité thérapeutique.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de la greffe est réduit au minimum tout en prenant en compte le taux de reprise des modèles de tumeurs humaines lors de la décongélation. Lors de l'étape d'amplification du modèle tumoral humain, une greffe bilatérale sera effectuée sur les animaux afin de réduire leur effectif. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. Les effectifs des animaux des autres procédures ne reposent sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la variabilité biologique possible entre les souris. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées et chaque étape devra montrer de bons résultats avant le passage à l’étape suivante afin de limiter le nombre d'animaux strictement nécessaire.

Raffinement

Méthode utilisée pour réduire la douleur : -Anesthésie générale gazeuse. 1 anesthésie/animal lors de la greffe (5min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque injection sous la peau ou dans la veine de la queue (5 min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque acquisition d'imagerie nucléaire (45min) et 1 anesthésie lors de la mise à mort de l'animal. -Analgésie mise en place en cas de douleur chez l'animal, possibilité de renouvellement toutes les 24h. -Antisepsie : application cutanée en cas de blessure observée en zone d'hébergement ou en amont de l'incision de la peau lors de la greffe. Raffinement des conditions d'hébergement : afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection de la molécule d'imagerie, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte dans le but de permettre un contact visuel des animaux et en enrichissement de la cage (jouet) sera ajouté.

Choix des espèces

Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux établis à partir du tissu cancéreux de patients (PDX) est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de PDX car celles-ci se caractérisent par l'absence de thymus, ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont entre 6 et 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge.

15 600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau sous anesthésie, puis ils reçoivent des traitements pouvant aller jusqu'à deux administrations par jour pendant plusieurs semaines, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine jusqu'à un diamètre de 20 mm chez la souris et 40 mm chez le rat. Ce dispositif sert au criblage in vivo de molécules anticancéreuses candidates, sur l'un des effectifs les plus élevés du lot. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit ces procédures et qualifie le recours à un "organisme entier" d'"indispensable".

Objectifs

Le cancer affecte des millions de personnes chaque année. Cette pathologie a donc des impacts sociaux et économiques majeurs sur les patients et le système de santé. Les thérapies actuellement disponibles pour traiter le cancer ont une efficacité limitée pour certaines indications comme le cancer du pancréas ou le cancer du poumon et les effets secondaires des traitements limitent considérablement leur utilisation. Il y a donc un besoin urgent de trouver des molécules efficaces nouvelles ou en repositionnement ayant un effet anti-cancéreux démontré. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte du cancer avec la mise en place de modèles avec greffe de cellules cancéreuses par voie sous-cutanée chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la croissance tumorale. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de nouvelles molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, ces études permettront de trouver potentiellement de nouveaux médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes. Ce projet a déjà été déposé en 2018.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet sur la croissance tumorale. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments anticancer sur différents types de tumeurs dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes.

Procédures

Tous les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pendant 3 minutes afin d’injecter, en sous-cutanée, les cellules cancéreuses (excepté le groupe 1 qui reçoit du PBS) au niveau du flan. Au cours de l’expérience, les animaux recevront des traitements (véhicule, molécule à tester ou molécule de référence). La voie d’administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, par voie orale ou par voie sous-cutanée, sur animaux vigile. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée Cela pourra être une à sept fois par semaine, jusqu’à 2 fois par jour pendant plusieurs semaines. Sur animal vigile pris en contention, la taille des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse jusqu’à la fin de l’étude. La technique non invasive du laser doppler pourra être utilisée une fois par semaine pour une vingtaine de minutes par animal, après une anesthésie par isoflurane. Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.

Impact sur les animaux

Du fait de l’implantation de cellules cancéreuses, l’animal va développer une tumeur solide en sous-cutanée qui va grossir au cours du temps. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

Euthanasie pour récupérer les tumeurs et différents organes pour analyses

Remplacement

Ce projet se focalise sur un modèle intégré d’étude du développement tumoral et/ou de l’angiogenèse (mesure du flux sanguin intra-tumoral) nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier permettant la formation de la tumeur. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant ces procédures expérimentales. Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux pour pouvoir tester l’effet du traitement sur la croissance tumorale dans un contexte physiologique.

Réduction

Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique. Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des lignées cancéreuses qui auront répondu au traitement lors d’études in vitro préliminaires afin de limiter l’utilisation des animaux.

Raffinement

La procédure d’implantation en sous-cutanée des cellules cancéreuses se fera sous anesthésie générale afin de bien maîtriser le geste et que la tumeur soit placée à un endroit qui ne gêne pas l’animal. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude. Ainsi, les animaux seront surveillés au moins une fois par semaine puis au moins deux fois par semaine une fois que les tumeurs seront palpables. Une surveillance plus fréquente peut être nécessaire lorsqu'une croissance tumorale rapide est attendue, lorsque les tumeurs approchent du point final ou si l'état de l'animal commence à se détériorer. De nombreux paramètres seront enregistrés, au niveau physique et comportemental. Les animaux montrant une douleur sévère et montrant des signes de détresse (dyspnée, convulsions, plégie…) seront mis à mort immédiatement. Les points limites sont définis selon les Directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : une perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, une hypothermie, une absence prolongée de réponse volontaire à un stimulus externe comme le bruit, des problèmes ambulatoires empêchant l’animal d’accéder à la nourriture ou à l’eau/anorexie prolongée, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou ulcération de la peau etc. De plus, la taille de la tumeur sera mesurée 2 fois par semaine et est limitée un diamètre maximal de 20 mm pour la souris adulte et de 40 mm pour le rat adulte, sous réserve d’euthanasier pour raison éthique. L’état et l’emplacement de la tumeur seront également inspectés régulièrement pour déceler par exemple la présence de nécrose ou ulcération importante au sein de celle-ci ou si la tumeur est mal placée pouvant gêner les mouvements de l’animal. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés (voir annexe 2). Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques. Lors des prélèvement de sang terminaux, une analgésie de l’animal sera effectuée (buprénorphine ou lidocaïne respectivement pour un prélèvement intra-cardiaque ou rétro-orbital).

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, du fait de leurs tailles et leurs spécificités, ils permettent l’étude et le suivi du développement tumoral d’un point de vue morphologique, histologique et moléculaire. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études en cancérologie en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Différentes souches pourront être utilisées en fonction des espèces (voir tableau récapitulatif en annexe 1). Un animal immunodéficient (comme la souris ou le rat Nude ou la souris SCID) sont classiquement utilisés pour ce type d’étude, ce qui permet l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Il s’agit d’un modèle non dommageable à l’état basal. Si les cellules greffées sont d’origine murine, des animaux immunocompétents seront utilisés. Ce sont des modèles de laboratoire bien connus avec suffisamment de données historiques. Ces projets permettront le suivi de l’impact de traitement sur le développement tumoral de cellules greffées. Les animaux seront âgés de 5 à 8 semaines au moment de l’injection des cellules tumorales, à un stade de jeune adulte où le pouvoir prolifératif des cellules reste important sans avoir à toucher au développement normal de l’animal.

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

6 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est irradiée puis reçoit une greffe de moelle osseuse, toutes reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau et, pour certaines, des chimiothérapies ou immunothérapies pendant plusieurs mois, la tumeur pouvant se nécroser et s'ulcérer. Le projet étudie comment la cellule cancéreuse échappe au système immunitaire, la pertinence clinique d'inhibiteurs étant annoncée comme un espoir. Le porteur affirme que les études in vitro ne reproduisent pas les voies d'un modèle intégré et que le remplacement n'est "pas applicable".

Objectifs

La cellule tumorale a besoin de s'adapter rapidement à un environnement dynamique, parfois hostile, afin de continuer à se multiplier et à survivre. Notre système immunitaire est initialement capable de reconnaître une cellule cancéreuse et de l’éliminer. Toutefois la cellule cancéreuse est capable de s’adapter et de devenir invisible afin de ne pas être éliminée par ce système de défense. Un des mécanismes impliqués dans l’adaptation rapide de la cellule cancéreuse, permet la production de protéines spécifiques qui rendront la cellule cancéreuse invisible au système immunitaire. Une des nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer consiste à utiliser des molécules qui inhibent la production des protéines. Etudier ce mécanisme d’adaptation de la cellule cancéreuse qui empêche le système immunitaire d’être efficace et définir l’impact des inhibiteurs de ce mécanisme sur le développement de la tumeur et les propriétés des cellules cancéreuses et immunitaires sont les objectifs principaux de ce projet.

Bénéfices attendus

La dynamique d’interaction entre les cellules cancéreuses et immunitaires font intervenir des mécanismes d’adaptation rapide qui impliquent la production de protéines spécifiques. Analyser cette dynamique au niveau de la production des protéines est particulièrement innovant et important car il existe des études pré-cliniques montrant l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs de la production des protéines dans le traitement de certains cancers. Alors que nous comprenons de mieux en mieux comment ces inhibiteurs affectent la cellule tumorale, peu d’études portent sur les effets de ces inhibiteurs dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Enfin, la pertinence clinique de l'utilisation de ces inhibiteurs sera évaluée au regard des thérapies conventionnelles, d’autres thérapies ciblées et immunothérapies utilisées en clinique, en espérant définir de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Certaines souris seront irradiées. Dans les 24 heures suivant l'irradiation, les souris seront anesthésiées puis recevront de la moelle osseuse par voie intraveineuse (injection dans la veine retro-orbitale). 6 semaines après l’irradiation, ces souris seront anesthésiées afin de réaliser un prélèvement de sang et d’analyser la reconstitution de la moëlle osseuse. Toutes les souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales et les tumeurs seront mesurées au minimum 3 fois par semaines pendant 3 à 22 semaines en fonction du modèle de tumeur. Certaines souris recevront un traitement (Chimiothérapie conventionnelle, thérapie ciblée, immunothérapie) dès que le volume tumoral atteint 50 mm3. Ce traitement sera administrés per os ou par voie intrapéritonéale. La fréquence des traitements dépend de leur nature et s’étend de 5 fois par semaine à tous les 21 jours et ce pendant 21 à 154 jours selon le modèle de tumeurs.

Impact sur les animaux

Le modèle syngénique de tumeurs sous-cutanées chez la souris qui consiste à injecter des cellules tumorales murines de même fond génétique que les souris réceptrices immunocompétentes, est communément utilisé pour l’évaluation de l’efficacité d’une thérapie dans de nombreux types de cancers. Au cours du développement de la tumeur sous-cutanée, aucune nuisance ni effet indésirable n’est observé chez la souris. Si toutefois les tumeurs grossissent très rapidement, il peut arriver qu’elles se nécrosent au centre et commencent à s’ulcérer ou à saigner. Dans ce cas, c’est un point limite et les souris seront sacrifiées. Aussi, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de la taille tumorale maximale. La chimiothérapie conventionnelle est bien tolérée chez la souris, les effets secondaires sont faibles et les plus fréquents sont des diarrhées. Les effets indésirables les plus fréquents associés à l’immunothérapie sont d’ordre cutanés (rash, prurit dans 15 à 25% des cas) ou gastro-intestinaux (diarrhées dans 15 à 30% des cas), dans les deux cas ces atteintes sont bénignes et réversibles dès l’arrêt du traitement. Ces effets indésirables sont les mêmes dans le cas de traitements avec des inhibiteurs de la voie des MAPK. Une photosensibilité cutanée est également souvent observée dans le cas de traitements avec certains inhibiteurs de cette voie de signalisation. Aucun effet indésirable n’a été reporté dans le cas de traitements des tumeurs chez la souris avec des inhibiteurs de la traduction. Il est important de noter que les effets indésirables observés en monothérapie sont les mêmes que ceux observés en thérapie combinée.

Devenir

18 lots de souris (soit 432 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 90 lots de souris (soit 2160 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 6 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 144 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 30 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 720 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Ce projet fait suite à des nombreuses expériences réalisées in vitro dans des modèles cellulaires. Malheureusement le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiopathologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine et l’évaluation de l’efficacité des traitements pour cette pathologie.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Les résultats préliminaires ont permis de valider que des lots de 8-10 souris selon les paramètres à évaluer permettent d’acquérir des données fiables.

Raffinement

Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine dès l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, que nous aurons définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

Nous disposons de souris knockout (KO) présentant des altérations de la voie des MAPK. Ces souris immunocompétentes seront utilisées pour générer des modèles syngéniques de tumeurs sous-cutanées. Ces modèles sont communément utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement tumoral et pour évaluer l’efficacité des thérapies anti-cancéreuses car ils reproduisent la complexité des tumeurs observées chez l’homme. Nous réaliserons des chimères hématopoïétiques qui présenteront des altérations de la voie des MAPK uniquement dans les lymphocytes B et T. La comparaison des résultats obtenus dans les deux modèles, KO total vs. chimères, permettra d’établir si l’impact des altérations de la voie des MAPK sur la croissance tumorale, le phénotype et la réponse aux traitements est extrinsèque et/ou intrinsèque aux lymphocytes. Enfin des altérations de la voie des MAPK seront réalisées uniquement dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 ayant un récepteur permettant la reconnaissance spécifique d'antigène présent à la surface des cellules cancéreuses.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéprimées reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein humain dans la glande mammaire, puis une injection d'un peptide radiomarqué et une imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque qui les tue. L'objectif est de vérifier où se fixe ce traceur dans l'organisme, première étape avant une éventuelle application diagnostique ou thérapeutique laissée au conditionnel. Le porteur affirme que les résultats in vitro ne suffisent pas et juge le recours à des souris porteuses de tumeurs "indispensable".

Objectifs

Le ciblage de récepteurs de neuropeptides par des médicaments radiopharmaceutiques connait un réel engouement aujourd’hui pour l’imagerie et la thérapie des cancers. Il a été montré une forte expression du récepteur Y5 au neuropeptide Y dans 11 lignées cellulaires tumorales (dont le sein, ovaire, colon, prostate) quel que soit le grade et le phénotype. Un programme de recherche a été établi visant à caractériser le récepteur Y5 dans diverses lignées cellulaires tumorales humaines et à développer le premier agent de ciblage utilisable en imagerie nucléaire et en thérapie. Un premier analogue du NPY spécifique du récepteur Y5 pouvant être radiomarqué avec des radiométaux (nom de code du composé : tg3) a été développé. Les résultats in vitro obtenus jusqu’à présent démontrent la bonne affinité du composé pour le récepteur. Le présent projet de recherche préclinique vise à tester in vivo ce peptide radiomarqué à des fins diagnostiques sur des modèles murins de cancers du sein exprimant ces récepteurs Y5.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si ce premier analogue du neuropeptide Y donne de bons résultats in vivo en imagerie TEP, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique.

Procédures

- xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales (cancer du sein) dans les glandes mammaires sous anesthésie gazeuse (durée 10min) pour les 24 souris balb/c nude - 1 Injection intraveineuse au niveau de la queue contenant les radiotraceurs sous anesthésie gazeuse pour les 36 souris (durée 5 min) - 1 imagerie pour la moitié des effectifs (soit 18 souris) sous anesthésie gazeuse (durée 35 min) - 1 ponction cardiaque terminale pour les 36 souris sous anesthésie gazeuse 3% (durée 5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau des glandes mammaires pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies répétées pour la mise en place du modèle et pour l'imagerie peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 36 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur Y5 est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique du peptide tg3.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude du peptide tg3 radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic TEP, il est nécessaire de visualiser leur biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs Y5. Deux modèles murins de cancers du sein dont la présence du récepteur Y5 a été validée in vitro seront étudiés. Une étude préliminaire sur des souris saines (sans tumeur) permettra la comparaison de fixation du radiopeptide sur les différents organes. Pour chaque groupe, le ligand spécifique du récepteur Y5 est comparé à un peptide similaire dont la fixation à Y5 est nulle. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 6 souris par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène.

Raffinement

Les souris sont placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour/nuit 12h/12h, enrichissement des cages) au sein d’une animalerie de recherche agréée. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la greffe orthotopique de tumeur humaine au niveau de la glande mammaire. La souris Balb/c sera utilisée pour l’étude de biodistribution sans tumeur puisqu’elle présente le même fond génétique que la Balb/c nude. Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les xénogreffes seront initiées à 10 semaines de développement. A ce stade, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. La pousse tumorale dure entre 2 et 4 semaines (volume minimum de 150 mm3). Les études in vivo par imagerie TEP suivi des biodistributions de l'analogue tg3 radiomarqué et de sa version "scrambled" sur les souris xénogreffées peuvent être réalisées. Pour les souris Balb/c, les biodistributions des peptides radiomarqués seront réalisées entre 12 et 14 semaines de développement pour pouvoir être comparables aux souris xénogreffées.

800 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau ou directement dans le foie sous échographie, un traitement par anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines et des échographies répétées sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une ulcération cutanée ou des douleurs, et que tous les animaux sont tués pour prélever tumeurs et foies. Il décrit des travaux in vitro et ex vivo déjà menés mais conclut à la nécessité d'une validation sur "animal entier".

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Une autre partie des animaux recevra une injection unique de cellules cancéreuses directement dans le foie grâce à un système échographique, réalisée sous anesthésie générale, sans subir de procédure chirurgicale. Cette procédure prend environ 15 minutes à être réaliser. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Certains animaux subiront une échographie de 20-30 minutes, sous anesthésie générale, 2 fois par semaine, afin de suivre la croissance tumorale dans le foie des animaux. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Pour les souris injectées dans le foie, la tumeur peut entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent en sous-cutané une greffe de trois cancers gastriques humains, puis neuf injections intrapéritonéales ou vingt-huit gavages, avec suivi de la tumeur au pied à coulisse jusqu'à un volume limite. L'objectif est de tester quatre molécules et une technologie brevetée de ciblage tumoral, avant d'éventuels essais cliniques. Le porteur affirme qu'après des tests sur cellules, la validation exige de travailler sur "un organisme entier et complexe".

Objectifs

Ce projet vise à tester l’efficacité anti-cancéreuse de quatre molécules novatrices dans trois modèles de cancer de l’estomac. Le diagnostic des cancers gastriques est souvent tardif, où le cancer de l'estomac est foudroyant. Malgré l’arrivée de nouveaux traitements, le besoin médical non couvert demeure très important. Le but des candidats médicaments testés est d'apporter un nouveau traitement novateur qui pourrait également en combinaison améliorer les chimiothérapies actuelles en diminuant leurs effets secondaires indésirables et en boostant leur efficacité. Afin de soigner les patients atteints de cancers de l’estomac qui résistent aux traitements actuels, une technologie brevetée permettant de cibler spécifiquement la tumeur, sans toucher les autres organes, et, ce faisant, de réduire la toxicité des traitements anticancéreux et augmenter leur efficacité, a été mise au point et sera testée ici.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la démonstration que de nouvelles molécules thérapeutiques sont actives dans le traitement du cancer de l’estomac. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de cancers gastriques, sinon de ralentir la progression tumorale. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ces molécules dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’Homme.

Procédures

Suite à l’implantation sous cutanée des cellules cancéreuses (injection de quelques secondes maximum), les souris seront observées et palpées 3 fois/semaine. Dès que les tumeurs seront palpables, le suivi des animaux sera fait comme suit : mesure de la taille des tumeurs au pied à coulisse 3 fois/semaine et pesée des souris 3 fois/semaine (geste de quelque secondes maximum). L’observation des animaux sera réalisée 3 fois /semaine par le(s) expérimentateur(s) en même temps que la palpation et la pesée. Les souris vont subir 9 injections intrapéritonéales (3x/semaine pendant 3 semaines) ou 28 gavages au total (2x/jour pendant 2 semaines). Les injections et gavages durent 10 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention ainsi qu’une douleur de courte durée à l’injection. La pousse tumorale peut engendrer une perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les injections intrapéritonéales et les gavages peuvent générer une douleur lors de l’injection. Les chimiothérapies peuvent entrainer des effets néfastes sur l’état général des souris, mais les drogues utilisées ici ont été testée précédemment et n'ont présenté aucun effet secondaire délétère. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour cause d'atteinte du volume tumoral maximal tel que défini dans les points limites et pour prélèvement des tumeurs pour analyse.

Remplacement

Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis d'affiner le design de l'étude, mais la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anti-cancéreux est fortement dépendante du microenvironnement tumoral. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessite de travailler sur un organisme entier et complexe. Pour cette raison nous devons effectuer ces études d’efficacité chez la souris.

Réduction

Les études seront faites séquentiellement et une évaluation de l’efficacité des 4 composés sera effectuée après la réalisation des expériences sur le premier modèle, ce qui donnera lieu à une décision d’arrêter ou de continuer les expériences pour les modèles suivants. Cette décision sera prise par le comité scientifique. Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Les études sur les différents modèles tumoraux seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. En conséquence, les études statistiques nous ont permis de déterminer qu'il nous faudra 720 animaux au total pour cette étude.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 56 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Pour les composés administrés en gavage, des sondes de gavage flexibles et à usage unique seront utilisées. Les animaux seront observés de manière qualitative par les zootechniciennes de l'animalerie qui remplissent tous les jours une grille de suivi, basée sur des scores de critères comportementaux. Les animaux ainsi repérés sont inspectés le jour même par un membre de l’équipe de recherche qui procédera à l’évaluation des points limites selon une grille de scoring. Cette procédure sous forme d'arbre décisionnel ainsi que la définition de points limites adaptés à l'étude permettent une évaluation objective des critères d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

L'objectif est de travailler sur des animaux présentant des tumeurs et éviter le phénomène de rejet. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter ce phénomène. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif est un modèle qui permet une prise tumorale avec de nombreuses lignées humaines. En effet cette souris immunodéprimée est une souche reconnue pour l’implantation de tumeurs humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

3 260 souris vont être utilisé·es, dont 2 960 réutilisées dans d'autres procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des cellules souches humaines après irradiation, puis des injections, gavages et prélèvements sanguins répétés jusqu'à huit fois, avec un suivi par imagerie. Il s'agit d'une plateforme produisant à la demande des souris "humanisées" pour le système immunitaire, fournies à des laboratoires pour tester vaccins et traitements. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non-humain et affirme qu'il est le "seul modèle d'hématopoïèse humaine expérimentale".

Objectifs

L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité et/ou leur impact sur le système immunitaire humain.

Bénéfices attendus

Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).

Procédures

irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) ) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) -administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie IVIS (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois)

Impact sur les animaux

Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.

Devenir

Les animaux portant un système immunitaire humain générés dans une procédure pourront être inclus d'autres procédures du même projet (par exemple pour booster certaines cellules humaines, augmenter le nombre de cellules myeloides humaines, valider l’activité d’immuno-modulateurs) ou d'autres projets à la demande des utilisateurs de la plateforme). Les autres souris utilisées pour valider l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort pour analyse des différents organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.

Réduction

Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).

Raffinement

La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris humanisée présentant un système immunitaire humain (HIS) est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches isolées dans des souriceaux nouveau-nés de moins de 9 jours car les nouveaux nés sont plus permissifs à la greffe dans les premiers jours de vie. Le contrôle qualité par vérification du niveau d’humanisation dans le sang sera réalisé à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines. Ce nombre de semaines correspond au temps minimum nécessaire au développement du système immunitaire humain dans une souris à partir de cellules souches hématopoïétiques. Les souris HIS seront ensuite utilisées entre 12 et 25 semaines de vie. Cet intervalle d’âge correspond à la période pendant laquelle le système immunitaire humain est le plus stable chez la souris.