Cancers

1 440 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie intraveineuse ou intra-tibiale, puis subissent des prélèvements sanguins répétés, jusqu'à trente-six ponctions étalées sur dix-huit mois. Le projet vise à anticiper la rechute de patients atteints de leucémie aiguë en amplifiant leurs cellules chez la souris pour tester des médicaments. Le porteur affirme que ni les cellules de patients en culture ni les lignées cellulaires ne conviennent et conclut que la xénogreffe reste le modèle "indispensable".

Objectifs

Les leucémies aiguës sont des cancers agressifs et rares du sang. Les rechutes surviennent dans ~40% des cas et sont presque systématiquement mortelles à défaut de traitement codifié efficace. Pourtant de nouveaux traitements émergent, en particulier les thérapies ciblées. Mais nous ne savons pas quels patients peuvent en bénéficier en situation de rechute. Il est impossible de de réaliser des tests de nouveaux médicaments directement sur la leucémie du patient. La seule méthode actuellement validée dans la littérature est d’injecter les cellules leucémiques du patient au diagnostic dans un modèle de souris immunodéprimée pour amplifier les cellules leucémiques et modéliser la rechute. Aussitôt la greffe obtenue et la leucémie amplifiée, l’expérimentation est arrêtée pour récupérer les cellules leucémiques et réaliser les tests de drogues en laboratoire dont il est établi qu’ils sont parfaitement corrélés avec la réponse thérapeutique du patient en rechute. Il s’agit par conséquent d’anticiper la rechute avec ce modèle afin de proposer au patient un traitement efficace aussitôt qu’il rechute. Nous n’injecterons chez les souris que des leucémies pour lesquelles nous avons identifié qu’elles étaient à haut risque de rechute (~40% des patients).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus se situent à deux niveaux. Le premier niveau est individuel : nous pourrons identifier avant même la survenue de la rechute du patient un traitement prédit efficace par le modèle qui pourra alors être proposé dès la rechute du patient. Le deuxième niveau est collectif : nous pourrons corréler les données de ce modèle avec d’autres informations biologiques collectées dans le laboratoire afin d’identifier des biomarqueurs prédictifs de la sensibilité à chacune des thérapies ciblées. C’est un atout majeur, car les patients qui rechuteraient sans avoir bénéficié d’un tel modèle pourront disposer d’un traitement ciblé sur la base de ces biomarqueurs ; et nous pourrons ne plus utiliser le modèle murin lorsque nous aurons identifié des biomarqueurs capables de se substituer à l’utilisation du modèle animal.

Procédures

Injection de cellules leucémiques dans la veine caudale (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile contentionnée, sous anesthésie locale : 1 injection unqiue/souris (durée : 30sec). Injection de cellules leucémiques par voie intra-tibiale (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 injection unique/souris (durée 2 min). Prise de sang au niveau de la veine sub-mandibulaire (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile : 2 fois par mois, puis 1 fois par semaine (durée : 30 sec) jusqu'à atteinte d'un point limite (maximum : 36 prélèvements de 30 sec étalés sur 18 mois). Prise de sang au niveau intra-tibial (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 fois/mois à partir de 3 mois après injection des cellules leucémiques (durée : 2 min, maximum : 15 prélèvements de 2 min étalés sur 18 mois).

Impact sur les animaux

Les éventuels nuisances/effets indésirables peuvent se produire à 3 niveaux : -1/injection (éventuelle douleur post-injection, rapidement résolutive). -2/prise de greffe (éventuelles douleurs, perte de poids, changement de comportement). -3/monitorage biologique (éventuel stress momentané). -4/Le cas échéant, survenue de pathologies liées à l'âge.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les cellules leucémiques de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des médicaments innovants. Ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour les besoins des expériences. L’utilisation de lignées cellulaires de leucémies aigues ne constitue pas une alternative, car elles ne représentent pas les spécificités individuelles des patients. Le modèle murin est le seul pertinent dans cette étude pour modéliser la rechute des patients individuels dans le cadre de la médecine personnalisée. Pour toutes ces raisons, l’utilisation de xénogreffes dérivées de patients reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des leucémies aiguës, et pour tester l’efficacité de nouveaux traitements, comme rapporté dans la littérature scientifique.

Réduction

6 prélèvements de patients à haut risque de rechute seront reçus par mois. La prise de greffe se produit pour environ 50% des souris injectées. Pour chaque patient, il est nécessaire de récupérer les cellules leucémiques provenant de 2 souris pour espérer avoir suffisamment de cellules leucémiques pour tester notre panel de médicaments innovants en duplicats et ainsi avoir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, afin de maximiser les chances de greffe et pour espérer obtenir suffisamment de cellules pour tester leur sensibilité aux traitements innovants, les cellules leucémiques de chaque patient seront injectées dans 4 souris âgées de 8 à 12 semaines (âge auquel le taux de prise de greffe est le plus haut).

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux : Les cages sont ventilées et enrichies à l’aide de cotons, petits bouts de bois et tunnels rouges, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera assuré par un zootechnicien Les responsables du projet tiendront une fiche d'observation des points limites 1 fois/semaine ou plus, si un animal présente des signes de mal-être ou de souffrance. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques au niveau de la veine caudale se fera sous anesthésie local. Les injections et prélèvements au niveau intra-tibial seront effectués sous anesthésie gazeuse (durée totale d'environ 2 minutes) avec couverture antalgique générale (30 min avant l'injection/prélèvement) et locale (immédiatement avant et après l'injection/prélèèvement) au point d'injection. Les prélèvements au niveau de la veine sub-mandibulaire et au niveau tibial pour le suivi de la prise de greffe seront réalisés en alternant successsivement les côtés gauche et droit pour chaque souris.

Choix des espèces

Voici les facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) Les souris immunodéprimées ont été abondamment décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des leucémies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouveau traitements. 2) L'hématopoïèse (=la fabrication des cellules du sang) et la leucémogénèse (=l'apparition de la leucémie) ont été largement étudiés chez la souris. Nous pourrons donc analyser nos résultats à la lumière de toute cette connaissance accumulée chez la souris. 3) Leur durée de vie est particulièrement adaptée par rapport à la cinétique de prise de greffe et pour un programme de recherche sur 5 ans. 4) Les 2 sexes seront utilisés sans distinction car il n'y a pas d'influence des hormones sexuelles sur la survenue des leucémies. Afin de maximiser les chances de greffe et d'obtenir suffisamment de cellules, chaque prélèvement de patient sera injecté dans 4 souris, âgées de 8 à 12 semaines (car présentent le plus haut taux de succès de prise de greffe).

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de défenses immunitaires, elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du foie humain, laissent croître une tumeur pendant un à deux mois, puis sont gavées chaque jour pendant dix à vingt jours, avec nécroses tumorales et pertes de poids possibles, avant d'être tuées pour analyse des tumeurs. Le projet teste des sucres issus d'algues marines comme traitement du cancer du foie, retombée que le porteur renvoie au long terme. Il indique avoir d'abord évalué ces molécules in vitro.

Objectifs

Le cancer du foie est le 6ème cancer par ordre de fréquence dans le monde. Parmi les facteurs impliqués dans la propagation de ce cancer on retrouve une protéine appelée héparanase qui dégrade les sucres biologiques entourant les cellules, et favorise ainsi la propagation du cancer. L’inhibition de l’activité de cette protéine, pour contrôler et limiter la propagation des cellules cancéreuses dans le foie, apparaît comme une stratégie de recherche prometteuse. Ainsi, ce projet vise à utiliser des sucres naturels issus d’algues dont le rôle principal est de diminuer l'action de l'héparanase. Notre problématique est d'évaluer une nouvelle stratégie de lutte contre le cancer du foie basée sur l’utilisation de ces potentiels traitements sur des tumeurs humaines ayant été developpées chez des souris. Le but de ce projet est de trouver un traitement original et innovant du cancer du foie, qui pourrait être administré en plus des stratégies thérapeutiques actuelles pour améliorer les chances de survie des patients.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court terme pour ce projet est la détermination du traitement ayant le plus d'effets sur les tumeurs du cancer du foie. Le bénéfice attendu à moyen terme est l'identification des mécanismes qui ont lieu au sein de la tumeur. Les bénéfices attendus à long terme seraient d'envisager un traitement du cancer du foie par ces traitements naturels à base d'algues marines, mais cela nécessitera alors des expérimentations supplémentaires pour s’assurer de leur potentielle efficacité dans ce cadre.

Procédures

a.Une injection sous la peau de cellules humaines (sous anesthésie). Cette injection devrait prendre quelques secondes par souris. b. Développement d'une tumeur sous la peau après l'injection de cellules humaines du cancer du foie aux souris. Il faudra environ 1,5 à 2 mois pour que la tumeur atteigne une taille adéquate permettant de commencer les traitements. La taille maximale des tumeurs ne devrait pas dépasser un volume de 200mm^3 c. Traitement quotidien (7 jours/7), une fois par jour pendant 10 ou 20 jours par gavage avec une sonde de gavage (volume de gavage : 200 µL). La durée de chaque gavage peut varier, mais en général, cette procédure est assez rapide et peut être effectuée en quelques secondes.

Impact sur les animaux

L'administration des traitements à l'aide d'une sonde métallique dans l'estomac des souris sera effectué tous les jours pendant 10 ou 20 jours (week-ends compris). Ce mode d’administration appelé gavage entraîne une nuisance et un stress de sévérité modérée aux souris, on note aussi une nuisance liée à la croissance des tumeurs. Parmi les effets indésirables possibles on note les effets suivants : Blessures ou nécrose des tumeurs - Perte de poids suite aux manipulations quotidiennes - Risque de propagation de la tumeur dans d'autres parties du corps.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure éxperimentale afin de récuperer les tumeurs et les analyser.

Remplacement

Dans un premier temps, nous avons étudié l'effet de nos molécules thérapeutiques dans un modèle de cellules au laboratoire, les résultats obtenus confirment l'efficacité anti-cancéreuse de notre traitement. Désormais notre objectif est de confirmer les effets observés sur les cellules dans un modèle animal. On voudrait également comprendre les interactions et les mécanisme biologiques qui ont lieu entre les cellules cancereuses et le milieu dans lequels elles baignent avec et sans traitement, notamment sur la création de nouveaux vaisseaux sanguins. Les modèles sur animaux pour étudier le cancer sont les seuls permettant de reconstituer la complexité des tumeurs humaines sur l'animal. Les résultats obtenus sur ces modèles permettent ainsi une réelle extrapolation en médecine humaine

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans cette étude est de 400 souris. Le nombre d'individus par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Une étude sur des cellules a été préalablement faite au sein de notre laboratoire et a démontré un effet anti-cancéreux de 3 sucres issus d'algues marines. Malgré l'importance des trois molécules, seulement deux ont été sélectionnés pour l’étude sur les souris. Toujours dans le but de limiter le nombre d'animaux, nous nous sommes référés aux données bibliographiques pour determiner le nombre de cellules à injecter aux souris. Et dans la mesure du possible, les tissus obtenus à partir d'une souris serviront à plusieurs analyses biologiques à la fois. Par ailleurs, la taille des effectifs a été établie grace à un calcul de puissance statistique, et les résultats obtenus permettront d'établir des analyses statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux proviennent d’un éleveur agréé .Une periode d'acclimatation de 7 jours est prévue suite à leur réception, L’hébergement est assuré en cages enrichies (nid végétal et/ou bûchettes) à raison de 5 animaux par cage conformément à la réglementation mais d'éventuels désagréments observés au cours du projet et inhérents à la promiscuité avec les autres animaux pourront nous conduire à réduire ce nombre. Pour assurer le bien-être des animaux et éviter de les stresser, l'injection de cellules sous la peau se fera sous anesthésie légère. Les animaux seront sous surveillance avec un accès facilité à la nourriture et à l'eau. Une surveillance quotidienne sera exercée pour s’assurer du bon état général des animaux. Le personnel de zootechnie est formé à l’observation des animaux et tout signe de mal-être est immédiatement signalé au responsable du projet qui prendra la décision sur leur devenir, en accord avec le vétérinaire référent si nécessaire. Les souris seront suivies 3 fois par semaine par un score clinique.

Choix des espèces

Nous avons choisi dans notre modèle d'étude des souris sans thymus dites athymiques. Ces souris présentent une immunodéficience qui limite le risque de rejet de la greffe des cellules humaines. Pour maximiser nos chances de prise de greffe nous avons choisi de faire notre étude sur des souris de 7 semaines d'age lors de l'injection de cellules cancéreuses humaines, elles auront au moins 13 semaines lorsqu'on débutera l'administration des traitements. Notre choix est fondé sur les données bibliographiques des études cancérologiques.

624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de système immunitaire, elles reçoivent une greffe de l'un des six modèles de cancer du sein triple négatif, puis des injections de molécules et un suivi de la tumeur, avec mise à mort au plus tard soixante jours après le début. Les retombées annoncées, de nouvelles thérapies contre un cancer de mauvais pronostic, sont présentées comme "nécessaires" à de futurs essais cliniques. Le porteur affirme que la sensibilité des tumeurs aux traitements dépend du microenvironnement et impose de travailler sur un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet vise à étudier 6 nouveaux modèles de cancers du sein triple négatif (catégorie de cancer à mauvais pronostic). Le cancer du sein désigne un ensemble de tumeurs malades. En l’absence de traitements cette catégorie de cancer présente une forte agressivité et a de mauvais pronostics. Ce cancer représente environ 15% de l’ensemble des cancers du sein et touche préférentiellement les femmes jeunes, entre les âges de 40 et 50 ans. L’incidence annuelle est de l’ordre de 14/100 000 femmes, soit environ 40 000 nouveaux cas par an en France. Que ce soit dans les formes localisées ou déjà propagées le pronostic est significativement plus sévère que dans les autres formes de cancers du sein. Il s’agit donc d’un véritable problème de santé publique pour lequel de nouveaux traitements sont nécessaires. Le présent projet vise à évaluer de nouvelles thérapies dans des modèles. Il se déroulera en deux temps. Tout d’abord seront établies les conditions optimales de prise tumorale des 6 lignées cellulaires sur une souche de souris dépourvue de système immunitaire, puis souhaitera évaluer l’efficacité de nouvelles molécules .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la démonstration que de nouveaux principes thérapeutiques soient actifs dans le traitement du cancer du sein triple négatif. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ces molécules dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’homme.

Procédures

Implantation de tumeur en sous-cutané ou orthotopique mammaire (ressemble à de la sous cutanée) (une fois au début de l'expérimentation, quelques minutes) - injection intraveineux de composés thérapeutiques non toxiques (quelques minutes), pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours - mesures tumorales au pieds à coulisse 3x/semaine (quelques secondes)

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales en sous cutané entrainant un stress lors de la contention, et une douleur lors de l'injection : quelques minutes, - injection de cellules tumorales en orthotopique mammaire ressemble à de la sous cutanée) entrainant un stress lors de la contention, et une douleur lors de l'injection : quelques minutes, - Pousse tumorale : nuisance possible si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite, gêne et éventuellement douleur au niveau de la tumeur - pesées et suivi tumoral : stress lors de la contention (quelques minutes) il n'y a aucun effet secondaire attendu pour les traitements.

Devenir

Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 60 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Nous devrons récupérer les tumeurs pour analyses.

Remplacement

La sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour cette raison nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris. In vitro au préalable, les molécules ont été testé sur ces mêmes lignées pour connaitre et valider la dose optimale. La voie d’administration de chaque drogue a fait l’objet d’une étude de toxicité et pharmacocinétique afin de déterminer la meilleure méthode d’injection de chaque composé.

Réduction

Les expériences seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable, i.e. 8 animaux par groupe. Le nombre de souris a été défini et établi via des outils statistiques. Les études sur les différents modèles tumoraux seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Avant la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs ont une très bonne expérience et détectent très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Leur état général sera aussi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation. Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 60 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux feront l’objet d’un suivi très soutenu le jour J de l’injection. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseignent une grille de suivi basé sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos vouté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec des animaux présentant un système immunitaire fortement déprimé pour éviter le phénomène de rejet. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter ce phénomène La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif. En effet la souris immunodéprimée est reconnue pour l’implantation de cellules humaines. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de système immunitaire, elles reçoivent une irradiation corporelle totale puis une greffe de cellules humaines, développant à partir de trois à quatre semaines une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et altération de l'état général. Les retombées annoncées, améliorer la greffe de moelle osseuse contre la leucémie, sont présentées comme "indispensables" à de futurs essais cliniques. Le porteur reconnaît poursuivre des expériences in vitro mais affirme que l'efficacité des cellules "ne peut pas être déterminée in vitro".

Objectifs

Ce projet de recherche concerne les lymphocytes NKT invariantes (iNKT), qui sont des cellules importantes dans notre système immunitaire qui ont la capacité de réguler les réponses immunitaires et de tuer les cellules cancéreuses. Lorsqu'une personne subit une greffe de moelle osseuse pour traiter une leucémie, les cellules du donneur peuvent attaquer les tissus sains du receveur, causant des dommages graves appelés "réaction du greffon contre l'hôte" (GVH). L'ajout d'iNKT au greffon pourrait aider à réguler la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé associés à la GVH tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour cela, il est important d'étudier comment les iNKT régulent la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé et déterminer la quantité d'iNKT nécessaire pour obtenir un effet bénéfique. Il est également essentiel de vérifier que l'ajout d'iNKT n'empêchera pas l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour atteindre ces objectifs, des modèles animaux seront utilisés pour étudier les effets de différentes quantités et sous-types d'iNKT sur la réponse immunitaire. Les interactions entre les iNKT et d'autres types de cellules immunitaires seront également examinées pour mieux comprendre leur rôle dans la régulation de la réponse immunitaire. Enfin, il sera étudié si l'ajout d'iNKT au greffon empêchera l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Les résultats de cette étude pourraient améliorer les traitements de greffe de moelle osseuse et réduire les risques associés à la GVH, tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la greffe de moelle osseuse, les cellules humaines intégrées dans le greffon détruisent les cellules leucémiques du receveur mais peuvent également reconnaitre et attaquer les tissus sains du receveur (réaction du greffon contre l'hôte appelée GVH). La GVH est responsable de la mortalité de 20% des patients greffés. Par ailleurs, l’effet anti-leucémique ne se développe pas chez tous les patients et le taux de rechute de la leucémie survient chez environ 30% des patients greffés. Ce projet vise à valider un sous type particulier de cellules humaines (les iNKT) qui favorisera l’effet anti-leucémique, avec un moindre effet sur les tissus sains. L’utilisation de ces cellules pourrait par conséquent améliorer le devenir des patients greffés. Les résultats de ce projet pré-clinique sont indispensables à la poursuite du développement de ce traitement innovant en vue de mettre en place des études cliniques chez l’homme.

Procédures

Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 264 souris pendant 40 secondes par carrousel (6 à 8 souris). -Une injection intraveineuse (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 216 souris, et trois injections pour 48 souris, pendant 1 minute par injection. -Une injection intra-péritonéale (IP) sur animal vigile, au maximum 4 fois pendant 8 semaines sur 76 souris, pendant 1 minute par injections. -Un prélèvement de sang sur animal vigile sur 188 animaux, et cela à 21, 28 et 35 jours après la greffe de cellules humaines, pendant 2 minutes par prélèvement..

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress modéré lors de la procédure de radiothérapie à faible dose préalable à l’injection dans la veine caudale des cellules humaines. Ils développeront des signes cliniques de GVH à partir de 3 à 4 semaines après la greffe. Ces signes cliniques sont une perte de poids (-20% par rapport au poids pré-greffe) avec ou sans diarrhée et des signes de fatigue et d’altération de l’état général : voussure, perte de brillance du pelage, hérissement des poils, inflammation des yeux et diminution de l’activité dans les cas sévères. Ces signes sont gradés par le même expérimentateur selon le score de GVH. Le niveau de souffrance sera modéré. Dans les expériences où seront injectées des cellules leucémiques, les animaux présenteront à partir de 3 semaines après l’injection des signes de croissance tumorale avec prise de poids et développement de masses abdominales qui pourront altérer leur état général (augmentation du score clinique utilisé pour grader le degré de GVH). Le niveau de souffrance sera modéré.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines plus ou moins avec des cellules leucémiques, une GVH ou une progression tumorale vont pouvoir se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ou en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences in vitro pour valider la fonctionnalité des cellules humaines de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé in vitro, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques : ainsi, l’expérimentation s’arrêtera dès l’obtention d’une différence significative entre les groupes (minimum 8 souris totales par groupe), et ne sera pas poursuivie en l’absence de différence statistiquement significative observée à 12 souris receveuses par groupe. Par ailleurs, les différentes étapes du projet seront conditionnées par les résultats obtenus dans les précédentes. Ainsi, au maximum 264 souris seront utilisées.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton), dans un portoir ventilé, dans un secteur spécifique pour les animaux immunodéprimés en animalerie EOPS avec contrôle de la température, de l'humidité, du cycle jour. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évalution sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris NSG permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines car cette souris, ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle osseuse. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur la GVH et l’effet anti-leumique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 15 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.

54 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une implantation sous-cutanée de gel sous anesthésie puis jusqu'à 35 séances d'imagerie sous anesthésie en 28 jours, pour suivre la libération d'un anticorps et la dégradation du gel. Le porteur indique que l'accumulation de contentions, d'anesthésies et d'injections entraîne une nuisance globale modérée. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace le modèle animal pour reproduire la complexité de l'environnement sous-cutané, l'objectif restant une preuve de concept à visée de confort des patients.

Objectifs

L'utilisation pharmaceutique de protéines thérapeutiques telles que les anticorps a augmenté au cours des dernières années. Ces actifs sont principalement administrés par voie intraveineuse (i.v.) conduisant fréquemment à une élimination trop rapide. Ceci entraine le besoin d’administrations régulières qui limitent la qualité de vie des patients et augmentent le coût global des traitements. Ces dernières années, l'administration sous-cutanée (SC) a attiré beaucoup d’attention car elle présente de nombreux avantages. Elle est en effet plus pratique, plus rapide, plus économique et plus facile à administrer que l'administration intraveineuse (i.v.). D’autre part, afin de limiter le nombre d’administrations, les efforts se sont tournés vers le développement de formulations permettant la libération prolongée des actifs thérapeutiques. Au cours des dernières décennies, les gels injectables sont apparus comme des matériaux prometteurs offrant une capacité de chargement élevée d'une large gamme d'agents thérapeutiques. Différents gels ont été développés dans la littérature mais certains présentent des limites. Il existe donc toujours un besoin de développer de nouveaux systèmes de délivrance de protéines thérapeutiques. Nous avons récemment formulé une famille de gels qui peut être chargé avec différents actifs thérapeutiques. L’objectif de ce projet est d’établir une preuve de concept de l’intérêt de ces gels pour la délivrance prolongée d’anticorps après administration sous-cutanée. Le but est d’évaluer sur souris saine la biodégradation des gels après implantation ainsi que la libération prolongée de l’anticorps par imagerie en fluorescence.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’établir une preuve de concept de l’intérêt des gels développés et de sélectionner des formulations prometteuses pour une libération contrôlée et prolongée d’un anticorps thérapeutique. L’objectif à long terme de ce projet est de proposer un système de délivrance de protéines thérapeutiques implantable en sous-cutané afin d’améliorer le confort de vie des patients tout en réduisant le coût global des traitements.

Procédures

Contention lors des déplacements (

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir plusieurs gestes tel que des contentions, des anesthésies, des injections sous-cutanées qui vont engendrer des douleurs et du stress et dont l’accumulation entraînera une nuisance globale modérée sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour permettre des analyses ex vivo nécessaires.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Des études in vitro ont déjà été réalisées mais ne permettent pas de reproduire toutes les conditions représentant la complexité d'un environnement sous-cutané. Le modèle animal est donc nécessaire pour évaluer la libération sous-cutanée des actifs piégés dans les gels ainsi que la biodistribution des gels dans le temps. Ces études auront lieu uniquement sur souris saines.

Réduction

L’emploi d'un système d'imagerie du petit animal permet un suivi dans le temps pour chaque animal et permet ainsi de réduire le nombre d’animal pour le projet. Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe pour maintenir une interaction entre individus dans des cages enrichies. Les souris ont accès librement à la nourriture et à l'eau. Le protocole expérimental prend en compte l’impact sur le stress et la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance et stress animal. Les imageries , administrations sous-cutanée et la mise à mort sont réalisées sous anesthésie pour réduire le stress. Après administration : suivi quotidien des animaux, avec mesure du poids lors des séances d’imagerie afin de minimiser le stress et la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec des souris pour lesquelles de nombreux protocoles sont bien établis et pour lesquelles, des études concernant l’administration d’hydrogels ou d’anticorps ont été décrites. Les souris utilisées n'auront pas de pelage qui interfèrerait avec les mesures d’imagerie optique in vivo. Seules des souris femelles (9-11 semaine en début de procédure) seront utilisées dans cette étude.