Cancers

31 souris porteuses de tumeurs du côlon vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intratumorale d'un composé, pour douze d'entre elles une prodrogue par voie intraveineuse et un prélèvement de sang à la jugulaire, puis jusqu'à quatre séances d'imagerie sous anesthésie avant la mise à mort et le prélèvement des organes. L'objectif est de vérifier que deux produits se concentrent bien dans la tumeur, une étape de pharmacocinétique préalable au test de leur effet anticancéreux dans d'autres travaux. Le porteur affirme que la biodistribution ne peut pas être prédite in vitro, faute de circulation sanguine et de système excréteur.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer et de comparer les propriétés pharmacocinétiques des nouveaux agents thérapeutiques dans le domaine de l'oncologie préclinique. Ces agents se composent de deux produits : l’un qui sera administré par voie intratumorale et un second contenant une pro-drogue (chimiothérapie rendue inactive) qui ne sera activé qu’en présence du premier. L’objectif de ce travail est de valider que les produits se localisent bien au niveau tumoral et y restent suffisamment de temps pour exercer leurs actions. Le développement de ces nouveaux agents est nécessaire pour faire progresser le traitement du cancer (i.e. optimiser le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables). Dans un premier temps, les composés seront évalués in vitro pour connaître leurs propriétés de base. Cependant, il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, notamment sa pharmacocinétique, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent. Par conséquent, pour s'assurer que les produits nouvellement développés présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables, ils seront d'abord testés in vivo sur de petits rongeurs. Après cette étape, leurs propriétés anticancéreuses pourront être évaluées dans d’autres travaux

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables. Ce projet permettra de réaliser la preuve de concept qu’il est possible d’activer une chimiothérapie au niveau de son site d’action en optimisant son efficacité et limitant ses effets secondaires dans le reste de l’organisme.

Procédures

- Observation des souris (poids, volume tumoral, santé générale) : toutes les souris, sur des animaux vigiles, deux fois par semaine. Durée : quelques secondes par souris - Injection intratumorale d’un composé : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Injection intraveineuse d’une prodrogue inactive : n=12 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Prélèvement sanguin par veine jugulaire : n=12 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes. - Imagerie : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, au maximum 4 points d'imagerie sur une période de six jours après l'injection de l'agent d’imagerie. Durée : maximum 60 minutes d’anesthésie - Euthanasie et prélèvement des différents organes : toutes les souris, les souris seront profondément anesthésiées et euthanasiées avant que la procédure n'ait lieu, dernière expérience.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait avoir des effets négatifs sur les animaux, comme une gêne des mouvements de l’animal ou des pertes de poids (cachexie). L'évolution de la taille de la tumeur sera donc suivie très régulièrement et l'étude sera terminée arrêtée lorsque les tumeurs auront atteint la taille mentionnée dans les points limites. L’état général de l’animal ainsi que son poids seront aussi suivis et un complément alimentaire sous forme de gel pourrait être fournis pour limiter les nuisances. Les procédures (injection intraveineuse ou intratumorale, prélèvements sanguin et imagerie) sont réalisées sous anesthésie sur lit ou plaque chauffante réduisant la douleur et l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Peu ou pas d'effets indésirables dus à l’injection des différents produits sont attendus : l'injection intratumorale du produit 1 a déjà été réalisée chez l’animal sans effet secondaire, la dose de radioactivité qui y sera ajoutée est très faible et ne causera pas d’effet sur l’animal. Si la molécule de chimiothérapie active peut avoir des effets secondaires se caractérisant surtout par une perte de poids, la prodrogue a été testée chez l’animal et ne possède aucun effet secondaire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.

Remplacement

Toutes les molécules qui seront évaluées dans ce projet ont été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou de tissus sont impliqués.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les nouveaux agents seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo. En comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant. Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide de tests statistiques. Cela donne un total de 24 souris nécessaires, soit 6 souris par groupe. Pour garantir qu'un nombre suffisant d'animaux puisse être inclus (taille homogène des tumeurs), 7 animaux résiduels seront également ajoutés pour un total final de n=31 souris.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expériences sont menées, dans une très large majorité sur des animaux pour lesquels le volume de la tumeur n’excède pas 1000-1200 mm3 (plus rarement, il est toutefois possible d’inclure des animaux dont le volume de la tumeur est supérieur à 1000-1200 mm3, mais sans dépassement de point limite). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris sont l’espèce de référence pour les études en oncologie. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. D’autre part, de nombreux modèles de cancers sont en place et très bien caractérisés chez la souris par l’établissement producteur permettant d’éviter une mise en place de modèle qui nécessiterait beaucoup plus d’animaux. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines minimum à la date de début d’étude d’imagerie) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

420 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses colorectales puis jusqu'à dix-huit injections dans l'abdomen sur deux semaines, pour tester si la nortriptyline ou le blocage de l'interleukine-23 rend la tumeur plus sensible à une chimiothérapie et à une immunothérapie. Le porteur précise que les souris sont maintenues sans traitement antidouleur pour ne pas fausser la réponse inflammatoire, tout signe de souffrance entraînant leur mise à mort. Il présente une régression complète de la tumeur comme un résultat probable et affirme que l'effet sur le microenvironnement tumoral ne peut être modélisé in vitro.

Objectifs

Ce projet vise à démontrer le rôle de l’accumulation de lipides et de son inhibition par la nortriptyline ou par le blocage de l’IL-23 dans la sensibilisation à la chimiothérapie 5-Fluorouracil et à l’immunothérapie anti-PD-L1 dans le cancer colorectal.

Bénéfices attendus

L’agent anti-cancéreux 5-FU perd de son efficacité avec l’accumulation induite de gouttelettes lipidiques intracellulaires et pourrait limiter également l’action favorable de l’immunothérapie anti-PD-L1 par l’induction de ces gouttelettes lipidiques limitant l’action du système immunitaire anti-tumoral. La prévention de l’accumulation des gouttelettes lipidiques par l’inhibition de la capture de lipides extracellulaires à l’aide de la nortriptyline ou l’anti-IL23 améliorerait l’efficacité du traitement 5-FU et de l’immunothérapie anti-PD-L1 conduisant probablement à une régression tumorale complète avec un traitement combinant ces trois molécules.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales tous les 3 jours pendant 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les injections IP répétées (avec au maximum 18 injections sur deux semaines) peuvent entraîner un stress chez les souris vigiles au moment de la contention. La transplantation en sous-cutanée des cellules se fera sur souris anesthésiée à l’isoflurane. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids (deux fois par semaine) sera effectuée.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront traitées pendant deux semaines et maintenues en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elles seront ensuite mises à mort.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle murin de cancer est nécessaire car l’effet du blocage de la capture de lipides extracellulaires pourrait moduler l’activité de l’ensemble du microenvironnement tumoral et notamment celle du système immunitaire qui ne peut être modélisée in vitro. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 420 souris mâles seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 ou Balb-C a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. Des souris mâles âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.

744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans les coussinets des pattes des injections de cellules dendritiques activées, puis une seconde injection dans le flanc, pour mesurer une réponse immunitaire contre des peptides issus du génome silencieux. Le porteur indique que les injections dans les coussinets peuvent provoquer une douleur de plusieurs jours empêchant l'animal de marcher, de boire et de manger normalement. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les flux de cellules entre organes et juge cette étape "indispensable" pour tester le pouvoir immunisant des peptides.

Objectifs

Le système immunitaire dispose de plusieurs possibilités pour identifier et cibler les cellules tumorales. Parmi les cellules du système immunitaire, les lymphocytes T constituent un mécanisme clef pour cibler les cellules tumorales, mais c’est aussi un des mécanismes responsables des dommages dans les maladies auto-immunes. Cette reconnaissance de ses propres cellules (tumorales ou pas) s’effectue par le biais de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). En effet, ces molécules, exprimées par la plupart des cellules, ont la capacité de capturer et d’exposer des peptides (fragments de protéines), reflétant la composition protéique de la cellule à un moment donné. Dans une situation normale, lorsqu’il s’agit de protéines du « soi », présentes normalement dans la cellule, le système immunitaire les ignore. En revanche, lorsqu’il s’agit de peptides dérivés de virus ou des bactéries (« non-soi »), le système immunitaire est activé, et est alors capable d’éliminer les cellules qui expriment ces peptides du non-soi. L’activation des lymphocytes T est faite par les cellules dendritiques. Ces cellules forment un réseau de cellules « sentinelles » capables de détecter des menaces. Après reconnaissance des menaces pour l’organisme, qu’il s’agisse de pathogènes ou de cellules tumorales, ces cellules peuvent capturer des peptides dérivés de pathogènes ; elles migrent ensuite dans les organes lymphoïdes secondaires où elles initient la réponse immunitaire en présentant ces peptides aux lymphocytes T. Une question majeure restant ouverte est celle de la nature des peptides exprimés par les cellules du « soi » visibles par le système immunitaire pendant les réponses auto-immunitaires ou dans le cadre de la tumeur. L’identification de ces peptides permettrait le développement des thérapies ciblés. Ce que nous voulons tester dans ce projet, c’est l’hypothèse selon laquelle les cellules du « soi » pourraient être vues par le système immunitaire par le biais de peptides dérivés de rétroéléments endogènes, éléments de la partie silencieuse du génome ayant la capacité de se répliquer et de se déplacer au sein du génome entier. L’expression de ces éléments est normalement inhibée, mais dans certaines situations, notamment dans des cellules cancéreuses, ils peuvent être réactivés.

Bénéfices attendus

Il est essentiel de noter que la très grande majorité des cancers développent des mécanismes très efficaces qui inhibent la réponse immunitaire. Les dernières années ont vu l’entrée en clinique des inhibiteurs de checkpoint, molécules utilisées dans le traitement de plusieurs cancers chez l’homme dans le cadre d’une approche appelée immunothérapie. Le développement de ces molécules constitue une avancée majeure dans le traitement de cancers chez l’homme. En effet, elles démontrent une efficacité chez des patients résistants à d’autres types de traitement. Cependant, les inhibiteurs de checkpoint ne fonctionnent que chez 20 à 25% des patients qui sont traités de cette manière. La compréhension des mécanismes expliquant cette efficacité variable fait actuellement l’objet d’efforts considérables de la communauté scientifique. Tout comme l’identification de molécules avec lesquelles les inhibiteurs de checkpoint pourraient être combinés pour augmenter leur efficacité. D’autre part, les traitements pour les maladies auto-immunes sont en général très peu spécifiques et impliquent la suppression plus ou moins généralisée du système immunitaire, ce qui entraîne plusieurs effets indésirables. Tant dans le cas des réponses immunitaires contre le cancer que dans celui des réponses auto-immunes, une question majeure restant ouverte est celle de la nature des peptides exprimés par les cellules du soi (tumoraux ou pas) visibles par le système immunitaire. L’identification de ces peptides permettra le développement des thérapies ciblés, soit contre les cellules cancéreuses, soit pour éviter les réponses auto-immunitaires. Ce projet permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer l’efficacité des thérapeutiques contre ces deux types de maladies.

Procédures

Pour ce projet, nous injecterons des cellules dendritiques, préalablement activées par une molécule dérivée de la paroi des certaines bactéries : le LipoPolySaccharide ou LPS (qui augmente la capacité des cellules dendritiques à activer les lymphocytes T) et incubées en présence des peptides candidats, dans la plante de pied de souris afin d’étudier leur capacité d’induction des réponses immunitaires in vivo. Les cellules dendritiques activées seront injectées dans chacun des coussinets des pattes arrière (1 ou 2 fois au cours de l’expérience) chez des souris anesthésiées (durée de l’anesthésie : 5 minutes). Les antigènes de soi, comme les peptides que nous allons tester dans ce projet, induisent des réponses immunitaires très faibles. Ces réponses ne sont pas détectables dans le sang de la souris, cependant, les cellules spécifiques seront concentrées dans les ganglions des pattes. Pour obtenir ces ganglions, certaines souris seront mises à mort 7-10 jours après ces injections. Les autres souris seront gardées et injectées 15-20 jours après la première injection avec une solution de peptides ou avec des cellules dendritiques activées par du LPS dans le flanc de la souris vigile (durée du geste inférieure à 10 secondes). 2-3 jours après la deuxième injection, les souris seront mises à mort pour évaluer l’ampleur de la réponse immunitaire contre les peptides après une deuxième immunisation.

Impact sur les animaux

Les injections dans les coussinets plantaires de la souris peuvent induire la douleur pour un temps limité après l’injection. Nous n’attendons pas une induction de l’inflammation dans les coussinets après l’injection des cellules dendritiques activées. Néanmoins, il est possible que les souris aient un peu de douleur pendant quelques jours dans les coussinets, ce qui pourrait les empêcher de marcher et de boire et manger normalement. Les injections dans le flanc de la souris peuvent induire un stress lié à la manipulation et une légère douleur pendant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet découle de résultats obtenus in vitro et in silico où on a constaté l’expression et la présentation des peptides dérivés de rétroélements endogènes dans des molécules MHC de cellules dendritiques lors de leur activation par LPS. Cependant, le fonctionnement du système immunitaire repose sur des interactions tridimensionnelles et des flux de cellules finement régulés entre organes. De plus, la réponse immunitaire anti-tumorale ainsi que les réponses auto-immunitaires, entraînent la réaction de différentes sous-populations cellulaires qui interagissent entre elles dans des localisations tissulaires spécifiques. C’est pourquoi ces phénomènes ne peuvent être encore aujourd’hui reproduits in vitro. Cette étape est indispensable pour tester la capacité des peptides trouvés à induire des réponses immunitaires aussi bien antitumorales qu’auto-immunes.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est de 4 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. D’après notre expertise, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Un minimum de 2 expériences indépendantes sur des groupes de 4 animaux est réalisé afin d'assurer la robustesse des résultats.

Raffinement

Les injections de cellules dendritiques dans les coussinets de la souris seront réalisées par du personnel entrainé sous anesthésie gazeuse afin de minimiser le stress causé à l’animal. Le volume injecté correspond à un volume réduit (par rapport au volume maximal de recommandations internationales ) afin de diminuer l’inconfort causé à l’animal. Les injections dans les coussinets plantaires de la souris peuvent induire la douleur pour un temps limité après l’injection. Nous examinerons les pattes et la démarche de la souris pour évaluer une possible gêne à la locomotion. En cas de douleur, celle-ci sera prise en charge par des anesthésiques locaux et des aliments gélifiés seront mis à disposition en cas de difficulté de locomotion. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte des points-limite, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin nous a permis d’identifier des peptides derivés de rétroélements endogènes par séquençage à haut débit. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance et que les résultats ne soient pas affectés par des modifications dues à un âge trop avancé des animaux. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.

6 950 souris immunodéprimées vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer des immunothérapies cellulaires associées à d'autres traitements contre le cancer. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales humaines, la thérapie à tester et des injections répétées, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse et par bioluminescence. Le porteur indique que la tumeur peut rendre les souris cachectiques et douloureuses, applique un point limite au volume tumoral, et tue les animaux en fin d'étude, une partie des surnuméraires étant réutilisée pour entraîner les expérimentateurs à leurs gestes. Il affirme que l'étude dans un "organisme vivant complet" reste "indispensable" après les tests in vitro.

Objectifs

L’immunothérapie est une avancée scientifique majeure dans la lutte contre le cancer. Elle utilise les caractéristiques du système immunitaire et de ses lymphocytes T, qui détectent et éliminent les attaques extérieures (microbes, virus, bactérie) ainsi que les cellules tumorales de l’organisme. Or, ces dernières envoient des signaux qui modulent l’activité de ces lymphocytes T les rendant moins efficaces. Les traitements d'immunothérapie visent à favoriser l’infiltration de cellules immunitaires dans les tumeurs afin de lutter contre, et de les aider à contourner les mécanismes de protection pour les détruire. Plusieurs stratégies existent : L’immunothérapie active basée sur le principe de la vaccination stimule les défenses immunitaires du patient pour prévenir les récidives ou traiter les cancers métastatiques. De petites molécules sont utilisées pour cibler directement les voies de signalisation impliquées dans l’activation et la prolifération des cellules immunitaires. L’immunothérapie adoptive consiste à injecter au patient des cellules "éduquées" qui agissent contre les cellules cancéreuses. Des cellules immunitaires sur lesquelles a été ajouté un attribut (type anticorps) ou dont le récepteur a été modifié, vont reconnaitre spécifiquement la cellule tumorale et enclencher sa destruction. L’administration de molécules agissant sur des points de contrôle immunologique : des protéines présentes à la surface des cellules saines de l’organisme qui régulent la réponse immunitaire en freinant ou boostant la stimulation des lymphocytes T. Les tumeurs peuvent exprimer certaines de ces protéines, leur permettant de passer inaperçues vis-à-vis du système immunitaire. Ces approches représentent des succès en clinique, mais certains cancers présentent malgré tout des résistances aux traitement et imposent de poursuivre la recherche et le développement de nouvelles thérapies. L’objectif de ce projet est de sélectionner les modifications des cellules immunitaires permettant de les rendre plus efficaces face à une croissance tumorale puis leur associer un traitement type petite molécule et/ou biologique afin de permettre une régression tumorale. Ces modèles sont développés sur souris immunodéprimées porteuses de tumeurs humaines. Ce projet vise également à identifier des biomarqueurs montrant l’engagement de la cible et de grande importance dans le diagnostic en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet comporte plusieurs phases, destinées à déterminer les conditions expérimentales optimales puis à effectuer l’évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies combinant des entités chimiques et biologiques ciblant des cellules tumorales injectées soit en sous-cutanée soit en intraveineuse à la souris. Dans un premier temps, il est nécessaire de déterminer la concentration suboptimale de cellules immunitaires modifiées à injecter induisant une régression tumorale. Si besoin, le suivi des biomarqueurs d’activité soit au niveau de la tumeur, soit dans la circulation sanguine soit dans des organes d’intérêts peut être fait. Dans un second temps, nous évaluerons l’activité des cellules immunitaires modifiées sur la régression tumorale en combinaison avec des traitements d’entités biologiques et/ou chimiques. Ces traitements permettent de lever l’inhibition que portent les cellules tumorales sur les cellules immunitaires modifiées et de stimuler ces dernières. Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en immunothérapie ciblée et personnalisée. En effet, connaissant les caractéristiques des tumeurs, la modification des cellules immunitaires du patient ou d’un sujet sain permet une reconnaissance ciblée de la tumeur et donc de s’affranchir des effets indésirables dus à la non-spécificité des traitements. L’association de ces cellules avec des entités chimiques ou biologiques permet de lever l’inhibition de la tumeur et de booster les cellules immunitaires.

Procédures

Injection en sous cutané ou en intraveineuse des cellules tumorales sur animal vigile (moins de 30 secondes) Injection en intraveineuse des cellules immunitaires modifiées sur animal vigile (moins de 30 secondes) Traitement intra-péritonéal ou per-os d’entité biologique ou chimique (moins de 30 secondes par administration) mesures du volume tumoral par pied à coulisse sur souris vigile (2 à 3 fois par semaine) (moins d’une minute à chaque mesure). Injection en intra-péritonéal de la luciférine, 2 à 3 fois par semaine (moins de 30 secondes par geste) Un maximum de 6 prélèvements de sang sur 24 h peut être envisagé sur animal vigile (moins de 30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

La potentielle souffrance peut être liée à la tumeur inoculée (qui peut rendre cachectique) ou à la croissance tumorale, voire à la convergence des deux. Mais compte tenu de la localisation de la greffe en sous-cutanée et des points limites prédéfinis, cette souffrance semble plutôt de nature modérée. Une potentielle source de stress peut également provenir : De la greffe de cellules immunitaire en intraveineuse. La contention d’une durée maximale de 30s peut générer du stress ainsi que l’injection (moins de 10s). De l’injection en intra-péritonéale de la luciférine pour les mesures d’imagerie par bioluminescence : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi que l’injection (moins de 10s). De l’administration d’entité biologique ou chimique en intra-péritonéal ou Per-os : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de raser les pattes arrière de l’animal. La contention ainsi que le rasage de la patte d’une durée maximale de 30s peut générer du stress. Du prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress De l’induction de l’anesthésie pour la mesure d’imagerie : l’induction qui est rapide peut générer du stress

Devenir

Les souris greffées en sous cutanée et non incluses surnuméraires ou dont la tumeur n’a pas suffisamment poussé peuvent être réutilisées pour l’entrainement des expérimentateurs à différentes techniques en lien avec ce projet ou d’autres projets (administration sous-cutanée, intra-veineuse, intra-péritonéale, per os, prélèvements de sang, apprentissage des mesures, puçage, etc…). Elles peuvent également être réutilisées dans d’autres études de pharmacologie (pharmacodynamie, pharmacocinétique) ou servir à l’évaluation de la tolérance d’un produit provenant d’une série chimique connue. En revanche, en cas de non-réutilisation possible, elles seront automatiquement euthanasiées. Pour cela le volume tumoral doit respecter les consignes de l'autorisation de projet dédiée à l'entrainement. Les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude Pour les souris ayant reçu des greffes de cellules tumorales en intraveineuse : les souris non incluses surnuméraires sont euthanasiées. Les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude.

Remplacement

Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Ce projet est mis en œuvre après la validation in vitro des différentes nouvelles entités biologiques et chimiques. L’absence d’efficacité in vitro ne permet pas de justifier l’utilisation d’un modèle animal par conséquent ce projet s’inscrit en dernier lieu dans le processus de recherche d’un candidat médicament. C’est seulement sur la base de ces données que les études d’efficacité antitumorale sont ensuite réalisées : uniquement les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique.

Réduction

Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires avant le début de l’expérimentation. Les cellules immunitaires issues de donneurs sains sont modifiées puis évaluées sur des tests in vitro dit de « killing ». Les cellules immunitaires modifiées sont mises en présence de cellules tumorales selon des ratios définis. Le choix du donneur pour une étude in vivo sera donc fait en fonction des résultats de ce test. Le design expérimental a été revu avec le biostatisticien/pharmacocinéticien afin d’identifier notamment le nombre de groupes et de souris dans chaque groupe et par étude au cas par cas, de façon à tirer des conclusions significatives tout en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaires. En cas d’animaux greffés en sous-cutané surnuméraires après randomisation, une ré-utilisation dans un autre projet peut être envisagé après l’aval de la SBEA (structure chargée du bien-être animal). Les tumeurs sont mesurées au moyen d’un pied à coulisse ou par imagerie optique : 2 techniques non invasives pour l’animal qui permettent un suivi de la tumeur dans le temps et une réduction du nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, nous réaliserons au cours d’une même étude : •Un suivi de la croissance tumorale (étude d’efficacité) •L’évaluation de biomarqueur (étude de pharmacodynamie) •L’évaluation de la biodisponibilité des produits testés (pharmacocinétique) Ainsi nous contribuons à diminuer le nombre d’animaux car 3 études peuvent être réalisées en une seule étude.

Raffinement

La progression des tumeurs est mesurée via le pied à coulisse (sous cutanée) ou par bioluminescence (intraveineuse) : 2 techniques non invasives pour l’animal. Dans le cas d’un protocole avec traitement chronique, les tumeurs sont mesurées au moins 2 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour limiter la souffrance et appliquer les points limites si nécessaire. Au-delà de 1500 mm3 (pour les tumeurs greffées en sous-cutanée), une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Pour les études de suivi par imagerie de bioluminescence, la surveillance se fait sur la perte de poids des animaux. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence. les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de prévenir tout risque d’infection et/ou contamination. des prélèvements de sang à la veine saphène latérale peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées) et pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excède pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement, peu invasive et rapide, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Un enrichissement de milieu adapté va également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique: ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines soit un poids corporel d’environ 18-20g en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.

154 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer une bithérapie contre des cancers dits méthionine-indépendants. Chaque animal reçoit une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, un régime privé d'un acide aminé et des traitements injectés, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. Le porteur indique une douleur modérée et une perte de poids liées à la tumeur, prévoit du paracétamol puis de la morphine, et tue les animaux atteignant un point limite de douleur sévère. Il affirme qu'une étude sur "organisme entier" est "nécessaire", la tolérance à long terme des molécules n'étant pas connue et le bénéfice restant un transfert possible "chez l'Homme".

Objectifs

Objectif principal : Evaluation de l’efficacité et de la synergie d’une nouvelle bithérapie ciblant les cancers méthionine-indépendants. Objectifs secondaires : Quantification de la synergie entre les 2 composés de la bithérapie, évaluation de la tolérance et toxicité à long terme des composés en monothérapie et en bithérapie, évaluation de la synergie de tolérance (réduction des effets secondaires liée aux diminutions posologiques permises par la synergie d’efficacité), évaluation des mécanismes d’efficacité anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité et la tolérance d’une association thérapeutique qui pourra être transférée chez l’Homme pour le traitement du cancer.

Procédures

Greffe de cellules cancéreuses : La greffe sera réalisée par une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses (procédure durant 10 min), dans le flanc droit des souris, à une distance suffisante des articulations pour éviter toute limitation des amplitudes articulaires. L’injection sera réalisée après une période d’acclimatation de 7 jours pour diminuer le stress des animaux liée à la minupulation, avec désinfection à la bétadine de la zone d’injection. Cette procédure permettra ensuite de suivre le volume tumoral de manière non invasive. L’étude visant à évaluer l’efficacité antui-tumorale d’une nouvelle association médicamenteuse, tous les animaux de l’étude seront concernés par cette procédure. Administrations des médicaments : L’étude vise à évaluer l’association entre un traitement administré par voie orale, et un traitement administré par voie injectable. Le premier traitement consistera en un régime particulier (croquettes en tout point identiques aux croquettes standards mais dépourvues d’un acide aminé particulier), mis à disposition des animaux. Le second traitement sera administré par voie sous-cutanée, intra-péritonéale (procédure durant 2 min), ou par mini-pompe osmotique SC placée sous anesthésie (procédure durant 10 min), selon ses propriétés de diffusion qui auront fait l’objet d’une étude préalable. Le délai entre deux injections aura été déterminé lors de l’étude préalable, et la fréquence des injections sera réduite au minimum (elle ne dépassera pas 2 injections par jour). Mesure du volume tumoral : Le volume tumoral sera mesuré 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse. Il constituera le critère de jugement principal pour évaluer l’efficacité des traitements. Tous les animaux de l’étude seront concernés. Prélèvements sanguins : Trois prélèvements sanguins sont prévus par animaux (procédure durant 8 min). Ils seront prévelés au niveau mandibulaire, aux temps suivants : J0 (avant la première administrationd de traitement), J7 et J21. Le délai mminimum entre 2 prélèvements correspond au délai nécessaire pour la reconstitution sanguine du volume prélevé qui est réduit au minimum (100 µl).

Impact sur les animaux

Le modèle de greffe tumorale a pour effet attendu une douleur modérée, une perte de poids liée à l’activité métabolique de la tumeur, et un stress modéré lié aux manipulations.

Devenir

Les animaux concernés par les 2 procédures seront mis à mort à la fin de ces procédures. Ceci permettra l’autopsie des souris pour évaluer l’éventuelle toxicité du traitement sur certains organes nobles (coeur, cerveau, foie, reins), et de mieux comprendre les mécanismes d’efficacités du traitement (par l’analyse de la tumeur). La mise à mort préalable avant ces prélèvements, dans le cadre d’une autopsie, permet d’éviter une manipulation chirurgicale sous anesthésie qui comprend des risques d’antalgie ou d’anesthésie insuffisante.

Remplacement

Une étude chez l’annimal est nécessaire pour évaluer l’efficacité d’associations thérapeutiques dont une des deux molécules est un nouveau traitement, jamais testé chez l’animal ou chez l’Homme, et pour vérifier la bonne diffusion de ces nouveaux composés jusqu’à la tumeur lorsqu’ils sont administrés ensemble par voie systémique Les données in vitro sont prometteuses et démontrent l’existence d’une efficacité anti-tumorale des bithérapies à l’étude, le comportement des nouvelles molécules, et a fortiori des associations médicamenteuses impliquant ces nouvelles molécules, n’a jamais été décrit sur un organisme entier. Il est donc nécessaire de vérifier i) que l’administration conjointe des 2 traitements ne modifie pas leur capacité à atteindre la tumeur par des mécanismes de régulations complexes propres aux organismes vivants, et ii) que l’administration systémique des associations thérapeutiques aboutira bien à une efficacité localisée au niveau des cellules tumorales. Aussi, une étude est nécessaire pour évaluer la bonne tolérance des nouvelles molécules et des bithérapies impliquant ces nouvelles molécules, notamment lors d’une administration prolongée et répétée. En effet, une étude in silico (modélisation informatique) et une étude in vivo préliminaire ont permis de sélectionner les composés qui sont bien tolérés à court terme, mais la tolérance à long terme n’est pas connue. La connaissance de la tolérance à long terme de ces nouvelles molécules et nouvelles associations thérapeutiques est nécessaire avant d’envisager leur administration chez l’Homme. Les éventuelles toxicités attendues, de manière hypothétique, étant principalement médullaire et neurologique, une évaluation chez l’animal est d’autant plus pertinente qu’il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour évaluer les effets spécifiques à long terme avec une administration médicamenteuse répétée sur ces systèmes. Nous avons testé la tolérance de notre traitement sur des fibroblastes et des cellules endothéliales, avec des résultats permettant d’envisager une très bonne tolérance in vivo, mais ces modèles ne représentent pas les systèmes les plus susceptibles d’être altérés, et ne permettent pas non plus d’évaluer l’éventuelle toxicité d’une administration répétée. Enfin, la synergie entre les 2 traitements devrait permettre de diminuer les doses nécessaires des nouvelles molécules pour assurer l’absence d’effet indésirable tout en maintenant un effet anti-tumoral.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons limité le nombre de groupes de traitements, le nombre d’animaux par groupes, tout en nous assurant que nous aurons un nombre d’animaux suffisant qui correspond aux exigences scientifiques et statistiques pour répondre à la question posée. Concernant le nombre de groupes, nous devions tenir compte de plusieurs exigences scientifiques : Inclure l’analyse de 2 nouvelles molécules agissant via deux mécanismes différents et comprenant chacune des avantages et inconvénients, et inclure des dosages différents. Si nous avions limité l’analyse à l’étude de l’un ou l’autre de ces traitements, nous n’aurions pas pu généraliser les résultats au second traitement en raison de leurs caractéristiques différentes, et l’étude aurait dû être renouvelée pour le second traitement. Réaliser d’emblée cette étude avec ces deux traitements permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, notamment en permettant de n’avoir qu’un seul groupe contrôle et témoin. Pour limiter le nombre de groupes, nous avons fait le choix de n’inclure dans l’étude qu’un seul traitement de chacune des deux classes thérapeutiques, en considérant que les résultats de chacun de ces traitements seront généralisables aux autres molécules de leur classe thérapeutique. Inclure différentes posologies (dosages) permettra de statuer sur la synergie (potentialisation d’effet) entre les deux traitements. Pour limiter le nombre de groupes, nous n'avons retenu que deux dosages par traitement. Concernant le nombre d’animaux par groupe, le nombre de souris a été réduit au minimum pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique. Pour déterminer le nombre d’animaux par groupe, nous avons tenu compte des différences attendues entre les groupes et de la variabilité de résultats au sein de chaque groupe Nous avons calculé qu’il est nécessaire d’inclure dans l’analyse statistique au minimum 11 souris par groupe en fin d’analyse. En raison du risque de non prise des greffes tumorales estimé à 10%, et du risque de décès prématuré de cause non tumorale estimé à 10%, nous avons calculé qu’il était nécessaire d’inclure 14 souris par groupe.

Raffinement

Nous prendrons toutes les dispositions nécessaires pour limiter au maximum les nuisances, attendues ou non, liées aux manipulations des animaux et procédures de l’étude. Le bien-être des animaux fera l’objet d’une évaluation biquotidienne, week-end compris. Pour limiter les nuisances et effets indésirables liées à la greffe tumorale, nous reproduirons un protocole d’étude déjà réalisé et décrit dans plusieurs études concernant les cellules cancéreuses d’intérêt chez des souris. Pour réduire le stress des animaux lié aux manipulations, une période d’acclimatation de 7 jours est prévue avant la première procédure, avec des éléments de distractions prévus dans les cages et des moments de préhensions douces pour habituer les animaux aux manipulations et au contact humain. Toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué 2 fois par jour, week-end compris. Pour prévenir un inconfort modéré, du paracétamol sera administré en continu systématiquement dans l’eau de boisson. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un traitement morphinique sera administré à visée antalgique à une dose plus ou moins importante selon les signes cliniques observés. En cas de signe clinique indiquant une douleur sévère définissant un point limite, la souris sera mise à mort pour éviter toute prolongation de sa souffrance.

Choix des espèces

La greffe de cellules cancéreuses pancréatiques à des souris a déjà été décrite dans plusieurs articles scientifiques. Reproduire ce modèle permettra de s’affranchir de manipulations de mise au point et de risquer le sacrifice inutile de souris en raison d’une mauvaise prise de greffe ou du délai de croissance tumoral. Nous avons privilégié un modèle de souris immunodéprimées à un modèle murin immunocompétent, car notre étude porte exclusivement sur les cancers méthionine-indépendants, or seules une quarantaine de lignées cancéreuses humaines ont été testées vis-à-vis de leur capacité à proliférer avec/sans méthionine, et aucune lignée murine n’a été testée dans ce but. De ce fait, greffer des cellules cancéreuses murines dont on ignore le statut de méthionine-dépendance/indépendance reviendrait à prendre le risque que l’étude menée ne soit finalement pas interprétable, au cas où la lignée choisie aurait été méthionine-dépendante. Les souris seront accueillies au laboratoire à 6 semaines de vie, pour une greffe tumorale et introduction des traitements entre 7 et 8 semaines de vie, comme décrit lors d’études précédentes évaluant des traitements anti-tumoraux sur le même modèle animal que celui décrit ici (même lignée cancéreuse, même lignée murine).

268 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une immunothérapie cellulaire contre le myélome multiple. Elles reçoivent par voie intraveineuse des cellules tumorales humaines, parfois après une irradiation aux rayons X et une greffe de cellules souches humaines, puis la thérapie à évaluer, avec un suivi par imagerie. Le porteur indique que la maladie induite peut provoquer une perte de mobilité puis une paralysie des pattes et une perte de poids, et qu'un échec de greffe peut tuer environ une souris sur dix. Il affirme que le recours à un "organisme vivant entier" est "indispensable", les bénéfices annoncés d'une thérapie "universelle" restant un "objectif ultime".

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est un cancer du sang caractérisé par la prolifération incontrôlée d'un type particulier de cellules sanguines de la famille des globules blancs appelées plasmocytes. Ces plasmocytes sont des cellules productrices d’anticorps et s’accumulent dans la moelle osseuse. Les traitements actuels du MM reposent sur la chimiothérapie et la greffe de moelle osseuse. Bien que ces traitements aient amélioré la survie des malades, certains patients répondent mal aux traitements conventionnels. L’immunothérapie est une nouvelle stratégie thérapeutique utilisée dans le traitement d'autres cancers du sang, qui vise à réorienter les défenses immunitaires de façon spécifique contre les cellules cancéreuses. Ainsi il est possible de modifier génétiquement une population de cellules du système immunitaire (les lymphocytes), afin qu'ils reconnaissent spécifiquement les cellules tumorales et les éliminent. Le but ultime étant d'améliorer la prise en charge des patients résistants aux traitements classiques. La plupart de ces immunothérapies cellulaires sont faites avec des cellules appelées lymphocytes T car elles sont très faciles à réorienter contre la tumeur; mais elles ont le désavantage d’être spécifiques à chaque individu et ne peuvent pas être données à un autre individu. C’est à dire, qu’un patient ne peut bénéficier de cette immunothérapie à base de lymphocytes T que s’il est en suffisamment bon état de santé (malgré son cancer) pour être prélevé de ses lymphocytes T. Une autre alternative est de faire ces immunothérapies cellulaires avec des cellules appelées lymphocytes NK, qui elles ne sont pas spécifiques à un individu et peuvent être obtenus d’un donneur sain. Cependant, ce type de thérapie dite « universelle » (les cellules thérapeutiques issues d’un donneur peuvent être utilisées pour traiter différents patients) reste peu exploité. Dans notre projet, nous testerons une nouvelle thérapie cellulaire « universelle » à base de lymphocytes NK pour le traitement du Myélome Multiple que nous avons développé. Notre objectif ultime est d’améliorer la prise en charge des malades et de proposer des nouvelles thérapies accessibles pour tous.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » contre le Myélome multiple. Les immunothérapies cellulaires ont déjà fait leurs preuves dans d’autres types de cancer du sang et donnent une nouvelle chance aux patients qui ont rechuté après un traitement classique. Ainsi, nous cherchons à contribuer à l’amélioration de la prise en charge des malades atteints de Myélome multiple en développant des alternatives thérapeutiques. De plus, nous avons choisi de développer cette thérapie cellulaire avec un type de cellules immunitaire pouvant être accessibles pour tous.

Procédures

Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » contre le Myélome Multiple (MM). Pour évaluer son efficacité sur cette maladie, nous utiliserons trois types de modèles murins de MM humain. Ces modèles consistent en l’injection par voie intraveineuse (veine de la queue) de cellules tumorales de MM humain à des souris éveillées (1 minute). Après 7 jours, notre thérapie cellulaire sera injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute) deux ou trois fois par semaine pendant deux semaines). La progression de la tumeur et donc l’efficacité de notre immunothérapie cellulaire seront suivis par imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée de la session : 10 min) et ce une fois par semaine pendant toute la durée de l'étude, soit 3 mois maximum. Une deuxième partie de l’étude consiste à vérifier qu’il n’existe pas de toxicité de la part de notre immunothérapie cellulaire envers des cellules saines. Pour ce faire, nous allons utiliser des souris ayant reçu une greffe de cellules souches humaines: les souris reçoivent un prétraitement au rayon X afin de les préparées à la greffe (2 minutes) et elles sont ensuite injectées par voie intraveineuse (veine de la queue) avec des cellules souches humaines (souris éveillées ; durée 1 minute). Cinq semaines plus tard, une prise de sang (1 à 2 gouttes prélevée de la veine mandibulaire, (veine de la joue), durée 1 minute, souris éveillée) sera effectuée pour vérifier la prise de la greffe. Notre thérapie cellulaire sera alors injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute). Pour vérifier s’il existe une toxicité de notre thérapie sur les cellules du sang, des prises de sang (1 à 2 gouttes prélevées de la veine mandibulaire, durée 1 minute) seront effectuées sur les souris éveillés 4 et 7 jours après l’injection de cellules thérapeutiques.

Impact sur les animaux

Dans le modèle de MM humain, les cellules tumorales se multiplient dans la moelle. Ceci entraine fréquemment, quand le traitement n’est pas efficace, l’apparition d’une perte de mobilité qui dans la plupart des cas est suivi par une paralysie des pattes inférieurs, s’accompagnant d’une perte de poids. Des tumeurs au niveau du crâne sont également des évènements susceptibles d’être attendus sur ce modèle, néanmoins ces tumeurs apparaissent à long terme à environ 2 mois post injection des cellules tumorales. Il est également possible que les cellules tumorales s’accumulent au niveau de la rate, pouvant générer une gêne abdominale. Dans le modèle souris humanisé (souris greffées avec des cellules souches humaines), il existe un risque d’échec de greffe (environ 1 souris sur 10) qui peut entrainer la mort de l’animal environ 15 jours après la greffe. L’irradiation rend aussi la souris fragile aux infections et peut favoriser la présence d’une diarrhée et perte de poids. Dans le cas où notre thérapie soit toxique envers les cellules du sang, une perte de poids et un changement de comportement sera attendu.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Nous analyserons à partir de la moelle osseuse et de la rate prélevées en post-mortem, les différentes populations de cellules du système immunitaire.

Remplacement

Nous avons réalisé le maximum d'expériences in vitro afin de valider l'efficacité de nos cellules thérapeutiques. Cependant ces tests ne nous permettent pas d'évaluer à long terme ces cellules thérapeutiques. L’utilisation d’un organisme vivant entier est donc indispensable afin de reproduire les conditions observables chez l’Homme dans le cadre de leur utilisation en thérapie. De plus, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un modèle in vivo, car celui-ci intègre la plupart des caractéristiques de ces pathologies humaines telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, l’existence de tissus sains, la présence de barrières limitant l'efficacité des traitements.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Plusieurs groupes de souris seront analysés simultanément permettant de n’avoir qu’un seul groupe d’animaux « contrôle ». L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une grille d'évaluation hebdomadaire prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. De plus la mesure hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle-ci devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple).

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles de MM humains et murins sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales) qui est l’âge de référence utilisé dans de nombreux modèle expérimentaux sur souris adultes.

614 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie rétro-orbitale sous anesthésie, puis une chimiothérapie ou un placebo, avant d'être tuées pour prélever moelle osseuse, rate et thymus. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de rechute et de chimiorésistance des leucémies aiguës lymphoblastiques T, dont les bénéfices pour les patients restent renvoyés au long terme. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'évaluer ces mécanismes dans des modèles vivants et que les cellules leucémiques ne survivent pas assez longtemps in vitro.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes agressives au pronostic réservé, notamment en cas de rechute. Elles représentent 15 à 30% des leucémies aiguës de l'enfant et de l'adulte. Les polychimiothérapies récentes ont permis d'améliorer le pronostic des leucémies aiguës, cependant 20 à 30% des patients atteints de LAL-T présentent une rechute le plus souvent réfractaire aux thérapeutiques conventionnelles et conduisent au décès des patients dans 60% des cas. Le statut mutationnel de certains gènes semble être un facteur important de ces rechutes résistantes aux thérapies. Les cellules souches leucémiques jouent également un rôle essentiel dans la progression et la rechute des leucémies. Par leur propriété d'auto-renouvellement et de quiescence, les LSC sont capables d'échapper à la chimiothérapie de 1è ligne et de régénérer le contingent leucémique, faisant le lit de la rechute. L'étude de ce compartiment cellulaire s'inscrit donc dans la continuité de ce projet, et fait l'objet ici de cet amendement. Identifier les mécanismes à l'origine de la rechute et l'acquisition d'une chimiorésistance est essentiel pour améliorer le pronostic de ces patients. Pour mener à bien ces objectifs il est dès lors indispensable d'évaluer leur impact dans des modèles vivants, seuls garants d'une reproductibilité dans ce contexte de pathologie maligne ou le micro environnement joue un rôle décisif. Dans cette perpsective, la souris immunodéprimée constitue le modèle animal le plus adapté. Par ailleurs, les cellules leucémiques de patients sont fragiles et ne peuvent être maintenues suffisamment longtemps in vitro pour y mener des tests thérapeutiques. Il est en revanche largement décrit dans la littérature scientifique que la souris est un bon modèle d'expansion des cellules leucémiques humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'étendre nos connaissances sur les mécanismes à l'origine de la rechute de LAL-T et comprendre les altérations moléculaires responsables de l'acquisition d'une chimiorésistance. A terme, ce projet contribuera à la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer les chances de guérison des patients atteints de LAL-T.

Procédures

1/ Injection de cellules leucémiques ou pré-leucémiques par voie rétro-orbitale après anesthésie générale (temps estimé < 10min par souris). Surveillance clinique et/ou biologique au moins bi-hebdomadaire et adaptée à l'état clinique des souris. 2/ Traitement des souris immunodéprimées après prise de greffe par de la chimiothérapie conventionnelle classiquement utilisée dans le cadre du traitement des leucémies aiguës humaines et comparaison avec un groupe recevant un placebo (La durée et fréquence du traitement dépendra de la molécule utilisée : quotidien à hebdomadaire pendant une durée inférieure à 6 semaines).

Impact sur les animaux

Le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Un nombre de 64 souris supplémentaires seront nécessaires pour l'amendement de ce projet, sans extension de sa durée (soit 2 années restantes). Nous serons particulièrement attentifs au bien être des animaux. Afin de réduire au maximum le risque de souffrance, les souris seont traitées dès que le taux d'infiltration sanguin leucémique sera compris entre 2 et 20% (évaluation en cytométrie en flux de façon hebdomataire via un prélèvement mandibulaire). Un tel taux d'infiltration est habituellement atteint entre 4 et 12 semaines post-greffe. Durant les protocoles expérimentaux, un suivi quotidien la première semaine, puis bi-hebdomadaire des animaux sera mis en place afin de surveiller les signes évocateurs d'une douleur. Afin de préserver le bien-être animal, nous détecterons les points limites qui conduiront à leur mise à mort (CF Points limites adaptés détaillés dans les procédures expérimentales). Concernant l'amendement, le temps de prise de greffe attendu dans les souris syngéniques est similaire au modèle de xénogreffe faisant l'objet du projet initial. En revanche, les souris utilisées pour cet amendement sont moins immunodéprimées que les souris initiales et la greffe étant syngénique, le risque potentiel pour l'animal est moins élevé pour les procédures relatives à cet amendement. Par ailleurs, aucune prédisposition à une toxicité particulière de ce modèle pré leucémique pour l'animal n'est attendue dans des conditions d'hébergement. Nous serons particulièrement attentifs au bien-être des animaux et appliqueront les mêmes règles de surveillance et d'éthique que précédemment, avec une surveillance interne quotidienne du personnel de l'animalerie.

Devenir

Mise à mort de l'animal à l'issue de chaque procédure pour récupération des tissus biologiques (moelle osseuse, rate, thymus)

Remplacement

Les expérimentations ayant pour objectifs de déterminer les mécanismes de résistance à la chimiothérapie ne peuvent pas être réalisées in vitro du fait de la forte mortalité des cellules leucémiques et doivent nécessairement être conduits in vivo dans des leucémies xénogreffées et amplifiées chez l'animal. Par ailleurs le modèle des lignées cellulaires n'est pas un reflet exact de la biologie des leucémies aiguës et ne peut donc pas être considéré comme un équivalent moléculaire fiable dans ce contexte. Pour la même raison, dans cet amendement, l'étude de la transformation leucémique de cellules immatures transduites avec un oncogène humain (ici TLX3) ne peut être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé (par test paramétrique) la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Concernant l'amendement, un nombre de 64 souris RAG2-/-gc-/- supplémentaires seront nécessaires à ce projet, sans extension de sa durée (2 années restantes). Ce nombre a été calculé en prenant en compte une probabilité proche de 100% de prise de greffe (modèle syngénique), afin d'élaborer un nombre suffisant de tumeurs et 1è et 3è génération (8 souris d'une première génération puis 4 souris de seconde génération (par première génération) puis 2 souris de 3è génération (par seconde génération)).

Raffinement

Nous serons particulièrement attentifs au bienêtre des animaux. Les souris immunodéprimées seront élevées dans un environnement répondant à un statut sanitaire de type EOPS ou SOPF et ne présenteront donc pas de phénotype dommageable dans ces conditions. Les cages sont ventilées et enrichies à l'aide de cotons, bout de bois et tunnels, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera mis en place par un personnel qualifié de l'animalerie. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques se fera sous anesthésie gazeuse par isoflurane (induction 4,5%, entretien 2,5-3%, durée totale d'environ 2 minutes). Le suivi de la leucémie sera réalisé à partir de la 3ème semaine suivant l'injection des cellules leucémiques humaines par des prélèvements sanguins (

Choix des espèces

Les modèles de xénogreffe de leucémies chez la souris sont connus et bien décrits dans la littérature scientifique, ce qui permet de nous assurer une efficacité maximale dans la réalisation de ce projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées entre 7 et 15 semaines. C'est la fenêtre d'injection qui premet d'avoir un taux idéal de greffe d'après les données de la littérature, en permettant de réaliser la procédure d'injection dans de bonnes conditions. Ce modèle de xénogreffe est particulièrement applicable à notre étude, car il permet de récapituler l'éventail des signes cliniques de la maladie et de modéliser sa progression.