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Etude de l’induction de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) par virothérapie dans des modèles syngéniques de souris porteuses de tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis des injections répétées de virus oncolytiques, par voie intratumorale, intranasale ou dans la muqueuse de la joue, avec un suivi des tumeurs par imagerie sous anesthésie. L'objectif est d'évaluer la capacité de ces virus à induire des structures lymphoïdes tertiaires et une réponse antitumorale, les retombées pour des patients atteints de cancer étant renvoyées à un éventuel développement clinique. Le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être modélisés ni in vitro ni sur organoïdes et conclut qu'il est "primordial" de recourir à des souris pour observer l'interaction avec l'"organisme hôte".
Objectifs
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) représentent une cible nouvelle dont le contrôle de la formation est devenu un enjeu immunothérapeutique. En effet, les TLS sont à l’origine du développement de réponses immunitaires adaptatives locales souvent favorables pour les patients atteints de certains cancers. Il a été montré que certaines molécules pouvaient être à l’origine de leur induction. Notre projet vise à évaluer la capacité de ces molécules, exprimées localement par des virus oncolytiques, à induire la formation de TLS. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des virus de la vaccine dont certaines souches ont déjà montré une capacité à induire des TLS. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la capacité de nouveaux virus oncolytiques armés, à induire des TLS et à générer une activité anti-tumorale. Nous verrons dans un second temps, s’il est possible d’augmenter leur efficacité thérapeutique en les combinant avec une autre immunothérapie.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de valider chez l’animal les effets thérapeutiques de ce nouveau traitement, en vue de le transposer ensuite chez l’humain dans le but final d’améliorer le pronostic vital de patients atteints de cancers. Si un effet probant est observé, les virus armés avec les chimiokines humaines pourront être générés dans l’entreprise collaboratrice, de sorte à poursuivre le projet vers un développement clinique. Si elle s'avère bénéfique, maitriser l'induction des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans le microenvironnement tumoral pourrait être une nouvelle voie de traitement des cancers. Les résultats issus de ce projet nous permettront aussi d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux et les molécules intervenant dans la néogénèse de TLS.
Procédures
Des tumeurs seront implantées chez les souris, par injection de cellules tumorales en sous-cutané, intrapéritonéal ou en intraveineuse. L’intervention n’aura lieu qu’une fois, durera moins d’une minute et sera réalisée sur souris vigile. Les tumeurs injectées par voie intra-muqueuse de la joue seront réalisées sur des souris anesthésiées une dizaine de minutes par injection de kétamine et xylazine. L’administration du traitement par voie intra tumorale des tumeurs sous-cutanées sera aussi réalisée sur souris vigile, ne durera pas plus d’une minute et sera répétée au maximum 3 fois (un jour sur deux). L’administration du traitement par instillation intranasale se fera sur souris anesthésiées et tenues à la verticale. L’opération durera environ 5 min par souris et sera répétée un jour sur deux pendant six jours. L’administration du traitement par voie intra-tumorale des tumeurs de la joue se fera aussi sur souris anesthésiées et sera répétée un jour sur deux pendant six jours. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie IVIS à une fréquence de 2 fois par semaine. Pour cette opération les souris seront anesthésiées avec de l’isoflurane à 2 pourcent durant une quinzaine de minutes. Toute injection intra péritonéale d’anesthésiant ou de traitement sera réalisée sur souris vigile et durera moins d’une minute.
Impact sur les animaux
La douleur potentielle liée aux actes d’injections des cellules tumorales ou des virus oncolytiques se limitera à l'introduction de l'aiguille au site d'injection et aura lieu au maximum à 4 reprises par animal et par procédure. La contention des animaux peut procurer un stress ponctuel (quelques minutes). La croissance des tumeurs sous-cutanées ou intrapéritonéales pourra générer une gêne physique et des difficultés à la mobilité. La croissance des tumeurs pulmonaires orthotopiques pourra occasionner une gêne respiratoire. La croissance des tumeurs intra-muqueuses de la joue pourra générer une gêne physique et une difficulté à la prise alimentaire. Les anesthésies peuvent être associées à des risques d'hypothermie, d'hypoventilation ou encore d'arrêt cardio-respiratoires.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées afin de prélever les tumeurs et d’analyser l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral après chaque procédure.
Remplacement
Nos travaux portent sur l’induction de structures lymphoïdes tertiaires au sein de tumeurs. Ce mécanisme fait intervenir plusieurs paramètres dynamiques et complexes (système immunitaire, vascularisation) qui ne peuvent pas être modélisés ailleurs que dans des modèles in vivo, pas même dans des modèles d’organoïdes. De plus, dans ce projet nous souhaitons valider de nouveaux virus oncolytiques candidats. Il est donc primordial d’utiliser des modèles in vivo afin d’appréhender leurs interactions potentielles avec l’organisme hôte.
Réduction
Avant d’être testés chez l’animal, les virus oncolytiques ont été caractérisés in vitro dans plusieurs lignées tumorales murines et humaines. Seuls ceux qui ont prouvé une activité efficace in vitro seront utilisés dans ce projet. Au sein d’une même expérience nous testerons plusieurs virus avec les mêmes groupes témoins, nous réduirons également le nombre d’animaux utilisés dans le groupe non-traités. Le suivi de la croissance tumorale dans le modèle pulmonaire orthotopique se fera par imagerie IVIS, ce qui permet de faire plusieurs mesures sur un même animal sans avoir à l'euthanasier. Des prélèvements pourront être fait sur les animaux destinés à être euthanasiés, avant et après euthanasie, afin d’évaluer en parallèle la pharmacologie des virus et des substances anti-tumorales utilisés et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Ce projet implique l'utilisation de 2484 souris maximum.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés (6 souris maximum par cage) et ne seront expérimentées qu'après une semaine minimum de stabulation. Notre structure possède un programme d'enrichissement (placement de nids végétaux et de tunnels en carton dans les cages) lors d'expérimentations supérieures à 15 jours. La stabulation sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, 6 animaux maximum par cage de type-IIL, température de 22 degrés plus ou moins 2 degrés, éclairage alterné jour et nuit 12h-12h de 6h-18h), et celles-ci recevront un régime alimentaire classique (nourriture Mucedola 4RF25 ou 21 ad libitum+eau par abreuvage automatique). Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et animaliers pendant la durée de chaque expérience. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Les points suivants seront considérés comme limitants : tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire ; toute modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos voûté) ; toute anomalie pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieur ou égale à 20 pourcent du poids initial de l’animal, plaies et ulcères, fractures, détresse respiratoire ou tout signe d’essouflement, tumeurs sous-cutanées et intra-muqueuses excédent respectivement 2000 mm3 et 300 mm3. Les instillations intra-nasales (i.n.) et les injections intra-muqueuses (i.m.) seront réalisées sur des souris anesthésiées puis remises dans leur cage au moment du réveil contrôlé visuellement, avec une lampe chauffante pour maintenir leur température corporelle. L'injection par voie intraveineuse (i.v.) sera réalisée dans la veine caudale préalablement dilatée par frottement à l'éthanol 70 pourcent et exposition sous une lampe chauffante. L’analyse de la croissance tumorale sera réalisée par imagerie IVIS chez des souris anesthésiées par l’isoflurane 2 pourcent.
Choix des espèces
La souris fait partie des modèles expérimentaux les plus utilisés, il est actuellement possible d'avoir accès à un grand nombre de protocoles et de réactifs adaptés ce qui a permis de comprendre de nombreux mécanismes transposables à l'humain. Le système immunitaire humain possède de nombreuses similitudes avec celui de la souris et des travaux ont montré qu'il était possible d'observer des structures lymphoïdes tertiaires (élément primordial de nos recherches) chez la souris. Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris: les marqueurs des cellules d'intérêts de cette étude sont connus et de nombreux réactifs sont disponibles. Les animaux seront reçus à l'âge de 12 semaines, car ce stade de développement correspond à des souris sevrées, de taille adulte et qui dispose d'un système immunitaire mature.
Etude de l’effet de composés à base d’or sur des modèles de cancer chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une xénogreffe tumorale et reçoivent des séries d'injections intraveineuses, orales et intrapéritonéales de composés à base d'or, pour comparer l'efficacité anticancéreuse de ces molécules. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements et que sa nécrose peut ouvrir une plaie susceptible de s'agrandir par frottement ou cannibalisme, paramètre qu'il comptabilise comme signe d'efficacité. Sur le remplacement, il souligne que les composés ont d'abord été identifiés in vitro sans animaux, tout en jugeant le passage in vivo nécessaire.
Objectifs
L'identification de nouvelles séries chimiques originales et efficaces sur les cibles thérapeutiques est devenue un des défis majeurs auxquels les industries pharmaceutiques sont confrontées. Dans l’optique d’étendre la diversité chimique et d’explorer de nouveaux territoires synthétiques, en utilisant la chimie organique nous pouvons envisager plusieurs approches et notamment le design de squelette in silico à partir de méthodes computationnelles. L'équipe de chimistes co-porteuse du projet s’intéresse à la conception et la synthèse d’outils chimiques par la synthèse de nouveaux complexes organométalliques de métaux de transition. Ces outils sont conçus en vue d’application en chimie médicinale. Deux familles de composés à base d'or ont été synthétisées, montrant une activité biologique vis-à-vis des cellules cancéreuses in vitro.
Bénéfices attendus
Les traitements anticancéreux à base de métaux sont apparus au milieu des années 1960 avec l’apparition de composé à base de platine comme le cisplatine. Bien que ces complexes soient utilisés en thérapie ils présentent des effets secondaires importants (neurotoxicité, néphrotoxicité...) sur l’Homme et/ou des résistances. Des études ont été menées pour remplacer le platine par de l’or (III). Ainsi nous avons synthétisé de nombreux complexes d’or avec des ligands CN (Carbone - Azote) ou PP (Phosphore-Phosphore) que nous avons testé sur des lignées cellulaires cancéreuses. Sur 28 composés des familles CN et des familles PP, nous avons mis en évidence une activité biologique anti-cancéreuse. Pour le projet présent nous souhaitons testés in vivo les 5 meilleurs par famille (famille CN et famille PP).
Procédures
Les souris seront soumises aux interventions suivantes : 9 injections en IV sur animaux vigiles sur réparties sur une durée de 19 jours. 5 injections per os sur animaux vigiles 5 jours d'affilés. 5 injections IV sur animaux vigiles sur 5 jours d'affilés 6 injections IV sur animaux vigiles sur réparties sur une durée de 19 jours. 1 injection IP sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La xénogreffe provoque le développement d'une tumeur solide. Les tumeurs ne sont pas innervées et elles n'entraînent pas de douleur. En revanche la taille tumorale peut provoquer des difficultés de déplacement des souris. L'efficacité de nos composés à l'image des traitements chimiothérapeutiques standards, quand le traitement a un effet, se traduit par un ralentissement du développement de la tumeur, une stagnation ou encore une baisse de la taille tumorale. Ces effets sont la résultante de la destruction de la tumeur par des phénomènes de nécrose qui peuvent atteindre la surface de la tumeur et provoquer une plaie. Ces plaies peuvent s'agrandir soit par cannibalisme soit par frottement en raison du déplacement de la souris. Cependant plus le traitement est efficace plus la nécrose va se développer. Nous comptabilisons ce paramètre pour évaluer l'efficacité de la thérapie.
Devenir
A l'issus de la procédure 1 les animaux sont mises à mort afin de récupérer la tumeur et procéder à l'analyse fine de l'efficacité de nos composés. A l'issue de la procédure 2 les animaux sont mises à mort afin de récupérer la tumeur et procéder à l'analyse fine de l'efficacité en combinaison de nos composés
Remplacement
Le recours aux expérimentations in vitro a mis en évidence une action biologique des composés chimiques à base d'or parmi des centaines de composés obtenus par des synthèses chimiques. L'action biologique observée a été complétée par des expériences de biologie moléculaire et d'analyse cellulaire par cytométrie afin de mettre en évidence les cibles de nos composées et le mode d'action sur les cellules cancéreuses. Aucun animal n'a été utilisé dans cette découverte majeure pour un traitement anticancéreux.
Réduction
Nous avons limité le nombre d'animaux par groupe sans remettre en cause l'analyse statistique de nos résultats mais en prenant en compte la variabilité interanimales et intergroupes. En tenant compte de la bibliographie, notre expérience dans le domaine du traitement des cancers, des tests de puissance statistique pour la taille des groupes, et des effets attendus un nombre de 10 souris par groupe sera utilisé. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultat et d'analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été élaboré afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux seront hébergés en portoir ventilé et ils disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de maison de type igloo et nous ajouterons des nids végétaux à base de fibres courtes de coton. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bienêtre des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites adaptés) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc...). L'administration des traitements devrait apporter un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression tumorale. De plus, l’ensemble des gestes techniques qui sont réalisés sur animaux vigils sont pratiqués par des personnes formées et expérimentées avec du matériel adéquate permettant de réduire significativement les nuisances liées aux actes techniques.
Choix des espèces
Une espèce couramment utilisée et reconnue en oncologie. C'est un modèle ayant permis de déterminer l’importance du protocole d’administration, l’influence du volume tumoral et la toxicité des traitements. La physiologie de la souris est comparable à celle de l'Homme. Les souris seront achetées entre 4 et 5 semaines d'âges et après 1 semaine d’acclimatation entreront en protocole. Selon la fiche research models de la souche NMRI-Foxn1nu/nu proposée par le fournisseur, le poids des animaux se stabilise entre 28 et 35 jours d’âge. Ce stade de développement est couramment utilisé et validé par la communauté scientifique. L’identification par bague est privilégiée, car la plus pratique pour identifier les souris. Elle sera réalisée au cours de la semaine d’adaptation En cas de perte les animaux seront bagués de nouveau ou à défaut des marquages au feutre de couleur des queues pourront également être réalisées pour sécuriser l’identification.
Etude de la biologie des tumeurs pédiatriques et développement de nouvelles approches thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de fragment tumoral sous la peau ou une injection de cellules tumorales issues de tumeurs pédiatriques, puis jusqu'à trois traitements par jour et des prélèvements de sang hebdomadaires, pour étudier le sarcome d'Ewing et chercher des cibles thérapeutiques. Le porteur indique que les tumeurs greffées ne devraient pas provoquer de gêne particulière et que les prélèvements au niveau de la joue entraînent une douleur brève. Sur le remplacement, il décrit des travaux in vitro et en microfluidique déjà menés, mais conclut que les modèles murins restent "nécessaires" avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
Les tumeurs pédiatriques sont rares, puisqu’en France, un enfant sur 440 va développer un cancer avant l’âge de 15 ans, mais elles représentent 28 % de la mortalité enfantine ce qui en fait la 2e cause de décès chez les 1-14 ans après les accidents. Le sarcome d’Ewing est la seconde tumeur osseuse maligne pédiatrique la plus fréquente après l’ostéosarcome et touche environ 80 à 100 nouveaux patients par an en France. Malheureusement, 20 % des patients présentent des métastases au diagnostic ce qui diminue drastiquement leur chance de survie. Génétiquement, le sarcome d’Ewing a bien été caractérisé et est lié à une fusion entre deux gènes, aboutissant à l’expression d’une protéine anormale. Cependant, les mécanismes d’action de cette protéine dans la transformation tumorale doivent encore être élucidés. Afin de comprendre cette transformation tumorale et identifier les meilleures pistes thérapeutiques pour ces patients, l’utilisation des modèles animaux est primordiale pour nos projets. Nous utilisons des modèles de PDX (patient derived xenograft) qui sont générés après une greffe chez la souris d’un fragment de tumeur issu de patients. A l’heure actuelle, ces modèles animaux n’ont pas d’équivalence qui leur permettrait d’être remplacés par des approches alternatives de type in vivo puisqu’ils sont les seuls qui se rapprochent le plus de la tumeur de patients. . L’objectif du projet est d’identifier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Pour la compréhension de la biologie des tumeurs pédiatriques telles que le sarcome d’Ewing et les sarcomes Ewing-like, il est important d’étudier : 1) la structure 3D de la chromatine (structure de l’ADN compacté) avec les modifications et l’accessibilité de cette structure dans les cellules cancéreuses. 2) les marques épigénétiques (modifications chimiques de l’ADN et des protéines associées qui permettent la régulation de l’expression des gènes) et 3) l’expression des gènes. En effet, il existe très peu d’étude sur ce sujet et en ce qui concerne les sarcomes d’Ewing-like il n’en existe aucune. Cela est dû au fait qu’il n’existe qu’une seule lignée cellulaire établie à partir de PDX d’un sarcome d’Ewing-like avec une fusion particulière, mais aucun autre modèle n’est établi pour les autres types de fusion que nous souhaitons étudier. Le seul moyen de pouvoir les étudier et d’établir des lignées cellulaires, est la génération de modèle PDX. Les bénéfices attendus sont : - la génération de nouveaux modèles PDXs ainsi que de nouvelles lignées cellulaires dérivées de PDX qui sont limitants aujourd’hui. En effet, les modèles de PDX nous permettent d’obtenir du matériel tumoral suffisant pour réaliser nos études puisque nous ne pouvons pas les effectuer sur les tumeurs de patient, vu la quantité de matériel obtenue et la rareté des échantillons. De plus, les modèles PDX sont les seuls modèles qui se rapprochent le plus aux tumeurs de patient. - Etudier la structure 3D de la chromatine sur ces échantillons de PDX pourra générer un maximum de données qui seront primordiales à la compréhension de la biologie des tumeurs d’Ewing et des Ewing-Like. Ces résultats et analyses vont nous permettre de répondre à nos questions biologiques et par la suite, ces données pourront être utilisées par toute la communauté scientifique afin de répondre à leur propre hypothèse. - La validation des nouvelles molécules identifiées sur des modèles de PDX. En effet, les découvertes qui seront réalisées grâce à ces nouvelles technologies et grâce au criblage in vitro en utilisant la technologie de CRISPR qui permet d’invalider un gène ou via une banque de petite molécule approuvée par la FDA, vont nous permettre l'identification de nouvelles molécules. Il sera donc important de valider ces dernières in vitro sur des cellules dérivées de PDX et in vivo sur des modèles de xénogreffe/PDX avant de passer aux tests cliniques chez l’homme.
Procédures
Une partie des souris de ce projet sera opérée sous anesthésie (1 fois) pour recevoir un fragment tumoral en sous-cutanée au niveau du dos (durée de l’anesthésie : 15 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine. (durée du geste inférieure à 30 sec) Une autre partie des souris sera injectée avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée aux animaux anesthésiés (1 fois – durée de l’anesthésie inférieure à 1 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine (durée du geste inférieure à 30 sec)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues au cours de la greffe de fragments tumoraux seront celles liées à l’incision de la peau sur des animaux anesthésiés (gène d’intensité faible et de courte durée). Suite à ces greffes, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du dos qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales seront celles à l’injection de produits non toxiques et non douloureux (gène d’intensité faible, de courte durée). Suite à ces injections, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du flanc qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les prélèvements de sang au niveau de la joue entraineront une douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques dans l’abdomen des souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L'utilisation de modèles pré-cliniques pertinents de la maladie est nécessaire, pour étudier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. En particulier, l'utilisation de la souris qui est un organisme vivant, mammifère intégré et autonome, présente de nombreuses similitudes avec l’homme. L’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques ne peut se limiter à des expériences in vitro. En effet, nous réalisons d’ores et déjà pour nos différentes études des expériences in vitro pour tester par exemple des molécules sur des lignées cellulaires. Aussi, nous réalisons en collaboration, des expériences ex-vivo en microfluidique en utilisant des cellules dérivées de PDX. La microfluidique permet de miniaturiser l’expérience afin de tester un grand nombre de molécules avec peu de cellules ce qui permet de réduire le nombre de souris à utiliser pour ces tests. Nous effectuons également des expériences sur des tumeurs de patients pour caractériser l’expression des gènes. Cependant, la rareté des échantillons humains et la faible quantité obtenue ne nous permettent pas de réaliser des expériences complémentaires sur ces échantillons. D’où l’importance d’utiliser ces - modèles murins, reproduisant au mieux la complexité de l’écosystème tumoral, incluant cellules tumorales et cellules du microenvironnement, avant d’envisager des tests chez l’Homme dans le cadre d’essais cliniques.
Réduction
Toutes les précautions seront prises pour réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en assurant une valeur significative des résultats obtenus. Les tests préliminaires in vitro permettent de limiter le nombre de molécules à tester sur les souris. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.
Raffinement
Les souris recevront anesthésique et analgésique au moment de la greffe. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, lors des greffes ainsi que des traitements, les animaux auront une surveillance accrue afin d'assurer leur bien-être. Une observation et une notation de leur état général seront évaluées de façon objective en utilisant une grille de score. Les expérimentations sont arrêtées dès l'atteinte d'un point-limite.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent pour les expériences menées en oncologie. En effet, les souches murines sont parfaitement définies (modèles génétiquement modifiés, souches immunodéprimées permettant le développement de tumeur d'origine humaine) et présentent une parenté biologique avec l’Homme (génome murin/humain, physiologie). Ceci est vrai pour la tumeur que nous étudions, à savoir le sarcome d’Ewing. Nous utilisons des modèles PDXs reproduisant la diversité des tumeurs de patients. Dans le contexte préclinique du cancer, les PDXs reconstituent l’écosystème tumoral avec ses différentes composantes, incluant cellules tumorales et autres cellules présentes de la tumeur tel qu’il existe chez les patients. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance, l'adolescence et les jeunes adultes. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des animaux âgés de 5 semaines (réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation) à 8 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement de ces tumeurs pédiatriques.
Etablissement de lignées tumorales humaines issues de patients pour greffer chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie deux greffes sous-cutanées de cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas, foie ou poumon, dont la croissance est suivie trois fois par semaine avant la mise à mort et le prélèvement des tumeurs. Le porteur indique que la croissance des tumeurs sous la peau peut provoquer une douleur modérée. Le projet vise à constituer un panel de tumeurs de patients pour de futures greffes, un modèle dont il affirme qu'il ne peut être remplacé par des cellules en culture faute de reproduire la complexité de l'"organisme entier".
Objectifs
La compréhension de la biologie des tumeurs est au cœur de la recherche actuelle. Issue de cette explosion de données et de connaissances, une multitude de thérapies ciblées a pu voir le jour. Ces dernières ont pour la plupart été préalablement testées sur des modèles animaux et reposent sur leur efficacité contre le cancer dans des expériences de greffe chez la souris qui consiste à injecter dans des souris des cellules cancéreuses. La sélection de nouvelles molécules repose notamment sur leur efficacité anticancéreuse dans des modèles animaux greffés. Dans ces derniers, des cellules cancéreuses issues de patients sont injectées dans des souris afin d’y faire se développer une tumeur et d’évaluer l’activité de ces molécules. Cependant, l’efficacité anticancéreux de ces molécules sur de telles greffes et sur les tumeurs issues de patients est souvent faiblement corrélée. L’amélioration du pouvoir de prédiction de ces modèles animaux peut être obtenue grâce à des modèles de greffe dérivée de la tumeur du patient dans lesquels un fragment du cancer du patient est greffé dans les plus brefs délais chez des souris. De plus, lorsque la tumeur est implantée, ces tumeurs issues de patients permettent parfois de mimer l’apparition de métastases. Pour ces raisons, un effort est actuellement en cours afin de générer un panel représentatif de tumeurs de patients pour chaque sous-type de cancer et plus particulièrement en ce qui nous concerne, les cancers (côlon, pancréas, foie et poumon). Le but de cette étude est d’établir un panel de différentes tumeurs de patients issus des 4 organes déjà cités, tumeurs qui pourront ainsi être des modèles cellulaires cancéreux qui seront greffés dans les modèles animaux dans nos futures études.
Bénéfices attendus
Communément, lorsque l’on parle de greffes, on fait référence au modèle qui consiste à injecter dans des souris des cellules cancéreuses. Pour la plupart des types tumoraux, des cellules ont pu être établies et sont fréquemment utilisées pour greffer des souris. Les cellules cancéreuses sont couramment utilisées car elles sont faciles à amplifier. Elles sont souvent bien caractérisées et relativement stables au cours du temps. Cependant, elles présentent quelques désavantages : i) une erreur de sélection lors de leur établissement et de leur propagation en culture, ii) une perte de l’aspect tridimensionnel de la tumeur puisque la plupart de ces cellules cancéreuses croissent en deux dimensions formant un tapis cellulaire ; iii) une perte de communication entre les cellules de l’environnement de la tumeur (cellules sanguines et immunitaires) et les cellules de la tumeur. Afin de palier la majorité de ces inconvénients, un modèle amélioré de greffe est de plus en plus utilisé : il s’agit de la greffe dérivée de la tumeur du patient. Ce modèle résulte d’une implantation après dissociation d’un fragment tumoral du patient fraîchement prélevé, chez des souris. La greffe dérivée de la tumeur du patient va alors se stabiliser et conserver dans la plupart des cas les caractéristiques pathologiques de la tumeur humaine initiale. Néanmoins, au vu de leurs avantages, les greffes dérivées de tumeurs de patients ont vu leur développement s’accélérer depuis quelques années et offrent aujourd’hui une approche pertinente pour mieux comprendre le développement des cancers afin d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
On réalise deux injections sous la peau de souris femelles adultes (1 injection sur chaque flanc de l'animal), de cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas, foie ou poumon sous anesthésie. Les cellules vont s’implanter à l’endroit de l’injection et commencer à croître. Cette injection dure moins de 30 secondes. La taille des tumeurs va être suivie par mesure régulière à l'aide d'un pied à coulisse électronique. L’ensemble des souris sera alors évalué 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs, mesurées à l’aide d’un pied à coulisse, au cours du temps.
Impact sur les animaux
(1) Un stress physique serait une nuisance induite par l’anesthésie lors de la xénogreffe et (2) une douleur modérée peut être engendrée par la croissance des tumeurs sous-cutanées. Les animaux ne subissent pas d'autres stress ou douleurs dans ce projet.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les tissus cancéreux seront prélevés pour analyses, dissociation et mise en culture.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu de la complexité physiologique de la tumeur comprenant plusieurs types cellulaires impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant de travailler à l'échelle d'un organisme vivant entier. Des études sur cellules en culture sont, par ailleurs, prévues pour étudier d’autres paramètres qui complèteront ce volet d’expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.
Réduction
Dans le but de répondre à la règle des 3R, nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir un nombre de cellules tumorales pour en evisager leur culture in vitro après la mort de l'animal et la dissociation des tumeurs. Dans le but de réduire le nombre d'animaux par groupe, celui-ci sera de 2 souris chacune implantée de 2 tumeurs issues de patients sur chaque flanc (droit et gauche), c'est à dire 4 tumeurs implantées par prélèvement issu de patient, ceci dans le but d’obtenir suffisamment des cellules tumorales issues de patients à mettre en culture in vitro en fin d’expérience. Ce nombre de 2 souris par tumeur issues de patient est le nombre suffisant pour obtenir une quantité utile de cellules (2 à 5 millions) pour envisager leur culture in vitro. Ce résultat est le fruit de l'expérience de ce type de procédure qui a déjà été proposé dans de multiples demandes d'autorisation à expérimention animale précédentes.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les animaux seront anesthésiés au moment de la greffe des cellules cancéreuses sous la peau. Au cours de l’expérience, une surveillance visuelle quotidienne et un suivi clinique (3 fois par semaine) seront réalisés dans le calme pour limiter au maximum le stress des animaux. L’administration d’analgésique sera réalisée si nécessaire (en cas de douleur). Des conditions d’hébergement standard adaptées sont appliquées avec une alimentation standard sans limite de quantité. Enfin, un enrichissement composé de coton et de lanières cartonnées en accordéon sera proposé aux animaux afin qu’ils puissent se confectionner des nids.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser l’espèce souris dans notre projet de recherche car la physiologie des cancers du côlon, du pancréas, du foie et du poumon induits dans cette espèce animale est proche de celle chez l’Homme. De plus, ce modèle apporte 2 autres avantages : sa taille et sa masse qui limite les quantités de traitement à administrer et le nombre extrêmement grand d'outils biologiques qui permettent la caractérisation des tissus cancéreux chez la souris. Les souris utilisées sont des femelles adultes pour que les animaux restent au même stade de développement tout au long de l’expérience. Nous avons privilégié des femelles pour limiter les conflits entre mâles hébergés dans une même cage.
Evaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique dans des modèles issus de patients atteints de cancer du poumon implantés chez la souris immunodéprimée
- Recherche appliquée
- Cancers
390 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie une greffe sous-cutanée de tumeur pulmonaire humaine, puis des injections deux fois par semaine et un gavage quotidien pendant quatre semaines, avant d'être tuées à l'atteinte d'un point limite ou au bout de quatre-vingt-dix jours. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer une gêne et une perte de poids, et qualifie de "non toxiques" les composés administrés. Il décrit une étude exploratoire sans test statistique, dont les retombées pour les patients atteints de ce cancer rare restent renvoyées à l'avenir.
Objectifs
Nous travaillons sur les cancers du poumon avec une fusion NRG1. Cette fusion est un évènement très rare (moins de 1% des cancers du poumon non à petites cellules) et les patients ne répondent pas aux traitements ou sur une durée très limitée. Les modèles d’étude sont rares. Ce projet a deux objectifs : 1/ d’établir des modèles d'étude de cette pathologie dans la souris, à partir d'échantillons de patients. Ces modèles sont des modèles de choix pour évaluer l’efficacité d’une thérapie et ses effets néfastes à l’échelle de l’organisme ; 2/ d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique dans ces modèles. Ce projet pourrait permettre de proposer à l'avenir une meilleure prise en charge aux patients.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. En effet, il n’y a pas aujourd’hui de stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer du poumon avec une fusion NRG1. L’établissement de modèles dérivés de patients permettra de valider l’efficacité d'un nouveau traitement, seul ou en association avec un inhibiteur déjà utilisé en clinique, dans ce contexte dans des modèles robustes.
Procédures
Implantation de tumeurs en sous-cutané, chirurgie, degré de gravité modéré, durée du geste : 10 minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral atteint le point limite - Injection intrapéritonéale (2 fois par semaine pendant 4 semaines), durée du geste : quelques secondes et gavage (une fois par jour, 5j/7, pendant 4 semaines), durée du geste : quelques secondes de composés thérapeutiques non toxiques - Pesée et mesure de tumeur : contention et geste de quelques minutes
Impact sur les animaux
Chirurgie pour implantation de tumeur en sous-cutané (degré de gravité modéré) - Développement tumoral : gêne si le volume tumoral atteint le point limite - Perte de poids possible - Pesées et suivi tumoral : stress lors de la contention et du geste (quelques minutes) - Gavage : irritation
Devenir
Tous les animaux ayant atteint un point limite, ou 90 jours après la greffe si aucun point limite n'est atteint, seront mis à mort. Les tumeurs seront collectées et analysées.
Remplacement
Les échantillons de patients sont précieux et la mise en culture in vitro difficile. La génération de modèles de cancers du poumon humain dans les souris permettra d'intégrer les cellules tumorales dans l'environnement d'un organisme entier et des interactions qui en découlent. De plus la sensisbilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Pour ces différentes raisons, nous devons effectuer cette étude sur la souris. Avant le passage dans les souris, l’efficacité du nouveau traitement a été validée in vitro.
Réduction
Cette étude est exploratoire et descriptive. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse 'pilote' pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d'animaux. Aucun test statistique ne sera effectué.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés et sensibilisés aux manipulateurs pendant 7 jours afin de limiter le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement, pesées chaque semaine et nous serons attentifs à leur état général (prostration de l’animal, poil hérissé, difficultés locomotrices) à chaque visite afin de détecter rapidement une souffrance ou l'atteinte d'un point limite. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux. Les conditions d'hébergement des animaux permettent d'éviter l'apparition de phénotype dommageable. Les animaux sont hébergés en groupe de 6 souris par cage pour répondre au besoin de socialisation et chaque cage présentera des enrichissements. La chirurgie sera réalisée après anesthésie des animaux.
Choix des espèces
Nous proposons d’établir des modèles dérivés de patients atteints de cancer du poumon et d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement. Une souche murine fortement immunodéprimée est nécessaire pour éviter le rejet des tissus implantés et favoriser la prise de greffe d'origine humaine. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux, il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. L'efficacité du traitement a été évalué in vitro. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.
Rôle du récepteur nucléaire PPARy dans la fibrose médullaire et dans le soutien du tissu hématopoïétique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
536 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de cellules hématopoïétiques sous anesthésie et jusqu'à six prélèvements de sang, pour étudier le rôle du récepteur PPARγ dans la fibrose de la moelle osseuse au cours de la myélofibrose, un cancer du sang. Le porteur indique que la maladie peut réduire la prise de poids et augmenter la taille de la rate, et que les souris sont tuées en fin d'expérience pour l'examen des fémurs, seuls les reproducteurs de la lignée étant gardés vivants. Sur le remplacement, il affirme qu'il reste impossible de reproduire in vitro la complexité du microenvironnement médullaire et conclut que la validation passe par le modèle murin.
Objectifs
La production des cellules sanguines (hématopoïèse) est réalisée au niveau de la moelle osseuse et résulte d’une interaction fine entre les cellules progénitrices (qui peuvent se diviser et donner les cellules du sang) et les cellules stromales qui sont une composante du microenvironnement de la moelle osseuse. La myélofibrose (MF) est un cancer du sang rare caractérisé par une fibrose de ces cellules stromales entrainant une altération de la production des cellules sanguines. C’est une pathologie grave, avec une médiane de survie de 5 à 6 ans. Il a été rapporté que l’activation du récepteur nucléaire (PPARγ) par des molécules pharmacologiques entraîne une réduction de la fibrose dans des modèles murins de MF. Ces résultats en font une une cible thérapeutique intéressante dans une pathologie où les traitements agissent principalement sur les symptômes de la maladie. Dans l’objectif d’utiliser des médicaments ciblant PPARy dans le traitement de la MF, il est impératif de caractériser le rôle physiologique de PPARy dans le stroma de la moelle osseuse. Pour répondre à cette question, un stroma médullaire murin qui, par l’utilisation d’une technique de génie génétique, n’exprime pas PPARy a été développé. Il récapitule des caractéristiques de la fibrose médullaire avec notamment une altération des capacités à soutenir l’hématopoïèse. Les premiers résultats obtenus in vitro ne permettent pas l’étude du rôle de PPARy dans toutes les composantes de l’hématopoïèse. Pour cela nous prévoyons de développer des systèmes d’étude plus complexes faisant appel au modèle murin. Nous mettrons en place une co-culture de cellules progénitrices hématopoiétiques murines et humaines sur stroma normal (WT) ou invalidé (KO) qui sera transplanté dans des modèles murins pour l’étude de leur hématopoïèse. La même approche sera utilisée avec des cellules progénitrices provenant d’hémopathies afin d’étudier l’effet sur une hématopoïèse pathologique En parallèle de cette étude un modèle murin d’invalidation (KO) de PPARy spécifiquement dans les cellules du stroma de la moelle osseuse sera développé. Il permettra après traitement par une molécule stimulant la MF de déterminer si la sensibilité à la fibrose est corrélée à l’expression de PPARy dans les cellules du stroma de la moelle osseuse. Enfin, on étudiera dans ce modèle la manière dont se développent différents cancers du sang afin de déterminer si la fibrose médullaire impacte l’histoire naturelle de ces maladies.
Bénéfices attendus
La myélofibrose (MF) est la plus grave des néoplasies myéloprolifératives (NMP) (famille de cancer du sang comprenant également la polyglobulie de Vaquez (PV) et thrombocytémie essentielle (TE) avec une médiane de survie de cinq à six ans. Les traitements actuellement disponibles ciblent principalement les symptômes et n’ont que peu d’influence sur l’histoire naturelle de la maladie. Seule la greffe de moelle osseuse est curative mais elle ne concerne qu’une faible minorité de patients qui sont éligibles au traitement. Récemment, il a été démontré que l’activation du récepteur nucléaire PPARy par ses ligands pharmacologiques permettait de réduire le développement anormal de la densité osseuse (ostéosclérose) et de la fibrose médullaire dans trois modèles précliniques murins de la MF. Au cours de ce projet, nous souhaitons caractériser la fonction physiologique de PPARy au sein des cellules du microenvironement de la moelle osseuse (stroma médullaire) qui supportent la production des cellules sanguines et sont les cibles de la fibrose. Nous souhaitons ainsi démontrer que PPARy est un acteur clé de la prévention du développement de la fibrose médullaire, de l’ostéosclérose et de la capacité des cellules mésenchymateuses à soutenir l’hématopoïèse. L’ensemble de ces travaux a pour objectif de mieux caractériser en quoi PPARy peut être une cible thérapeutique ouvrant de nouvelles stratégies de prise en charge (en monothérapies ou associées au traitement conventionnels) des NMP et particulièrement de la myélofibrose. Ces résultats pourront également être étendus à d’autres organes dont les pathologies impliquent le développement d’une fibrose. Dans un contexte plus général ce travail permettra également de mieux comprendre et appréhender la part relative au stroma médullaire dans le développement des hémopathies et le potentiel intérêt d’un ciblage thérapeutique du stroma en plus de celui des cellules hématopoïétiques. Des molécules pharmacologiques ciblant PPARy étant déjà sur le marché, ce travail permettra également d’envisager leur repositionnement thérapeutique dans la prise en charge de la MF.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à : - Une irradiation : procédure indolore, réalisée en maintenant les groupes sociaux définis, et durant une dizaine de minutes. - Une unique injection pour chaque animal (animal sous anesthésie générale et analgésie) de cellules hématopoïétiques normales ou pathologiques. Cette intervention ne dure que quelques minutes et se déroule sous un contrôle permanent pour veiller à la bonne anesthésie, l’absence de douleur et gérer le réveil. - Des prélèvements de sang : pour le suivi de l’hématopoïèse, réalisés sur animaux vigiles sur une durée ≤ à une minute, avec un délai minimum de 3 semaines entre chaque prélèvement et un nombre maximum de 6 prélèvements - un traitement par injection impliquant un geste d’une durée inférieur ou égale à une minute sur une période maximale de 3 semaines.
Impact sur les animaux
L’irradiation, l’anesthésie, la transplantation de cellules hématopoïétiques, les injections sous-cutanées et les prélèvements de sang au niveau de la veine faciale peuvent engendrer du stress chez la souris. Le développement d’une hématopoïèse pathologique peut également engendrer des modifications des constantes hématologiques avec notamment une augmentation de plaquettes et/ou de l’hématocrite, qui peuvent à terme générer de la fibrose et une diminution de production des cellules sanguines, ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. Durant le développement des hémopathies PV, TE, MF la prise de poids des animaux est réduite.
Devenir
Les analyses de la fibrose de la moelle osseuse ce font par examen histopathologiques des fémurs ce qui nécessite l’euthanasie des animaux à la fin de chaque expérimentation. Seuls les animaux reproducteurs seront maintenus en vie. En effet, si le modèle murin d’invalidation de PPARy dans les cellules stromales médullaires apporte les résultats escomptés, il pourra être utilisé pour d’autres hémopathies ou pour des questions plus fondamentales d’étude de la communication entre le microenvironnement et les cellules hématopoïétiques. Il constituera donc un intérêt pour la communauté scientifique et pourra être pérennisé.
Remplacement
Au cours de ce projet, une grande partie des expériences seront menées in vitro, cependant en raison de la complexité et du nombre d’intervenants cellulaires et matriciels composant le micro-environnement médullaire et régulant l’hématopoïèse, il est actuellement impossible de mimer la physiologie médullaire par des modèles exclusivement in vitro. Nos modèles in vitro seront donc utilisés autant que faire se peut afin de mettre au point les protocoles et de générer les résultats préliminaires, mais ils nécessitent néanmoins d’être validés dans des modèles in vivo murins dans un second temps. D’autre part, ce projet a pour objectif de caractériser la pertinence du ciblage thérapeutique de PPARy dans la myélofibrose. Il est donc important de valider sa fonction dans des modèles murins précliniques, validés et reconnus, de cette pathologie.
Réduction
Dans l’ensemble des expérimentations associées à cette demande les animaux sont hébergés en groupe (n=5 individus par cage). Nos expériences précédentes nous ont montré que pour une condition expérimentale en analyse non-paramétrique un minimum de deux boites (dix individus) était nécessaire. Le nombre d’expérimentations indépendantes pour chaque condition est réduite à 2 (pour vérifier la reproductibilité entre expérience). Lorsque cela était possible, nous avons choisi de réaliser des greffes compétitives. Cette stratégie présente deux avantages, 1) elle augmente la sensibilité en permettant de comparer les conditions au sein d’un même individu ce qui réduit dans les analyses de groupe la variation inter-individu et permet de réduire les effectifs, 2) chaque individu étant son propre contrôle cela permet de supprimer le groupe contrôle et de limiter encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les souris seront hébergées en groupe, avec des éléments d’enrichissement. Elles seront surveillées régulièrement pour limiter tout mal-être éventuel en accord avec les critères d’évaluation de l’état général des animaux. Certains critères biologiques spécifiques comme le taux l’hémoglobine seront également monitorés et pris en compte comme point limite. Les interventions de transplantation seront pratiquées sous anesthésie générale et analgésie en limitant la durée de l’anesthésie et en assurant un maintien de la température corporelle grâce à un tapis chauffant et de l’hydratation des yeux grâce à un gel oculaire. Les animaux sont traités par antibiotiques durant les 3 semaines post-transplantation pour limiter le risque d’infection. Les prélèvements de sang seront faits par voie sub-mandibulaire afin d’être le moins douloureux possible et seront espacés d’au moins 3 semaines.
Choix des espèces
Le modèle rongeur nous semble le plus adapté car c’est historiquement un modèle de prédilection pour l’étude de l’hématopoïèse. C’est un modèle bien établi, validé par la communauté scientifique, et qui fait l’objet de nombreuses publications scientifiques. Les modèles précliniques des différentes hémopathies étudiées, la leucémie myéloïde chronique (LMC), la thrombocytémie essentielle (TE), la polyglobulie de Vaquez (PV) et la myélofibrose (MF) sont établis dans le modèle rongeur. Travailler sur la même souche murine apporte une pertinence à la comparaison entre nos données. Que cela soit pour obtenir une meilleure prise de greffe, ou pour avoir la possibilité de suivre le développement de la pathologie au cours du temps, nous devons utiliser des animaux jeunes (8 semaines).
Étude métabolique et fonctionnelle en imagerie in vivo d’un modèle de gliomes chez la souris (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules humaines de glioblastome dans le cerveau par chirurgie, puis passent trois séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses post-mortem. Le porteur indique que l'injection peut provoquer une neuroinflammation, un état fébrile, une perte d'appétit et une léthargie pendant une douzaine d'heures. Les bénéfices avancés, un biomarqueur d'imagerie utile pour évaluer de futures thérapies contre un cancer de mauvais pronostic, sont renvoyés au conditionnel.
Objectifs
Les cancers du cerveau sont encore aujourd’hui de mauvais pronostic, et notamment le plus agressive le glioblastome qui est aussi le plus fréquente. Ces cancers sont classés et identifiés grâce à des analyses réalisées directement sur le tissu malade à partir de biopsies cérébrales. L’un des critères majeurs est la présence d’une mutation spécifique sur le gène appelée IDHmut. Cette mutation apporte des éléments pronostics important pour les patients puisque les tumeurs cérébrales IDHmut ont un meilleur taux de survie que les IDH non mutés. La greffe de cellules humaines de glioblastome est un modèle animal de cancer du cerveau largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes de croissance du cancer. Ce modèle permet aussi de tester d’évaluer de nouvelles thérapies. Des lignées cellulaires portant la mutation IDHmut seront greffées sur des souris afin de créer un modèle se rapprochant des caractéristiques des cancers humains. Ce projet permettra de caractériser les différences entre les souris portant la mutation et des souris témoins et fournira de nouvelles méthodes d’imagerie in vivo. Ces nouvelles méthodes en imagerie médicale sur les souris seront utilisées pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les glioblastomes (GBM) sont les plus fréquents et les plus grave des gliomes diffus de l’adulte, avec une médiane de survie globale qui ne dépasse pas 15 mois. Ce projet permettrait de caractériser un nouveau biomarqueur d’imagerie (mesuré en spectroscopie par résonance magnétique) dans un modèle bien connu de GBM chez la souris. Ce biomarqueur sera ensuite associé à d’autres marqueurs fonctionnels (grâce aux ultra-sons ou aux biomarqueurs d’imagerie pat tomographie d'emission de positrons) qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, la possibilité d’obtenir ces biomarqueurs sur des modèles précliniques sera une aide précieuse pour une évaluation précoce de nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule chirurgie d'une durée de 30 minutes. Par la suite les animaux auront 3 examens d'imagerie non invasive de 1 heure maximum chacun pendant lesquels les animaux seront anesthésiés et endormis.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une perte d’appétit et une léthargie. Cette nuisance exclusivement liée à l’injection stéréotaxique ne sera pas répétée et ne durera pas plus de 12 heures.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure afin de permettre des analyses post-mortem in vitro. En effet, les données d’imagerie in vivo doivent être complétées par les analyses in vitro qui permettent d’apporter des mesures plus variées et précises sur les problématiques métaboliques et vasculaires.
Remplacement
Le projet a été construit après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP, IRM, ultrasons) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Les équipements d’imagerie (microTEP, microIRM et sonde ultrasonore) sont adaptés à la souris. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celle obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés, et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’humain.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux est réalisée grâce au suivi longitudinal, en imagerie non invasive IRM, de la taille de la tumeur. Ce type de suivi augmente la puissance statistique et les tests statistiques permettent de réduire de 51 à 34 le nombre souris. Ce projet permettra de contrôler le bien-être des souris en rapport avec le volume de la tumeur cérébrale. Cette étude pilote guidera les étapes suivantes qui seront adaptées en fonction des résultats observés. L’ensemble du projet nécessite 196 souris. Les expérimentations se dérouleront en blocs expérimentaux : l’ensemble de l’étude étant constitué de 2 groupes (un groupe contrôle et un groupe test), chaque groupe sera divisé en blocs (de 5 à 7 souris s) ce qui permettra d’analyser par des tests statistiques les résultats après les données obtenues sur chaque bloc. Si les analyses montrent des données significatives, les blocs suivants ne seront pas utilisés, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille d’évaluation neurologique et des points limites adaptés. La mutation portant sur le gène IDH n’apportera pas de changement majeur par rapport à la lignée sauvage, dite wild-type "wt", (si ce n’est une vitesse de croissance diminuée), les points limites seront les mêmes pour tous les animaux. Il a été démontré que la lignée utilisée dans ce protocole ne provoque pas de déficits moteurs chez les souris avant le jour 27 après injection intracérébrale en comparaison des souris contrôles. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (buprénorphine), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques en cas d’apparition de signes de souffrances. En cas de signes de détresse, la procédure sera interrompue et si nécessaire, l’euthanasie sera effectuée. Les séances d’imagerie avec ultra-sons seront réalisées avec une sonde de taille adapté aux crânes des souris.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau de la souris est proche de celle de l’humain. Ce modèle est aussi pertinent car le model de greffe de glioblastome humain chez la souris est très bien décrit. Enfin, l’imagerie par ultrasons fonctionnels peut être réalisée chez la souris à travers le crâne directement car les os du crâne sont suffisamment fins pour ne pas provoquer d’atténuation du signal. De la même façon que l’échographie, le signal ultrasonore est atténué grandement par les os. Souris adultes de 2 mois afin de modéliser les gliomes diffus de l’adulte.
Développement du cancer colorectal chez le rat : analyse de la contribution du microbiote intestinal dans l’effet du régime alimentaire.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une puce sous-cutanée, un gavage de microbiote humain et une injection d'azoxyméthane, un composé cancérigène destiné à déclencher des lésions précoces du côlon, puis subissent trois prélèvements de fèces avant d'être tués pour analyse. Le porteur décrit ces gestes comme générant un stress et une douleur "minimes" et affirme que l'injection du cancérigène n'engendrera pas de douleur. Les retombées annoncées, une piste nutritionnelle contre le cancer colorectal moins coûteuse que le médicament, restent formulées comme une possibilité.
Objectifs
Le risque de cancer colorectal (CCR) est fortement affecté par l’alimentation, avec un risque augmenté par la consommation de viande rouge et un risque réduit par un régime pesco-végétarien (sans viande mais avec des oeufs et des produits laitiers en plus des végétaux, auquel on ajoute des produits de la mer comme les poissons, les crustacés et les mollusques). Le projet porte sur l’étude de la contribution du microbiote intestinal dans ces effets de l’alimentation sur le risque de CCR.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de contribuer à documenter (i) le rôle du microbiote intestinal en lien avec le régime alimentaire dans le développement du cancer colorectal, (ii) la possibilité d’intervenir à l’échelle du régime alimentaire pour favoriser un microbiote limitant le risque de cancer colorectal. Ces bénéfices ont donc un intérêt dans le domaine de la santé humaine, mais aussi dans le domaine de l’économie de la santé, dans la mesure où des interventions nutritionnelles visant à préserver ou restaurer l’équilibre du microbiote intestinal sont moins coûteuses que le développement de médicaments.
Procédures
- 1 implantation sous-cutanée d’une puce électronique destinée à identifier les rats de manière unique et pérenne (rats vigiles, tous les rats), durée : 5 secondes. - 1 gavage unique de microbiote humain dilué (1 ml) (rats vigiles, tous les rats), durée : 10 secondes - 1 injection intra péritonéale unique d’un composé cancérigène (rats vigiles, tous les rats), durée : 5 secondes - 3 prélèvements de fèces (2 semaines après l’inoculation, à 7 semaines, et à 14 semaines après l’inoculation). Pour cela, chaque rat est placé quelques minutes dans un grand pot en plastique transparent ; les rats émettent spontanément et rapidement les 1-2 crottes nécessaires (rats vigiles, tous les rats)
Impact sur les animaux
Le projet porte sur les liens entre alimentation, microbiote intestinal et cancer colorectal. Il est donc attendu que les rats présentent, suite à l’injection d’azoxyméthane, une augmentation des marqueurs de cancérogenèse au niveau du côlon. Toutefois, il s’agit d’une procédure établie pour étudier les stades précoces de la cancérogenèse (foyer de cryptes aberrantes, lésions prénéoplasiques…) qui n’engendreront pas de douleur. Les interventions sur les animaux seront d’une part l’inoculation des microbiotes par gavage et d’autre part l’injection intra-péritonéale d’une solution tamponnée d’azoxyméthane. Ces gestes sont assurés par des personnels expérimentés et généreront un stress et une douleur minimes. LLes prélèvements fécaux n’occasionneront que peu de stress ou douleur aux animaux puisqu’il s’agit de selles spontanément émises.
Devenir
Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure pour étudier différents paramètres biologiques associés au développement du cancer colorectal.
Remplacement
A l’heure actuelle, étudier l’effet du microbiote et de l’alimentation sur le cancer colorectal nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative technique suffisamment sophistiquée pour le remplacer.
Réduction
Nous utiliserons 10 rats par groupe. Notre expérience, et celle d’autres groupes de recherche, dans l’étude de l’effet du régime alimentaire et/ou du microbiote intestinal sur la cancérogenèse colique, indique qu’un effectif de 10 rats par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets statistiquement significatifs. En particulier, les résultats obtenus lors d’un protocole similaire (mais avec transfert de microbiotes de rats) ont montré que ce nombre d’animaux permettait de mettre en évidence des effets du microbiote sur certains marqueurs de la cancérogenèse.
Raffinement
La solution du composé cancérigène est préparée de façon à ce qu’elle évite une douleur au point d’injection. Il n’y aura pas d’autres manipulations provoquant de la douleur pendant cette procédure, et l’étude est arrêtée au stade de lésions précancéreuses qui ne provoquent pas de douleur. Tous les rats auront dans chaque cage un enrichissement de milieu par l'ajout de feuilles de cellulose (pour faire le nid), d'un bâton de bois à ronger et des cylindres en plastique où se cacher et sur lesquels grimper. Les rats seront 2 par cage pour éviter l'isolement et auront libre accès à la nourriture et à l'eau. Tous les rats recevront de l'eau stérilisée à l'autoclave et un régime alimentaire standard irradié.
Choix des espèces
Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus utilisé est l’injection unique d’un composé cancérigène qui a l’avantage de provoquer des stades précoces du cancer colorectal comparable à la situation humaine. Nous utiliserons des rats adultes, âgés de 5 semaines au début de l’expérimentation, l’objectif étant d’étudier la relation alimentation-microbiote-cancer colorectal chez l’adulte.
Impact de la cryothérapie sur l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique
- Recherche appliquée
- Cancers
8 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, deux étant opérés sous anesthésie sans réveil. Les six autres subissent une chirurgie cérébrale d'une heure puis des IRM hebdomadaires sous anesthésie de deux heures pendant six à huit mois, pour suivre l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique après cryothérapie. Le porteur signale des effets liés aux anesthésies répétées et à la chirurgie du cerveau, œdème cérébral, déficit moteur, vomissements et céphalées, avant mise à mort pour analyser les tissus. Il justifie le recours au porc par un cerveau proche de celui des primates et présente ce modèle comme préparant un "transfert rapide" vers un essai clinique.
Objectifs
Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale maligne primitive la plus fréquente et est extrêmement agressif. Actuellement, le traitement de référence est une chirurgie pour enlever la zone tumorale si elle est accessible, accompagnée par une radiothérapie puis une chimiothérapie. Malgré un traitement bien conduit, tous les patients présentent une récidive tumorale locale ou régionale. Forts d’une première étude ayant démontré un gain important dans la survie des patients traités par cryothérapie, nous souhaitons affiner la compréhension des mécanismes en jeu et plus spécifiquement, l’impact de la cryothérapie sur la barrière hémato-encéphalique (BHE), véritable muraille protégeant le cerveau mais bloquant l’arrivée des molécules thérapeutiques. En effet, lors de notre étude clinique, la BHE des patients s’est révélée fragilisée. Or, l’ouverture de la BHE représente un facteur important d’amélioration du pronostic des patients en permettant l’arrivée des médicaments dans le cerveau et donc aux cellules tumorales. Dans ce contexte, notre objectif consiste tout d’abord à confirmer cette ouverture de la BHE par la cryothérapie cérébrale sur un modèle porcin, puis, dans un second temps, de déterminer le délai d’ouverture de la BHE qui offrirait une fenêtre thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de valider et déterminer la durée de l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique suite à une cryothérapie, offrant une fenêtre thérapeutique pour l’administration de chimiothérapies dans le traitement de tumeurs cérébrales. Le protocole défini pour ce projet se rapproche au maximum des conditions chez le patient, aussi bien pour la chirurgie que pour le suivi mini-invasif utilisant l’IRM, préparant un transfert rapide vers un essai clinique. Ainsi, une étude clinique prospective rentrant dans le cadre d’un programme hospitalier de recherche clinique (PHRC) pourrait ensuite être réalisée afin d’évaluer l’efficacité de la cryothérapie cérébrale sous IRM combinée à un traitement adjuvant chez des patients atteints d’une récidive de glioblastome.
Procédures
Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale initiale d’une heure sous anesthésie générale, puis à des examens IRM hebdomadaires sous anesthésie de deux heures pour suivre sur 6 à 8 mois le statut de la barrière hémato-encéphalique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant survenir sont liés aux anesthésies répétées (stress, nausées, désorientation, hypothermie, irritation trachéale) et à la chirurgie cérébrale (inflammation de la plaie, œdème cérébral, déficit moteur controlatéral, vomissements et céphalées).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour l'analyse des tissus cérébraux qui complètera les données IRM sur l'état de la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
Ce projet fait suite à une étude clinique démontrant le fort intérêt thérapeutique d’utiliser ce traitement innovant chez des patients atteints de glioblastome en récidive. Le but étant la validation de l’ouverture de la BHE par la cryothérapie, nous devons travailler dans un tissu vivant sain afin de soustraire tout effet de la pathologie sur l’intégrité de la BHE. Par conséquence, nous ne pouvons éviter à ce jour l’utilisation d’un modèle animal. Préalablement aux études in vivo, la mise au point de la chirurgie est validée sur cadavre de porc afin d'adapter le protocole aux variations anatomiques et de réduire à moins de 2 cm l'ouverture nécessaire pour l'insertion de la sonde de cryoablation.
Réduction
Il s'agit d'une preuve de concept. Le nombre d’animaux ainsi que leur répartition entre les procédures ont été estimés au plus juste pour répondre à notre problématique. Le protocole d’une procédure dépendra du résultat de la précédente. L’usage de l’IRM, méthode non invasive et non irradiante utilisée en clinique pour observer l’intégrité de la BHE nous permettra de suivre un même animal au cours du temps et ainsi de limiter les effectifs requis.
Raffinement
Les porcs sont hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à mâcher et de balles, ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les conditions d’ambiance sont contrôlées et la température est maintenue entre 18 et 24°C. Une période d’acclimatation permet aux animaux de s’habituer à leur environnement et au personnel soignant qui met en place un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses. Le jour de l’intervention, les porcs sont tranquillisés pour être transportés sans stress dans la salle d’opération, ils sont maintenus sous anesthésie générale avec gestion de la douleur pendant la chirurgie et l’acquisition d’images IRM. Suite à la chirurgie, les animaux sont étroitement surveillés jusqu’à leur réveil et tous les jours suivant l’intervention. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Une videosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Des points limites sont définis pour détecter les signes précoces d’une détérioration et arrêter la procédure en cas de souffrance.
Choix des espèces
Le cerveau circonvolutionné du porc ressemble davantage au cerveau des primates que le cerveau lissencéphale (cortex lisse, sans circonvolutions) des rongeurs, et la littérature rapporte le modèle porcin comme pertinent dans de nombreuses approches en neurosciences notamment dans l’étude de la BHE. L’accès à un modèle de grande taille est nécessaire pour reproduire la cryothérapie chez le patient. Le volume et l’anatomie du cerveau de jeunes porcs de 30 à 50 Kg répondent à cette limitation et permettent d’envisager la survie l’animal dans de bonnes conditions.
Etude de l’environnement inflammatoire cérébral post-radiothérapie : suivi par microdialyse sur rat porteur de glioblastome (EU porteur; EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale humaine est implantée dans leur cerveau, puis une sonde de microdialyse qui ressort du crâne et y reste jusqu'à la mise à mort, des prélèvements de liquide cérébral étant réalisés sur l'animal conscient et maintenu en contention entre le 11e et le 17e jour. Ils subissent aussi radiothérapie et imagerie sous anesthésie, la mise à mort survenant dès un point limite ou au plus tard à 90 jours. Le porteur présente la microdialyse comme un moyen de réduire le nombre d'animaux et affirme que le remplacement n'est "clairement pas possible".
Objectifs
Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes et sont généralement agressives. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nouvelles molécules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique d'un médicament innovant (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine implantée chez l'animal. L’objectif du projet étant d'étudier la réponse immunitaire après traitement par ce médicament innovant en association avec la radiothérapie. Pour cela nous utiliserons une technique qui permet un dosage répété des molécules présentent dans l'environnement de la tumeur sans réaliser de biopsie du cerveau. Au cours d'une chirurgie nous plaçons une sonde dans la tumeur cérébrale de l'animal; celle-ci nous permettra de mesurer la réponse immunitaire durant plusieurs jours. Cette technique permet de réduire considérablement le nombre d'animaux comparé aux techniques traditionnellement utilisées qui necessiteraient la mise à mort de l'animal pour chaque point de mesure. Pour le suivi de l'évolution de la masse tumorale des différents traitements, nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament innovant pour le traitement du glioblastome. La technique de mesure utilisée permettra, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le tissu cérébral, d'obtenir des échantillons de façon dynamique tout en gardant l’animal en vie. Ces échantillons nous permettront un suivi au cours du temps de la réponse immunitaire après traitement du médicament innovant et de la radiothérapie.
Procédures
Implantation dans le cerveau des animaux de tumeurs cérébrales humaines, cette chirurgie dure environ 1h. Implantation d'une sonde de microdialyse : durée de la chirurgie environ 1h30 ; présence de la sonde qui ressort au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal. Prélèvement de liquide cérébral sur animal vigile hébergé en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement. Cette méthode de prélévement sera réalisée du jour 11 au jour 17 sur l'animal conscient; l'hébergement en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement induit une restriction des déplacements de l'animal. Protocole de radiothérapie et imagerie pour le suivi de l'évolution de la tumeur sur animal anesthésié
Impact sur les animaux
Implantation au niveau du cerveau de cellules tumorales d'origine humaine : chirurgie classée modérée car seule l’incision de la peau du crane peut provoquer une souffrance à l’animal. Nous utiliserons un analgésique local pour limiter la souffrance des animaux. Implantation de la sonde : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la sonde (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements adaptées au mode de prélèvement avec système de contention. Radiothérapie et imagerie sur l’animal : transport de l'animal jusqu’à la plateforme d'imagerie et de radiothérapie ; afin d’éviter toute nuisance à l’animal, le transport est réalisé en cages filtrées dans un sac de transport isotherme (pour le maintien d’une température optimale, des bouillottes chauffantes sont placées sous les cages si nécessaire). Les procédures de radiothérapie ou d’imagerie sont réalisées sur l’animal anesthésié. L'imagerie est un examen non invasif , il ne produit aucune forme de douleur.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. La mise à mort est réalisée dès l’apparition d’un point limite (altération des déplacements et/ou perte de poids) ou en cas d'efficacité du traiement au maximum 90 jours après le début des expérimentations.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales et les effets du traitement par radiothérapie avec ou sans médicament innovant, dépendent de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que sur un modèle animal.
Réduction
La technique utilisée est une méthode permettant le recueil du liquide cérébral et de ses composants sans avoir à mettre à mort les animaux. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements peuvent être réitérés au cours du temps. Nous n’avons pas de réelle idée des variations attendues entre les différents groupes d'animaux, il est donc compliqué de définir un nombre d’animaux précis nécessaire pour une obtenir une solide étude statistique mais 8 animaux par groupe semble tout à fait pertinent.
Raffinement
Les deux procèdures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress de l'animal et de permettre un réveil rapide. Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la sonde (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment des prélèvements intracérébraux, en effet les animaux seront régulièrement observés pour vérifier que le comportement des animaux n’est pas altéré par le mode de prélèvement et les contraintes de contention. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.
Choix des espèces
Dans les études menées en cancérologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante permettant une implantation de la tumeur et de la sonde de prélèvement plus précise mais également par la nécessité d’obtenir de volumes de prélèvement suffisamment importants. De plus la taille du cerveau de rat offre une meilleur résolution pour l’imagerie. Des rats âgés de 6-8 semaines sont utilisés, à un stade où la taille et la forme du crâne correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.
Evaluation de l’efficacité et de l’impact sur la réponse immunitaire de l’association de radiothérapie avec des immunothérapies, des nanoparticules radiosensibilisantes et/ou de chimiothérapies sur plusieurs modèles de tumeurs syngéniques murines
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour optimiser des combinaisons de radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et immunothérapie. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et des prises de sang sous anesthésie, les tumeurs pouvant former des nécroses et ulcérations douloureuses. Le porteur indique qu'environ 75 % des souris seront tuées après un point limite ou une progression tumorale dès la première procédure, le reste à l'issue de la seconde. Le modèle de souris immunocompétente est présenté comme 'indispensable' pour reproduire un 'organisme entier'.
Objectifs
Nous proposons d’optimiser les combinaisons à base de Radiothérapie avec des Nanoparticules et/ou des immunothérapies et/ou des chimiothérapies. L’efficacité de ces traitements sera évaluée par suivi du volume des tumeurs traitées et par étude de la réponse immunitaire à partir d’échantillons sanguins. L’objectif de ces expérimentations est de constituer des bases solides nécessaires aux développements d’essais cliniques en évaluant l’efficacité des combinaisons présentant les meilleurs efficacités en préclinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont cliniques avec l’optimisation et la sélection des meilleurs schémas de combinaison à base de radiothérapie, nanoparticules et ou immunothérapies pour traiter des cancers localisés ou métastatiques.
Procédures
- Injection sous cutanée de cellules tumorales - Prélèvement sanguin sous maxillaire - Ces deux types d’interventions seront réalisés sous AG gazeuse (Isoflurane 2.5%)
Impact sur les animaux
Les tumeurs formées par certains types de cellules peuvent former fréquemment des nécroses/ulcération en surface qui peuvent entrainer une douleur évaluable par palpation de la tumeur Aucun effet secondaire ou nuisance dû aux prélèvements sanguins en sous maxillaire n’est attendu. Ce geste est couramment réalisé par les membres de notre équipe.
Devenir
A l’issue de la procédure N°1 : environ 75% des animaux auront été mis à mort après atteinte d’un point limite ou parce que leur tumeur est en progression. Les 25 autres pourcents des animaux seront pris en charge dans la procédure N°2 A l’issue de la procédure N°2 : tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Etant donné que nous allons évaluer l’effet de la radiothérapie sur l’activation de cellules immunitaires, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux présentant un système immunitaire actif. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur des cellules en culture nous a permis de nous affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)
Réduction
La formation de tumeur par les types de souris qui seront utilisés dans ce projet, se fait de façon homogène, permettant l’utilisation d’un nombre d’animaux relativement réduit pour répondre aux questions scientifiques posées. Afin de pouvoir traiter dans un même groupe des tumeurs de tailles comparables, il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules de cancer de souris permet de pouvoir travailler avec des souris au système immunitaire actif sans entrainer de rejet des tumeurs. Ainsi, nous pouvons étudier les effets de nos traitements à la fois sur la croissance des tumeurs mais aussi sur les cellules immunitaires. Afin de garantir la fiabilité de nos résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations 3 fois.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe dans des cages de taille adaptées et en présence d’enrichissement (matériel leur permettant de constituer un « nid »). Les combinaisons des traitements par radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et/ou immunothérapie ont déjà été réalisées dans ces conditions dans notre équipe sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur aux animaux seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le modèle de souris est indispensable car les expérimentations sur cellules en culture ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme entier, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La formation de tumeur par les souris qui seront utilisées dans ce projet est homogène et maitrisé par notre équipe. Ceci permet de limiter la quantité de souris injectées par des cellules tumorales pour constituer des groupes de traitement avec un volume de tumeur comparable. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature.
Etude de l’efficacité anticancéreuse de la synergie entre un traitement aux ultrasons et un traitement de référence en immunothérapie, dans un modèle de cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans un modèle de cancer du pancréas. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, cinq séances d'ultrasons sous anesthésie et cinq injections intrapéritonéales d'immunothérapie, les ultrasons pouvant provoquer une brûlure au niveau de la tumeur. Le porteur décrit des points limites liés aux brûlures, ulcérations et nécroses tumorales, traités par crème ou antidouleur puis par mise à mort si la douleur persiste. Les bénéfices annoncés pour les patients sont renvoyés au 'long terme'.
Objectifs
Alors que l’immunothérapie s’avère être un traitement efficace pour certains cancers, elle ne l’est pas pour le cancer du pancréas. Ce dernier est la deuxième cause de décès liée aux cancers en France. La chirurgie curative, à un stade précoce, est actuellement le seul traitement qui permet une survie à long terme, à environ 20% à 5 ans. L’environnement de la tumeur semble être responsable de cet échec. Il est proposé ici d’utiliser les ultrasons pour désorganiser cet environnement tumoral et permettre à l’immunothérapie de pouvoir atteindre la tumeur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie ultrasons + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas pour qui le taux de survie à 5 ans est très faible
Procédures
- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 5 traitements par ultrasons maximum 15 minutes sous anesthésie à raison d’un par semaine, - 5 injections intrapéritonéales d'immunothérapie à raison d’un par semaine dans l’abdomen, 30 secondes - 1 injection sous cutanée d’antidouleur dans l’abdomen (30 secondes) - Au maximum 14 pesées et mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de deux par semaine.
Impact sur les animaux
Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). Une injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut rarement entrainer une gêne à la locomotion. Les injections intrapéritonéales hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale gazeuse et un traitement aux ultrasons une fois par semaine, les ultrasons pouvant induire une brûlure au niveau de la tumeur. Le traitement par anti PD-1 n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris (pas de réaction auto immune).
Devenir
Suite à la procédure les animaux en études seront mis à mort pour les prélèvements de tumeurs soit 48h après le deuxième traitement soit en fin d’étude.
Remplacement
Plusieurs informations ont été données via des études de culture de cellules : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons. Les paramètres de traitement aux ultrasons ont été évalués par simulations informatiques. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux a été déterminé par un outil statistique et les résultats seront interprétés grâce à des tests statistiques.
Raffinement
Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Des points limites détectés via une grille de score permettront, en fonction des observations, la mises en place de mesures : -Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. -En prévision d’éventuelles brûlures cutanées à cause de la cavitation, les souris recevront une injection d’antalgique au préalable du traitement aux ultrasons. - Les animaux seront placés sur litière en cellulose pour éviter toute uclération, irritation ou nécrose des tumeurs des animaux, si malgré la litière suite au traitement une irritation est observée on appliquera en transcutané sur 7 jours de la crème Dermaflon pour soulager la brûlure. - En cas de douleur observée via les critères de la grille de scoring et via la palpation on administrera à nouveau selon la sévérité soit de la buprénorphine soit du paracétamol sur 48h. Si malgré le traitement antidouleur la douleur est toujours présente alors on euthanasiera les animaux. Si les tumeurs deviennent nécrotiques les animaux sont euthanasiés. Des prélèvements en cours d’étude et en point final (tumeurs) seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Tous les animaux présentant une prise tumorale à la randomisation seront intégrés dans l'étude pour pallier d'éventuelles pertes lors des anésthésies ou à cause de l'atteinte de points limites. Nous possédons l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi du modèle de cancer du pancréas ainsi que pour l’administration de traitements
Choix des espèces
La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. La C57Bl/6 est choisie car nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 7-8 semaines, 7 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature, et donc en action.