Cancers

900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 720 tuées à l'issue et 180 expédiées vers des laboratoires clients. Ce prestataire induit à la demande des tumeurs mammaires par injection de cellules cancéreuses, avec un suivi par imagerie, des traitements répétés et des prélèvements sanguins, puis la mise à mort pour analyses. Le porteur décrit une offre de modèles tumoraux facturée à des chercheurs extérieurs, justifiée par 400 animaux déjà utilisés lors d'une autorisation précédente. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace "l'animal entier" pour étudier la biodistribution d'un composé.

Objectifs

Ce projet a pour but de mettre en œuvre, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer mammaire et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.

Bénéfices attendus

Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.

Procédures

Induction de cancer mammaire : 1 seule injection par animal, cellules injectées sous anesthésie gazeuse dans le coussinet mammaire des souris. Cette procédure dure moins de 5 minutes. Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 9 semaines sous anesthésie générale soit 18 examens d’imagerie au maximum par animal dans une étude. Pour les techniques d’imagerie les plus longues, le temps est de 20 minutes maximum par examen. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 6 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse sur animal vigile. Il faut 30 secondes au maximum pour administrer un traitement. Au cours d’une étude, un animal recevra au maximum 30 traitements. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire volume maximal de 130μL(en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) pour une souris de 25g en alternant les joues gauche et droite .Il faut environs 30 secondes pour effectuer ce type de prélèvement et appliqué un point de pression avec un crayon hémostatique au point de collecte pour arrêter le saignement. On estime qu’un animal aura au maximum 9 prélèvements de sang sur 9 semaines d’étude.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus sont liés au développement d'une tumeur mammaire et éventuellement à l'apparition de foyers tumoraux secondaires (dans les ganglions lymphatiques, le sang, le foie, les poumons, le cerveau, et les os). Néanmoins, ces foyers, qui peuvent être détecé par imagerie de bioluminescence.apparaissent lorsque la tumeur primaire est déjà proche de l’atteinte d’un point limite (>2cm3 ou apparition de nécrose). Les dommages attendus sont donc essentiellement liés à la tumeur primaire. Nous mettrons en place un suivi ainsi que des points limites pertinents permettant d’anticiper toute douleur ou stress qui pourrait être provoqué chez l’animal. La douleur infligée par l’injection des cellules et réactifs pour l'imagerie et les traitements, correspond à celle d’une piqûre d’aiguille. On s’assurera auprès du client que les molécules sont déjà connues pour leur non toxicité. Les molécules nouvelles seront testées au préalable selon un projet spécifique pour vérifier la tolérance avant de débuter ce type d’études en modèle cancéreux. De plus, les souris seront suivies grâce à nos grilles de scoring pour surveiller l’apparition d’effet secondaire tels que la perte de poids, modification de la physiologie ou du comportement.

Devenir

Les animaux de 3 études (180 animaux) seront uniquement induits pour des tumeurs, hébergés dans nos locaux pendant 1 semaine minimum, le temps de leur récupération complète. Il n'y aura aucun acte d'imagerie. Ils pourront ensuite être fournis à des clients demandeurs de ce modèle pour des travaux expérimentaux réalisés dans leurs locaux. Nous leur fournirons la grille de scoring des animaux de la semaine précédent l'envoi dans leurs EU. Les animaux de 12 études ( 60 x 12 =720 animaux) seront mis à mort à l'issue de la procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour une autre étude.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer mammaires en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo. De plus nous justifions l’utilisation de 900 animaux sur 5 ans puisque lors des 3 dernières années dans une DAP similaire à présent expirée, nous avons utilisé 400 animaux pour des études clients qui ont d’ores et déjà prévu de tester des candidats médicaments très prochainement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre des techniques d’imagerie (bioluminescence, échographie, scanner, photoacoustique, imagerie radioisotopique, imagerie par résonnance magnétique, imagerie de fluorescence) qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.

Raffinement

Les animaux seront observés scrupuleusement et des points limites prédictifs (perte de poids >20%, nécrose de la tumeur, volume tumoral >2cm3, aspect général, physiologie clinique, locomotion) nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. De plus, durant les examens d'imagerie et l'induction du modèle tumoral dont la douleur est similaire a une piqure d’aiguille, les souris seront anesthésiées. Les symptômes potentiels liés au traitements sont principalement une légère perte de poids. Enfin, les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes, enrichies avec du celluron (Les souris utilisent chaque semaine ce petit cylindre de coton pour la fabrication d’un nid). Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

Certains types de tumeurs mammaires utilisées sont injectés à des modèles immunodéficients ce que l’on ne retrouve pas chez toutes les espèces mais quasiment uniquement chez la souris. Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines et murines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.

100 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses pour développer une carcinose du péritoine, un suivi tumoral par bioluminescence sous anesthésie, puis trois tests comportementaux que le porteur ne détaille pas, censés mesurer une "dépression". Elles sont tuées à J14 ou J28 pour analyses, un point limite de mise à mort étant fixé à 20 % de perte de poids. Le porteur affirme que le modèle murin ne peut être remplacé et espère qu'un antidépresseur pourrait freiner le développement des carcinoses chez les patients.

Objectifs

Un patient porteur d’un cancer va exprimer des troubles psychologiques. Le fait de se savoir malade d’une pathologie mortelle à court terme, d’y associer une possible prédisposition familiale, ou une exposition à des toxiques, va aussi affecter la thymie (siège des passions et de l’humeur) des patients. Une des manifestations est la dépression. Pour les cancers qui sont métastatiques au péritoine, nommés carcinose, la dépression est fréquente, 30% des carcinoses coliques et 70% des carcinoses ovariennes selon certaines publications. L’objectif de notre étude est d’évaluer cette dépression chez la souris développant une carcinose péritonéale et d’évaluer l’effet des traitements antidépresseurs ou/et chimiothérapie sur le développement de la carcinose et de la dépression.

Bénéfices attendus

Si l'utilisation d'un antidépresseur diminue la dépression des animaux et le développement de la carcinose péritonéale, nous pourrions mettre en évidence un nouveau type de traitement non invasif qui diminuerait le développement des carcinoses chez les patients. Aujourd’hui les patients qui reçoivent un traitement antidépresseur lors de leur soins, le reçoive souvent à l’initiative de leur médecin généraliste et non de l’oncologue et cela comme un traitement visant à améliorer leur qualité de vie et non la durée de leur survie.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes) qui sera associée associé à une chimiothérapie (3 à 4 fois 30 secondes) ou à un anti-dépresseur (dilué dans l’eau de boisson pendant la durée de l’expérience). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 4 fois 20 minutes pour les C57BL/6) après une injection de luciférine (3 x pour les Balb/c (4X pour les C57BL/6) 0,1ml pour 10g, poids des souris). A J14 pour les Balb/c et à J28 pour les C57BL/6, les souris suivront 3 tests comportementaux (3 x 15 min par souris répétées deux fois donc 6 x 15 min). Ces tests comportementaux ont pour objectif la mesure de la dépression des animaux.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer une carcinose péritonéale et nous observerons si le traitement par un antidépresseur va diminuer le développement tumoral au même titre que la chimiothérapie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à J28 post-injection des cellules cancéreuses pour des analyses post mortem.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin car un comportement dépressif corrélé à un développement de la carcinose péritonéale ainsi qu’une réponse du comportement à un anti-dépresseur et/ou une chimiothérapie ne peut être évalué in vitro.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles, en nombre de nodules ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, le suivi par bioluminescence d'un même animal tout au long de l'expérience permet de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests Student et Anova en comparant le groupe CTRL avec les groupes traités par la chimiothérapie ou l'antidépresseur.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement. Lors du suivi de la croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse et avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie et seront ensuite sous anesthésie générale Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids (>20%), la déshydratation, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante (signal de bioluminescence étendu à tout l’abdomen) mais surtout de confirmer le développement de la carcinose et ne pas inclure des animaux non malades dans l’expérience.. Les cellules utilisées exprimant la luciférase, la bioluminescence correspond à l’émission de lumière à partir du substrat injecté en intrapéritonéale des souris, la luciférine, lue par un luminomètre. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Les CT26 correspondent à une lignée de cellules cancéreuses du côlon murin qui est issue des Balb/C alors que les ID8 correspondent à un lignée de cellules cancéreuses ovarienne murines qui est issue des C57BL/6. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées de façon répétée par une génotoxine bactérienne, elles subissent des injections, des imageries et des prélèvements de sang étalés sur six à dix-huit mois, pour tenter de démontrer que cette toxine cause un cancer du foie. Le porteur mentionne une perte de poids liée à l'inflammation hépatique et une fatigue liée aux prélèvements répétés. Il justifie l'euthanasie par le prélèvement des organes et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour reproduire ce processus.

Objectifs

Nous sommes fréquemment infectés par des bactéries qui produisent des toxines qui endommagent l’ADN de nos cellules et seraient à l’origine de cancers digestifs. Parmi ces toxines, la génotoxine CDT est répandue chez de nombreuses bactéries. L’objectif est de démontrer que cette génotoxine induit le cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de démontrer le rôle direct et causal de la génotoxine dans la transformation maligne, démontrant que l'infection chronique et/ou répétée par des bactéries productrices de cette génotoxine cause le cancer.

Procédures

L'ensemble des gestes sera réalisé sur animaux anesthésiés. Injection dans la circulation sanguine (inférieur à 3 minutes) : une seule fois pour 100 animaux, tous les 2 mois environ pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux). Imagerie nécessitant une injection dans le péritoine (inférieur à 10 minutes) : 2 fois par semaine pendant 2 semaines (40 animaux), 1 fois par semaine pendant 1 mois (20 animaux), 2 mois (20 animaux) ou 4 mois (20 animaux), 2 fois par mois pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux). Prélèvement sanguin (inférieur à 3 minutes) : 2 fois par semaine pendant 2 semaines (40 animaux), 1 fois par semaine pendant 1 mois (20 animaux), 2 mois (20 animaux) ou 4 mois (20 animaux), 2 fois par mois pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux).

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au développement d’une inflammation au niveau du foie et voir d’une carcinogénèse. Fatigue liée aux prélèvements sanguins répétés, dans ce cas les prélèvements seront davantage espacés.

Devenir

Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.

Remplacement

Nous souhaitons voir les effets d’une infection longue et répétée de bactéries productrices de la génotoxine CDT. Notre hypothèse est que la CDT induit le développement de cancer hépatique. L’étude chez la souris est indispensable pour permettre de voir le développement éventuel d’un cancer au niveau hépatique après des mois d’infection constante à la CDT. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour mimer ce processus.

Réduction

L'imagerie de bioluminescence nous permet de faire un suivi longitudinal sur un même animal. Nous sommes également capables de réaliser des bilans hépatiques à partir de petits volumes de sang au cours du temps, sur un même animal. Ces 2 procédés nous permettent de réduire le nombre d'animaux. Des analyses seront aussi effectuées sur les tissus récoltés.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de woodwoll). Une mise en place de points limites évalués par une grille de scoring spécifique a été mise en place pour le suivi des souris. Les souris seront pesées 2 fois par semaine, en cas de perte de poids nous mettrons de la nourriture humidifiée dans la litière et les souris seront pesées quotidiennement durant les prochaines 48H. Si la perte de poids persiste les souris seront euthanasiées. Afin de pallier à une éventuelle déshydratation liée aux prélèvements sanguins, du sérum physiologique sera administré à l’animal après chaque prélèvement.

Choix des espèces

De par notre expérience l’inflammation hépatique provoquée par une infection bactérienne se fait très bien chez la souris. Le modèle souris est également un modèle de choix vis-à-vis de la technique de suivi en imagerie que nous avons mis en place. Nous travaillerons avec des jeunes adultes car nous souhaitons garder les animaux jusqu’à 18 mois suivant les lots. Le cancer touchant les 2 sexes, nous travaillerons avec des mâles ou des femelles.

24 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée d'organoïdes cérébraux humains, puis une ouverture de la cage thoracique et une exsanguination sous anesthésie, avant le prélèvement des greffons. Le porteur avance que valider ces organoïdes vascularisés pourrait à terme "réduire fortement l'utilisation d'animaux" pour l'étude des tumeurs cérébrales, un bénéfice conditionné à la réussite du modèle. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour vérifier la vascularisation, faute de circulation sanguine hors d'un animal vivant.

Objectifs

Les organoïdes cérébraux sont composés de différents types de cellules (neurones et cellules gliales) d’origine humaine constituant le cerveau. Nous développons une nouvelle génération d’organoïdes cérébraux qui sont pourvus également de vaisseaux sanguins, car la vascularisation joue un rôle essentiel dans la physiopathologie du cerveau. En particulier, dans le contexte de tumeurs cérébrales, la vascularisation favorise la survie et la croissance tumorale. Ce projet a pour but de valider que la vascularisation de ces nouveaux organoïdes est fonctionnelle. Cette validation sera obtenue par transplantation des organoïdes à des animaux. Ce nouveau modèle permettra d’étudier les mécanismes de la croissance des tumeurs cérébrales et de développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de vérifier que notre modèle d’organoïde comporte une vascularisation fonctionnelle. La présence de vascularisation est importante dans le cadre des études des tumeurs cérébrales car elle joue un rôle important dans le développement tumoral. Si la vascularisation des organoïdes est fonctionnelle, de nombreuses expériences sur les cancers cérébraux et, en particulier, les tests des médicaments anticancéreux ne nécessiteront plus l’utilisation d’animaux. Ce modèle réduira donc fortement l’utilisation d’animaux ; en particulier dans le cadre des études sur les tumeurs cérébrales comme le glioblastome.

Procédures

L’opération de greffe sous-cutanée des organoïdes cérébraux comporte 4 étapes (injection d’un antalgique, une anesthésie gazeuse, une incision cutanée et un point de suture) pour une durée totale de moins de 15 min/souris. Un mois après la greffe, un produit fluorescent sera administré sous anesthésie afin de colorer les vaisseaux sanguins. Cette opération comporte 5 étapes (injection d’un antalgique, injection d’anesthésique, ouverture de la cage thoracique, perfusion de la solution fluorescente et exsanguination) cette opération est suivie de la mort de l’animal. L’opération dure 15-20 min (sans compter la période de 30 min après l’injection d’antalgique);

Impact sur les animaux

Les opérations de greffe sous-cutanées ne sont pas très invasives et devraient n’entraîner que des perturbations physiologiques et cliniques mineures. Néanmoins, un stress opératoire et une douleur post-opératoire sont attendus mais cette dernière sera limitée par une pharmacologie adaptée. L’anesthésie pourrait entraîner une détresse respiratoire voire un arrêt cardio-respiratoire et ceux-ci seront surveillés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les organoïdes afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’existe pour vérifier que la vascularisation des organoïdes est effective. Les expériences de transplantation permettront à la vascularisation de l’organoïde de se « connecter » à la vascularisation de l’hôte grâce à une néo-vascularisation. En revanche, cette dernière ne peut être obtenue que si l’animal est vivant et permettre une circulation sanguine dans l’organoïde.

Réduction

La procédure sera réalisée sur un total de 6 lots d’animaux afin d’analyser des organoïdes d’âges différents obtenus avec deux lignées de cellules souches pluripotentes. Les analyses histologiques révèlent que la grande majorité des organoïdes que nous avons obtenus à ce jour présentent des structures ressemblant à des vaisseaux dès un mois. Ainsi, nous testerons deux groupes d’âge : organoïdes jeunes (1 mois) et organoïdes âgés (4-6 mois) pour les 2 lignées dont nous disposons. Par ailleurs, nous avons estimé qu’un nombre de quatre animaux par lot d’organoïdes serait suffisant pour appréhender la variabilité expérimentale. Ainsi, un maximum de vingt-quatre souris devra être utilisé pour ce projet (6 lots x 2 ages x 2 lignées). Les expériences seront réalisées de façon séquentielle afin d’arrêter le protocole si cela est suggéré par les premiers résultats.

Raffinement

Un protocole d’anesthésie/analgésie sera mis en place pour les greffes d’organoïdes. Par la suite, une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier l’état clinique des animaux et les critères d’arrêt de souffrance sont prédéfinis.

Choix des espèces

De nombreuses études ont montré la néovascularisation de greffons ou d’organoïdes humains lorsqu’ils sont greffés chez la souris adulte. Les xénogreffes seront réalisées chez des souris adultes âgées de 2 mois. La formation de nouveaux vaisseaux sanguins, ou néovascularisation, est toujours observée chez la souris adulte.

6500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus porteurs de tumeurs disséminées de type leucémie ou métastases, souvent après xénogreffe de cellules humaines chez des animaux immunodéprimés, ils subissent irradiations, administrations répétées, prélèvements de sang et de moelle osseuse et séances d'imagerie, pour évaluer des candidats médicaments avant leur passage chez l'humain. Le porteur indique que le développement tumoral induit une perte de poids et des difficultés locomotrices, et prévoit une trentaine d'études par an. Il décrit les modèles de reconstruction en 3D comme "marginaux" et aux résultats "difficilement transposables à l'homme", concluant au caractère "indispensable" du recours aux rongeurs.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 2 heures). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 minute) Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 1 minute) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : - Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Technique d’imagerie, potentiellement répétée: sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal: -Identification des animaux -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou radiothérapie -Suivi des animaux par imagerie Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang ou de moelle osseuse en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : Le développement tumoral induira une perte de poids et des difficultés locomotrices.

Devenir

Les animaux étant porteur de tumeur ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidatsmédicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individu. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 30 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisée dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. En général, en oncologie et du fait de la randomisation, le nombre d’animaux greffés est supérieur au nombre d’animaux utilisés randomisés dans chaque groupe. Pour les modèles disséminés ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Au-delà, une dérogation sera demandée et le modèle sera expertisé pour évaluer si plus de 10% des animaux sont réellement nécessaires. Dans tous les cas, il sera recommandé l’utilisation d’un minimum de résidus

Raffinement

Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. L’induction tumorale se fera sous anesthésie. avec traitement antalgoique adaptée. L’induction tumrale fera l’objet d’une surveillance et de soins post induction seront pratiqués si nécessaires. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse, les animaux en plus d’être anesthésiés recevront une antalgie adaptée. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations du comité éthique en termes de volume, d’anesthésie, de fréquence et d’antalgie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux Dans toutes les cages, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les protocoles, on leur greffe des cellules tumorales sous la peau ou dans la prostate par chirurgie, ou on déclenche des tumeurs par injections de tamoxifène, avant des séries d'injections répétées et des séances d'imagerie sous anesthésie s'étalant jusqu'à dix-huit mois. Le porteur indique que les souris développent des tumeurs et une dégradation progressive de leur état général, encadrées par des points limites. Le projet vise à confirmer chez la souris le rôle de la signalisation calcique dans le cancer de la prostate et à tester un anticorps, l'application chez l'humain restant présentée comme une perspective.

Objectifs

L’objectif du projet consistera à permettre une validation in vivo de nos résultats obtenus in vitro à savoir : -la signalisation calcique est impliquée dans la croissance tumorale en réponse à une stimulation du système nerveux parasympathique -la signalisation calcique est impliquée dans la résistance aux traitements chimiothérapeutiques -la signalisation calcique est impliquée dans la formation des métastases osseuses du cancer de la prostate -la signalisation calcique est une cible thérapeutique potentielle in vivo.

Bénéfices attendus

Les enjeux en matière de cancérologie sont importants car nous avons identifié in vitro que la signalisation calcique un rôle central dans plusieurs mécanismes clés de la cancérogenèse (prolifération, angiogenèse, métastase, apoptose, résistance aux chimiothérapies…). Nous devons confirmer ces données obtenues in vitro par des études chez la souris. Une autre application importante de ce projet sera l’étude de l'efficacité d'un anticorps monoclonal ciblant spécifiquement la signalisation calcique des cellules tumorales afin de stopper la progression tumorale. L’anticorps testé pourra être modifié et utilisé chez l’homme comme thérapie seule ou en combinaison contre les cancers prostatiques avancés aujourd’hui incurables.

Procédures

Procédures 1,2 et 5: 1 Anesthésie à l'isoflurane (10 min) suivie d'1 injection sous-cutanée de cellules tumorales. Une fois par semaine (pendant 9 semaines): traitements avec les chimiothérapies ou solvant seul (1 injection intra péritonéale/sem soit 9 IP) et/ou 1 administration per os/sem de Rucaparib (ou solvant seul) (soit 9 PO) et/ou 1 injection IP de l'anticorps monoclonal ou son peptide contrôle (à renouveler tous les 3 jours) (soit 21 IP). Procédure 3 : 1 Anesthésie par isoflurane avant la procédure chirurgicale (implantations dans la prostate de cellules cancéreuses humaines à l'aide de seringues à insuline). Puis, chaque semaine (durée étude 25 semaines), la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à bioluminescence : 1 injection (100 µL) IP de luciférine (25 IP au total) puis 1 Anesthésie à l’isoflurane (25 AG au total) puis imagerie. A partir de la semaine 4 et pendant 21 semaines, traitements appropriés comme indiqué (anticorps ou anticorps-CTL ; à renouveler tous les 3 jours soit 49 IP; docetaxel 1 IP/sem soit 21 IP; inhibiteur de PARP 1 IP/sem soit 21 IP ; docetaxel+PARP 1 IP/sem soit 21 IP). L’influence du système nerveux périphérique sera également évaluée avec un antagoniste des voies cholinergiques/muscariniques (darifenacin (Chrm3)). A partir de la semaine 4, les souris concernées recevront une IP journalière de darifenacin à 2.5 mg/kg dans du PBS ou du PBS seul (soit 147 IP). Procédure 4: durée de 18 mois. 5 IP intrapéritonéales consécutives à la semaine 2 (souris âgées de 15 jrs) pour l'administration du tamoxifène ou du solvant seul (huile de maïs). A partir de la semaine 4, les souris concernées recevront une IP journalière de darifenacin à 2.5 mg/kg dans du PBS ou du PBS seul (476 IP au total). Pour toutes les souris de la procédure 4: 36 anesthésies par isoflurane (pour chaque souris tous les 15 jours) afin de réaliser un suivie par imagerie petit animal à rayon X de l'apparition des métastases osseuses.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris concerneront la douleur et la maladie puisque les souris vont développer des tumeurs selon trois approches : xénogreffes sous cutanées, xénogreffes orthotopiques protatiques ou tumeurs spontanées. Pour les xénogreffes sous cutanées (Procédures 1, 2 et 5), une injection souscutanée de cellules tumorales sera réalisée au niveau du dos sous anesthésie générale. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements (chimiothérapies, anticorps) que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Pour les xénogreffes orthotopiques protatiques (Procédure 3), une injection intra-prostatique de cellules tumorales sera réalisée également sous anesthésie générale. Un acte chirurgical sera nécessaire. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Cependant, chaque semaine, la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à bioluminescence (non invasif) et une anesthésie générale à l’isoflurane sera nécessaire. Enfin, en ce qui concerne les tumeurs spontanées (Procédure 4), les souris recevront une administration de tamoxifène par injection intrapéritonéale une fois toutes les 24 heures pendant 5 jours consécutifs afin d’induire la délétion d’ORAI3 spécifiquement dans la prostate. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Cependant, chaque semaine, la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à rayon X (non invasif) et une anesthésie générale à l’isoflurane sera nécessaire. En ce qui concerne les nuisances ou effets indésirables attendus et engendrés par suite des expérimentations (conséquences, phénotype), les souris vont développer des tumeurs et donc des douleurs pourront apparaître avec une détérioration progressive de l’état générale. Ainsi, pour chaque procédure des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum, sans remettre en cause les résultats du projet sont présentés.

Devenir

Tous les animaux des différents protocoles seront euthanasiés sans douleur à la fin de chaque procédure expérimentale afin de récupérer les tumeur pour réaliser des analyses omics.

Remplacement

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. De même, l’influence de l’innervation qui est un paramètre que nous souhaitons examiner n’est pas reproductible in vitro. La délétion de manière inductible et spécifique dans les cellules épithéliales de la prostate permettra d’évaluer précisément le rôle de la protéine ORAI3 au sein d’un microenvironnement composé de différents type cellulaires (cellules nerveuses, stromales, immunes) dans différents contextes physiologiques et physiopathologiques. De plus, l’utilisation d’animaux d‘expérimentation comme la souris est particulièrement pertinente dans le cadre de la recherche en cancérologie afin de confirmer in vivo l’intérêt de nouvelles associations de chimiothérapies ou l’utilisation d’un anticorps monoclonal thérapeutique dont nous avons montré in vitro l'efficacité

Réduction

Afin de réduire la variabilité des résultats, l'environnement des souris et leur statut sanitaire seront contrôlés. Des tests statistiques appropriés ont été utilisés afin de déterminer le nombre nécessaire et suffisant de souris par lot. La randomisation sera également appliquée afin de supprimer certains risque de biais. Au total, ces mesures permettent de réduire au maximum le nombre des animaux utilisés pour les procédures expérimentales.

Raffinement

Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans des cages adaptées en termes de surface et 3 enrichissements seront prévus (tunnel, coton, igloo rouge) pour réduire le stress des animaux. Aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L'environnement des animaux, l'équipement, système d’abreuvoir, la qualité de l’eau, la nourriture et la litière seront contrôlés régulièrement. L’état de bien être des souris sera également évalué quotidiennement par l’observation des signes physiques, physiologiques et comportementaux (perte de poids, aspects du pelage, morsures...). Lors de chaque anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. De plus, un gel oculaire (à base de vaseline) est appliqué au niveau des yeux des animaux pour éviter tout dessèchement de la cornée à chaque anesthésie. Nous allons utiliser des analgésiques et/ou des anesthésiques locaux adaptés afin de prévenir et/ou réduire au maximum la douleur chez les animaux.

Choix des espèces

L’innervation du cancer de la prostate est un paramètre que nous souhaitons examiner et n’est pas reproductible in vitro. Le modèle murin est aujourd’hui validé pour l’étude de l’innervation du cancer de la prostate. Les protocoles seront réalisés avec des souris mâles âgées de 5 semaines. En effet, pour les expériences utilisant des souris immunodéprimées (nude) il est connu que les souris d'un âge plus avancé peuvent récupérer des lymphocyte T par rapport aux souris jeunes. Dès lors, pour les autres souris du projet et afin de pouvoir comparer les différents groupes nous utiliserons pour tout le projet des souris âgées de 5 semaines. Pour la procédure3: des souris plus âgées seront utilisées (8 semaines car il nous faut attendre la maturité sexuelle des mâles soit 8 semaines pour réaliser les injections intra-prostatiques). Pour la procédure 4: le développement tumorale sera induit par injections de tamoxifène sur des souris âgées de 15 jours et l'étude de survie durera 18 mois.