Cancers

679 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome humain, sous la peau ou dans le tibia, puis des traitements répétés par gavage, injection ou voie intraveineuse et une imagerie hebdomadaire pendant trois à six mois. Le porteur décrit une douleur aux sites d'injection, une perte de poids et une mobilité réduite à mesure que la tumeur grossit, et programme la mise à mort dès l'atteinte de points limites. Il reconnaît utiliser des lignées cellulaires in vitro mais juge le modèle murin "indispensable", les retombées pour les patients atteints de lymphome restant renvoyées "à terme".

Objectifs

Les lymphomes NK/T extraganglionnaires de type nasal sont des entités rares de lymphomes T périphériques associés au virus Epstein Barr. Ils se localisent le plus souvent au niveau de la sphère ORL mais peuvent également atteindre d’autres organes dans le cadre de formes disséminées extranasales. La survie globale à 5 ans des formes localisées est actuellement de l’ordre de 70%, alors que celle des formes disséminées ne dépasse pas les 40%. Ceci justifie le développement de nouvelles approches thérapeutiques basées sur des thérapies plus ciblées incluant des approches d’immunothérapie. Les thérapies ciblées permettent en effet une meilleure tolérance au traitement par la réduction des effets indésirables toxiques mais également une meilleure éradication de la tumeur. Elles peuvent s'utiliser seules ou en association avec la chimiothérapie conventionnelle. La compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des lymphomes NK/T est essentielle pour identifier et tester de nouvelles cibles pharmacologiques afin de compléter l’arsenal thérapeutique du clinicien et améliorer significativement les chances de guérison et de survie des patients. Plusieurs molécules candidates ont été identifiées grâce à des données préliminaires obtenues dans des modèles in vitro. Pour certaines d’entre elles, leur efficacité semble être modulée par la présence d’une mutation dans un gène d’intérêt. Ce projet a donc pour objectif de valider l’efficacité de ces molécules dans des modèles murins in vivo. Certaines molécules ont une action cytotoxique directe sur les cellules tumorales et peuvent donc être testées dans des modèles murins immunodéficients alors que d’autres ont pour mécanisme d’action une modulation de l’immunité anti-tumorale et doivent donc nécessairement être évaluées dans des modèles immunocompétents. Le projet se déroulera en deux étapes : -1ère étape : générer les modèles murins appropriés, qu’ils soient immunodéficients ou immunocompétents -2ème étape : tester l’efficacité des thérapies candidates dans ces modèles en évaluant l’impact du statut mutationnel pour notre gène d’intérêt.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité d'inhibiteurs pharmacologiques et d’immunothérapies déjà disponibles dans un modèle préclinique. L’objectif à terme sera de proposer un rationnel d’utilisation de ces médicaments dans les futurs protocoles cliniques de prise en charge des lymphomes NK/T.

Procédures

>Injection des cellules tumorales humaines (lignées) en sous-cutané : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 640 animaux >Injection des cellules tumorales humaines (cellules primaires) par voie intratibiale : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 39 souris >Prélèvement sanguin jugal : • souris vigile • bimensuelle puis hebdomadaire si présence de cellules tumorales circulantes, pendant 3 à 6 mois • durée : 1 min • 49 souris >Imagerie in vivo par bioluminescence : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • hebdomadaire pendant 3 à 6 mois • durée : 30 min • 679 souris >Administration de molécules thérapeutiques par gavage oral : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour pendant 14 jours • durée : 30 secondes • 60 souris >Administration de molécules thérapeutiques par injection intrapéritonéale : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour (ou tous les deux jours) pendant 14 jours (5 jours / semaine) • durée : 30 secondes • 450 souris >Administration de molécules thérapeutiques par voie intraveineuse caudale : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour pendant 14 jours (5 jours / semaine) • durée : 30 secondes • 180 souris >Transfert adoptif de lymphocytes T OT-1 par voie rétroorbitaire : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 120 souris

Impact sur les animaux

Douleur aux sites d’injection des cellules tumorales (maxi : 3 jours) / Perte de poids / Mobilité réduite à cause de la croissance tumorale (1 semaine) / Stress lié à l’administration par gavage oral (14 jours)

Devenir

Mise à mort pour tous les animaux de toutes les procédures lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : • Atteinte des points limites (cf grille de score établie pour chaque procédure) • Indication à une greffe dans des receveurs secondaires • Absence de prise de greffe au-delà de 3 ou 6 mois (selon les procédures)

Remplacement

Compte tenu du coût des études cliniques chez l’homme et de la réglementation actuellement en vigueur, une étape intermédiaire de vérification des hypothèses dans un modèle préclinique est indispensable. Dans le cadre de notre projet : •Les cellules tumorales de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des molécules d’intérêt. De plus, ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour pouvoir mener des expériences pharmacologiques in vitro. •Les lignées cellulaires n’étant pas le reflet exact de la biologie des hémopathies, il est indispensable de tenter d’amplifier les cellules primaires via un modèle murin afin d’objectiver la pertinence thérapeutique d’une drogue en tenant compte de sa pharmacodynamie et pharmacocinétique. •Pour évaluer la réponse immune anti-tumorale et de sa modulation par les immunothérapies, le rôle du micro-environnement tumoral est absolument majeur dans la réponse au traitement, une dimension qui ne peut naturellement pas être appréciée dans les études in vitro / ex vivo. Pour toutes ces raisons, la souris reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des lymphomes NK/T et pour tester l’efficacité in vivo de nouvelles thérapeutiques, et ce, avant de pouvoir les proposer aux humains dans le cadre d’essais cliniques.

Réduction

Méthologie de réduction du nombre des animaux nécessaires à l’expérimentation : •Evaluation pharmacologique in vitro approfondie sur lignées cellulaires pour optimiser les concentrations de drogues et pour sélectionner un nombre restreint de drogues d’intérêt (déjà réalisé) •Quantification de la viabilité cellulaire avant toute injection dans les souris •Optimisation du matériel issu de xénogreffe par productions multiples •Réduction du nombre d’animaux au minimum, après estimation des effectifs afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement recevables. •Utilisation d’un même groupe de souris contrôles traitées par placebo pour évaluer l’efficacité de plusieurs drogues administrées selon la même voie •Utilisation de l’imagerie par bioluminescence : ce système d'imagerie optique préclinique permet d’évaluer la croissance tumorale. Des signaux de bioluminescence et/ou de fluorescence peuvent être suivis de manière longitudinale ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux. Un suivi quotidien des souris sera effectué dans les 3 jours suivant l’injection des cellules tumorales. En cas de signes évocateurs d’infection ou de douleurs au site d’injection, du meloxicam sera administré. Nous avons également défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi bihebdomadaire de ces points limites permettra de minimiser la douleur des animaux en programmant leur mise à mort si nécessaire. Les procédures seront par ailleurs raffinées par un enrichissement des cages d'animaux. Les cages seront enrichies à l’aide de coton et de cabanes, pour répondre aux besoins de nidification et ludiques des souris. Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Les souris NSG seront hébergées dans une zone SOPF, en portoirs ventilés et manipulées sous hotte ou PSM, leur permettant ainsi de ne pas exprimer de phénotype dommageable. Les injections de cellules en sous-cutané, rétroorbitaire ou intratibiale, les prélèvements sanguins et l’imagerie par bioluminescence nécessaires au suivi seront réalisés sous anesthésie. Concernant les traitements nécessitant un gavage oral, les souris seront habituées progressivement aux procédures de gavage avant la phase de traitement.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes ont été décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des hémopathies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Concernant l’évaluation de la réponse immune anti-tumorale, le modèle de greffe dans des souris contrôles a déjà été validé dans la littérature. Pour les souris immunodéficientes : souris adultes entre 8 et 12 semaines, âge durant lequel la probabilité de prise de greffe est maximale selon les données de la littérature et l’expérience du laboratoire. Pour les souris contrôles : souris adultes entres 6 et 8 semaines, âge conforme aux données de la littérature

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont surveillées et pesées pour suivre l'apparition de tumeurs spontanées de l'endomètre, de la peau, des poumons ou du foie, avant des analyses post-mortem. Le porteur indique que la souffrance modérée découle de l'apparition des tumeurs et non des manipulations, limitées à la contention. Il présente un modèle vivant comme "indispensable" pour confirmer qu'un variant génétique identifié chez des patientes prédispose au cancer, et prévoit de tuer les mâles reproducteurs pour stocker leur sperme.

Objectifs

Chez des patientes présentant des caractéristiques évoquant un syndrome de prédisposition au cancer de l’endomètre, un variant spécifique d’un gène, a été identifié. Ce gène n’a jamais été précédemment impliqué dans la prédisposition au cancer chez l’Homme. Ce variant est absent dans la population générale. La surexpression du gène étudié est un facteur de mauvais pronostic dans plusieurs types de cancers (cancers du sein, de l’endomètre, du poumon et du foie). Par ailleurs, une étude a montré un effet tumorigène spontané au sein d’un modèle murin sur-exprimant le gène d’intérêt. Le variant identifié est situé dans un domaine de la protéine qui pourrait diminuer sa dégradation. Par conséquent ce dérèglement pourrait jouer un rôle dans la formation des tumeurs. Notre hypothèse est que le variant de ce gène conduit à une stabilisation de la protéine qui a un rôle essentiel dans le la machinerie de division des cellules. Ainsi, ce variant pourrait prédisposer à la survenue de cancers. L’objectif de ce projet est de confirmer le caractère pathogène du variant identifié chez des patientes, c’est-à-dire montrer qu’il est causal d’un nouveau syndrome de prédisposition tumorale. Un modèle murin porteur de ce variant est utilisé pour démontrer une prédisposition au développement de tumeurs. Par ailleurs, la compréhension du mécanisme de tumorigenèse associé à cette variation de gène, jamais décrite, présente un intérêt scientifique majeur.

Bénéfices attendus

Le variant et le gène impliqué n’ont jamais été décrits comme pouvant conduire à une prédisposition au développement de tumeurs ou de cancers chez l’Homme. Il y a donc un bénéfice direct pour les patients porteurs à confirmer le caractère délétère du variant pour permettre un diagnostic adapté. A plus long terme, l’analyse des tumeurs permettra sur le plan scientifique de mieux comprendre les mécanismes de la tumorigenèse associés à l’hyperactivation de cet oncogène, voire à tester des approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront uniquement observés et pesés pour vérifier le développement de tumeurs potentielles.

Impact sur les animaux

Des tumeurs sont susceptibles de survenir au niveau de l’endomètre ou bien la peau, les poumons ou le foie. Des méthodes non invasives seront utilisées pour évaluer l’apparition de ces tumeurs. Les nuisances expérimentales se limiteront aux stress de la contention et de la manipulation des animaux et les nuisances modérées sur les animaux seront donc la conséquence de l’apparition des tumeurs

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

La variation génétique identifiée a été caractérisée in vitro. Après confirmation du phénotype tumoral associé à la modification génétique testée, l’analyse des tumeurs développées sera une étape importante dans la compréhension du mécanisme de développement tumoral associé. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement auquel est soumis la cellule contenant la mutation. Un modèle vivant intégré est donc indispensable pour étudier les interactions entre la tumeur et ses organes cibles mais également avec l’organisme dans sa totalité. Ces modèles vont nous permettre d'étudier le développement de la maladie en essayant de mimer et comprendre leur mécanisme oncogénique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé grâce à des outils statistiques. Par ailleurs, les mâles reproducteurs seront mis à mort afin de récupérer leur sperme en vue du stockage long terme de cette lignée et réduire ainsi le nombre d’animaux.

Raffinement

Le présent projet inclut uniquement une surveillance des animaux avec un suivi de croissance tumorale (si développement de tumeurs) par observation et pesée des souris. Aucune manipulation invasive n’est prévue. Nous n’anticipons pas de phénotype dommageable pour les souris sauvages mais pour les souris mutées on attend un développement de tumeurs spontanées. Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront administrés. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce souris a été fait pour plusieurs raisons : La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l'Homme, Le gène étudié est présent dans les deux espèces et l’acide aminé muté est également identique entre les 2 espèces, La souris est un modèle classique pour les modifications génétiques et est pertinent pour l’étude de la prédisposition génétique au cancer. Jeunes souris sevrées puis adultes

3240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs, elles reçoivent des agents d'imagerie et sont soumises à des séances d'imagerie sous anesthésie, jusqu'à huit par animal sur sept jours, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la croissance tumorale peut gêner les mouvements et provoquer une cachexie, et que le suivi s'arrête à un volume de tumeur défini comme point limite. Il affirme que l'imagerie divise par deux le nombre d'animaux et qu'aucun test in vitro ne prédit la biodistribution, pour sélectionner des produits de diagnostic et de traitement du cancer.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer les propriétés pharmacocinétiques (adsorption, distribution, métabolisme et excrétion) d'agents d'imagerie diagnostique et thérapeutique dans le domaine de l'oncologie préclinique. Le développement de ces nouveaux agents est nécessaire pour faire progresser le diagnostic et le traitement du cancer. Dans un premier temps, les composés seront évalués sur des cellules (in vitro) pour connaître leurs propriétés de base. Cependant, il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, et certainement pas sa pharmacocinétique, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent. Par conséquent, pour s'assurer que les produits nouvellement développés présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables, ils seront d'abord testés in vivo sur de petits rongeurs.

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer le diagnostique en étant plus précoce mais aussi plus spécifique, afin d’adapter au mieux le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables. Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de sélectionner les produits d'imagerie diagnostique et thérapeutique les plus prometteurs sur la base de leurs propriétés pharmacologiques chez les petits rongeurs. Ceux-ci seront ensuite sélectionnés pour un développement plus approfondi, ce qui dépasse le cadre de ce projet. Les autres candidats, moins prometteurs, seront écartés et ne seront pas utilisés dans de futures études. En outre, les produits prometteurs (basés sur des données obtenues précédemment) pourront être testés dans différents modèles de tumeurs afin de déterminer leurs propriétés pharmacocinétiques dans ces modèles précliniques. Cela nous permettra de choisir le modèle de souris le plus optimal pour des études ultérieures d'efficacité ou de thérapie et d’utiliser le moins de souris possible dans ces études.

Procédures

- Observation des souris (poids, santé générale) : toutes les souris, sur des animaux vigiles, deux fois par semaine. Durée : quelques secondes par souris - Injection d'un agent d’imagerie seul ou avec compétiteur : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Imagerie : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, au maximum huit points d'imagerie sur une période de sept jours après l'injection de l'agent d’imagerie. Selon l'agent d'imagerie utilisé, différentes techniques peuvent être employées : Tomographie par émission de positons (TEP), imagerie par résonance magnétique (IRM), imagerie optique ou une combinaison de différentes techniques, telles que par exemple TEP/IRM, TEP/tomodensitométrie (CT) ou Tomographie par émission monophotonique (SPECT)/CT. Durée : maximum 60 minutes d’anesthésie - Prélèvement de sang : sur animaux anesthésiés, au maximum 2 fois. 10 minutes maximum d’anesthésie - Euthanasie et prélèvement des différents organes : toutes les souris, les souris seront profondément anesthésiées avant que la procédure n'ait lieu, dernière expérience.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait avoir des effets négatifs sur les animaux, comme une gêne des mouvements de l’animal ou des pertes de poids (cachexie). L'évolution de la taille de la tumeur sera donc suivie de près et l'étude sera terminée lorsque les tumeurs auront atteint la taille mentionnée dans les points limites. L’état général de l’animal ainsi que son poids seront aussi suivis et un complément alimentaire sous forme de gel pourrait être fournis pour limiter les impacts. La majorité des procédures (injection [intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale], prélèvements de sang et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant la douleur et l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Peu ou pas d'effets indésirables dus à l'injection du traceur sont attendus (les doses de traceurs sont très faibles).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été, si possible,au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou de tissus sont impliqués. En cas d’observation d’effet secondaire lié à l’injection intraveineuse du traceur, l’étude sera stoppée. La biodistribution réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les nouveaux agents seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo. Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide de calculs statistiques. En comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant. . L'imagerie permet une diminution par environ 2 du nombre d’animaux en comparaison d'une étude n'utilisant pas l'imagerie.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection, prélèvements et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. . Les expériences sont menées, dans une très large majorité sur des animaux pour lesquels le volume de la tumeur n’excède pas 1000-1200 mm3 (plus rarement, il est toutefois possible d’inclure des animaux dont le volume de la tumeur est supérieur à 1000-1200 mm3, mais sans dépassement de point limite). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les animaux seront hébergés par 5 ou 10 en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront donnés ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Au cours de ce projet, nous utiliserons des souris adultes (âge minimum de 8 semaines au début de l'expérience) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles. Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont l’une des seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. D’autre part, de nombreux modèles de cancers humains sont en place et très bien caractérisés chez la souris par l’établissement producteur permettant d’éviter une mise en place de modèle qui nécessiterait beaucoup plus d’animaux.

12 macaques, six crabiers et six rhésus, vont être utilisés puis réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une IRM puis quatre séances d'imagerie TEP par candidat médicament, sous anesthésie générale pouvant durer 300 minutes, avec pose d'un cathéter artériel et prélèvements sanguins. Le porteur indique un stress lié à la contention et au réveil, et signale que le produit de contraste, un oxyde de fer, peut élever le taux de fer sanguin. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier la distribution d'un médicament dans un "organisme entier" proche de l'humain, et conclut à la nécessité du primate.

Objectifs

L’objectif de cette étude est l’évaluation préclinique de la distribution tissulaire de candidats médicaments pour traiter des maladies telles que le diabète, certains cancers et des pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction. Pour y parvenir, nous synthétiserons des analogues radiomarqués de ces candidats médicaments que nous injecterons à des primates non humains. La distribution tissulaire sera suivie grâce à une technique d’imagerie non invasive. Cette technique d’imagerie non invasive (tomographie par émission de positons ou monophotonique) consiste à injecter un analogue de candidat médicament radiomarqué par différents isotopes utilisés en médecine humaine. La distribution tissulaire des candidats médicaments peut ainsi être mesurée par des approches d’imagerie non-invasive correspondant aux isotopes utilisés et qui sont également utilisées en médecine humaine. Cette étude permettrait d’évaluer l’exposition tissulaire par le candidat médicament étudié lors d’une administration. Les candidats médicaments étudiés concernent le diabète, le cancer, les pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction et également les neuroprotecteurs. Deux séances d’imagerie seront nécessaires. La première imagerie permet d’établir les paramètres pharmacocinétiques initiaux du candidat médicament. La seconde imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire du candidat médicament étudié. Le candidat médicament radiomarqué sera co-administré avec une molécule à usage humain dont on sait qu’elle interagit de manière spécifique avec la cible pharmacologique du candidat médicament étudié. Typiquement, cette étude sera réalisée en co-injectant le radiotraceur avec son analogue « froid », afin qu’il rentre en compétition avec la fixation tissulaire du radiotraceur. Les doses de médicament « froid » seront choisies en fonction de la littérature et du recul de l’utilisation de cette molécule chez l’homme ou chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont majeures puisqu’elles permettront d’apporter des informations pertinentes sur l’exposition tissulaire et sur les spécificités de la distribution et de l’élimination des candidats médicaments étudiés. Ces résultats peuvent être extrapolés chez l’Homme.

Procédures

Les animaux auront une séance d’imagerie anatomique (IRM) puis quatre séances d’imagerie dynamique (TEP) par candidat médicament étudié. Toutes les imageries (IRM et TEP) se dérouleront sous anesthésie générale (durée 300 minutes maximum) pour une acquisition d’une durée de 240 minutes maximum. Il n’y aura pas de prélèvements sanguins pendant l’imagerie IRM. En revanche, il y aura des prélèvements sanguins à chaque imagerie TEP qui seront séparés de 15 jours au minimum. Une voie artérielle sera positionnée en début d’anesthésie (durée de la pose inférieure à 5 minutes) afin de faire les prélèvement sanguin (durée inférieure à 5 secondes) durant l’examen. Pour 2 des 4 imageries TEP, les animaux recevrons une dose pharmacologique du candidat médicament par injection intra-veineuse sur 1 minute.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable prévu est un stress associé à la contention physique (durée inférieure à 2 minutes) précédent l’injection de l’anesthésie par voie intra musculaire ainsi qu’un stress pendant la phase de réveil (durée inférieure à 1 heure). Présence d’anesthésies répétées et relativement longues avec injections des médicaments et prélèvements sanguins.

Devenir

Le protocole expérimental ne nécessite pas d’euthanasier les animaux. Les animaux pourront être réutilisés sur décision du vétérinaire à la fin de l’étude.

Remplacement

Compte tenu de la complexité des phénomènes étudiés, il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier les effets d’un candidat médicament sur un organisme entier et donc d’extrapoler les résultats chez l’Homme. Afin d’obtenir des données convaincantes d’un point de vue clinique, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier dont l’organisation se rapproche au maximum de celle de l’Homme. Cette étude ne peut être envisagée qu’in vivo chez des primates non humains dont les déterminants pharmacocinétiques et la physiologie sont plus proches de l’Homme que celle des rongeurs.

Réduction

L’approche statistique envisagée permet la comparaison des deux conditions expérimentales entre elles avec suffisamment de puissance pour mettre en évidence un phénomène pharmacocinétique notable d’un point de vue pharmacocinétique. Cette estimation prend en compte la variabilité des mesures observées lors d’études précédentes réalisées chez les primates non-humain. Dans une perspective de réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude, seulement 12 primates non-humain seront inclus. Chaque animal participera à 4 examens par molécule étudiée afin d’obtenir des données répétables et représentatives des phénomènes étudiés.

Raffinement

Pendant toute la durée de cette étude, il y aura une mise en place d’un renforcement positif avec un remplacement hebdomadaire (physique) et journalier (alimentaire, sensoriel) des enrichissements. Une surveillance quotidienne des primates non humains sera pratiquée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Tous les examens se réalisent sous anesthésie générale. Juste avant le début de l’examen un examen clinique de l’animal sera systématiquement réalisé. Durant les examens d’imagerie, la température corporelle est monitorée et maintenue à l'aide d'une couverture chauffante à air (42°C) et une maintenance hydrique, réchauffée à 37°C, est suppléé. Les paramètres physiologiques et de ventilation sont suivis et sont utilisés comme indicateurs pour adapter la profondeur d’anesthésie et comme témoins de la gestion de l’analgésie. Durant ces examens la surveillance des animaux est renforcée jusqu’au réveil complet de l’animal (animal debout). Certains animaux possèdent une sensibilité aux agents anesthésiants. Des protocoles ont été mis en place afin d’identifier et de prévenir ces sensibilités.

Choix des espèces

La physiologie des barrières biologiques des primates non-humains est plus proche de celle des primates humains que de celle des rongeurs. Les niveaux d’expression de nombreux transporteurs de médicaments sont très différents entre les Hommes et les rongeurs. Il a été montré que les primates non-humains constituent un modèle plus prédictif de l’activité de ces transporteurs lors des études de pharmacocinétique. Aussi, afin d’étudier ces effets et extrapoler les résultats chez l’Homme, l’utilisation de primates non-humains est particulièrement pertinente. Le macaque adulte réunit tous les critères requis et constitue le meilleur choix pour notre étude.

660 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de tumeur colique sous anesthésie, des traitements par voies multiples, parfois une irradiation, et des mesures répétées de tumeur, la croissance tumorale pouvant provoquer occlusion, ascite et perte de poids. Le porteur, prestataire de services en recherche préclinique, propose ces modèles à des clients pour sélectionner des molécules anticancéreuses avant essais chez l'humain. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes alternatives ne prédisent pas l'efficacité in vivo et que la reconstruction 3D de tumeurs reste marginale.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer, spécifiquement les cancers colorectaux. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Identification des animaux par implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage, sous anesthésie (1 fois, moins de 1 minute). Induction tumorale : sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieur à 30 min). Des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée (sous anethésie pour une durée maximale d’1 heure. Les animaux sont traités sous anesthésie générale par voie : - intra-veineuse -intrapéritonéale -sous cutanée -intra-musculaire ou intra-dermique avec analgésie Les animaux sont traités vigile par voie : - per os faite sous contention La palpation et la mesure au pied à coulisse des tumeurs nécessite la contention des animaux (inférieur à 30 secondes) Des prélèvements de sang pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Des prélèvements d’urine peuvent être réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention.

Impact sur les animaux

La greffe tumorale pourra engendrer une douleur et un stress modérés sur 1-2j. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur, une gêne, une occlusion intestinale, un envahissement de la cavité abdominale ou pelvienne, de l’ascite et une perte de poids. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j. Les animaux recevront des traitements par voie intra-musculaire, intradermique, sous cutané, intra-veineuse, orale, per os ou intra-péritonéale et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger.

Devenir

Les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. Il est estimé que 9 études seront réalisées sur 5 ans. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 10 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux sont pesés minimum 2 fois par semaine. Le volume tumoral est estimé, minimum 2 fois par semaine par palpation. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès que la perte de poids supérieur à 10% sera observée. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. La greffe de tumeur est réalisée sous anesthésie générale gazeuse avec administration préalable d’un analgésique opiacé. L’implantation de la greffe nécessite l’incision de la peau, la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection d’anti inflammatoire non stéroïdien en préopératoire ainsi que le lendemain, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Toutes les procédures invasives et la plupart des procédures peu invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés dont les compétences ont été validées. Les administrations/prélèvements sont réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire et intradermique) sont réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements sont effectués en suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter le développement tumoral ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.