Troubles cardiaques
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Caractérisation tissulaire des zones impliquées dans la survenue de troubles du rythme cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Un tiers des porcs devrait mourir subitement au moment où on leur provoque un infarctus : c'est le calcul qui porte l'effectif de 8 à 12. 12 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent d'abord une heure et demie de chirurgie sous anesthésie générale pour l'infarctus, puis deux mois plus tard trois heures de cartographie du ventricule gauche destinée à déclencher une tachycardie ventriculaire, avant la mise à mort et le prélèvement du tissu cardiaque. Le porteur retient le porc juvénile de 30 à 35 kg au motif que son cœur est le plus proche de celui de l'être humain, les animaux devant peser 70 à 80 kg à la fin du protocole.
Objectifs
La mort subite touche environ 50 000 patients en France tous les ans. Sa cause principale est l’infarctus du myocarde. Les mécanismes de la mort subite sont mal connus. Cependant des troubles du rythme cardiaque, faisant suite à la survenue de l'infarctus, sont suspectés. Ainsi le mécanisme rythmique à l’origine de la mort subite est le plus souvent la survenue d’une tachycardie ventriculaire (rythme cardiaque trop élevé) qui se transforme en fibrillation (contractions érratiques) ventriculaire, responsable de l’arrêt cardio-circulatoire. Pour mieux comprendre les mécanismes tissulaires qui expliquent la survenue de ces troubles du rythme, nous proposons de réaliser une analyse histologique des zones responsables de ces arythmies. Ceci n’est pas réalisable chez l’homme et nous proposons de réaliser cette étude sur le porc, gros animal, dont l’anatomie cardiaque est très proche de celle de l’homme. Pour cela en pratique, nous proposons d’induire une tachycardie ventriculaire, qui est le trouble du rythme à l’origine de la mort subite, à distance (a posteriori) de l'induction d’un infarctus du myocarde. Nous souhaitons étudier les anomalies histologiques et moléculaires présentes dans les zones anatomiques impliquées dans la survenue d’une tachycardie ventriculaire. Ainsi la première phase de l’étude consistera en la réalisation d’un infarctus du myocarde et la deuxième phase consistera à induire une tachycardie ventriculaire et à repérer les zones anatomiques responsables de cette tachycardie ventriculaire. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de survenue de ces tachycardies qui sont responsables de mort subite chez l’homme.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de remodelage tissulaire responsable du développement des arythmies ventricuaires. Cela pourrait aboutir à l’identification de biomarqueurs cellulaires spécifiques et à des applications thérapeutiques.
Procédures
Réalisation d’un infarctus du myocarde sous anesthésie générale. La durée de cette procédure est d’environ 1h30. Deuxmois après cartographie ventriculaire gauche sous anesthésie générale. La durée totale de cette intervention est d’environ 3 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus incluent : - le stress induit par la contention avant induction de l'anesthésie générale, - les risques liés à l’anesthésie générale elle-même : hypoxie, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire, - l'induction d’un infarctus du myocarde avec risque d'insuffisance cardiaque ou de mort subite.
Devenir
Des prélèvements du tissu cardiaque doivent être effectués pour analyses histologiques, nécessitant la mise à mort de l’animal.
Remplacement
Aucun modèle in vitro ou mathématique ne permet de reproduire et de modéliser les dommages tissulaires provoqués par un infarcus du myocarde. Un étude animale est obligatoire pour caractériser ces lésions tissulaires, car il n’est pas possible de faire ce type de prélèvements chez l’homme. Il n’est pas non plus possible d’effectuer cette étude sur un cadavre humain car il n’y a plus d’activité électrique dans le cœur.
Réduction
Il s’agit d’une étude pilote. Nous comparerons les tissus chez les porcs chez qui il sera possible d’induire un trouble du rythme cardiaque après l’infarctus versus ceux chez qui il ne sera pas possible d’induire ce troube du rythme. Nous estimons qu’il sera possible d’induire une tachycardie ventriculaire dans la moitié des cas. L’autre moitié servira de groupe contrôle. Nous attendons une différence de 40% dans la répartition tissulaire entre ces 2 types groupes (groupe tachycardie et groupe contrôle), ce qui correspond à 8 porcs dont les résultats pourront être analysés. Nous estimons que 1/3 des porcs feront une mort subite à l’induction de l’infarctus, raison pour laquelle nous prévoyons d’inclure 12 porcs dans l’étude.
Raffinement
Les porcs sont hébergés dans une animalerie où les paramètres d’ambiance sont contrôlés, avec un cycle alternance jour/nuit de 12h/12h. Ils sont hébergés en groupes sociaux sur litière de copeaux de bois afin de leur permettre d’exprimer leur comportement de fouissage. Des enrichissements sont mis à disposition tels que chaine à mâcher, ballons en platique et boules dans lesquels des granulés ou de la compote de pomme peuvent être cachés. Ces enrichissements sont mis à disposition de façon alternative toutes les semaines environ. Des morceaux de fruits sont également distribués. Les porcs bénéficient d’une période d’acclimatation de minimum 7 jours au cours desquels ils sont habitués à la présence de l’homme et à leur manipulation lors des périodes de change et la distribution de nourriture/eau notamment, moments propices à la distribution de caresses (avec des gants de massage) et de friandises. Les interventions pouvant occasionner de la gêne ou de la douleur sont réalisées sous anesthésie générale et une analgésie multimodale incluant des opioïdes est administrée. Des points-limites adaptés ont été définis afin de limiter toute forme de stress ou de souffrance. Les animaux sont a minima contrôlés une fois par jour pendant la période d’acclimatation puis 3 fois par jour après l'induction de l’infarctus et ce jusqu’à la fin de la période de suivi de 2 mois au terme de laquelle une cartographie tisuslaire est réalisée.
Choix des espèces
Il s’agit de l’espèce la plus proche de l’homme au niveau cardiaque, permettant de réaliser un infarctus du myocarde et une cartographie électrique de la tachycardie ventriculaire. Nous souhaitons travailler sur des porcs juvéniles d’environ 30-35 kg au moment de la première phase (induction de l'infarctus) car la deuxième phase (induction de la tachycardie ventriculaire et réalisation de la cartographie) sera espacée de 2 mois et les porcs pèseront environ 70-80 kg en fin de protocole.
Evaluation des biomatériaux pour la réparation de tissu cardiaque dans un modèle d’infarctus chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Soumis à une ligature d'artère coronaire pour provoquer un infarctus, puis rouverts une semaine plus tard pour qu'un patch soit collé sur leur cœur, 320 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit deux chirurgies thoraciques de trente à quarante minutes sous ventilation mécanique, cinq prises de sang et quatre échographies cardiaques sous anesthésie, réparties sur quatre-vingt-dix jours. Tous sont tués au terme du suivi, pour analyser la cicatrice, les vaisseaux formés et l'intégration du patch. Le porteur annonce une mortalité postopératoire de 30 % après induction de l'infarctus et pose du patch, soit près d'une centaine de rats morts des suites des opérations.
Objectifs
L'ischémie cardiaque, un problème où le cœur manque d'oxygène, est la principale cause de décès dans le monde depuis deux décennies. Ce manque d'oxygène entraîne des dommages au cœur, conduisant à une maladie chronique appelée insuffisance cardiaque. Récemment, des scientifiques et des médecins se sont intéressés à des thérapies alternatives basées sur l'ingénierie tissulaire pour réparer le cœur. Une méthode récente qui a attiré l'attention des chercheurs et des médecins est l'utilisation d'une structure appelée matrice extracellulaire native, obtenue à partir de tissus dépourvus de cellules. Cependant, cela présente des défis tels que le manque de donneurs, le risque d'infection, et des déséquilibres chimiques et physiques qui peuvent affecter les tissus et les cellules. Dans ce contexte, notre équipe de recherche vise à développer un biomatériau imitant les caractéristiques de la matrice extracellulaire cardiaque pour être utilisé comme une sorte de "squelette" actif dans le traitement de l'insuffisance cardiaque. Notre idée est de combiner différents matériaux dans un patch cardiaque unique, avec des propriétés physiques et chimiques contrôlées, ainsi que la matrice extracellulaire naturellement sécrétée contenant les éléments nécessaires à la réparation des tissus. Nous pensons que cette approche fournira un environnement optimal aux cellules cardiaques, favorisant ainsi la réparation du cœur après une ischémie cardiaque. Nous prévoyons de démontrer l'efficacité de ce patch en évaluant la réparation cardiaque chez le rat, en analysant les tissus grâce à des techniques d'imagerie médicale et de mesure morphologique après l'implantation du patch dans un modèle chirurgical simulant l'ischémie cardiaque.
Bénéfices attendus
Aujourd'hui, il n'existe malheureusement aucun traitement curatif pour l'insuffisance cardiaque causée par des lésions chroniques du cœur. Les solutions actuelles se concentrent principalement sur le soulagement des symptômes pour améliorer la qualité de vie des patients. De plus, ces traitements sont souvent associés à des effets indésirables. La transplantation cardiaque reste une option thérapeutique, mais elle est souvent réservée en dernier recours en raison de ses contraintes importantes. Heureusement, des avancées récentes ouvrent la voie à des thérapies alternatives pour traiter la perte de tissu cardiaque, en évitant la formation de cicatrices et le remodelage du cœur. Une approche prometteuse utilise ce qu'on appelle la matrice extracellulaire (MEC) native, obtenue par un processus de décellularisation des tissus. Cette MEC agit comme un matériau biologique pour réparer le cœur, et certains produits basés sur cette technologie sont déjà disponibles sur le marché. Les avantages de la MEC sont nombreux, car elle présente des propriétés physiques favorables et des composés qui régulent le comportement des cellules cardiaques et leur communication. Cependant, l'utilisation de MEC d'origine animale a ses limites, notamment en raison du nombre restreint de donneurs, des risques d'infection et des différences physiques et chimiques qui peuvent affecter la physiologie des tissus et des cellules. Notre projet innovant vise à créer un patch cardiaque qui offre un environnement propice aux cellules cardiaques, permettant ainsi une amélioration de la fonction cardiaque après un épisode d'ischémie. Cette avancée pourrait représenter une percée majeure dans le traitement de l'ischémie cardiaque, offrant de nouvelles perspectives d'amélioration de la santé cardiaque.
Procédures
Des animaux participeront à une étude simulant une crise cardiaque. Tout d'abord, ils seront traités avec des anti-douleurs et placés sous anesthésie et seront ventilés mécaniquement, puis une incision sera pratiquée sur le côté de leur poitrine. En utilisant un fil spécial, une ligature sera placée autour d'une artère importante du cœur pour provoquer une crise cardiaque simulée. Cette procédure durera entre 30 et 40 minutes et sera réalisée sous anesthésie pour le confort des animaux. Une semaine plus tard, ces mêmes animaux recevront un traitement sous forme d'un patch cardiaque. Encore une fois, ils seront ils seront traités avec des anti-douleurs et placés sous anesthésie et respiration assistée, puis une petite incision sera faite au niveau de la poitrine (sternum) pour exposer la zone du cœur touchée. Le patch sera fixé à cette zone à l'aide d'une colle médicale. Cette intervention durera également entre 30 et 40 minutes et sera réalisée sous anesthésie. Pour évaluer l'efficacité des traitements, des prises de sang seront effectuées aux jours 1, 7, 30, 60 et 90 pour examiner les changements dans leur santé (durée de l'intervention: 5 minutes). Des images du cœur seront également prises aux jours 5, 30, 60 et 90 à l'aide d'une échographie cardiaque, le tout sous anesthésie (durée de l'intervention: 10 minutes). À la fin de l’étude, une perfusion sera réalisée sous anesthésie, sans que les animaux se réveillent, pour évaluer le fonctionnement du cœur. Ces évaluations permettront de suivre la récupération du cœur après les différentes interventions.
Impact sur les animaux
Induction de l'ischémie cardiaque, une procédure simulant une crise cardiaque, sera réalisée en pratiquant une incision sur le côté gauche de la poitrine et en ligaturant une artère importante du cœur. Les animaux ressentiront une douleur post-opératoire modérée. Des prélèvements sanguins seront effectués aux jours 1, 7, 30, 60 et 90, avec une douleur modérée. L'implantation du patch cardiaque, réalisée par une incision sur le thorax, peut entraîner une douleur post-opératoire. La mortalité post-opératoire après induction de l'ischémie cardiaque et implantation du patch cardiaque est de 30 %. Les animaux peuvent ressentir du stress en raison des anesthésies répétées. Il y a également un risque d'infection au niveau des sutures et un risque de cicatrisation déficiente.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés après 7, 30, 60 ou 90 jours suivant l'implantation du patch. Cette mesure sera prise dans le but d'analyser les tissus du cœur, en évaluant des aspects tels que la présence de cicatrices, le nombre de cellules, leur multiplication, l'intégration du patch, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et les changements dans la matrice extracellulaire. Ces informations nous aideront à mieux comprendre l'efficacité du traitement et son impact sur la récupération du cœur.
Remplacement
Actuellement, il n'est pas possible de reproduire avec précision l'action des patchs cardiaques dans un tissu cardiaque en laboratoire ou par simulation informatique. Il n'existe pas de modèle fiable, que ce soit in vitro (dans une boîte de culture) ou in silico (simulation numérique), pour imiter une crise cardiaque. De nombreuses études scientifiques se basent sur des modèles expérimentaux d'ischémie cardiaque chez le rat, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie chez l'homme. Pour étudier les changements au niveau cellulaire, des analyses des tissus sont nécessaires, impliquant malheureusement l'euthanasie des animaux. Cependant, au cours des deux dernières années, des expériences ont été menées in silico (modélisation 3D) et in vitro (culture de cellules cardiaques) au sein de notre unité. Ces travaux ont permis de réduire le nombre de biomatériaux à tester in vivo (dans des organismes vivants) et d'établir un processus de fabrication robuste des patchs cardiaques. Ces avancées sont essentielles pour mieux comprendre et traiter les problèmes cardiaques dans le futur.
Réduction
Nous utilisons des méthodes d'imagerie non invasives, comme l'échocardiographie, qui nous permettent de suivre les changements chez les mêmes animaux au fil du temps. De plus, nous avons effectué des calculs statistiques pour déterminer le nombre optimal d'animaux nécessaires à nos études, visant à obtenir des résultats significatifs sans avoir à utiliser un grand nombre d'animaux. Ces calculs ont été réalisés à l'aide d'un test spécifique, et pour détecter une différence significative entre les groupes d'étude et les groupes témoins. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés pour garantir la fiabilité de nos conclusions.
Raffinement
Nous nous assurons que les conditions de vie des animaux sont optimales. Ils sont placés en petits groupes de trois dans des cages et nous enrichissons leur environnement. Nous respectons également leur rythme jour-nuit et leur accordons le temps nécessaire pour s'acclimater avant toute procédure. Nous avons mis en place des normes strictes pour garantir le bien-être des animaux. Nous utilisons des techniques d'imagerie non invasives, comme l'échocardiographie, et nous recourons à l'anesthésie et à des analgésiques pour toutes les procédures afin de minimiser tout inconfort. Les animaux seront surveillés quotidiennement, avec un suivi clinique réalisé chaque jour pendant la première semaine, puis deux fois par semaine par la suite. Cette surveillance sera effectuée en se basant sur une grille spécifique permettant d'identifier précocement les signes de douleur. En fonction de l'état des animaux, des mesures seront prises pour minimiser la douleur au maximum. Cela peut inclure l'application de soins locaux au site opératoire, l'administration d'analgésiques, et dans les cas de souffrance sévère, l'euthanasie sera envisagée pour mettre fin à la douleur.
Choix des espèces
Nous avons choisi avec soin le modèle animal pour nos recherches, en optant pour des rats, une sélection basée sur les publications scientifiques les plus pertinentes dans le domaine. L’implantation de patchs cardiaques et le modèle d’ischémie cardiaque chez le rat ont été décrites dans de nombreuses publications internationales de prestige. Les dimensions du cœur du rat permettent l’induction de l’ischémie, l'implantation du patch et l'analyse en imagerie. Les rats seront utilisés à un stade adulte car la population humaine présentant des ischémies cardiaques est relativement âgée. Les animaux seront utilisés à 9 semaines de vie ce qui correspond à un stade adulte.
Etude du rôle de l’endothéline dans la calcification valvulaire aortique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les rats subissent trois chirurgies, une ligature de l'artère du rein gauche à J1, l'ablation du rein droit à J8 et la pose d'une mini-pompe à J38, encadrées d'un prélèvement sanguin à J37 puis d'une IRM et d'une échocardiographie en semaine 12. 108 rats Sprague-Dawley mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. L'insuffisance rénale ainsi provoquée s'accompagne, si le modèle fonctionne, d'une anémie, d'une hypertrophie et d'une fibrose du cœur et d'une baisse de la fonction ventriculaire, avec 25 % de mortalité annoncée. Le porteur espère à long terme un traitement du rétrécissement aortique et vérifie d'abord une hypothèse sur un récepteur de l'endothéline.
Objectifs
Le rétrécissement aortique est une pathologie fréquente qui touche environ 2% de la population de plus de 65 ans. Cette maladie se caractérise par une calcification des tissus et une diminution de la surface valvulaire empêchant l’éjection du sang. Au stade final de la maladie, il en résulte des symptômes à type de dyspnée, insuffisance cardiaque à l’origine d’une importante morbi-mortalité cardiovasculaire. Hors, il n’existe actuellement aucun traitement médical permettant de stopper le développement des calcifications valvulaires. La seule issue thérapeutique consiste en une intervention. Quelques études suggèrent l’implication de la voie de l’endothéline dans le rétrécissement aortique et ex vivo qu’un blocage du récepteur de l'endothéline B augmentait les calcifications et qu’à l’inverse, une stimulation diminuait les calcifications . La stimulation du récepteur de l'endothéline B pourrait donc être une potentielle cible thérapeutique à l’avenir. L’objectif de cette expérimentation est donc de vérifier sur un modèle animal de calcification valvulaire ces premiers résultats et de s’assurer de l’absence d’effets secondaires de cette modulation de la voie de l’endothéline.
Bénéfices attendus
Le rétrécissement aortique est une pathologie qui représente un véritable enjeu de santé publique. Il s’agit en effet de la valvulopathie la plus fréquente dans les pays occidentaux avec une prévalence de 2% des sujets de 65 ans et plus et 10% des sujets de 80 ans et plus . Les symptômes apparaissent au stade du rétrécissement aortique serré et sont le plus souvent invalidant à type de dyspnée amenant à des hospitalisations. Actuellement le seul traitement consiste est une intervention, soit par voie chirurgicale, soit par voie percutanée. Dans les deux cas, le remplacement de la valve par une prothèse valvulaire n’est pas dénué de risque (accident vasculaire cérébral, implantation de pacemaker, troubles du rythme). Même si certaines publications anciennes ont suggéré un rôle de l’endothéline dans les calcifications valvulaires aortiques, cela n’a toujours pas été confirmé et les mécanismes impliqués n’ont toujours pas été expliqués. Notre projet pourrait donc permettre : 1)A court terme, de répondre à une question scientifique en cours et confirmer le potentiel rôle de l’endothéline dans le développement du rétrécissement aortique. La compréhension des mécanismes impliqués pourrait également ouvrir la voie à d’autres idées de recherche dans des domaines variés. En effet, la voie de l’endothéline est notamment étudiée en oncologie et en neurologie . 2) A long terme, cette étude pourrait également permettre la conception d’un traitement médical du rétrécissement aortique. Cela pourrait éviter à de nombreux patients d’arriver au stade symptomatique de la maladie et donc éviter des hospitalisations et des interventions.
Procédures
Les animaux de la procédure subiront trois chirurgies dans un premier temps une ligature de l'artére rénale du rein gauche à J1 de l'étude puis une ablation totale du rein droit au J8 de l'étude et enfin une pose de mini pompe à J38. Des prélèvements sanguins seront effectués à J37 sur tous les animaux sous-anesthésie gazeuse pour randomiser nos groupes en fonction du dossage de la créatine. L'analyse des effets fonctionnels (IRM : semaine 12 et échocardiographie cardiaque : semaine 12 et J38 ) sera effectué sous anesthésie avec une durée de 10 minutes/rat.
Impact sur les animaux
La procédure est classée sévère. La chirurgie visant à induire une un modèle animal de calcification valvulaire afin d’étudier l’impact de la modulation du récepteur de l’endothéline B dans le développement du rétrécissement valvulaire aortique. Pour cela les animaux subiront une néphrectomie qui sera réalisée en deux temps avec une ligature de l’artère rénale gauche à J1 et une ablation du rein droite à J8 (avec une durée de chaque intervention de 20 minutes). De manière certaine, les animaux, après néphrectomie (Sténose) du rein gauche des 5/6ème (procédure classée sévère) et néphrectomie totale rein droit développeront une insuffisance rénale Chronique (IRC). Nous nous attendons, si notre modèle fonctionne, insuffisance rénale chronique associé avec une anémie, une hypertrophie cardiaque, une fibrose cardiaque et une diminution de la fonction systolique et diastolique du ventricule gauche. Le taux de mortalité lors de la réalisation de ce modele est de 25%. Tous les animaux subiront plusieurs anesthésies gazeuse et une anesthésie par injection lors de IRM (durée 40 minutes) et de la mise à mort.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort puisqu'il est nécessaire de récupérrer la valve aortique et le coeur pour analyse des calcifications présentes.
Remplacement
Dans ce projet d’étude, des expérimentations in vitro et ex vivo sur des cellules valvulaires ont déjà été faites antérieurement. Cependant, le modèle in vivo ne peut pas être remplacé car il permettra d’étudier l’effet systémique des modulateurs de la voie de l’endothéline au-delà des cellules valvulaires ainsi que la tolérance des agents pharmacologiques sur un organisme vivant. Il s’agit d’une étape indispensable si l’on souhaite développer par la suite un médicament chez l’homme.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM) puis une analyse histologique. Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats nécessaire.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement controlé et stabilisé (température de 21°C , hydrométrie à 55% et luminosité à 100lux avec une durée de cycle de lumière normal soit 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la structure chargée du bien être animale. Pendant la chirugie, nous injectons une solution saline en sous- cûtanée pour maintenir l'hydratation de nos animaux. En post- opératoire une injection de glucose à 5% en IP est réalisée en ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Un traitement analgésique à l’aide de xylazine (10 mg/kg) en préopératoire et de buprénorphine (0.5 mg/kg) en pré et post-opératoire est réalisé suivi d'une injection toutes les 8h pendant 24h qui suivent l’opération. Nous allons dans ce projet utiliser des rats mâles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.
Choix des espèces
Le choix du rats sprague dawley males se justifie par l’expérience du laboratoire à la fois pour la chirurgie de la néphrectomie mais également pour l’étude des fonctions cardiaque par échocardiographie et IRM. Par ailleurs, le rapprochement des espèces humaines et des rongeurs sur le plan phylogénétique rend pertinent le choix de cette espèce en garantissant une bonne extrapolation des résultats chez l’homme. Nous utiliserons que des mâles pour notre études pour diminuer les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles. Nous utiliserons des rats adultes car cette pathologie survient chez des humains adultes (pathologies non existante chez les enfants).
Effets des extraits de fruits ou de feuilles du carambolier (Averrhoa carambola) dans l’hypertension artérielle et le syndrome métabolique chez le rat Wistar
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
Une heure trente de mesure de pression artérielle par rat, autant pour le test de tolérance au glucose, à J7, J21, J35 puis J49 : 78 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent chaque jour un gavage d'extraits de feuilles ou de fruits de carambolier, avant d'être anesthésiés puis tués par saignement de l'aorte abdominale pour prélever leurs organes. Le porteur ne mentionne comme nuisances que l'inconfort lié aux complications de l'hypertension ou du syndrome métabolique provoqués et la gêne du gavage. Le choix du rat repose, écrit-il, sur sa "facile prise de poids" sous régime riche et sur la facilité d'induction de l'hypertension, deux atteintes provoquées pour l'occasion.
Objectifs
Une tendance à la hausse des maladies métaboliques a été observée ces dernières années. Au niveau mondial, les maladies cardiovasculaires sont responsables d'environ 17 millions de décès par an, soit près d'un tiers du total des décès dans le monde. Quatre cent vingt cinq millions d'adultes étaient diabétiques en 2017, dont plus de 90 % avaient un diabète sucré de type 2. On estime que 629 millions de personnes seront atteintes de diabète d'ici 2045. Quand à l'hypertension artérielle on estime qu'elle est à l'origine de 7,5 millions de décès, soit environ 12,8 % de l'ensemble des décès annuels dans le monde. Cette étude est faite pour participer à la lutte contre le diabète, maladie métabolique, et l’hypertension artérielle, car leur prise en charge est coûteuse et leurs complications sévères. En effet, Une partie de la prévention de ces maladies peut se faire par la consommation de fruits et de légumes. Parmi les produits d'origine végétale, les feuilles et les fruits du carambolier (Averrhoa carambola) sont très utilisés en médecine traditionnelle brésilienne. Les fruits sont largement consommés pour leurs propriétés gustatives. Ils sont reconnus au Brésil et en Asie pour soigner et prévenir certaines maladies métaboliques. Ce projet vise à évaluer les propriétés préventives et thérapeutiques d'extraits de feuilles ou de fruits dans un modèle d'hypertension artérielle et un modèle de syndrome métabolique chez le rat.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de développer une nouvelle stratégie thérapeutique afin de limiter et/ou prévenir certaines maladies cardiovasculaires ou métaboliques telles que l’hypertention artérielle et le syndrome métabolique, notamment dans les pays africains où le carambolier est disponible. Ce projet pourrait également donner l'opportunité de mieux comprendre les mécanismes d’action des molécules responsables des effets antihypertensifs et antihyperglycémiques des extraits étudiés. De plus, il pourrait mettre en lumière de nouveaux bénéfices de l'utilisation de la A. carambola dans l’alimentation humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions. Un gavage oral avec une sonde souple sera réalisé (30sec) sur tous les animaux (1 fois/jour). La mesure de la pression artérielle pour 6 groupes sur 9 (1h30 par rat). Le test de tolérance au glucose (1h30 par rat), le prélèvement de sang (10 minutes) et la prise de poids (1 minute) pour 9 groupes sur 9. Tous ces actes seront effectués à J7, J21, J35 (et J49 jours seulement pour le modèle de maladie métabolique). Les animaux seront également soumis à des prélèvements d'organes (en fin d'expérimentation) après leur anesthésie puis euthanasie par exsanguination au niveau de l'aorte abdominale. Ces interventions concernent les 78 animaux sur la durée totale de traitement.
Impact sur les animaux
Complications générées par l’hypertension artérielle ou le syndrome métabolique avec inconfort. Une gêne peut être produite par le gavage oral avec une sonde souple.
Devenir
Tous les animaux des lots étudiés sont concernés par l’euthanasie.
Remplacement
Le remplacement des animaux n’est pas possible pour répondre aux questions du présent projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in silico ou in vitro) pour explorer un développement naturel du syndrome métabolique et de l’hypertension et des potentiels effets bénéfiques du traitement.
Réduction
De manière à respecter la règle de réduction, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum permettant d’anticiper les différences interindividuelles. Le nombre total de rats utilisés dans le projet est 78 et se repartit comme suit : Pour ce qui concerne l’activité antihypertensive (procédure 2), le nombre de 10 rats par groupe est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats reproductibles et exploitables et réaliser une analyse statistique. Le nombre d'animaux a été calculé en prenant l'estimation de la variation de la pression artérielle avec ou sans traitement et donne 10 animaux par groupe expérimental. Pour ce qui concerne l’effet systémique (procédure 1) et la procédure sur le modèle de syndrome métabolique (procédure 3), le nombre de 8 rats par groupe est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats reproductibles et exploitables et réaliser une analyse statistique. Le nombre d'animaux a été calculé en prenant l'estimation de la variation du poids de l'animal et donne 8 animaux par groupe expérimental.
Raffinement
- Un hébergement qui respecte les recommandations en vigueur, une animalerie contrôlée (température, hygrométrie) et un enrichissement des cages (des tunnels, des morceaux de bois, des fisures de papier Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). - Manipulation douce régulière des animaux pour habituation à l'expérimentateur. - Le gavage est réalisé à l'aide d'une sonde souple. - Un suivi régulier des animaux par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). - Définition des points limites utilisation d'une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. Optimisation des protocoles expérimentaux pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse et pertinence des résultats obtenus.
Choix des espèces
Ne pouvant étudier les effets des extraits de carambole dans un système de culture cellulaire, les animaux rongeurs sont un bon modèle pour l'étude des mécanismes impliqués dans l'obésité par leur facile prise de poids lorsqu'ils sont soumis à un régime riche et l’hypertension par son induction facile. L’utilisation de ce modèle animal permettra aussi d’étudier la capacité de nos produits testés à prévenir le développement des problèmes métaboliques et cardiovasculaires. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6-7 semaines. Ces animaux sont des jeunes adultes, stade optimal pour étudier l'impact de nos traitements sur les régimes apportés.
ValvAO: Mise au point d’un modèle de dégénérescence de bioprothèses valvulaires cardiaques chez le cochon
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Tués en fin de protocole pour que la prothèse valvulaire soit prélevée et examinée, 70 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit un remplacement de valve aortique sous circulation extracorporelle, six heures d'anesthésie puis une dizaine d'heures sous sédation et ventilation, quarante-huit à soixante-douze heures de soins intensifs, et des échographies à un, trois et six mois. Le porteur cite parmi les effets attendus l'infection du site chirurgical et un mauvais fonctionnement cardiaque pouvant aller jusqu'à l'insuffisance cardiaque. Il calcule ses effectifs en intégrant une perte "classiquement attendue" de 50 % faute de redémarrage du cœur, chiffre qui dit ce que ce modèle chirurgical inflige.
Objectifs
Aucun traitement médical n’est à l’heure actuelle disponible pour traiter les pathologies valvulaires cardiaques. La seule option offerte aux patients est le remplacement valvulaire par une nouvelle prothèse lors d’une chirurgie à cœur ouvert. Ces dernières années, l’utilisation de prothèses biologiques a pris le pas sur les prothèses mécaniques, principalement à cause de leur meilleure performence hémodynamique et du développment de techniques moins invasives (remplacement par transcatherter des valves). Par contre, ces prothèses ont une durabilité réduite : en effet, la dégénerescence de ces bioprothèses est observée 10 à 15 ans post implantation. Cette dégénrescence a une implication importante d’un point de vue clinique, pouvant entraîner des symptomes chez les patients, un besoin d’une ré-intervention valvulaire et peut aussi entrainer le décès. Cependant, à ce jour, les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ce processus dégénératif sont inconnus. L’objectif de notre projet de recherche est d’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la survenue de cette dégénérescence des bioprothèses. Ce projet s’appuie sur un modèle de chirurgie de remplacement valvulaire cardique chez le cochon. L’étude portera sur le rôle de l’hypercholestérolémie et de la thrombose dans le processus de dégénérescence des bioprothèses. Des cochons contrôles (Yucatan WT) et modifiés génétiquement (Yucatan avec gain de fonction de PCSK9), recevant ou non un traitement anticoagulant seront étudiés dans cette étude, qui permettra donc d’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la dégénrescence des bioprothèse et l’effet synergique de l’hypercholestérolémie et/ou de la thrombose prosthétique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le processus de dégénérescence des bioprothèses, et ainsi aboutir à des modifications de prise en charge des patients subissant un remplacement valvulaire avec une bioprothèse, mais aussi modifier la préparation des bioprothèses (préparation et confection des matrices utilisées par exemple). L’un des avantages majeurs de l’étude est que nous pourrons identifier les processus précoces impliqués dans le dévelopement de la pathologie, dès l’implantation de la prothèse et donc proposer des interventions chez l’homme tôt, en per ou post chirurgie.
Procédures
Chirurgie de prothèse valvulaire avec circulation extracorporelle sous anesthésie générale (anesthésie durant 6 heures puis maintien sous sédation et ventilation pendant une dizaine d'heures), Soins intensifs post-opératoires sur 48 à 72 heures, Prélèvements sanguins intra et post-opératoires pendant la semaine de soins intensifs par aspiration de sang au niveau du cathéter veineux central (aucune contention de l'animal et aucune douleur), Prélèvement sanguin et échographie transthoracique à un mois, 3 mois et 6 mois jusu'à la fin du protocole sur animal vigile ou sous sédation selon la tolérance de l'animal (utilisation d'une contention physique minimale et si échec, utilisation d'une contention chimique anxiolytique à base de benzodiazépines), Anesthésie générale finale avant euthanasie
Impact sur les animaux
Douleur modérée pendant l'acte chirurgical sous anesthésie générale et suite au trauma chirurgical en phase postopératoire : traitement analgésique multimodal pendant l'anesthésie et le post-opératoire immédiat et plan d'analgésie de secours si traitement multimodal de première intention insuffisant. Infection du site chirurgical (douleur légère à modérée, hyperthermie, manque d'appétit) : technique chirurgicale aspetique et antibiothérapie adaptée selon les analyses hématologiques, Protection des plaies avec des bandages souples. Malfonctionnement cardiaque suite à l'intervention pouvant entrainer une insuffisance cardiaque (douleur légère à modérée, fatigue, anorexie). Manipulation de l'animal pour l'administration des traitements et des prises de sang (stress, douleur légère) : instrumentation avec un cathéter long-terme jugulaire permettant le prélèvement sanguin sans contention et l'administration de médicaments par voie intraveineuse sans inconfort. Stabulation isolée le temps de la phase post-opératoire immédiate (enrichissement avec jouet et nourriture) et remise en contact d'un congénère dès que la convalescence est suffisante (alimentation normale, arrêt des soins et traitements post-opératoires)
Devenir
Euthanasie en fin de protocole pour prélèvement et étude histologique de la prothèse valvulaire
Remplacement
II n’existe pas de méthode in vitro ou in silico permettant de reproduire les phénomènes physiologiques et pathophysiologiques liés au fonctionnement et à la dégénérescence de la prothèse valvulaire. Les prothèses sont testées pour leur tolérance tissulaire sur des animaux de laboratoire plus petits (rats) avec une mise en place du tissue en sous-cutané. Cette méthode n’est pas adaptée à l’étude de la dégénérecence du tissu valvulaire, qui est implanté chez l’homme dans la circulation et fait face a des contrainte liées au flux sanguin et au pressions/tensions observées au niveau du système circulatoire central.
Réduction
Compte-tenu des connaissances sur les modèles de chirurgie intracardiaque avec circulation extracorporelle chez le porc et de la nécessité d’avoir un nombre d’animaux minimum pour avoir une significativité statistique, le nombre d’animaux comprend des animaux pour la mise au point et la standardisation du modèle chirugical de remplacement valvulaire aortique ainsi que 8 à 15 animaux par groupe pour chaque condition d’évaluation de la dégénérescence prosthétique (perte maximale classiquement attendue pour des protocoles de chirurgie cardiaque chez le porc de 50% par défaut de redémarrage du coeur). Au vu des résultats préliminaires obtenus, le nombre d’animaux pourra être réduit pour chaque groupe d’expérimentation et conditions.
Raffinement
En plus du raffinement des conditions d’hébergement et de manipulation des animaux, les procédures de préparation, d’induction de l’anesthésie, de mise en place de l’analgésie répondent aux exigences de l’analgésie multimodale pré-emptive et sont confiées à des anesthésistes/réanimateurs spécialistes. Une attention identique est portée au suivi des animaux pendant les interventions chirurgicales et le suivi postopératoire grâce à l’ensemble des moyens de monitorage du plateau technique. Les données de monitorage sont enregistrées fréquemment afin de relever à posteriori d’éventuelles réponses physiologiques chez les différents animaux. Des échantillons sanguins sont prélevés avant la chirurgie (après anesthésie), pendant la chirurgie et après la chirurgie (pendant le suivi post-opératoire) afin de collecter le maximum de données. Les besoins en données sont anticipés et ouverts aux analyses exploratoires afin de pouvoir effectuer des analyses sur des paramètres qui n’auraient pas été anticipés. Les chirurgies cardiaques avec CEC sont réalisées par des chirurgiens cardiaques humains, avec le support d’un perfusionniste, permettant de rafiner le protocole chirurgical selon les standards cliniques.
Choix des espèces
Le choix du mini-porc est fondé sur plusieurs critères : - Modèle animal bien décrit et largement utilisé pour la chirurgie intracardiaque avec CEC avec des aspects anatomiques et un fonctionnement physiologique proche de l’homme ; des paramètres hémato-biochimiques comparables et dont les variations sont accessibles par des techniques de dosages similaires à celle utilisées en médecine humaine, afin d’assurer la prédictivité des résultats. - Existence d’une lignée modifiée génétique (gain de fonction de PCSK9) présentant une hypercholestérolémie. - Réponse du mini-pig à l'induction d'une diète HC en 4 semaines (doublement du taux de cholestérol) permettant de générer un modèle hypercholestérolémique, représentatif de l'Homme. - Taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie, ainsi que l’utilisation d’instruments et de matériels identiques à ceux utilisés chez l’Homme. - Le mini-porc à l’âge adulte atteint un poids minimum de 40 kg et reste maitrisé par le rationnement (environ 50-60 kg) ce qui représente un avantage comparativement au porc charcutier. Animaux adultes afin d’avoir une taille de thorax et d’aorte compatible avec l’intervention chirurgicale
Effet de l’hormone obestatin sur l’inflammation cardiaque causée par la cachexie associée au cancer chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
Toutes tuées pour analyser l'infiltration inflammatoire de leur muscle cardiaque, 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 45 reçoivent des cellules tumorales implantées dans le pancréas au cours d'une intervention de vingt minutes, 45 autres des cellules de tumeur pulmonaire sous la peau du flanc, et 60 portent quinze jours une mini-pompe osmotique sous-cutanée qui diffuse l'hormone testée. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale gêne les déplacements dans les derniers stades et réduit la prise alimentaire. Il justifie le recours à la souris par sa reproduction rapide et son nombre de naissances, et fixe les effectifs sur une bibliographie qui, écrit-il, suggère dix à quinze souris par procédure.
Objectifs
L'obestatine est une petite hormone produite principalement dans le tube digestif et distribuée dans divers organes et tissus. Cette hormone a des effets très bénéfiques sur le muscle squelettique, dont elle favorise la régénération. Cependant, le rôle de cette hormone dans le tissu musculaire cardiaque pathologique demeure peu clair de nos jours. Par conséquent, l'objectif principal de la présente étude est d'explorer la capacité de l'hormone en tant que traitement possible de la pathologie cardiaque associée à la perte musculaire consécutive au cancer. L'atrophie et la fonte musculaire sont des complications extrêmement graves du cancer et constituent la principale cause de décès chez de nombreux patients. L'atrophie et le dysfonctionnement du muscle cardiaque sont communs à pratiquement tous les types de tumeurs, réduisant la qualité de vie des patients. Au cours des dernières décennies, la réponse immunitaire s'est imposée comme une composante majeure de la pathologie cardiovasculaire et du muscle cardiaque. Pour cette raison, il nous semble intéressant de réaliser cette étude dans laquelle nous établirons : - Le profil des cellules inflammatoires qui atteignent le cœur en présence de différentes tumeurs. - Le rôle de l'hormone sur ces populations inflammatoires atteignant le cœur.
Bénéfices attendus
- Identification de nouvelles voies thérapeutiques ou de traitements liés aux cellules inflammatoires infiltrant le cœur. - Établissement de la petite hormone obestatine comme agent thérapeutique anti-inflammatoire potentiel.
Procédures
Au cours du développement de ce projet, les souris seront soumises à 4 interventions différentes : 1.- Echographie du cœur: Cette intervention sera réalisée sur toutes les souris du projet. L'acquisition a une durée de 10 minutes. Toutes les souris seront soumises à cette ntervention. 2.- Anesthésie : une anesthésie sera pratiquée pendant les échographies, pendant l'implantation des cellules tumorales et lors de la pose de mini-pompes osmotiques. La durée de l'anesthésie pendant l'échographie sera de 10 minutes. La durée de l'anesthésie pendant l'implantation des cellules tumorales sera de 20 minutes (pancréas) et 5 min (sous-cutanée). La durée de l'anesthésie pendant la pose de mini-pompes osmotiques sera de 10 minutes. Toutes les souris seront soumises à cette intervention. 3.- Induction de tumeur pancréatique: Des cellules tumorales pancréatiques seront implantées dans le pancréas sain de souris. Le développement de la tumeur dure trois semaines. A effectuer sur 45 souris. Intervention d'une durée de 20 minutes 4.- Induction tumorale sous-cutanée: Des cellules tumorales du pulmon seront implantées sur le flanc de la souris. Le développement de la tumeur dure quatre semaines. A effectuer sur 45 souris. Intervention d'une durée de 5 minutes 5.- Pose de mini-pompes osmotiques sous cutanées et infusion continue de l’hormone: les mini-pompes resteront implantées pendant 15 jours. A effectuer sur 60 souris. Intervention d'une durée de 10 minutes
Impact sur les animaux
- L'utilisation de l'anesthésie pour procéder à l'immobilisation de l'animal peut entraîner une baisse de la température de l'animal. - L'implantation de cellules tumorales dans le pancréas expose les animaux à un risque de blessure et peut provoquer une douleur modérée au niveau de l'incision. Les souris peuvent avoir une mobilité réduite. L'implantation de cellules tumorales sous-cutanées implique une petite piqûre, sans irritation observable. Les animaux peuvent simplement présenter des symptômes de stress. - Le développement de la tumeur dans les deux modèles peut entraîner une gêne pour les animaux, en particulier en ce qui concerne la mobilité dans les derniers stades du développement de la tumeur. Dans les deux modèles, les souris peuvent présenter une réduction de l'ingestion. - La mise en place de mini-pompes expose les animaux à un risque de blessure et stress.
Devenir
A l'issue de chacune des procédure les animaux seront mis à mort afin que l'infiltration inflammatoire du muscle cardiaque puisse être analysée.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux pour l'étude des pathologies est standardisée et largement utilisée. Cette étude serait irréalisable chez l'homme, et bien qu'il existe des modèles animaux peut-être plus proches de l'homme, des éléments tels que leur acceptation par la communauté scientifique, leur coût/bénéfice, et leur disponibilité (stabulation, protocoles expérimentaux, nombre d'animaux, etc.), explique l’utilisation de modèles murins, adaptés à ce type d'étude. Les modèles in vivo sont une étape essentielle dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des complications cardiaques. Il n'existe actuellement aucun modèle cellulaire ni aucune approche computationnelle permettant de visualiser le problème de l'acquexia.
Réduction
La bibliographie examinée suggère l'utilisation d'un nombre compris entre 10 et 15 souris pour les procedures signalées ci-avant. Ce nombre est décrit comme le plus approprié pour obtenir des données fiables et une analyse statistique robuste. On essaiera d'obtenir le maximum d'informations à partir d'un seul animal afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés
Raffinement
Les animaux seront logés dans des cages avec un maximum de 5 animaux par cage. L'air, l'humidité et la température doivent être contrôlés dans l'animalerie. Les animaux doivent avoir accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Afin de réduire les comportements nuisibles ou anormaux, les animaux doivent bénéficier de techniques d'enrichissement appropriées. Toutes ces techniques d'enrichissement permettent aux animaux de développer des capacités d'adaptation telles que la recherche de nourriture, la manipulation et les activités d'exploration. La surveillance des animaux s'effectue selon une grille de score de points limites.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. Grâce à ces modèles de souris, nous pouvons obtenir très rapidement des résultats pour la recherche, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce dont la reproduction serait beaucoup plus longue et dont le nombre de naissances serait beaucoup plus faible. Les animaux adultes ont été choisis pour le projet car ils ont une réponse inflammatoire suffisamment élevée pour être surveillée.
Pharmacothérapies pour améliorer la structure-fonction artérielle dans des conditions physiopathologiques liées à des altérations des fibres élastiques (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 383 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacune passe neuf séances de quinze minutes de mesure de pression artérielle par manchon à la queue. Un tiers subit quatorze jours d'hypoxie intermittente, avec perte de poids et baisse de la prise alimentaire les premiers jours. Les deux autres tiers portent une délétion du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1 qui altère leurs vaisseaux dès la naissance et peut conduire à des sténoses ou des anévrismes, et une partie est hébergée jusqu'à 24 mois pour l'étude du vieillissement, isolée quand les congénères meurent de vieillesse. Le porteur annonce que ces travaux permettront de proposer la stratégie thérapeutique la plus appropriée pour trois maladies humaines. Les organes vitaux, eux, sont prélevés sur chaque souris au cours d'une procédure sans réveil.
Objectifs
L'élasticité des grosses artères est essentielle pour permettre une perfusion correcte des tissus. Les fibres élastiques, responsables de l'élasticité artérielle, sont composées à 90% d'élastine (Eln) et à 10% de microfibrilles riches en fibrilline-1 (Fbn1), et ne sont produites que jusqu'à la fin de l'adolescence, ne faisant ensuite que fonctionner tout en se dégradant (avec perte d'élasticité artérielle) jusqu'à la fin de la vie. Cette dégradation de l'élasticité artérielle a des conséquences délétères majeures sur la fonction cardiaque, la pression et la circulation sanguines, et la perfusion des organes. C'est ce qui advient au cours du vieillissement normal, mais aussi dans les maladies génétiques liées à l'organisation anormale des fibres élastiques : syndrome de Williams-Beuren (rétrécissements artérielles dûs à la déficience en Eln) et syndrome de Marfan (anévrismes dûs à la déficience en Fbn1). Des études récentes ont également montré que l'altération des fibres élastiques et les dysfonctions artérielles correspondantes (dont la rigidification artérielle) sont associées à l'hypoxie intermittente générée par le syndrome d'apnée obstructive du sommeil, qui concerne 10-20% de la population générale et jusqu'à 30-50% des personnes âgées. Il a préalablement été démontré que 3 traitements pharmacologiques, administrés à des souris, peuvent, dans des situations fixées, protéger et/ou restaurer la production des fibres élastiques et diminuer la rigidité artérielle. Ces 3 traitements n'ayant jusqu'alors pas été appliqués dans les mêmes situations pathologiques, ce projet propose de comparer de manière systématique chez les mêmes souris l'efficacité des 3 traitements, dans trois modèles pathologiques présents au laboratoire, en fonction du sexe et de l'âge. Le but ultime est de proposer le traitement le plus efficace pour chacune des trois pathologies, chez les patients humains. Le projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs qui apporteront chacun l'accès à des techniques spécifiques différentes.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche est motivé par l'importance en santé publique de la dégradation des fibres élastiques artérielles dans différentes situations physiopathologiques comme le vieillissement, la déficience génétique du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1, ou l'hypoxie intermittente causée par le syndrome d'apnée du sommeil. Ceci conduit à des dysfonctions artérielles et à l'hypertrophie et l'insuffisance cardiaques induites, couplée à une hémodynamique altérée, une mauvaise perfusion et une dysfonction des organes. La réparation des fibres élastiques dégradées est donc un enjeu thérapeutique majeur. La littérature fait état de nombreux travaux à ce sujet (plusieurs milliers, motsclefs: elastic fiber artery), montrant l'intérêt général pour comprendre les mécanismes et améliorer ou restaurer l'élasticité artérielle. Les résultats obtenus sur ces modèles de souris permettront de vérifier et de comparer les efficacités des trois traitements pharmacologiques dans le maintien ou l'amélioration de l'élasticité artérielle et des paramètres physiologiques associés chez des animaux modèles de 3 pathologies humaines. Suivant la pathologie, le traitement le plus efficace pourra s'avérer ne pas être le même, et nos résultats permettront donc de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique la plus appropriée chez les patients atteints par chacune de ces trois affections.
Procédures
1/3 des animaux seront exposés à la normoxie ou à l'hypoxie durant 14 jours avant leur mise à mort. Les autres animaux (2/3) ont un gène délété qui altère, dès la naissance, la plasticité et l'élasticité de leurs vaisseaux : 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de l'élastine ou seront les animaux témoins de ceux-ci, et 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de la fibrilline-1 ou seront les animaux témoins de ceux-ci. Dans chacun de ces 3 groupes d'animaux, les effets de 3 traitements pharmacologiques seront étudiés : un premier tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le premier traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), un deuxième tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le deuxième traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), et le dernier tiers des animaux de chaque groupe sera injecté dans la veine de la queue 3 fois à 5 jours d'intervalle juste avant la fin de l'expérimentation avec le troisième traitement pharmacologique ou du sérum physiologique (durée de l'injection 30 secondes). Tous les animaux seront soumis à des mesures de pression artérielle vigile (3 fois par jours pendant 3 jours, à raison de 15 minutes par session), non-invasives, par sphygmomanométrie à la queue (tail-cuff). La fonction cardiaque et aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole, par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. A la fin de l'ensemble des procédures, des prélèvements d'organes seront réalisés sous anesthésie et analgésie, entrainant la mort des animaux. Ces organes seront utilisés par la suite dans des expériences de physiologie, de biochimie, d'histologie et de biologie moléculaire, et pour réaliser des cultures de cellules musculaires lisses vasculaires. De plus, les animaux mis en vieillissement pour former les groupes des souris âgées de 24 mois auront, par conséquent, un hébergement de longue durée. Les expériences d'échographie sur animal anesthésié seront réalisées dans l'EU2 ; toutes les autres expériences seront réalisées dans l'EU1, porteur principal du projet.
Impact sur les animaux
La mesure sur animal éveillé de la pression artérielle peut induire un léger stress. Les animaux en hébergement longue durée pour du vieillissement pourraient se retrouver isolés si leurs congénères venaient à mourir de vieillesse. La mise en hypoxie des animaux entraine une perte de poids les premiers jours le temps de l'adaptation à la restriction d'air de façon récurrente et répétée et une diminuation de leur prise alimentaire. Les animaux génétiquement modifiés ont une perte l'élasticité et de plasticité de leur vaisseaux pouvant conduire à des sténoses ou à des anévrismes. L'administration des traitements testés devraient limiter les effets délétaires de l'hypoxie ou celles induites par les modifications génétiques, voire améliorer la plasticité et l'élasticité vasculaire.
Devenir
Tous les animaux se verront appliquer un prélèvement d'organes vitaux terminal au cours d'une procédure sans réveil. Aucun animal ne restera donc en vie à la fin des procédures expérimentales. Ces prélèvements d'organes permettront des études d'artériographie de pression, d'histologie classique ou en microscopie synchrotron, de biologie moléculaire (expression des gènes et protéines liés aux fibres élastiques) et, concernant l'aorte, pour généréer des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires.
Remplacement
Remplacer : la mécanique et la réactivité vasculaires reposent sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires, ainsi qu'une interaction entre les signaux circulants et les différents types cellulaires vasculaires, aussi bien que sur l'interaction entre les différents types de cellules vasculaires structurées de manière très précise dans la paroi, nécessitant forcément une approche in vivo. Aucune méthode alternative ne peut donc se substituer à l’utilisation des animaux pour la réalisation de notre projet car il requiert une approche intégrée.
Réduction
Réduire : Sur la base des résultats de nos expériences publiées antérieurement et du niveau de dispersion des données constaté chez les souris, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 12 animaux par groupe chez les adultes (16 par groupe à mettre en vieillissement pour obtenir 12 animaux agés, du fait du taux de décès spontané avant 24 mois) sont prévus mais le maximum de procédures expérimentales non-sévères seront réalisées sur tous les animaux, ce qui permet de ne pas devoir recourir à des groupes d'animaux séparés/additionnels pour réaliser des procédures différentes, sauf nécessité absolue due à l'impossibilité de réaliser de multiples études de physiologie sur différents organes vivants en même temps. Aussi, nous aurons besoin de constituer des groupes témoins non-traités pour chaque traitement, sans pouvoir les mutualiser de manière générale. Cependant, deux des traitements pharmacologiques étant tous deux simplement ajoutés à l'eau de boisson des animaux, nous constituerons des groupes témoins mutualisés pour ces deux traitements (animaux buvant de l'eau de boisson normale), ce qui permettra une réduction sensible du nombre d'animaux utilisés. Après la réalisation des procédures in vivo et l'euthanasie des animaux, nous allons collecter les organes et tissus de ces mêmes animaux pour les utiliser au cours des études ex vivo et in vitro post-mortem, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, un certain nombre d'expériences de signalisation cellulaire seront menées sur des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires issues de nos souris, ce qui permettra de réduire encore le nombre des animaux nécessaires pour atteindre nos objectifs.
Raffinement
Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie des animaux. De plus, une surveillance attentive sera réalisée pendant l'hébergement et lors de la réalisation des procédures expérimentales afin d'évaluer en permanence les nuisances subies (douleur, stress, ...), de façon à pouvoir appliquer immédiatement un renforcement analgésique et/ou anesthésique si nécessaire et faire en sorte que ces nuisances soient absentes ou réduites à leur niveau minimum. Les conditions de l'hébergement de longue durée des animaux en vieillissement, seront particulièrement surveillées afin de limiter au maximum les risques de décès spontané liés à l'âge. L'organisation des cages sera optimisée (mise en place d’enrichissement supplémentaire pour les animaux âgés en situation d’isolement, croquettes mouillées au sol dans les cages pour les animaux âgés). Les conditions d'expérimentation seront aussi optimisées pour le confort des animaux, avec habituation à la contention (mesures de pression artérielle) et gel oculaire appliqué lors d'anesthésies longues (échographie). Des points limites prédictifs et précoces, gradés précis et adaptés, ainsi que des critères d'arrêt, sont définis, et un arbre décisionnel mis en place, permettant aux personnels de décider des actions à réaliser pour le bien-être des souris et l'application des points limites et critères d'arrêt définis. Les expérimentateurs et soigneurs seront formés pour appliquer ces procédures et règles de protection du bien-être animal, conformément à la règlementation. Aussi, les lignées de souris génétiquement déficientes pour l'élastine ou la fibrilline-1 sont à phénotype dommageable car les individus homozygotes meurent quelques jours ou semaines après la naissance. Les animaux homozygotes n'étant pas un objet de notre étude, ils ne seront pas produits, en n'effectuant que des croisements d'animaux de type sauvages avec des animaux hétérozygotes. En raison d'une mortalité intra-utérine partielle des animauxhétérozygotes pour l'élastine, les mères seront particulièrement surveillées en période périnatale (deux fois par jour au lieu d'une) de façon à détecter au plus vite tout problème et appliquer les mesures de soin ou critères d'arrêt définis. Le transport des animaux entre les 2 EU est fait par un expérimentateur compétent, en cage d'hébergement standard, temporairement occultée, avec eau, croquettes et enrichissement.
Choix des espèces
Nos travaux évalueront l'efficacité réparatrice de trois traitements pharmacologiques sur les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme (déficits génétiques responsables des syndromes de Williams-Beuren et de Marfan, et hypoxie intermittente due à l'apnée obstructive du sommeil), en fonction de l'âge et du sexe. Notre étude concerne la physiologie cardiovasculaire et les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche fondamentale dans ce domaine, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec nos résultats antérieurs et avec la littérature. Les souris utilisées dans le cadre de ce protocole sont âgées de 6 mois (jeunes adultes) et de 24 mois (âgées), ce qui correspond aux âges ciblés pour une vérification optimale des potentialités thérapeutiques des trois traitements pharmacologiques sur nos modèles murins physiopathologiques.
Développement de nanoparticules lipidiques pour limiter l’hyperplasie intimale après une intervention chirurgicale vasculaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
L'abdomen ouvert sur sept centimètres, l'aorte incisée, un cathéter à ballonnet poussé jusqu'aux artères iliaques pour en abîmer la paroi : l'intervention dure environ 90 minutes. 480 rats vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La lésion sert à provoquer un rétrécissement artériel sur lequel un gel de nanoparticules lipidiques sera testé, avec pour effets possibles une occlusion des artères et une thrombose. Le porteur ne donne aucun calcul pour l'effectif et se contente d'évoquer un "plan expérimental stéréotypé" permettant la puissance statistique voulue.
Objectifs
L'hyperplasie intimale (HI) est un phénomène complexe qui entraine la diminution progressive de la lumière du vaisseau sanguin puis son obstruction. Elle apparait après des gestes de chirurgie vasculaire comme un pontage ou encore une pose de stent. L'HI représente une des complications majeures non encore résolue à ce jour, de ces interventions chirurgicales pratiquées de manière courante. Ce phénomène survient rapidement après le geste initial : entre le 3ème et le 18ème mois. Ce phénomène considéré comme une "surcicatrisation" au niveau de la paroi artérielle conduit au rétrécissement de l'artère jusqu'à son occlusion, et nécessite une nouvelle intervention chirurgicale. Diverses approches ont été envisagées pour limiter le phénomène d’HI telles que l’utilisation de matériaux biocompatibles synthétiques pour remplacer les vaisseaux sanguins, ou alors l’utilisation d’endoprothèse modifiés en surface (stent enrobé par des agents thérapeutiques) lors d’une recanalisation. Cependant, ces approches thérapeutiques peuvent reconduire à l'apparition d'HI. Dans ce projet, nous cherchons à développer un biomatériau de type hydrogel de nanoparticules lipidiques contenant une substance thérapeutique capable de limiter ce phénomène d’HI. Le gel pourrait être appliqué sur la paroi externe des vaisseaux (le site d’intervention) par le chirurgien après la suture vasculaire. L'agent thérapeutique se trouvant dans le gel sera diffusé le long de la paroi des vaisseaux sur le long terme et limiterait l'HI, ce qui diminuerait considérablement le taux de réintervention chirurgicale. À travers les expérimentations animales, nous cherchons à démontrer l'efficacité de ce biomatériau de type hydrogel sur un modèle animal d'HI. Pour ce faire, nous allons induire l'HI par un geste chirurgical chez le rat puis appliquer le gel sur le site d'intervention. Après 1 à 4 semaines, nous étudierons les effets de l’hydrogel sur le développement de l’HI.
Bénéfices attendus
Le développement de l’hyperplasie intimale (HI) suite à une intervention chirurgicale des vaisseaux est un phénomène très fréquent. En fonction de type d’intervention, plus de 50% des patients peuvent développer l’HI. De nos jours, seul traitement étant réintervention chirurgicale, il est primordial de prévenir et de limiter son apparition. Le principe de cet hydrogel des nanoparticules lipidiques (NpL) est d’appliquer directement sur le site d’intervention à la fin de la chirurgie, ce qui ne nécessite pas une réintervention chirurgicale chez les patients. Par ailleurs, il est possible de moduler le temps de libération des substances à partir de l'hydrogel en modifiant la quantité des composants du gel. L’intérêt étant de limiter la surcicatrisation après la mise en place de la bonne cicatrisation, la libération de molécule thérapeutique peut être retardée dans le temps. De plus, grâce à ses composants biodégradables, il n’y a peu, voire pas de résidu après l’absorption par l’organisme. Notre hydrogel des NpLs présente donc une meilleure biocompatibilité par rapport à d’autres types de nanoparticules. Ce type d’hydrogel contenant une autre substance thérapeutique a déjà été étudié sur un cancer cérébral. Les résultats ont montré une amélioration de taux de survie chez les animaux cancéreux. Si les résultats de ce projet sont prometteurs, cela permettra de proposer une nouvelle thérapie pour l’HI et d’ouvrir la possibilité d’application de ce type d’hydrogel pour d’autres pathologies.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’induction d’hyperplasie intimale (HI) au niveau de l’aorte abdominale (incision) et des artères fémorales (lésion pariétale). L’intervention durera environ 90 min au total. Sous l’anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront des piqûres d’analgésiques en sous-cutanée en préopératoire. 15 min plus tard, l’abdomen sera incisé d’environ 7 cm. Les animaux des groupes « HI » subiront une petite incision au niveau de l’aorte abdominale et l’introduction de cathéter à ballonnet jusqu’aux artères iliaques pour une lésion pariétale. Après avoir retiré le cathéter, l’incision de l’aorte et l’abdomen seront refermées par des points de suture. De l’ouverture à la fermeture de l’abdomen, la durée estimée est d’environ 45-50 min. L’animal subiront une administration sous-cutanée d’analgésique en post-opératoire avant de retourner dans sa cage d’initial (environ 2h plus tard après l’intervention).
Impact sur les animaux
Au cours de leur vie, ils ressentiront des inconforts liés à la préhension et à la manipulation, qui seront minimisés par l’intervention d’un seul expérimentateur. Durant la procédure chirurgicale, les douleurs liées à l’intervention seront gérées et soulagées par l’administration des analgésiques. L’hypothermie sera également gérée par l’utilisation de tapis chauffant et d’une couveuse. Ils pourront ressentir l’angoisse liée à l’isolement pendant le rétablissement post-opératoire, qui durera au maximum une demi-journée. Il peut également y avoir des effets indésirables du modèle pathologiques d’HI tels que l’occlusion des artères et/ou la thrombose.
Devenir
Utilisation de tous les animaux pour récupérer les tissus artériels et étudier les effets de l'hydrogel sur le développement de l'hyperplasie intimale.
Remplacement
Dans ce projet, nous utilisons 5 nanoparticules (NpLs) différentes, ce qui leur donnent des caractéristiques physico-chimique différentes. La biocompatibilité et la capacité d’internalisation des NpLs varient en fonction de ces caractéristiques. Nous avons effectué des études sur des cellules (in vitro) pour définir une NpL parmi les 5 qui présente la plus faible toxicité et le meilleur taux d’internalisation dans les cellules. Suite à ces résultats, nous utiliserons la seule NpL définie pour des expériences sur les animaux (in vivo). En revanche, l’hyperplasie intimale (HI) étant due à des mécanismes et des processus de régulation complexe de l'organisme, il n’est pas possible de reproduire ces conditions pathologiques in vitro pour étudier l’efficacité de notre biomatériau d’hydrogel sur la pathologie. C’est pourquoi nous avons recours au modèle animal en choisissant le rat comme modèle classique de mammifère qui est également un modèle d’HI bien établi dans la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies avec des cartons et des cabanes et sont surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les rats seront manipulés uniquement par l’expérimentateur du projet pour l’habituation à la préhension permettant de réduire le stress lié. Suite à l’intervention, une surveillance accrue sera mise en place par l'expérimentateur afin d'aller voir ces animaux opérés tous les jours pendant au moins une semaine, en plus de la visite quotidienne par les animaliers. Après l’opération, chaque animal sera mis individuellement dans une cage placée dans une couveuse réglée à 27°C pendant quelques heures pour le rétablissement post-opératoire puis sera remis avec d’autres rats en groupe social. L'isolement ne dépassera pas 24h. Afin de réduire au maximum les douleurs liées à l'intervention, les analgésiques seront administrés en préopératoire, post-opératoire et dans le cas d'apparition de signes cliniques. La pesée et l’évaluation de comportement et d'apparence selon la grille du score seront également effectuées pour d’assurer le bien-être de l’animal.
Choix des espèces
Les rongeurs sont recommandés par les agences de régulation du médicament (FDA, EMEA) comme première approche. L’utilisation des rats est préférable au vu du type d’intervention. Il aurait été très difficile d’effectuer ces interventions chez les souris à cause de leur petite taille. La perte liée à la chirurgie aurait été beaucoup plus importante chez la souris que chez le rat. Par ailleurs, le rat est le modèle animal d’hyperplasie intimale (HI) couramment utilisé et très bien établi dans la littérature. Chez l’Homme, les pathologies vasculaires surviennent à l’âge adulte. Les adultes sont donc sujets à recevoir des interventions chirurgicales des vaisseaux et sont susceptible de développer l’HI par la suite. De ce fait, nous travaillerons sur les rats adultes âgés de 18 à 24 semaines pour reproduire l’HI.
Évaluation des effets thérapeutiques cardiaques d’un nouveau virus adéno-associé
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trente-deux souris sont cathétérisées jusque dans le cœur par la veine jugulaire, sous anesthésie générale, et ne sont pas réveillées. 126 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 94 d'entre elles et modéré pour 32. Baguées et biopsiées à trois semaines pour vérifier leur statut génétique, elles reçoivent une injection de virus adéno-associé à sept semaines, puis de trois à cinq électrocardiogrammes et un examen échographique, certaines jusqu'à l'âge de soixante semaines. Le porteur justifie la mise à mort systématique après cathétérisme par l'impossibilité de suturer la veine jugulaire, qu'il faut donc ligaturer, et par le risque que le cathéter lèse les valves cardiaques et provoque une insuffisance cardiaque droite.
Objectifs
L'objectif général du projet est d'évaluer les effets thérapeutiques d'un virus adéno-associé sur un modèle de souris présentant des troubles de la conduction de l'influx électrique cardiaque liés à une perte de fonction d'un gène impliqué dans cette conduction. Chez les humains, les mutations conduisant à une perte de fonction de ce gène sont à l'origine de pathologies génétiques responsables de morts subites (syndrome de Brugada et troubles de la conduction cardiaque) pour lesquelles il n'existe pas de thérapie préventive. Le virus adéno-associé a été montré, dans un modèle cellulaire, comme étant susceptible d'avoir un intérêt thérapeutique. Les objectifs spécifiques du projet sont d'évaluer les effets du virus adéno-associé sur : 1. la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, à l'aide d'enregistrements de l'électrocardiogramme ; 2. la survenue d'arythmies ventriculaires ; 3. l'apparition de fibrose cardiaque secondaire à la perte de fonction du gène de la conduction au cours du vieillissement. Ces deux derniers objectifs ne seront réalisés que si le virus adéno-associé permet une amélioration de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du virus adéno-associé sont une amélioration significative, voire une restauration complète de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, et une disparition des arythmies ventriculaires et du remodelage fibrotique cardiaque.
Procédures
Trois semaines après la naissance, les souris seront baguées et biopsiées (afin de vérifier leur statut génétique) sous anesthésie générale. Dans une première étape du projet, 32 souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 3 enregistrements de l'électrocardiogramme à l'âge de 7 (durée de 3 min), 9 (3 min) puis 12 semaines (15 min), et un examen échocardiographique (15-20 min) à 12 semaines, réalisés sous anesthésie générale. En fonction des résultats obtenus dans la première étape, 32 autres souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines et 2 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7 puis 9 semaines, réalisés sous anesthésie générale, puis une exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque, d'une durée de 20-30 min, réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale, sans réveil. Enfin, en fonction des résultats obtenus dans l'étape 1, 20 souris supplémentaires seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 5 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7, 9, 30, 45 et 60 semaines et 1 examen échocardiographique (15-20 min) à 60 semaines, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé dans ce projet est étudié depuis de nombreuses années. Ces souris présentent un trouble de la conduction de l'influx électrique cardiaque qui augmente progressivement avec l'âge, comme les patients, mais qui ne conduisent pas à des blocs complets de la conduction comme observé chez certains patients ou à la survenue de tachycardies ventriculaires sévères et/ou fibrillation ventriculaire comme observé chez d'autres patients. Elles se développent normalement et ne présentent pas de signes notables de souffrance. L'injection des virus adéno-associés sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale au point d'injection afin d'éviter stress et douleur. Les examens réalisés pour étudier les effets cardiaques des virus adéno-associés (enregistrement de l'électrocardiogramme et échographie) ne sont pas des techniques générant de la douleur mais ils seront cependant réalisés sous anesthésie générale pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable. Pour les mêmes raisons, l'exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque sera également réalisée sous anesthésie. Cette procédure entraine une douleur au niveau du point de ponction cutanée pour cathétériser la veine jugulaire, qui sera prévenue par une anesthésie locale, comme cela est fait chez les patients. En ce qui concerne le virus adéno-associé, une étude antérieure a montré qu'il n'entraine pas d'effet indésirable chez des souris sauvages aux doses conduisant à un effet bénéfique dans le modèle cellulaire.
Devenir
A l'issue de la procédure 2 (effets du virus adéno-associé sur la fonction cardiaque), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens immunohistochimiques. A l'issue de la procédure 3 (exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque), les souris sont systématiquement mises à mort parce que cette procédure peut avoir des conséquences néfastes sur la souris. En effet, il est possible, mais difficile de suturer la veine jugulaire après avoir retiré le cathéter, ce qui nous oblige à la ligaturer pour éviter les hémorragies, perturbant ainsi le retour veineux depuis la tête de l'animal. Par ailleurs, bien que les cathéters aient un diamètre très faible (1/3-1/2 mm), ils sont suffisamment gros pour léser les valves cardiaques, ce qui peut induire une insuffisance cardiaque droite à plus ou moins long terme. La mise à mort des souris permet en outre de prélever le cœur pour des études biochimiques. A l'issue de la procédure 4 (effets à long terme du virus adéno-associé), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens histologiques.
Remplacement
Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée avec un modèle cellulaire, puis une étude in vivo chez la souris sauvage qui montrent que la surexpression du virus adéno-associé entraine une augmentation de l'expression du gène cible. Ces études sont à la base de ce projet réalisé sur un modèle pertinent pour la pathologie humaine. Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur la fonction cardiaque : l'observation d'un effet bénéfique sur un modèle cellulaire est un pré-requis mais ne préjuge en rien de l'efficacité in vivo. Très spécifiquement dans le cadre de ce projet, les effets protecteurs de ce traitement sur les anomalies structurales du myocarde (fibrose) apparaissant au cours du vieillissement ne peuvent être appréhendés que sur l'animal vivant.
Réduction
Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (électrocardiographie et échocardiographie), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le projet est organisé en deux étapes successives. La seconde étape ne sera réalisée que si la première démontre que les souris traitées avec le virus adéno-associé présentent une amélioration significative de leur conduction cardiaque. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. Leur taille a été déterminée à l'aide du logiciel de statistiques Sigmastat sur la base de notre expérience antérieure. Une analyse statistique des résultats sera réalisée avec le même logiciel.
Raffinement
Lors du sevrage, le prélèvement d'une biopsie pour déterminer le statut génétique des souris est réalisé sous anesthésie générale. Les souris sont hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels ou de cabanes pour se camoufler et/ou de frisottis pour fabriquer des nids. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale. L'exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié sous anesthésie.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du gène de la conduction. Ce modèle est bien caractérisé et représente un bon modèle des pathologies humaines résultant des mutations "perte de fonction" de ce gène. Les souris seront injectées avec les virus adéno-associés à l'âge de 7 semaines, puis étudiées jusqu'à l'âge de 12 semaines dans la première étape, et de 60 semaines dans la seconde, parce que ces pathologies ne touchent que très rarement les enfants et les adolescents. Les souris utilisées seront des mâles et des femelles dans des proportions comparables parce que les pathologies d'intérêt chez l'humain touchent tous les genres. L'injection du virus à l'âge de 7 semaines permet, d'une part, de réduire la quantité d'AAV9 injectée et, d'autre part, d'obtenir une expression optimale de l'AAV9 avant d'en étudier les effets cardiaques chez les jeunes souris adultes (9, puis 12 semaines). Si le traitement s'avère efficace sur la conduction de l'influx électrique cardiaque, l'étude réalisée à l'âge de 60 semaines permettra de déterminer ses effets à long terme sur l'apparition de fibrose cardiaque observé normalement chez ces souris.
Inflammation pulmonaire et altérations cardiovasculaires dans un modèle de Bronchopneumpathie Obstructive Chronique (BPCO)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
352 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 198 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacun subit la totalité des gestes du protocole. Sur animal éveillé, ils passent quinze minutes en pléthysmographie, quinze minutes d'épreuve d'effort sur tapis, quinze minutes de mesure de pression artérielle à la queue, et une prise de sang deux jours après une infection pulmonaire simulée. Sous anesthésie, un emphysème leur est induit, leur fonction cardiaque est mesurée par échographie et une sonde relève la pression transœsophagienne. Comme effets attendus, le porteur ne décrit pourtant qu'une "difficulté respiratoire modérée à l'exercice", une réduction de l'activité physique et un stress lié aux manipulations sur animal éveillé.
Objectifs
Les changements rapides dans notre environnement peuvent perturber l'équilibre délicat de nos poumons, entraînant des problèmes de santé tels que l'asthme et la Bronchopneumopathie Obstructive chronique (BPCO), une maladie pulmonaire chronique. Les substances que nous respirons peuvent également affecter d'autres parties de notre corps, comme le cœur, les vaisseaux sanguins, le cerveau, les muscles et les reins. Les infections virales ou bactériennes peuvent aggraver la BPCO, et des problèmes cardiaques sont fréquents chez les personnes atteintes de BPCO ou d'emphysème qui est une maladie qui entraine la destruction des alvéoles des poumons. Cela rend la respiration difficile, car les poumons ont du mal à se remplir d'air et à expulser le dioxyde de carbone. Comprendre comment cette maladie se développe ou s'aggrave est complexe, et nous ne comprenons pas encore complètement comment ils progressent dans le temps. Pour mieux comprendre comment les problèmes cardiaques se développent chez les personnes atteintes de BPCO, nous avons créé un modèle chez le rat qui imite cette maladie. Notre objectif est d'étudier comment la taille de l'emphysème affecte le cœur et les vaisseaux sanguins chez les rats, et comment l'inflammation et le vieillissement contribuent aux problèmes respiratoires et cardiaques après une infection pulmonaire. Nous allons également tester différentes approches pour réduire les impacts sur le système cardiaque chez les personnes atteintes de BPCO.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette recherche seront principalement de comprendre et d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents des répercussions cardiaques de l'emphysème. En analysant les composantes de l'inflammation et du vieillissement, nous visons à élucider les intrications complexes entre ces processus, offrant ainsi des perspectives plus approfondies sur les facteurs qui contribuent aux dysfonctionnements cardiaques observés dans le contexte de la BPCO. De plus, en éclaircissant les liens entre l'inflammation, le vieillissement et la pathologie cardiaque, cette recherche pourrait contribuer à la découverte de biomarqueurs potentiels et à la mise en évidence de voies thérapeutiques ciblées.
Procédures
La totalité des animaux seront soumis aux mêmes gestes techniques suivants: sur animal éveillé la pléthysmographie/fonction respiratoire (15 minutes par animal), tapis métabolique/épreuve d'effort (15 minutes par animal), mesure non invasive de la pression artérielle à la queue (15 minutes par animal), prélèvement sanguin de 0,1 mL sera effectué à la queue deux jours après avoir mimé une infection pulmonaire (environ 1 minute par animal). L'animal sera anesthésié pour induire l'emphysème (10 minutes au total), analyser la fonction cardiaque par échographie (environ 15 minutes par animal) et enfin mesurer la pression transœsophagienne (environ 15 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Nous avons maintenant plus de 5 ans de recul sur ce modèle. Les animaux peuvent présenter les symptômes classiques de l'emphysème pulmonaire chez l'homme, tels qu'une difficulté respiratoire modérée à l'exercice et une réduction de l'activité physique. De plus, un stress lié aux manipulations non invasives sur animal éveillé peut exister chez l'ensemble des animaux (prise de la pression artérielle, prise de sang et épreuve d'effort).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre des prélèvements d'organes. L'objectif principal de cette euthanasie est de réaliser une exploration histologique approfondie, mettant particulièrement l'accent sur des organes tels que le cœur et les poumons. Ce processus est essentiel pour une compréhension détaillée des éventuelles altérations histopathologiques et pour valider les atteintes pulmonaires et cardiaques.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode en laboratoire capable de reproduire les conditions exactes rencontrées chez les personnes atteintes d'emphysème ou de BPCO. Pour mieux comprendre ces maladies et leurs mécanismes, des expériences sur des rats sont nécessaires. Cela nous permet d'étudier les processus inflammatoires qui se produisent dans les poumons lors de la BPCO. Ces expériences sont difficiles à réaliser chez les humains, et il n'existe pas de modèle cellulaire qui puisse reproduire parfaitement la maladie.
Réduction
Nous avons maintenant plus de 5 ans de recul sur ce modèle, ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats, en utilisant les données publiées de notre équipe de laboratoire pour une procédure similaire et des études fonctionnelles au niveau cardiaque chez le rat. Nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés grâce à une approche rationnelle et organisée des protocoles : des études échographiques, hémodynamiques et biologiques sont réalisées sur le même rat, ce qui permet de diminuer le nombre de rats et d'optimiser les interprétations. De plus, à la fin du protocole, les animaux sont utilisés par plusieurs groupes de recherche de l'équipe pour étudier les fonctions pulmonaires, cardiaques, vasculaires et musculaires. Afin de réduire le nombre d'animaux et d'augmenter la puissance statistique, un maximum de déterminations seront réalisées sur tous les animaux. Le nombre d'animaux utilisés dans ce protocole (22 animaux par groupe, soit un total de 352 animaux) a été calculé afin d'obtenir des résultats significatifs grâce à des outils statistiques.
Raffinement
Notre objectif est de réduire au strict minimum la détresse imposée aux animaux. Les rats seront hébergés de manière appropriée, avec un enrichissement du milieu permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Les animaux seront surveillés de près et les points limites établis seront appliqués. Nous évaluerons les critères de souffrance animale (rythme cardio-respiratoire, reprise de mouvement, état de prostration, hydratation) ; en cas de détresse anormale, les animaux seront euthanasiés par injection létale d'anesthésique. Chaque jour, les animaux seront contrôlés par un zootechnicien formé lors de sa visite de zone.
Choix des espèces
Le modèle de rat est largement caractérisé sur le plan cardiovasculaire, avec un nombre important de travaux décrits dans la littérature quant à sa faisabilité. La physiologie cardiaque des rongeurs et notamment du rat présente de grandes similitudes avec celle de l’homme, tant au niveau des régulations que de la structure morpho-fonctionnelle. Le modèle rongeur présente l’avantage de permettre des investigations depuis l'échelle cellulaire et moléculaire jusqu'aux mesures sur l'animal en laboratoire, en utilisant les mêmes techniques exploratoires employées chez l’homme. Les études sont réalisées sur des animaux adultes mâles âgés de 8 semaines, ainsi que sur des mâles âgés de 18 mois, afin d'étudier l'effet du vieillissement.
Evaluation de l’efficacité d’un traitement phagique seul ou couplé à la vancomycine dans un modèle d’ostéite à Staphylocoque à coagulase négative résistant à la méticilline chez le rat – Phase Pilote
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Un trou percé au dremel dentaire dans le tibia, un implant de titane posé au contact, une solution bactérienne inoculée dans la plaie : 29 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'opération dure dix minutes sous anesthésie fixe, et l'infection osseuse qui suit, une ostéomyélite localisée, fait partie des effets recherchés. Le porteur veut savoir si des bactériophages, seuls ou associés à la vancomycine, viennent à bout d'un staphylocoque résistant à la méticilline, et il précise que cinq des 29 rats sont utilisés uniquement pour que l'opérateur s'entraîne au geste. Le rat a été retenu parce que son tibia est plus gros que celui de la souris, "trop petite" pour que l'implant tienne.
Objectifs
Les infections ostéoarticulaires (ou ostéite) sont des infections qui touchent les os et/ou les articulations. Ce sont des pathologies graves susceptibles d’entraîner un handicap très lourd et parfois de mettre en jeu le pronostic vital. Elles peuvent survenir chez les patients porteurs de prothèse articulaire ou de matériel (clou, plaque, vis…) mais aussi à la suite de traumatismes (fractures ouvertes sans matériel), engendrant des ostéites chroniques. Actuellement, les infections ostéoarticulaires sont le plus souvent dues à des staphylocoques, avec une prédominance des Staphylocoques à coagulase négative et sont traitées par antibiothérapie. Cependant, l’antibiothérapie classique a montré ses limites pour diverses raisons : résistance des souches bactériennes, mauvaise diffusion des antibiotiques dans le tissu osseux, présence de matériel étranger (ex : prothèse) favorisant la formation de biofilm bactérien (lequel protège la bactérie de l’action des antibiotiques). Dans ce contexte, il est donc aujourd’hui nécessaire de trouver des solutions alternatives et/ou complémentaires aux antibiotiques, efficaces pour traiter ces infections. La phagothérapie (usage de bactériophages) apparait aujourd’hui comme une solution pertinente. Les bactériophages sont des virus qui possèdent la particularité de n’infecter que les bactéries, d’être inoffensifs pour tous les organismes eucaryotes tels que les mammifères (humains, animaux) et d’être très spécifiques de l’espèce bactérienne qu’ils attaquent. Ils sont déjà largement utilisés chez l’homme en Europe de l’Est mais, s’agissant d’organismes vivants, leur développement en France se heurte à un cadre réglementaire peu clair et inadapté à la phagothérapie dans la conduite d’essais cliniques. De ce fait, les agences règlementaires demandent la réalisation d’études pré-cliniques préalables. Ce projet se déroulera de façon séquentielle et la première étape se divisera elle-même en deux parties : 1. Entrainement de la pose d’implant dans le tibia du rat non infecté. 2. Mise au point du modèle d’ostéite à Staphylococcus epidermidis résistant à la méticilline chez le rat avec matériel étranger ;
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement thérapeutique dans le traitement des infections ostéoarticulaires. L’efficacité de ce traitement permettra d’étendre le champ des possibilités dans la guérison de ces infections pouvant conduire à l’amputation de certains patients suite à l’échec de l’antibiothérapie seule.
Procédures
- Les rats recevront une injection intrapéritonéale (5 secondes) d’un mélange anesthésique. - Un acte chirugical de 10 min subit par l’animal sous anesthésie fixe : Une incision de 1 cm sera réalisée stérilement au niveau du genou et un trou sera effectué de façon à pouvoir placé l’implant dans un premier temps puis inoculé la solution bactérienne. Deux à trois points de sutures seront réalisés sur le plan cutané afin de refermer la plaie.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur. La phase pilote consistera à calibrer les différentes conditions expérimentales permettant d’induire une infection ostéoarticulaire avec un matériel étranger dans le tibia du rat. La première nuisance sera liée à l’administration du mélange d’anesthésiques. La deuxième nuisance principale est due à la chirurgie en elle-même. Nos expériences précédentes nous ont permis de raffiner l’acte chirurgical afin de limiter la souffrance des animaux. Sous anesthésie fixe, une incision de 1 cm sera réalisée stérilement au niveau du genou et un trou sera effectué à l’aide d’un dremel dentaire de façon à pouvoir placé l’implant en titane. Dans un même temps, l’infection bactérienne sera effectuée au contact de l’implant. Deux à trois points de sutures seront réalisés sur le plan cutané afin de refermer la plaie. Une troisième nuisance également attendue est le développement de l’infection, une ostéomyélite localisée.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (29))afin de récupérer les tibias et implants pour dénombrement bactériens.
Remplacement
Une étude a été réalisée in vitro sur l’efficacité de ce bactériophage sur un grand nombre de souches de S. epidermidis ainsi que dans des modèles de biofilm. Toutefois, l’efficacité de tels composés in vivo peut s’avérer très différente de celle obtenue in vitro tant sur le plan de l’efficacité elle-même que sur la cinétique des phages dans un organisme vivant au niveau du site de l’infection. Également, l’infection ostéoarticulaire est particulière dans le sens où toutes les conditions qui la caractérisent ne peuvent être rassemblées dans un modèle vitro. Enfin, les modèles pré-cliniques sont règlementaires pour le développement de ces nouvelles alternatives thérapeutiques, au vu du peu d’informations existantes sur ce sujet.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Nos expériences passées nous permettent de tester qu’un seul inoculum pour la mise en place de l’infection ostéoarticulaire. 6 animaux par jour d’autopsie (J7, J12, J21, J28) seront nécessaires pour évaluer la charge bactérienne au cours du temps. De plus, pour la phase d’entrainement, seuls 5 animaux seront utilisés pour l’appréhension du geste technique de la pose d’implant dans le tibia du rat.
Raffinement
Nos expériences précédentes nous ont permis de raffiner l’acte chirurgical afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de l’implant au niveau articulaire sera réalisée sous anesthésie fixe. De plus, une analgésie pré et post-opératoire sera réalisée. Le suivi post-chirurgical d’une récupération de la mobilité de l’animal sera mis en place. Durant toute l’étude, La nourriture sera placée directement à l’intérieur des cages et des biberons au bec plus long seront également installés afin de faciliter l’accès aux animaux. La litière sera également changée tous les deux jours Le suivi du poids sera effectué tous les deux jours. Enfin, un programme d’enrichissement de l’environnement (igloo, jouet …) sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle animal préférentiellement utilisé dans la littérature dans ce type d’expérimentation est le rat. En effet, la taille du tibia chez le rat permet un meilleur accès et une meilleure prise d’infection et d’implantation que chez la souris trop petite. Le tibia du rat permet une implantation plus stable et reproductible. Des rats mâles de 250 g seront nécessaires pour la phase pilote.
Édition génomique par CRISPR Cas9 pour traiter les cardiomyopathies liées aux mutations du gène LMNA, dans un modele murin Lmna p.H222P homozygote.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris sont tuées à six mois d'âge, avant l'insuffisance cardiaque qui frappe 80 % d'entre elles vers dix mois chez les mâles et douze chez les femelles. 120 souris porteuses d'une mutation du gène LMNA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. À deux jours de vie, encore éveillées, elles reçoivent une injection intraveineuse d'outils d'édition génomique, puis passent une échocardiographie sous anesthésie chaque mois pendant six mois, l'anesthésie pouvant provoquer une hypothermie et, plus rarement, une défaillance cardiorespiratoire. Le porteur annonce des répercussions "majeures" en santé humaine pour une maladie sans traitement, tout en fixant l'objectif immédiat à la démonstration chez la souris d'une correction déjà obtenue sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines.
Objectifs
Ce projet a pour but l’évaluation de l’effet bénéfique de la correction de la mutation des lamines (protéines fibreuses) chez des souris atteintes d’une maladie génétique touchant le muscle cardiaque. Il a été démontré que cette approche était un moyen de corriger le défaut génétique sur des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) différenciées en cardiomyocytes, porteurs de la mutation des lamines étudiées. Il est nécessaire de réaliser cette approche sur un modèle murin avec la même mutation afin de prouver ce concept en in vivo.
Bénéfices attendus
Correction génique et phénotypique pour les souris traitées. Ce projet peut aboutir à la première démonstration du bénéfice de la correction du génome sur l'atteinte cardiaque dans la cardiomyopathie due à des mutations du gène LMNA. Les repercussions peuvent etre majeures en santé humaine, en tant que medecine personnalisee pour cette pathologie, pour laquelle aucun traitement n'est actuellement disponible.
Procédures
1) Injection intraveineuse à l'âge de 2 jours dans un etat vigile de l'animal. Dans son intégralité (contention+injection), le geste s'effectue rapidement en une dizaine de secondes; 2) Echocardiographie tous les mois, pendant 6 mois, sous anestesie. La durée d’une échocardiographie est de 5 à 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
L'injection intraveineuse est une modalité d’administration peu invasive et facile à mettre en oeuvre, elle peut tout de même engendrer un stress et une faible douleur de courte durée chez le nouveau-né. La fonction cardiaque sera évaluée par échocardiographie, sous anesthésie. Cette technique d'imagerie cardiaque n'est pas invasive, mais l'anesthésie peut induire une hypothermie et dans de rare cas une défaillance cardiorespiratoire. Les effets indésirables attendus sur les animaux sont surtout dûs à un éventuel développement précoce du phénotype dommageable de la lignée. Notre connaissance approfondie de l’histoire naturelle du développement de ce phénotype permet de déterminer précisément la progression de l’atteinte cardiaque et en particulier l’âge (10 mois pour les males et 12 mois pour les femelles) auquel 80pourcents des souris entrent en insuffisance cardiaque. Afin d’éviter toutes douleurs liées à l’insuffisance cardiaque, dans ce projet, les souris sont euthanasiees à 6 mois d'âge. Il peut egalement y avoir une inflammtion au site d'injection de nos AAV. Cependant cela n'a pas ete observé dans d'autres protocoles en place dans notre centre de recherche.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (thérapie génique et suivi par échocardiographie). Les organes des animaux seront prélévés pour une étude moléculaire de la correction génique et du recouvrement des mécanismes cellulaires.
Remplacement
Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour optimiser le traitement pour la cardiomyopathie causée par des mutations d'un gène spécifique. Pour cela il est nécessaire d’étudier le rôle de notre approche corrective, et les effets du traitement dans un modèle animal tel que la souris pour avoir accès à la fonction cardiaque. Pour réaliser cette étude, l’utilisation du modèle murin est donc indispensable. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote toutes les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie humaine liée aux mutations du gène étudié.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité permettant une analyse statistique. Néanmoins, 24 animaux par groupe (5 groupes pour un total de 120 souris) seront malgré tout nécessaires pour permettre une analyse statistique. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et que l’on n’ait pas à la refaire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). Les zootechniciens assurent un contrôle quotidien des animaux afin de relever le moindre signe de souffrance, un changement régulier ds cages, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum hors cages d’accouplement) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage et de la bouillie pourra être introduite dans les cages si nécessaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (suivi de poids hebdomadaire, évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de lésions). Nous avons des mesures mises en place pour réduire la douleur pendant la procédure expérimentale (avec des points limites adaptés)
Choix des espèces
La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Nous utilisons une souche sur laquelle la mutation Lmna a été dérivée. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie liée aux mutations d'un gène spécifique. Les premiers symptômes sont détectés entre 3 et 6 mois chez les mâles homozygotes et évoluent rapidement jusqu’au décès des animaux provoqué principalement par l’aggravation du phénotype cardiaque. Les souris seront utilisées à deux jours de vie en pré-symptomatique, pour une injection intraveineuse de nos outils de correction génique. Les souris seront ensuite maintenues pour 6 mois car cela permet d'observer l'apparition et l'évolution de phénotype avant l'apparition des premiers symptomes. Le phenotype devient dommageable à 6 mois.