Troubles cardiaques

Jusqu'à seize prises de sang dans la joue sur animal vigile, réparties sur vingt-quatre semaines : 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cœur et des organes. Une partie subit une chirurgie de trente minutes provoquant un infarctus du myocarde, avec douleur postopératoire et mobilité réduite pendant huit heures. L'objectif est de mettre au point un anticorps ciblant une population immunitaire, à administrer chez des patients en phase aiguë d'infarctus. Le porteur retient la souris parce qu'elle se reproduit vite et donne beaucoup de petits, et parce que les lignées mutantes voulues n'existent que chez elle.

Objectifs

L’incidence de l’insuffisance cardiaque consécutive à un infarctus du myocarde (IM) est en augmentation constante et la mortalité à moyen et long termes reste élevée, ce qui constitue un enjeu médical et sociétal majeur. Si la prise en charge aigüe a permis de diminuer la mortalité dans les premiers jours, les conséquences chroniques de la perte de fonction cardiaque restent importantes et sont associées à une perte de qualité de vie et un coût conséquent pour la société. Notre projet a pour but de développer un outil thérapeutique à utiliser en clinique à la suite d'un infarctus du myocarde afin de limiter l'atteinte cardiaque. A cette fin, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées pour développer un anticorps ciblant une population immunitaire particulière. Nous traiterons des souris avec cet anticorps pour confirmer son effet en condition non pathologique. Pour valider son efficacité, nous l'utiliserons dans des modèles de souris soumises à un infarctus du myocarde induit chirurgicalement sous anesthésie générale. L’analyse consistera à étudier la fonction cardiaque, le remodelage cardiaque et la réponse inflammatoire post-infarctus.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires après un infarctus du myocarde et par conséquent, réduire la mortalité post-infarctus et limiter le développement de l’insuffisance cardiaque. Ce développement d'un nouveau traitement à utiliser en phase aiguë de l'infarctus du myocarde et visant à réduire les dommages et le remodelage cardiaque présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, diminuer les ré-hospitalisations, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.

Procédures

Une partie des animaux va subir des prélèvements sanguins répétés par voie submandibulaire, étant vigile. Ces prélèvements sont d'une durée inférieure à 1 minute. Il y aura jusqu'à 16 prélèvements, espacés au minimum d'une semaine et répartis sur une durée allant jusqu'à 24 semaines. Une partie des animaux va subir une chirurgie de 30 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde est réalisé sous anesthésie générale. Un minimum de quatre injections sous-cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents temps après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 15 minutes. Une partie des animaux va subir une injection intraveineuse d'une durée maximale de 30 seconde sous anesthésie générale. Une autre partie des animaux va subir deux injections par voie intraveineuse d'une durée maximale de 30 secondes sous anesthésie générale, espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, potentielle douleur au point d'injection, stress lié à l'anesthésie, stress/potentielle douleur lors de la pose de la bague à l'oreille pour identification; douleur au site de prélèvement dans les cadre des prélèvements sanguins répétés. Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire, mobilité transitoirement réduite suite à l'anesthésie (8 heures).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.

Remplacement

Afin de respecter le principe des 3R, les anticorps seront générés en utilisant des lignées cellulaires. Par ailleurs, les différents clones seront au préalable caractérisés sur des cellules afin pré-sélectionner les clones les plus intéressants à tester chez la souris. Ces modèles animaux représentent une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes impliquant un grand nombre de types cellulaires, ce que des modèles artificiels ne pourraient pas permettre de recréer dans leur entièreté. Nous voulons étudier chez l'animal, le phénomène de réparation tissulaire consécutif à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 15 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents à la procédure chirurgicale, nous estimons une taille de groupe à 20 animaux. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Par ailleurs, il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas particuliers. La souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation d’anesthésie générale et d’analgésie adaptées, et par l’établissement et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et renforcée par les expérimentateurs confirmés et par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grace à ces modèles murins, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 8 à 10 semaines minimum et chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité.

Porteuses d'une mutation qui reproduit le syndrome NARP, ces souris présentent un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire attendus. 313 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à un, deux, quatre et six mois, des tests de force musculaire, de coordination et d'endurance sur tapis de course, rotarod et grip test, ainsi que des IRM et des échocardiographies sous anesthésie. Une grille de score commande la suite : entre 6 et 7, un antidouleur puis la mise à mort si rien ne s'améliore en vingt-quatre heures, entre 8 et 9, la mise à mort immédiate.

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

Génétiquement modifiées pour développer de l'athérosclérose, privées du récepteur aux LDL ou de l'apolipoprotéine E, 376 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 300 d'entre elles reçoivent pendant trois mois un régime enrichi en cholestérol, avec des prises de sang sous anesthésie gazeuse, et une partie est maintenue en vie jusqu'à 28 mois pour croiser vieillissement et maladie. Toutes sont tuées, le porteur listant le sang, le cœur, l'aorte, le liquide péritonéal, la moelle osseuse, le foie, la rate, les reins, le tissu adipeux, les quadriceps et les artères fémorales parmi les prélèvements attendus. Il décrit l'athérosclérose et la stéatose hépatique induites comme asymptomatiques et sans altération de la qualité de vie, tout en déclarant une souffrance modérée pour l'ensemble du projet.

Objectifs

L’athérosclérose est un facteur de risque majeur des maladies cardiovasculaires, première cause de mortalité en France. Elle se caractérise par une accumulation de graisses (lipides) au niveau des artères. En s’oxydant, ces lipides sont reconnus comme des signaux de danger par les macrophages de la paroi artérielle. Progressivement, ces macrophages vont se charger en lipides oxydés. Ceci, en entraine leur mort, contribue à la formation progressive de la plaque d’athérome et mène à l’obstruction des artères. L’âge est un facteur de risque majeur de l’athérosclérose. Pourtant, les mécanismes sont peu compris et peu étudiés. L’athérosclérose est associée à une inflammation de bas grade et au recrutement de cellules immunitaires qui jouent un rôle central dans le développement de la plaque. Les altérations de la fonction des cellules immunitaires et l’inflammation chronique constituent une piste de choix pour expliquer l’athérosclérose liée à l’âge. Les travaux de notre équipe suggèrent que l'activation des cellules myéloïdes est liée à des changements dans l’élimination des mitochondries endommagées (mitophagie). Le vieillissement est associé à un ralentissement de la mitophagie qui contribue à une altération des fonctions mitochondriales. De manière intéressante, in vitro, nous avons observé un phénotype similaire dans des monocytes et macrophages de sujets âgés. L’objectif de ce projet est d’étudier les altérations de la fonction mitochondriale et de la mitophagie dans les cellules myéloïdes dans des modèles de souris génétiquement modifiées sensibles à l’athérosclérose d’âges différents. Ces paramètres seront évalués chez des souris nourries avec un régime standard ou favorisant l’athérogénèse. Le niveau de mitophagie et la fonction mitochondriale seront modulés par des approches pharmacologiques via l’utilisation de modulateurs pharmacologiques de la mitophagie.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de décrypter le rôle des altérations de la mitophagie et de la fonction mitochondriale dans l’athérosclérose liée à l’âge. La première stratégie mise en place permettra de caractériser en détail l’impact de l’âge et du sexe sur l’athérogénèse dans le cadre d’un régime standard ou d’un régime athérogénique. Cette caractérisation reposera sur une analyse détaillée des tissus. Ceci nous permettra de décrire avec précision les modifications de la mitophagie et de la fonction mitochondriale dans les cellules myéloïdes au cours du vieillissement et de mettre ces résultats en parallèle du degré de développement de l’athérosclérose et des critères de gravité associés. Cette étude nous permettra également d’évaluer la pertinence d’une stratégie de restauration pharmacologique de la mitophagie ou de la fonction mitochondriale pour lutter contre l’athérosclérose. Les 2 volets de cette étude permettront de déterminer si les altérations de la mitophagie et/ou de la fonction mitochondriale dans les cellules myéloïdes contribuent à l’athérosclérose liée à l’âge. Ce travail de recherche pré-clinique nous permettra également d’évaluer la pertinence du ciblage pharmacologique de cette voie. Ainsi, ce travail contribuera à améliorer la connaissance de la physiopathologie de l’athérosclérose liée à l’âge en lien avec la fonction des cellules myéloïdes et d’évaluer l’efficacité de deux nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

300 souris seront placées sous régime athérogénique enrichi en cholestérol pendant 3 mois. Les prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse de même que l’euthanasie des animaux qui seront toutes réalisées par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Le régime athérogénique enrichi en cholestérol va induire une athérosclérose et une stéatose hépatique chez les souris. Ces évènements sont asymptomatiques et ne se traduisent pas par une altération de la qualité de vie des animaux pour un régime d’une durée de trois mois. Des animaux âgés seront utilisés dans le cadre de ce projet. Il s’agit d’un processus physiologique. Dans les conditions standards d’hébergement, les animaux ne présentent aucun signe de souffrances visibles jusqu’à un âge 30 mois. Au-delà de cet âge, des cas d’altérations de l’appareil locomoteur peuvent être observés. Par ailleurs, il est également classique d’observer une perte de poids. Ce phénomène est également physiologique et non lié aux investigations mises en place.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie gazeuse pour prélever le sang, le cœur, l’aorte, le liquide péritonéal, les fémurs (prélèvement de moelle osseuse), le foie, la rate, les reins, le tissu adipeux, les quadriceps et les artères fémorales. L’objectif de tous ces prélèvements est de réduire la nécessité de reproduire ces l’expérience.

Remplacement

L’athérosclérose est une pathologie complexe faisant intervenir des interactions entre plusieurs organes et entre le métabolisme des lipides et des lipoprotéines, l’inflammation et le système immunitaire (cellules myéloïdes en particulier). Ce type de pathologie ne se développe que chez les mammifères et ne peut pas être mimée in vitro. Seule l’utilisation de modèles animaux présentant une physiopathologie de l’athérosclérose proche de celle observée chez l’Homme peut permettre une meilleure compréhension de cette pathologie. Les souris déficientes pour le gène codant pour le récepteur aux LDL (lipoprotéine de basse densité) ou l’apolipoprotéine E (apolipoprotéine présente au niveau des lipoprotéines LDL qui permet leur captation tissulaire) sont deux modèles bien décrits pour l’étude de l’athérosclérose. En effet, les souris de souche sauvage ne développent que de rares lésions athéromateuses avec un régime athérogénique. C’est pourquoi ces 2 modèles, qui conduisent à une augmentation des niveaux plasmatiques de lipoprotéines LDL sous régime athérogénique, sont classiquement utilisés. Il est par ailleurs très bien établi que la physiopathologie de l’athérosclérose dans ces modèles mime parfaitement la situation humaine sur une durée beaucoup plus courte. Par ailleurs, la souris est un modèle parfaitement adapté pour étudier les conséquences du vieillissement sur cette pathologie à l’échelle d’un organisme entier. Cette approche permet ainsi d’étudier les conséquences sur plusieurs organes en parallèle.

Réduction

Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables en ce qui concerne la formation de lésions athéromateuses, nos études requièrent 10 animaux par groupe. Cet effectif a été établi en tenant compte de la variabilité inter-individuelle. Par ailleurs, cet effectif par groupe est en cohérence avec les nombreuses publications scientifiques basées sur l’utilisation de ces mêmes modèles animaux. La pertinence d’un tel effectif est également basée sur l’expérience acquise par notre laboratoire durant de nombreuses années avec ces modèles animaux. Afin de prendre en compte la différence de susceptibilité à l’athérosclérose liée au sexe, les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous n’utiliserons qu’un modèle de souris sensible au développement de l’athérosclérose pour la première partie de l’étude visant à décrire l’impact de l’âge et du sexe sur le développement de l’athérosclérose. Ces résultats seront confirmés sur le second modèle de souris sensibles à l’athérosclérose avec un nombre de groupe limité.

Raffinement

Les régimes alimentaires ne sont pas générateurs de souffrance. Néanmoins, le suivi de animaux permettra d’identifier des signes de souffrances qui pourraient survenir de manière indépendante, notamment en raison de l’âge des animaux dans certain groupe expérimentaux. Si les points limites définis sont atteints, les animaux seront immédiatement mis à mort. Le milieu d’hébergement sera enrichi avec des nids. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 à 10 animaux pour maintenir les interactions sociales.

Choix des espèces

L’utilisation de modèles murins pour étudier l’athérosclérose est nécessaire car l’athérosclérose est un processus physiopathologique complexe ne pouvant pas être modélisé in vitro et les souris génétiquement modifiées sont le modèle de référence dans ce domaine. Les similarités génétiques, développementales, physiologiques et biochimiques entre la souris et l’homme, nous permettent d’extrapoler les conclusions à l’Homme, en particulier dans le domaine de l’athérosclérose où la souris demeure le modèle pré-clinique de référence dans lequel sont testées la majorité des stratégies thérapeutiques émergentes. Ce projet vise à caractériser l’impact du vieillissement sur l’athérogénèse en lien avec un déficit de la mitophagie et/ou de la fonction mitochondriale. Ainsi, des animaux âgés de 3 à 4 mois, de 14 à 16 mois, de 22 à 24 mois et de 28 mois seront utilisés.

360 souris descendantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 36 d'entre elles étant conservées pour maintenir la lignée et les autres tuées, une partie dès le sevrage. Les mères gestantes sont gavées chaque jour de resvératrol ou d'un placebo, du huitième jour de gestation au sevrage, et leurs petits passent un test de suspension, un champ ouvert, un test d'acuité visuelle, une reconnaissance d'odeurs et un labyrinthe aquatique, l'ensemble étant qualifié de non douloureux. Ces souris portent une déficience génétique de la méthionine synthase limitée au cœur ou au cerveau, pour reproduire la maladie CblG, qui touche moins d'un enfant sur un million. Le porteur reconnaît que des études in vitro sur biopsies de peau de patients ont déjà montré l'effet des activateurs de SIRT1, et affirme qu'il est "indispensable" de tester les organes atteints chez l'animal.

Objectifs

La maladie CblG (Cobalamine G) est une maladie rare, moins d’un enfant sur 1.000.000 de naissances est atteint. La maladie se manifeste en général dès la naissance, mais des formes tardives (adolescence ou âge adulte) ont été décrites. Dans la plupart des cas, les patients présentent un retard du développement, des manifestations neurologiques (crises convulsives, encéphalopathie, hypotonie, troubles psychiatriques), anémie, mais les patients peuvent présenter des anomalies dans d’autres organes comme le cœur (malformation) ou le foie. La maladie peut être diagnostiquée dès la naissance grâce à la détection dans le sang d’une concentration élevée de la molécule nommée l’homocystéine et une diminution de la molécule nommée méthionine. Actuellement, le traitement est basé sur des injections quotidiennes de vitamine B12 associées à une supplémentation en méthionine afin de réduire la concentration d’Homocystéine et augmenter celle de la méthionine. Bien que ces traitements permettent l’amélioration des symptômes cliniques, ils sont inefficaces en qui concerne les troubles neurologiques. Un nouveau traitement impliquant la sirtuine Sirt1 pourrait être une nouvelle piste. Sirt1 est une protéine qui participe au bon fonctionnement de l'organisme (notamment le métabolisme central) dans plusieurs organes dont le cœur et le cerveau, elle exerce des effets protecteurs contre le stress cellulaire et l'inflammation. L’objectif de ce projet est de démontrer, sur le cœur ou le cerveau, l’efficacité du traitement avec un activateur de Sirt1 (resvératrol) chez un modèle de souris reproduisant cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation de Resvératrol comme activateur de Sirt1 est efficace dans la prévention et le traitement des manifestations neurologiques et cardiaques de la maladie CblG. De plus, ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans chaque organe atteint, coeur ou cerveau, grâce à l’utilisation de 2 types de souris génétiquement modifiées, ayant une protéine MTR déficiente (cause de la maladie) spécifiquement au niveau du coeur ou du cerveau.

Procédures

Les souris femelles gestantes seront traitées quotidiennement par gavage avec le Resvératrol ou le placebo dès le 8ème jour de gestation jusqu’au sevrage : un tiers des souriceaux subira un examen d’imagerie non invasif à l'âge de 20 jours, un autre tiers à 6 mois tandis que le dernier tiers sera soumis à des tests comportementaux non douloureux (3x16 animaux). Pour évaluer la fonction cardiaque nous testerons la force, l'agilité et le niveau d’exploration libre des souris par un test de suspension et un test du champ ouvert. Et pour l’étude du cerveau, nous réaliserons un test d’acuité visuelle, de tests de reconnaissance d'odeur et un labyrinthe aquatique pour tester les capacités de mémorisation.

Impact sur les animaux

Bien qu’elle ne soit pas douloureuse, la procédure de gavage est désagréable pour les souris. Elle peut entrainer un léger stress physique lié à la contention de l'animal. Ce stress va inéluctablement diminuer suite à l'habituation des souris, sur les manipulations répétées par le manipulateur. L'inconfort à l'introduction de la sonde se verra lui aussi diminuer de jour en jour au fil du protocole. Ce geste technique sera effectué par un zootechnicien expérimenté qui prend toutes les mesures nécessaires pour limiter la souffrance animale en pratiquant un geste rapide et sûr. De plus, la prise de poids étant effectuée 3 fois par semaine, les pertes de poids éventuelles, mais peu probables, seront un indicateur de signe de mal-être chez les animaux. La procédure de TEP sera intégralement réalisée par une équipe technique qualifiée dans un environ dédiée à ce type d’analyse, et les animaux seront plongés sous anesthésie durant toute la procédure. Malgré cela, cette étape pourrait déclencher un stress post-anesthésie.

Devenir

Maintien : Les souris surnuméraires présentant la modification génétique d'intérêt pour le maintien de la lignée seront conservées dès le sevrage. Mise à mort : A la fin de l’ensemble des procédures, toutes souris soumises à l'imagerie médicale ou aux tests comportementaux seront mises à mort à l’âge de 21 jours (48 souris), 8 semaines (48 souris) ou 6 mois (48 souris). De même, les souris génétiquement modifiées surnuméraires présentant d'intérêt pour la recherche seront également mises à mort à l'âge de 6 mois pour dissection et analyses biochimiques et histopathologiques. Les souris surnuméraires ne présentant pas la modification génétique pour le maintien de la lignée seront mises à mort dès le sevrage ou pourront servir à des formations internes (dissections et microdissections).

Remplacement

tôt dans la vie, laissant penser qu’un traitement précoce chez le nouveau-né ou même pendant la grossesse pourrait diminuer les manifestations cliniques chez le nouveau-né. Des études in-vitro ont déjà été menées sur des biopsies de la peau des patients, démontrant l’efficacité des activateurs de la protéine SIRT1 pour palier à la déficience de la protéine MTR. Cependant, ces études sont faites sur des sur biopsie de la peau de patients atteints par la maladie. Cependant les cellules de la peau ne reflètent pas la spécificité des organes atteints. C’est pourquoi, afin de valider l’efficacité du traitement par resvératrol, il est indispensable tester les effets sur les organes atteints par la maladie, nous souhaitons utiliser des animaux avec une déficience de la protéine MTR dans le cerveau et cœur (mère et progéniture). Pendant cette étude, des expérimentations non invasives seront réalisées chez la progéniture (imagerie cardiaque) pour mieux comprendre les conséquences de la carence en vitamine B12 dans chaque organe étudié, et une épreuve d’effort pour comprendre pourquoi les souris meurent à un âge précoce si la défaut est au niveau du cœur, et des tests comportementaux d'observation et non douloureux seront menés en parallèle pour savoir si un traitement réduit les manifestations neurologiques. L’ensemble des résultats sera étudié par informatique pour créer un modèle de « souris personnalisée » capable de prédire ce qui se passe dans l’organisme de la souris en cas de dérégulation ou de traitement, permettant ainsi de remplacer toute autre utilisation de souris dans certaines expérimentations, ou de limiter le nombre d’expérimentations grâce à ce modèle.

Réduction

Pour évaluer l’efficacité du Resvératrol sur la protéine Sirt-1 chez les patients CblG qui ont des troubles sévères dans différents organes essentiels tels que le cerveau ou le cœur, nous souhaitons utiliser 2 lignées de souris transgéniques qui expriment la maladie dans ces 2 organes cibles, et les étudier à 3 périodes différentes de la vie (sevrage à 21 jours, maturité sexuelle à 8 semaines et début du vieillissement à 6 mois). Afin d’assurer une étude statistique fiable nous inclurons 16 animaux par groupe d’étude, pour chaque tranche d’âge. Ces souris transgéniques seront traitées quotidiennement avec le médicament (ou placebo) par gavage durant la gestation jusqu’à la veille de la mise à mort, puis durant la lactation à partir de 2 jours post-naissance et jusqu’à l’âge de 21 jours. Ce projet nécessitera 72 femelles dont la moitié sera accouplée à 12 mâles portant la mutation au cerveau, et l’autre moitié à 12 mâles porteurs de la mutation au cœur Ce nombre d’accouplements est suffisant pour produire tous les animaux descendants nécessaires à la poursuite du projet. 360 animaux descendants seront nécessaires car l’étude est divisée en 3 groupes d’animaux traités avec le médicament ou son placebo et analysés à plusieurs stades du développement : - Groupe malade au niveau du cœur : 96 souris dont 48 sont traitées avec le médicament et 48 avec le placebo, et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois. - Groupe malade au niveau du cerveau : 96 souris, distribuées de la même manière que les souris malades au niveau du coeur. - Groupe témoin non malade : 96 souris traitées avec le placebo et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois, et dont la moitié sera utilisée comme groupe témoin “Cœur” et l’autre moitié comme groupe témoin “cerveau” Étant donné le type de données (variables continues), les effectifs (N>5), le nombre de groupes comparés (n>2) et l'indépendance des échantillons, nous aurons le nombre indispensable de souris qui nous permettra faire des statistiques et arriver à avoir de conclusions de notre travail. Par ailleurs, toutes les données issues de nos expérimentations seront modélisées en tenant en compte du phénotype, des résultats des études fonctionnelles et du traitement. Cette modélisation nous permettra d’aborder l’ensemble de résultats obtenus et de réduire au maximum le nombre de souris étudiées.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle agréée respectant les paramètres pour les conditions de vie des souris (hygrométrie, température…). Les souris seront hébergées en groupe dans la même cage (4/cage), auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et bénéficieront d’objets pour l’enrichissement (bouts de bois, carton, mouchoir…). Toutes les procédures seront réalisées par des personnels entraînés et qualifiés pour ce type d’étude. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.

Choix des espèces

La souris génétiquement modifiée est le seul modèle disponible de mutation tissu-spécifique permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. Il n'existe pas de modèle animal autre que la souris génétiquement modifiée permettant l'étude de cette maladie. Les animaux impliqués dans ce projet seront étudiés à plusieurs périodes de la vie telles que le sevrage (21 jours), la maturité sexuelle (8 semaines) et le début du vieillissement (6 mois) car ce sont des périodes charnières dans le déclenchement de la maladie CblG chez l’homme. Le traitement par Resvératrol sera effectué quotidiennement par gavage de la mère gestante (40 mg/kg/j) à partir de 9 jours après le début de la gestation (E9) jusqu’au sevrage. Différentes procédures expérimentales seront mises en œuvre (tests comportementaux, tests d’effort, imagerie à J20 ou 6 mois). A l’issue de chaque période clé du protocole, une partie des animaux sera mise à mort pour procéder aux analyses biochimiques et histopathologiques.

L'introduction d'un filament dans la carotide pour provoquer un accident vasculaire cérébral tue moins de dix pour cent des animaux opérés dans les soixante-douze heures, par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne. 126 souris et 84 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre eux gardés en vie jusqu'à six semaines avant une imagerie terminale. Les chirurgies d'une heure sous anesthésie générale injectent dans le cerveau soit un lipopolysaccharide bactérien pour déclencher une neuroinflammation, soit un peptide vasoconstricteur pour rétrécir les vaisseaux, et certains animaux subissent une seconde opération deux semaines plus tard. Le choix des espèces tient à la résolution d'imagerie pour les rats, dont le cerveau est plus gros, et pour les souris au coût des nanoparticules d'oxyde de fer et des anticorps.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. L’AVC induit une réaction inflammatoire qui contribue de manière importante aux lésions cérébrales. Le suivi par imagerie in vivo de cette réaction inflammatoire permettrait de mieux comprendre sa dynamique spatio-temporelle et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à la moduler. Pour cela, nous proposons de développer une approche en imagerie cellulaire et moléculaire in-vivo. L’objectif de l’imagerie cellulaire est de pouvoir suivre des cellules d’intérêt dans le cerveau : soit des cellules ayant des propriétés thérapeutiques visant à moduler l’inflammation (telles que les cellules souches issues du tissu adipeux) soit des cellules du système immunitaire (telles que les macrophages). L’imagerie moléculaire vise à suivre l’expression de récepteurs impliqués dans la réponse inflammatoire à un AVC, telles que les molécules d’adhésion qui permettent l’entrée de cellules immunitaires dans le cerveau. Les modalités d’imagerie utilisées pour ces développement méthodologiques seront les mêmes que celles qui peuvent être utilisées chez l’humain : imagerie par résonance magnétique (IRM) et scanner X. Le développement de telles techniques d’imagerie ouvrirait la voie à un suivi non-invasif des cellules et des récepteurs de l’inflammation, qui pourrait être répété dans le temps. Le but à plus long terme est de transférer ces méthodes chez l’humain, pour une meilleure prise en charge des patients présentant un AVC.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral est une maladie invalidante chez l’adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre la réaction inflammatoire associée ainsi que le devenir des cellules thérapeutiques, dans des modèles rongeurs (rats et souris) plus simples à mettre en oeuvre et à standardiser que le modèle classique qui procède via une occlusion artérielle mécanique avec un filament. Ces aspects inexplorés du modèle animal permettront ensuite de définir des biomarqueurs d’imagerie utiles pour évaluer les approches thérapeutiques visant à moduler l’inflammation. Ces biomarqueurs seront à terme utilisables chez l’humain puisque le transfert en clinique des techniques d’imagerie utilisées dans ce projet est à l’étude.

Procédures

L’infusion locale du LPS (solution de lipopolysaccharide, molécule d’origine bactérienne provoquant une inflammation) induisant la neuroinflammation ou du peptide vasoconstricteur spécifique (rétrécissant le diamètre des vaisseaux sanguins) mimant l’ischémie cérébrale nécessite une injection stéréotaxique. Le modèle d’AVC transitoire nécessite l’introduction d’un filament par la carotide. Ces chirurgies, permettant de réaliser ces différents modèles d'AVC, sont réalisées sous anesthésie générale et dure au maximum une heure. Chaque animal subit une seule chirurgie de durée maximale d'une heure. Certains animaux recevront les cellules thérapeutiques par voie intracérébrale et subiront pour cela une deuxième chirurgie sous anesthésie générale deux semaines après la réalisation du modèle. Cette seconde chirurgie dure au maximum une heure.

Impact sur les animaux

Suite à cette chirurgie permettant de réaliser ces différents modèles, une perte de poids minime (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser des analyses post-mortem (imagerie ex vivo, microscopie).

Remplacement

Les agents de contraste seront d’abord testés dans des modèles in-vitro : les cellules thérapeutiques sont marquées avec les nanoparticules par incubation puis placée dans un tube Eppendorf et imagées en IRM et en imagerie X. Cela permettra de réaliser une première sélection des agents de contraste d’intérêt. Néanmoins le contraste va dépendre également du microenvironnement (inflammatoire) et de la métabolisation des agents de contraste in-vivo : il nous apparaît donc indispensable de tester les cellules marquées avec les meilleurs agents de contraste (4 au maximum) chez l’animal vivant. Les cerveaux des animaux des cinq procédures seront prélevés pour l’imagerie post-mortem à l’aide de techniques innovantes basées sur les rayons X (scanner spectral à comptage de photon, imagerie de contraste de phase, de champ sombre et du k-edge avec le rayonnement synchrotron). Ces imageries ex-vivo viendront apporter des informations précieuses avant le développement in-vivo de ces nouvelles approches. Par ailleurs, les images issues de ces expérimentations seront mises en ligne à disposition de la communauté de manière anonyme sur une plateforme collaborative, afin de pouvoir être exploitées plus largement.

Réduction

L’avantage de l’imagerie in-vivo est qu’elle permet des études sur l’animal vivant plutôt que d’avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude bibliographique de la variabilité du modèle. Des groupes expérimentaux de 6 animaux (3 mâles et 3 femelles) seront typiquement utilisés pour ce projet à caractère exploratoire. Si certaines conditions expérimentales ne fournissent pas un signal suffisant pour être détecté (problème de sensibilité), alors l’inclusion sera stoppée. Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus que les cerveaux pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Le modèle animal d’inflammation cérébrale focale provoquée par l’injection intracérébrale de lipopolysaccharide (LPS) est utilisé car il est moins invalidant pour les animaux que le modèle d’AVC et il est bien approprié pour les études d’imagerie. Il crée une lésion cortico-striatale qui occasionne des troubles sensori-moteurs mineurs et transitoires du côté contralatéral à la lésion (faiblesse des pattes, perte de sensibilité des vibrisses). Néanmoins les animaux continuent de s’alimenter normalement (récupération du poids pré-opératoire dans les 3 jours qui suivent la chirurgie, pas de perte de poids en comparaison avec les animaux sains à plus long terme) et à avoir une activité normale. Dans un second temps, nous allons évaluer si les modèles d’injection intracérébrale de peptide vasoconstricteur et de LPS peuvent nous fournir des informations pertinentes du point de vue de l’imagerie et donc se substituer aux modèles d’AVC, car ils ont l’avantage de limiter le handicap et la mortalité des animaux. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) avec un traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), une thermorégulation continue, et une hydratation sous-cutanée. Une grille dédiée au codage des expressions faciales spécifique à un modèle animal (souris ou rat) permet d’identifier les signes de la souffrance post-opératoire afin de la traiter. La salle d’évaluation neurofonctionnelle a été installée dans un endroit dédié et calme avec une lumière rouge afin de ne pas agresser les yeux des animaux albinos. En soins post-opératoires, nourriture et boisson sous forme gélifiée sont mises à disposition de l'animal pour faciliter leur hydratation, en plus de la nourriture et boisson habituelles. Les groupes sociaux sont conservés (isolement limité au réveil complet de l’animal, sauf en cas d’agressivité constatée). L’évaluation de l’état des animaux est réalisé une heure après la chirurgie et pendant une semaine suivant la chirurgie. Un score de l’état de l’animal est déterminé à l’aide d’une grille de score inspirée des études de raffinement de la procédure post-opératoire d’une chirurgie stéréotaxique, qui permet une évaluation de l’état de l’animal et l’identification des points limites.

Choix des espèces

Les rats sont utilisés car l’imagerie cérébrale de cette espèce a une meilleure résolution en comparaison avec celui de la souris, en raison de la plus grosse taille de cerveau. Nous allons travailler avec des rats Sprague Dawley chez qui le modèle de LPS est bien maîtrisé par notre équipe. Les souris sont utilisées en raison en raison du coût des certaines particules d'oxyde de fer (marquées à la rhodamine fluorescente) et du coût des anticorps (pour la fonctionnalisation des particules d’oxyde de Fer). Les souris utilisées pour cette étude seront des souris C57Bl6 car notre équipe a une expérience extensive de l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVC. Des souris Swiss pourront être utilisées afin de faciliter la pose d'un cathéter veineux. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (jeunes adultes) : la maturité cérébrale sera atteinte et le poids sera suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste. Rats : 250-300 g à T0 et souris : 25-30 g à T0.