Troubles cardiaques
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- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
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- Troubles musculosquelettiques
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- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude du rôle de l’inflammation hypothalamique dans les complications cardiovasculaires associées à l’obésité et au diabète
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise à un régime riche en graisse pendant treize à seize semaines pour développer obésité, diabète et athérosclérose, avec implantation d'une sonde de télémétrie, mesures de pression artérielle, injections et induction d'une fibrillation cardiaque. Le porteur indique que le régime réduit la mobilité des souris et que la chirurgie et les manipulations génèrent du stress, les animaux étant mis à mort pour prélever leurs tissus. Il affirme qu'il n'existe "aucun moyen de remplacer" de telles études portant sur l'ensemble de l'organisme.
Objectifs
L’obésité est associée avec une inflammation chronique de faible intensité impliquée dans le développement des facteurs de risque du diabète de type 2. La consommation d’un régime riche en graisse s’associe en effet à une inflammation précoce d’une partie du cerveau, l’hypothalamus, contrôlant la dépense énergétique, suggérant son rôle critique dans le développement de l’obésité et de ses conséquences. Cependant, les mécanismes impliqués dans l’initiation de l’inflammation hypothalamique ne sont pas totalement connus. Dans ce projet, en utilisant une nouvelle stratégie ciblant spécifiquement les cellules hypothalamiques, nous cherchons à diminuer l’inflammation associée à la prise d’un régime riche en graisse utilisant différents modèles de souris avec prédisposition à l’inflammation et au diabète. L’expérimentation animale prévue dans ce projet permettra d’obtenir des données pour améliorer les altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l’obésité ainsi que favoriser le développement de thérapies plus effectives.
Bénéfices attendus
Démontrer l'implication de la protéine NLRP3 dans le processus inflammatoire associé au développement de l’obésité et du diabète au niveau hypothalamique. En plus, la confirmation de l’implication de NLRP3 dans la dérégulation hypothalamique de la prise de poids et les dépenses d’énergie impliquerait sa validation en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l’obésité.
Procédures
Six interventions : - Régime riche en graisse : 13 (procédure 1) ou 16 semaines (procédure 2) – Implantation sous-cutanée : 1 implantation/animal, durée 20 minutes (procédure 2) - Mesure pression artérielle : 6 mesures (6 jours, procédure 1) et 12 mesures (28 jours, procédure 2), durée : 10 minutes/mesure - Prélèvement de sang : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime (procédure 1), durée de chaque prélèvement < 5 minutes. - Injections intraveineuses : 2 ou 12 injections (une injection tous les 3 jours pendant les dernières 7 jours dans la procédure 1 ou 4 semaines dans la procédure 2), durée de chaque injection < 5 minutes. - Induction d’une fibrillation atriale : une fois (procédure 2), durée 20 minutes/animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Prise de poids liée à un régime enrichi en graisse ; 2) Développement de maladies liées à cette alimentation spécifique : obésité, diabète de type 2, athérosclérose ; 3) Mobilité réduite dans des cages à cause de la prise de poids ; 4) Stress liée à la chirurgie après l’implantation de la sonde de télémétrie ; 5) Stress lié aux manipulations (échographie, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, pris de la température au niveau rectal, prise de sang de la queue, injection de vésicules extracellulaires). Les 3 premiers effets concerneront 288 souris sur 672, qui seront nourris avec le régime riche en graisse. L’effet 4 concerne 168 souris puis l’effet 5 concerne l’ensemble des souris.
Devenir
A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux mis à mort. Il est nécessaire d'analyser chaque tissu pour évaluer les effets du régime riche en graisse.
Remplacement
Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l’obésité et au diabète, comme la formation de la plaque d’athérome depuis ses phases les plus précoces.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide du logiciel statistiques avec un écart-type de 20%, un risque alpha=5% et une puissance beta=95%, il est nécessaire d’inclure 12 animaux par groupe. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserions un même animal pour plusieurs mesures.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera donc évalué de façon hebdomadaire en observant leur comportement. Les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses) seront surveillés. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (évolution du poids, suivi des plaies, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores. La grille de scoring des points limites est montrée dans chaque procédure. De plus, comme les animaux vont prendre du poids et pour favoriser leur sociabilisation, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Cependant, dans certains cas, il est possible d’avoir un animal mâle isolé. Dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. De même, ils auront à disposition des bâtonnets de peuplier afin de leur permettre de ronger quelque chose de dur puisque le régime riche en graisse rend les croquettes moins dures que leur nourriture habituelle. Les souris diabétiques étant polyphagiques, polydispisques et polyuriques, elles seront placées avec une litière abondante et absorbante. La fréquence du changement de litière sera augmentée en fonction des besoins des animaux.
Choix des espèces
Ce projet vise à analyser les mécanismes moléculaires impliqués dans la favorisation de l'inflammation au niveau hypothalamique responsables des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l'obésité et au diabète. À cette fin, nous avons choisi d'utiliser l'espèce Mus musculus modèles de souris sauvage C57BL/6, en tant que contrôle, et des souris transgéniques knock-out pour plusieurs protéines ainsi que des souris présentant une mutation spontanée du récepteur de la leptine, les souris db/db. L’étude comparative de l’effet du régime riche en graisse dans ces modèles de souris permettra de relier directement le processus inflammatoire avec le développement de l’obésité et le diabète. L'utilisation de ces modèles animaux est une condition nécessaire à l'avancement de la recherche à la suite d’études déjà réalisées in vitro dans le laboratoire avec des échantillons de patients et différents types de cellules. Les souris seront utilisées à l’âge de 6-8 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme adultes et peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.
Etude des potentiels effets indésirables d’une vésiculothérapie CD146 dans l’athérosclérose
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vésicules puis un prélèvement de sang, avant d'être euthanasiées pour récolter la moelle osseuse des os des pattes, l'objectif étant de repérer les effets indésirables d'une thérapie contre l'athérosclérose. Le porteur indique que l'injection rétro-orbitaire et la biopsie de la queue peuvent causer un stress ou une douleur légère. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne permet d'évaluer les effets hors-cibles d'une telle thérapie.
Objectifs
Ce projet permettra d'étudier les effets indésirables de la vésiculothérapie par CD146 qui consiste à délivrer des petites vésicules exposant la protéine CD146. En effet, un protocole précédemment accepté a testé le bénéfice de cette thérapie dans l'athérosclérose qui est la maladie correspondant aux dépôts de LDL cholestérol dans les parois des artères pouvant conduire à des AVC ou des infarctus du myocarde. Nos études en cours montrent que l'administration de vésicules CD146 par voie intraveineuse diminuent significativement l'athérosclérose. Mais les vésicules extracellulaires étant été également décrites comme pouvant être pro-coagulantes ou pro-inflammatoires, selon le contexte clinique, il est essentiel de vérifier que la vésiculothérapie proposée n'entraîne pas de phénomènes de coagulation ou d'inflammation qui pourraient être délétères dans l'athérosclérose.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique dans la lutte contre l'athérosclérose.
Procédures
1/ Injection dans la veine de vésicules extracellulaires après anesthésie gazeuse (5 secondes) 2/Temps de saignement : Prélèvement de quelques gouttes de sang à la queue après anesthésie gazeuse (15 minutes maximum) 3/Extraction des cellules de la moelle osseuse sur animal euthanasié. Au total, 2 interventions sur animal anethésié (1 et 2) et 1 sur animal enthanasié (3).
Impact sur les animaux
L'animal subit une injection rétro-orbitaire, une anesthésie ainsi qu'une biopsie de la queue. Cela pourra entrainer par exemple : un stress physique léger, un stress thermique ou une douleur légère chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, en effet il est necessaire d'avoir un animal euthanasié pour récolter la moelle osseuse des tibias et des péronés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune autre alternative à l'utilisation d'un modèle murin pour tester le bénéfice global d'une thérapie dans l'athérosclérose, l'évaluation des effets indésirables hors-cibles ne pouvant pas se faire in vitro.
Réduction
Les souris seront observées avant d’initier le protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, deux protocoles différents seront testés sur le même animal sans que cela ne perturbe les données scientifiques. Ainsi, les souris qui seront soumises à un test de saignement pour évaluer l'effet de la thérapie sur l'hémostase, seront ré-utilisées pour leur extraction de moelle osseuse afin d'isoler et de mettre en cuture les macrophages in vitro.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages contenant de l'enrichissement. Aussi, si les animaux présentant des symptômes type infection, ils seront écartés des protocoles, anesthésiés puis euthanasiés. Nous serons attentif à toute souffrance animal lors de l'élevage. En effet, si l'animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait l’analgésie peut être envisagée par administration de carprofène par voie sous-cutanée à 5 mg/kg, 1 injection par jour tant que les signes de douleur persistent.
Choix des espèces
La meilleure façon d'appréhender les effets indésirables et 'hors cibles' d'une nouvelle stratégie thérapeutique est de l'étudier dans un modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, seul le modèle murin adulte développe des plaques d'athérosclérose semblables à celle de l'homme.
Analyse d’images multimodales précliniques (SPECT et IRM) pour la détection de la dysfonction coronaire microvasculaire (2/2)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
20 rats vont être utilisés, tués sans réveil à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces rats obèses subissent des imageries IRM sous anesthésie répétées entre 17 et 32 semaines, puis une imagerie nucléaire avec pose d'un cathéter et injection d'un agent de contraste, pour caler l'analyse d'images d'une dysfonction des petits vaisseaux du cœur. Le porteur affirme que les effets indésirables sont "très faibles" et que les animaux sont tués sans réveil après la dernière acquisition. Il conclut que le remplacement de l'expérimentation animale par un modèle alternatif "n'apparaît pas envisageable".
Objectifs
Les maladies qui affectent les gros vaisseaux sanguins et le cœur, aussi appelles maladies cardiovasculaires, représentent la première cause mondiale de mortalité. Les problèmes liés aux petits vaisseaux qui alimentent le cœur est de plus en plus reconnue comme un responsable majeur de la mortalité cardiovasculaire indépendamment de la présence ou de l'absence de maladie des gros vaisseaux. Bien que la dysfonction des petits vaisseaux qui alimentent le cœur soit dorénavant considérée comme un marqueur clinique dont l'évaluation fournirait des informations primordiales pour évaluer le risque des patients avec ou sans maladie des gros vaisseaux, il n’existe pas à l’heure actuelle de technique non invasive et largement disponible pour l’évaluation ces petits vaisseaux. Les images produites par les techniques d'imagerie nucléaire sont très importantes pour diagnostiquer et prédire les maladies qui affectent les vaisseaux sanguins qui alimentent le cœur, même chez les patients qui ont peu de symptômes. L’objectif du projet est de réaliser le suivi longitudinal de l’évolution des petits vaisseaux qui alimentent le cœur chez le rongeur par imagerie nucléaire ainsi que par IRM, avec un double objectif. Il s’agit tout d’abord de développer des outils d’intelligence artificielle permettant d’améliorer la détection précoce d’anomalies des petits vaisseaux sur les images nucléaires à l’aide de l’IRM. L’objectif à terme est d’améliorer l’évaluation clinique de la des problèmes liés aux petits vaisseaux qui alimentent le cœur en imagerie nucléaire. Deuxièmement, nous souhaitons améliorer l’analyse du signal IRM pour la mesure de ces petits vaisseaux. Nous limitons le projet, qui se déroule en collaboration entre deux établissements utilisateurs, aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Le nombre d’animaux par cage (avec enrichissement du milieu de vie) sera adapté en fonction de leur poids. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être. La mise en place de points limites adaptés permettra de limiter la souffrance de ces animaux. Les injections seront réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’améliorer l’évaluation de la DCM en imagerie nucléaire grâce à la comparaison des données avec les valeurs de référence procurées par l’IRM. Il devrait permettre à terme d’améliorer l’évaluation clinique de la DCM en SPECT.
Procédures
A l’âge de 17 semaines les animaux seront placés sous anesthésie générale. Une injection dans l’abdomen sera réalisée pour mimer un effort avant l’acquisition IRM. La durée de l’acquisition sera de 60 min environ. A l’issue de l’anesthésie, les animaux seront replacés dans leurs cages. L’acquisition IRM sera répétée selon les mêmes modalités à 25 semaines et 32 semaines d’âge. A l’issue de l’acquisition à 32 semaines, une acquisition d’image nucléaire sera réalisée après anesthésie générale et pose d’un cathéter intraveineux pour l’injection de l’agent de contraste. La durée d’acquisition des images sera de 25 min.
Impact sur les animaux
L’acquisition des images IRM est réalisée sans agent de contraste et ne nécessite qu’une anesthésie gazeuse dont les nuisances ou effets indésirables attendus sont très faibles. L’acquisition d’images nucléaire nécessite une injection intraveineuse caudale et une injection dans l’abdomen, aux effets indésirables également très limités, d’autant plus que les animaux seront mis à mort sans réveil à l’issue de l’acquisition.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de l’unique procédure expérimentale pour analyses post mortem.
Remplacement
Remplacement : Cette étude vise à caractériser les conditions d’analyse des images précliniques SPECT de la perfusion myocardique pour permettre l’évaluation de la DCM sur les images cliniques. Le remplacement de l’expérimentation animale par un modèle alternatif n’apparaît pas envisageable.
Réduction
Réduction : Au total 20 rats seront utilisés ici. Il y aura 10 animaux par groupe. Il s’agit du strict minimum d’animaux nécessaires afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables en termes de classification des images SPECT comme correspondant à des animaux présentant ou non une DCM par machine learning ou deep learning en fonction des valeurs de référence procurées par les images IRM (vérité-terrain).
Raffinement
Raffinement : Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être. Le poids des animaux ainsi que la prise de nourriture seront surveillés une fois par semaine. Le nombre d’animaux par cage sera adapté en fonction de leur poids. Ils disposeront d’enrichissement de leur milieu de vie (bâton en bois, tunnels, etc…). Une surveillance particulière de la consommation d’eau de boisson sera effectuée considérant le statut pré-diabétque des animaux. Les expérimentations prévues lors de cette étude sont des procédures non invasives (IRM et SPECT). Lors de ces procédures, les animaux sont sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane. Une surveillance quotidienne des animaux reste cependant nécessaire et des points limites sont proposés. L’effet de l’agent pharmacologique permettant de mimer la situation d’effort pour l’acquisition des images SPECT est transitoire, mais une grille de surveillance sera toutefois ajoutée pour la surveillance respiratoire des rats.
Choix des espèces
Ce modèle de rat obèse est très largement utilisés pour l’étude de pathologies métaboliques. Une étude préliminaire a permis de démontrer par imagerie échographique une atteinte microvasculaire (diminution de la réserve coronaire) chez les animaux obèses aux stades où nous prévoyons d’utiliser les animaux dans le présent projet. De plus, nous disposons de données préliminaires qui pourront être comparées à celles obtenues dans le cadre du présent projet. Enfin, le rat est particulièrement adapté au matériel d’acquisition (gamma-caméras) en termes de sensibilité et de résolution, par comparaison avec la souris. Les animaux seront accueillis à un âge compris entre 13 et 16 semaines. Ils seront hébergés dans des conditions standards pendant 1 semaine minimum avant inclusion dans le protocole. Cet âge correspond, d’après la littérature, au stade des signes cliniques (obésité, insulinorésistance, hyperlipidémie) développé par ces animaux. Ils seront suivis jusqu’à 32 semaines, âge auquel nous avons précédemment observé une DCM par imagerie échocardiographique.
Explorer les axes intestin / système nerveux autonome et central / cœur pour ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une arthrite rhumatoïde leur est induite par injection de collagène ou d'auto-anticorps, avec implantation chirurgicale d'un capteur cardiaque, échocardiographie et gavages destinés à modifier leur microbiote intestinal. Le porteur indique que les animaux implantés doivent être isolés en cage individuelle et que les injections visent à établir un "tableau clinique de polyarthrite rhumatoïde". Il affirme que l'étude des interactions entre microbiote, système nerveux et cœur ne peut se mener directement chez les patients ni sur cellules, les tissus étant prélevés après la mise à mort.
Objectifs
L'objectif de notre projet global est de comprendre les interactions entre le microbiote intestinal et le reste de l’organisme et en particulier le système nerveux autonome , le système cardiovasculaire, et l'intestin et comment elles peuvent être modulées par l’alimentation ou les probiotiques dans la polyarthrite rhumatoïde.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet seront une meilleur compréhension du rôle de microbiote intestinal dans la physiopathologie de la polyarthritre rhumatoïde et comment une modification de ce microbiote influe sur l'activité du sytème nerveux autonome et finallement sur la fonction cardiovasculaire. Cette meilleur compréhension devrait permettre d'identifier de nouveaux marqueurs de la polyarthrite rhumatöide, et d'identifier les voies impliquées dans ce processus pathologique. Ces voies indiqueront de possible cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à - l'induction de l'arthrite rhumatöide par injection de collagène (injection J0, J21 et suivi sur 56 jours) en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse ou à -l'induction de l'arthrite rhumatöide par injection d'auto-anticorps anti collagène/LPS (injection J0, J3 et suivi sur 10 jours) en sous-cutranée sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront soumis ensuite à - la mesure de l'electrocardiogramme par télémétrie (implantations du capteurs de télémétrie sous anesthésie gazeuse) et à la mesure échocardiographique non invasive (sedation gazeuse). Les animaux seront soumis à une humanisation du microbiote intestinal par gavage. Certains animaux auront une modulation du microbiote intestinale par option thérapeutique (modulateur du métabolisme par l'alimentation ou probiotiques, médicaments ciblant les voies identifiées dans le projet).
Impact sur les animaux
Le projet nécessite l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Pour ne pas gêner les mouvements de l’animal, le capteur est implanté sous la peau au niveau du dos. Pour éviter les blessures post-opératoires entre les animaux au niveau de la suture, les animaux implantés devront être isolés en cage unique. Cet isolement et la chirurgie seront pris en compte par un suivi journalier de l'animal. Les modifications du microbiote par gavage auront un effet minime sur le bien-être animal et sont censés seulement moduler l'activité du système nerveux (rythme cardiaque). Les interventions du projet (injection de collagène ou auto-anticorps anticollagène) visent à établir un tableau clinique de polyarthrite rhumatoïde très modéré.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèver différents tissus qui seront analysés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles approches thérapeutiques dans la polyarthrite rhumatoïde basées sur la modulation du microbiote par l’alimentation et les probiotiques et d’en évaluer les conséquences à l’échelle de l’organisme. Les approches directement chez les patients permettront de voir les effets cliniques et immunologiques mais ne permettront pas de décortiquer les effets liés au microbiote ni d’appréhender l’influence du système nerveux et des autres organes dans les effets observés. Actuellement, seul le recours aux expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vitro permettent d’évaluer les fonctions d’un microbiote. Tous ces éléments ne peuvent absolument pas être appréhendés en dehors de modèles in vivo.
Réduction
Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge et du même genre au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, échocardiographie), compatible entre elles et permettant le suivi des animaux dans le temps pour réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'information sur chaque animal.
Raffinement
L'ensemble de la procédure d'implantation du capteur de télémétrie sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse. L'animal est monitoré jusqu’à son réveil complet puis placé dans une couveuse à 30°C / 3 heures en cage unique. Le jour de la procédure, des visites régulièresl sont effectuées. Des soins per- et postopératoires appropriés seront réalisés depuis l'avant réveil puis dans les 2 jours suivant l’implantation. Une grille d'évaluation clinique de l'animal permettra son suivi et le respects des points limites. A l'exception des animaux en télémétrie, les animaux seront hébergés en cage par 5 pour respecter leur caractère grégaire, avec présence d'outil de raffinement (nid en cellulose et carré de cellulose).
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vivo, permettent d’évaluer les conséquences fonctionnelles intégrées d’un microbiote précis. La régulation autonomique (afférences/éfférences) est similaire entra l'Homme et la souris. L'expérience du laboratoire dans le transfert de microbiote chez la souris, dans les investigations cardiaques et autonomique (HRV) permet d'éviter une mise au point/validation du protocole et la consommation d'animaux d'autres espèces pour cela. Par ailleurs, un projet connexe sur le modèle murin est déjà en cours sur cette thématique au laboratoire. Notre structure et son matériel est de plus adaptée à la souris.
Evaluation du potentiel protecteur d’un anticorps antiplaquettaire dans le cas de lésions de reperfusions à la suite d’un accident vasculaire cérébral.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue et toutes classées en souffrance sévère, dans des procédures impliquant la pose chirurgicale d'une fenêtre crânienne. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par obstruction transitoire de l'artère cérébrale moyenne, suivi d'une injection d'anticorps et d'une imagerie du cerveau de deux heures sous anesthésie, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur justifie l'impossibilité de garder les animaux en vie par la nature même de l'expérience, un thrombus occlusif étant provoqué. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité de la désagrégation plaquettaire et que les plaquettes, cellules anucléées, ne peuvent être cultivées.
Objectifs
Lors d'un saignement les plaquettes s'accumulent au niveau de la lésion formant un clou hémostatique qui stoppe l’hémorragie. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade et mener à la formation d'un thrombus entrainant l’occlusion du vaisseau, responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Une étude clinique très récente indique qu'un nouveau candidat médicament divise la mortalité par 3 de patients qui présentent un AVC ischémique aigu. Le mécanisme d’action de cet agent reste obscur étant donné que l’effet protecteur n’est pas lié à une meilleure recanalisation mais un risque hémorragique diminué, suggérant un impact lors de la reperfusion de la zone du cerveau ayant subit une privation d'oxygène. Ce projet vise à déterminer le mécanisme d’action de cet agent lors d’AVC ischémique chez la souris justifiant ainsi l’utilisation de cet agent pour un futur essai clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet portent sur la possible utilisation d'un nouveau candidat médicament pour de nouvelles indications et d’essais cliniques
Procédures
Tous les animaux subiront : •Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale permettant la pose d’une fenêtre cranienne afin de pouvoir imager le cortex cérébral. 1 fois 45 minutes •Une induction d’un AVC par obstruction transitoire de l’artère cérébrale moyenne du cerveau sous anesthésie générale ainsi qu’une injection par voie veineuse d’un anticorps 4 semaines après la pose de la fenêtre. 1 fois 15 minutes •Imagerie du cerveau par microscopie multiphotonique sous anesthésie générale 1 fois 2h •Mise à mort pas dislocation cervicale
Impact sur les animaux
Lors de l’expérimentation nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence cardiaque, respiratoire ainsi qu’une baisse de température dû à l’anesthésie de l’animal. Ces paramètres seront surveillés, la concentration d’anesthésique sera ajustée si nécessaire et l’animal sera réchauffé tout au long des procédures. La procédure expérimentale comprenant une chirurgie au niveau du crâne ainsi que du cou de la souris sera réalisée par un personnel expérimenté disposant de la formation requise pour réaliser ce type d’expérimentation limitant ainsi au strict minimum les effets indésirables. De plus les souris seront anesthésiées tout au long des procédures expérimentales et et leur état de santé sera étroitement surveillé. Après la pose de la fenêtre cranienne, nous pouvons nous attendre à une légère perte de poids des animaux qui ne devrait pas excéder 3 jours. Nous nous attendons pas a des effets indésirables après l’induction de l’AVC de plus les animaux seront conservés seulement 24h et seront encore sous traitement analgésique.
Devenir
Le projet porte sur l’étude de l'effet d'un anti-thrombotique dans le cas d'un thrombus occlusif au niveau de l'artère carotide, en conséquence les animaux ne peuvent pas être garder en vie à l'issu de l'expérimentation.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’inhibiteurs dans un processus complexe et intégré qu’est la désagrégation plaquettaire. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, un modèle in vivo sera utilisé. De plus, les plaquettes sont des cellules anucléées qui ne peuvent être cultivées, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum. Pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs les effectifs de chaque groupe ont été calculés suivant les tests statistiques en respectant la distribution selon une loi normale. Nous utiliserons des statistiques pour la comparaison de 2 groupes.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un antalgique sera administré au niveau de la zone de chirurgie. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel qualifié.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répendus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris sur un même fond génétique : •Exprimant la Glicoprotéine VI humaine permettant de tester des anticorps humains chez la souris. •N’exprimant pas la protéine Glicoprotéine VI permettant d’évaluer l’importance de la glicoprotéine dans la formation de thrombus occlusif. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. L’expression de la Gliprotéine VI humaine n’induit pas d’effet indésirable notable chez les souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris contrôles sauvages. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 8 et 24 semaines. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge.
Etude des conséquences des troubles métaboliques dans le contexte de l’accident vasculaire cérébral dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 188 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après trois mois de régime enrichi en graisses, elles subissent une chirurgie provoquant un accident vasculaire cérébral, puis des tests de comportement et de l'imagerie, pour étudier la réparation cérébrale liée à l'âge et aux troubles métaboliques. Le porteur indique que le modèle induit une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une prise de poids importante et une possible déshydratation. Les bénéfices pour l'être humain restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que l'étude ne s'envisage que dans un "organisme entier" et juge le passage à l'animal "indispensable".
Objectifs
Cette étude a pour objectif de caractériser le rôle de l’âge et des perturbations métaboliques qui font partie des facteurs de risque bien identifiés dans les pathologies cardiovasculaires, première cause de mortalité dans le monde dont l’accident vasculaire cérébral (AVC) fait partie. L’étude s’intéressera particulièrement à comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse et la réparation cérébrale et vasculaire suite à un AVC, en prenant en compte ces facteurs de risques. A terme, l’objectif est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour offrir des possibilités adaptées d’améliorer les résultats cliniques suite à un AVC.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités). Il pourra en découler l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Après 3 mois d'alimentation enrichie en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (1 injection de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie toutes les 30 min pendant 2h). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique en utilisant un modèle in vivo d'ischémie cérébrale (chirurgie sous analgésie et anesthésie gazeuse d'une durée de 15+5 min, suivie de 2 injections d'analgésiques 2 fois par jour pendant 3 jours). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés 48h, 7 et 21 jours après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement (3 tests d'une durée de moins d'1 min par test) et de l’imagerie (méthode non invasive).
Impact sur les animaux
L’âge et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). La douleur induite par l’injection dans l'abdomen de glucose peut également être une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire une étude protéique, moléculaire et de tri cellulaire.
Remplacement
Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques dons le calcul de puissance est effectué en utilisant le logiciel in vivoStat. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique (buprénorphine) en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse par isoflurane). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle murin pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Après une étude in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions angiogéniques et sécrétoires des cellules endothéliales, le projet a pour but maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale, représentant un enjeu majeur de santé publique, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il est donc indispensable de passer à des études chez l’animal. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC et du vieillissement vasculaire. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte avec des facteurs métaboliques aggravant comme le diabète, les animaux seront utilisés au stade adulte après un régime conduisant à des perturbations métaboliques systémiques en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime (âge nécessaire pour avoir un vaisseau mature et qui peut subir un vieillissement vasculaire semblable au vieillissement vasculaire humain).
Rôle de l’Angiopoiétine-like 4 (ANGPTL4) dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un modèle de choc septique.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de LPS provoquant un choc septique, avec chute de pression, troubles de conscience puis coma, suivie d'échographies et de prélèvements intracardiaques. Le porteur étudie le rôle d'une protéine, l'ANGPTL4, dans la fuite capillaire, l'objectif d'un traitement pour les patients restant à long terme. Il indique que des études in vitro préalables ne reproduisent pas les voies physiologiques en jeu et conclut au recours "nécessaire" au modèle animal.
Objectifs
Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 (ANGPTL4), cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de l’ANGPTL4 dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’ANGPTL4 permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique.
Bénéfices attendus
Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.
Procédures
Les animaux recevront chacun une injection en intra-péritonéal (IP) de LPS (d’une durée de moins d’une minute) puis d’ANGPTL4 qui se fera soit en IP de la façon précédemment décrite, soit en intraveineuse (au niveau caudal, procédure d’une durée d’environ 3 minutes), soit par minipompes (durée d’environ 10 minutes par souris pour l’implantation de cette dernière). Ensuite, une échographie (d'une durée totale de 20 minutes) suivie d’un prélèvement intracardiaque (typiquement 1 à 2 minutes) seront réalisés sur une partie des souris. Sur une autre partie, une mesure de la pression artérielle (également d’une durée de 20 minutes) sera réalisée. Enfin, une injection prophylactique d’antalgique (buprénorphine) sera réalisée systématiquement en IP en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l'injection de lipopolysaccharides (LPS) sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma).
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et l’ANGPTL4 régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le nombre d’animaux nécessaires est calculé a priori. Le dimensionnement de notre étude a été réalisé grâce à un test de puissance.
Raffinement
À des doses modérées de LPS, le choc induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques entre l’injection de LPS et le stade de coma. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, une antalgie prophylactique par une injection sous-cutanée (SC) de buprénorphine sera réalisée. Durant l’ensemble du projet, l’inconfort sera systématiquement dépisté par la « mouse grimace scale » toutes les 2h heures et complétée par le score validé par le comité éthique s’il est ≥ 2. Si ce score est ≥3 un traitement antalgique par buprénorphine sera administré par voie SC. Néanmoins, si malgré l’administration de buprénorphine, l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal à l’issue d’une intervention comme les injections de LPS (en IP, en IV ou par le système de diffusion passive), les examens d’imagerie ou simplement dans le cadre du suivi (animal prostré, tremblant, isolé ou présentant une nécrose d’un membre ou une difficulté respiratoire), l’expérience sera interrompue par dislocation cervicale sous anesthésie profonde par isoflurane. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Concernant l’étude de survie, en plus des précautions prises ci-dessus, les animaux seront davantage surveillés (3 fois/jour). Enfin, les animaux sont élevés dans les conditions usuelles d’hébergement, en groupe, validées par la structure bien-être de l’animal au sein du centre de recherche agréé. Chaque chercheur demandeur du projet APAFIS est détenteur du niveau 1 d’expérimentation animale et du diplôme de chirurgie expérimentale.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS (Syndrôme de Réponse Inflammatoire Systémique) au LPS est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de l’ANGPTL4 dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si l’ANGPTL4 peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.
Evaluation de l’efficacité de l’ablation par champs pulsés dans un model ovin d’infarctus du myocarde
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
50 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une création d'infarctus par occlusion des artères coronaires, des séances d'imagerie, une ablation cardiaque par électroporation et des prises de sang répétées, avant l'euthanasie pour prélever le cœur. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de tachycardie ventriculaire, une procédure plus efficace et une meilleure qualité de vie, restent au conditionnel. Le porteur affirme que le remplacement "n'est actuellement pas possible" et présente un jumeau numérique en développement comme un remplacement futur.
Objectifs
La tachycardie ventriculaire est un trouble du rythme cardiaque complexe grave qui peut entraîner une mort subite. Dans la grande majorité des cas (>70%), les tachycardies ventriculaires surviennent dans un contexte d’infarctus du myocarde ancien. Le remodelage du tissu cardiaque suite à un infarctus permet la création d’hétérogénéités qui favorisent les tachycardies ventriculaires. L’ablation par cathéter de ces zones hétérogènes du cœur, est une thérapie qui peut significativement réduire les nombres de tachycardies ventriculaires des patients, en améliorant leur qualité de vie. Une nouvelle forme d’ablation, utilisant un champ électrique pulsé de haute amplitude appelée ablation par électroporation ou Pulsed Field Ablation (PFA), est une nouvelle technique de traitement pour obtenir une thérapie plus efficace, notamment si elle est combinée avec des techniques d’imagerie qui permettent d’avoir un modèle, trois dimensions du cœur du patients (jumeau numérique) pendant l’opération. Dans ce projet, nous souhaitons investiguer les effets et les propriétés de cette technique d’ablation dans un modèle animal ovin pathologique, avec l’assistance de jumeaux numériques. Les objectifs scientifiques sont les suivants : mieux caractériser les lésions de la technique innovante d’ablation PFA dans le tissu hétérogène du cœur en utilisant de techniques d’imagerie non invasive ; développer un modèle mathématique pour optimiser et personnaliser l'administration de la thérapie ; et l'inclure dans un logiciel de traitement d’images pour les procédures cliniques existantes, ce qui fournira un nouveau outil à la thérapie des patients.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’optimiser une technique d’ablation innovante (PFA) et de révéler des aspects importants de l'effet de cette technique sur les tissus d’intérêt du cœur (sur le modèle pathologique post infarctus développé). Il permettra un meilleur dosage de l’énergie d'électroporation et d’adapter le protocole en fonction de l’anatomie individuelle du cœur et de l’origine de la tachycardie ventriculaire. Le projet ouvrira également de nouvelles perspectives dans le domaine du traitement des images cardiaques en trois dimensions (jumeau numérique) grâce à cette première application pour la tachycardie ventriculaire. Cette technologie pourrait permettre de l’étendre à d’autres formes de maladies cardiaques. Autant de thèmes encore largement ignorés mais capitaux pour éviter les récidives et les interventions ultérieures sur les patients atteints de tachycardie ventriculaire. Les patients bénéficieront non seulement d’une procédure plus efficace et plus sûre, mais aussi d'une meilleure prise en charge pendant et après la procédure, avec une meilleure qualité de vie après le traitement. Ce travail permettra à cette technique d’ablation PFA de devenir progressivement le traitement de choix pour l’ablation des tachycardies ventriculaires.
Procédures
Les animaux utilisés subiront des interventions de création d’infarctus, d’imagerie et d’ablation par electroporation sous anesthésie générale et avec l’administration d’une thérapie anti-algique appropriée. La procédure de création d’infarctus (150 minutes) se déroule, sous guidance des rayons X, par occlusion progressive, sous surveillance, de deux ou trois branches des artères coronaires. Une prise de sang avant (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) et 24 après l’infarctus (animal vigile, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesure l’état inflammatoire (cytokine) et de dégâts subis par le tissu cardiaque (troponine). Apres 4-6 semaines de récupération, les séquences d’imagerie sont de type non-invasif, soit par IRM cardiaque et/ou une échocardiographie par sonde thoracique/transoeasophagienne et/ou par scanner cardiaque (environ 180 minutes). L’ablation par cathéter (90 minutess) est effectuée sous anesthésie et administration d’héparine pour prévenir la formation de caillots. Des systèmes de traitement d’image et de cartographie de contact nous permettent de cibler les zones potentiellement favorisantes des tachycardies ventriculaires. Une prise de sang avant (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) et 24 après l’ablation (animal vigile, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesure l’état inflammatoire (cytokine) et des dégâts subis par le tissu cardiaque (troponine). Apres 4-6 semaines de récupération, une imagerie (environ 180 minutes) et une cartographie de contact diagnostique (90 minutes) de suivi sont prévus pour évaluer les effets du protocole d’ablation par electroporation. Une prise de sang avant l’euthanasie (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesure l’état final du contexte inflammatoire et du remodelage cardiaque.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie), ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante, molécules de réanimation par exemple si besoin) sont mis en place. Les examens d’imagerie (échocardiographie, IRM et cartographie de contact) sont effectués sous anesthésie générale et thérapie antalgique. La création de l’infarctus aura lieu durant la perfusion continue d’anti-arythmiques et de bétabloquant, dont le débit sera ajusté en fonction des signes cliniques observés sur le monitoring. Pendant l’ablation, notamment avec la PFA, on pourrait observer une paralysie temporaire du nerf phrénique ou du diaphragme, mais ces conditions n’empêchent pas la ventilation mécanique. En phase d’étude diagnostique pendant la cartographie de contact, des déclenchements de tachycardie ventriculaire et potentiellement débordants en fibrillations, seront traitées immédiatement par un défibrillateur toujours présent en salle. Des saignements mineurs peuvent avoir lieu aux sites d’introduction des cathéters pour la cartographie.
Devenir
Afin de prélever le cœur et effectuer des études ex vivo d’histologie et de microscanner, qui nous permettront de mieux comprendre la structure des cicatrices induites par l’infarctus et l’ablation, l'ensemble des animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Pour répondre aux questions d’ordre clinique, pour développer et optimiser la prise en charge des patients, des modèles animaux de pathologies humaines sont nécessaires. Le remplacement des animaux n’est actuellement pas possible. En effet, l'étude des mécanismes physiologiques complexes dans leur globalité nécessite d’avoir recours à un modèle animal et il n'existe pas à ce jour de modèle de modélisation numérique ou in vitro. Au cours des dernières années, un travail est en cours sur une technologie de traitement des images préopératoires permettant de construire un jumeau numérique du cœur sain et malade. En utilisant cet outil en clinique, nous évitons aujourd’hui d’utiliser des animaux pour l’optimisation des protocoles d’ablation. Ce projet permettra à terme d’obtenir un modèle numérique remplaçant l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
Notre stratégie pour réduire le nombre d'animaux utilisés repose sur la création, dans notre modèle, de plusieurs cicatrices, ce qui nous permettra d’obtenir des sites d’ablation. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer la taille des lésions entre les groupes et pour définir la vulnérabilité à la tachycardie ventriculaire avant et après la thérapie. Cela nous donnera une idée de la variabilité individuelle liée à la structure du tissu et au remodelage du tissu cardiaque. Nous allons également minimiser les temps des différents examens, pour que nous puissions utiliser les mêmes animaux pour différentes techniques d’imagerie non invasive l'une après l'autre, notamment l’IRM ou l'échographie. Dans le meilleur des cas, cela nous permettra de diminuer jusqu’à 50% le nombre d’animaux nécessaires. En phase de création du modèle nous allons utiliser certains animaux comme leurs propres contrôles. Cette dernière stratégie nous permettra de ne pas inclure d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Au cours du projet, les animaux reçoivent un protocole analgésique approprié, ils sont sous anesthésie générale avec une ventilation mécanique et les constantes vitales sont suivies en permanence lors des opérations. Tout le nécessaire est mis en place pour leur prise en charge : opération réalisée par du personnel formé, anti-arythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire, défibrillateur disponible... Pendant la phase de suivi, l'animal est hébergé dans des locaux adaptés et les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce sont mise en place (groupe social notamment). Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel, qui peut intervenir rapidement. Le vétérinaire et le responsable du projet adapteront les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l'état de santé au point d'atteindre l'un des points limites sans qu'aucune action ne puisse permettre un retour à l'état basal alors le protocole sera interrompu.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme (mouton, porc, chèvre, chien), le mouton a été retenu car ce modèle est une référence pour la communauté scientifique dans l’étude des pathologiques cardiaques, de plus le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ce modèle. Le mouton atteint la fin de son développement entre 1 et 2 ans, à ce stade de développement, l’organe d’intérêt de l’étude, à savoir le cœur aura donc une taille et une maturité nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Histoire naturelle et études pilote de thérapie génique chez la souris PKP2_Het, modèle animal de la cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène (CVDA)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation reproduisant une cardiomyopathie du ventricule droit, elles subissent une biopsie de la queue, une évaluation cardiaque sous anesthésie avec stress adrénergique, puis pour certaines une injection d'un vecteur de thérapie génique et des prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que les analyses histologiques et moléculaires "ne peuvent se faire du vivant de l'animal", ce qui justifie la mise à mort de toutes les souris. Il présente ce travail comme une étape préalable à l'évaluation de traitements, l'objectif immédiat restant de décrire l'histoire naturelle de la maladie chez ce modèle.
Objectifs
La Plakophiline 2 (PKP2) est une protéine codée par le gène PKP2. On la trouve en abondance dans la peau et le muscle cardiaque, où elle fait le lien entre différentes protéines. Dans le cœur, elle se trouve au niveau des jonctions cellulaires, où elle participe activement à la connexion mécanique intercellulaire et à la propagation du signal necéssaire aux contractions cardiaques. Une mutation du gène PKP2 provoque une cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène (CVDA). Cette maladie est caractérisée par le remplacement progressif du muscle cardiaque dans le ventricule droit par du tissu graisseux et fibreux. Le cœur perd alors sa contractilité et il en résulte à terme une mort subite, pouvant être déclenchée par l'exercice. Il n'existe actuellement pas de traitement. PKP2 est une protéine assez conservée entre les espèces. Par conséquent, l'étude de la déficience en PKP2 dans des modèles animaux est une approche pertinente. La majorité des mutations du gène PKP2 chez l'homme entraînent une haplo-insuffisance, ce qui signifie que la présence d'environ 50 % seulement de la protéine normale dans le cardiomyocyte entraîne la maladie. Si des modèles de souris haplo-insuffisantes pour PKP2 ont été générées par le passé (avec quelques résultats publiés dans la littérature), aucun modèle de souris transgénique de ce type n'est disponible aujourd’hui sur le marché ou via des collaborations. Afin de comprendre le phénotype de la maladie chez la souris et de surtout pouvoir tester des approches thérapeutiques, un nouveau modèle de souris transgénique mutée sur le gène PKP2 murin a été généré. Nous souhaitons aujourd’hui (i) caractériser la pathologie de ce nouveau modèle de souris appelé PKP2_Het, et (ii) en cas de pathologie avérée, évaluer une approche thérapeutique de thérapie génique. C’est l’objet de ce projet, qui est donc divisé en 2 parties.
Bénéfices attendus
La CVDA est une cardiomyopathie héréditaire caractérisée par un remplacement progressif des cardiomyocytes par du tissu graisseux et fibreux. Les syndromes observés sont des troubles du rythme cardiaque, qui causent une mort subite chez les adultes jeunes et les sportifs (l’effort étant un facteur déclenchant de la mort subite). La prévalence de la CVDA est estimée entre 1/2000 et 1/5000. Une mutation du gène PKP2 est impliqué dans 70 à 90% des cas de CVDA. Le traitement actuel repose sur la prise de bêtabloquants parfois en association avec des anti-arythmiques, l’ablation par radiofréquence, l’implantation d’un défibrillateur automatique implantable ("pace-maker"), et plus généralement le traitement de l’insuffisance cardiaque. La pratique sportive est clairement contre-indiquée, même chez les jeunes patients. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l’efficacité des produits thérapeutiques, études de dose…). Le présent projet vise à évaluer la pertinence d’un nouveau modèle murin créé pour mimer cette pathologie, et en cas de pertinence avérée, réaliser une étude pilote pour évaluer l’efficacité d’un traitement de thérapie génique. C’est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints de CVDA.
Procédures
Pour l'étude d'histoire naturelle du modèle de souris étudié, les animaux seront soumis aux interventions suivantes: - Biopsie de queue pour génotypage (1 biopsie / animal): 2 min - Evaluation de la fonction cardiaque sur animaux anesthésiés, avec induction de stress adrénergique (1 test par animal): 20 min, puis sans réveil de l’animal : prélèvement sanguin (2 min), avant mise à mort. Pour l’étude pilote pour l'évaluation de l'efficacité d'une approche thérapeutique de thérapie génique, les animaux seront soumis aux interventions suivantes: - Biopsie de queue pour génotypage (1 biopsie / animal): 2 min - A un âge déterminé lors de l’étude d’histoire naturelle : injection unique d'un vecteur de thérapie génique ou de véhicule, sous anesthésie ou bien sur animal vigile, selon le site d’injection choisi (1 injection / animal):10 min max - Prélèvements sanguins au niveau d’une veine sous-mandibulaire (2 prélèvements / animal, avant injection, puis avant la mise à mort): 5 min - Evaluation de la fonction cardiaque sur animaux anesthésiés, avec induction de stress adrénergique (1 test par animal): 20 min, puis sans réveil de l’animal : prélèvement sanguin: 5 min, avant mise à mort.
Impact sur les animaux
(i) Injection intraveineuse: l'injection intraveineuse réalisée dans la veine caudale se fera sous contention et pourra provoquer un stress léger le temps de l'injection (moins de 10min), et une petite douleur au niveau du site de ponction. L'injection intraveineuse par voie rétro-orbitale se fera sous anesthésie et ne provoquera pas de stress ou de douleur à l'animal. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez la souris est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) ECG et échocardiographie trans-thoracique : geste non invasif, réalisé sur animal anesthésié pour éviter tout stress à l’animal. (iii) Injection intrapéritonéale d’un mélange d’isoprénaline et de phényléphrine : injection réalisée sous anesthésie générale, donc sans douleur pour l’animal. Par contre, le stress adrénergique qui sera alors appliqué pourrait induire, chez les animaux malades, une arythmie accrue et une mort subite. Cela pourrait toucher environ 20% des animaux (données obtenues dans d'autres modèles d'arythmies cardiaques). Sachant que ce stress sera induit juste avant la mise à mort des animaux (sans interruption de l’anesthésie entre l’évaluation de la fonction cardiaque et la mise à mort), cela n’aura pas d’impact négatif sur les animaux. (iv) Prélèvement sanguin terminal chez la souris au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour l’animal, puisque cet examen sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.
Devenir
A l'issue de cette étude, tous les animaux de cette étude seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.
Remplacement
Ce projet de caractérisation de l'histoire naturelle de la souris PKP2_Het (à différents âges et avec des évaluations adaptées) nous permettra à terme de réaliser l'évaluation préclinique de traitements potentiels de la CVDA dans ce modèle animal, s’il se révèle en effet adapté, et donc de raffiner le nombre d'animaux utilisés dans ces futurs projets précliniques. D'autre part, il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d’administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation d’un modèle animal est donc essentiel pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement de la CVDA.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets et des données de la littérature sur les autres modèles de souris hétérozygotes PKP2, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles.
Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (cages équipées de mezzanine et mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement, coupage des incisives si nécessaire) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (cf exemple en annexe 1 de la saisine). 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
PKP2 est une protéine assez conservée entre les espèces. Par conséquent, l'étude de la déficience en PKP2 dans des modèles animaux est une approche pertinente. Le modèle de souris étudié dans ce projet est partiellement déficiente pour PKP2, comme les patients atteints de cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène (CVDA). Dans ce sens, elle se révèle être un modèle animal pertinent pour notre étude. Pour l’étude d’histoire naturelle, la caractérisation sera réalisée à différents âges, afin d’évaluer le processus évolutif de la maladie, et définir à quel âge il serait pertinent de traiter les animaux lors des études thérapeutiques. Chez l’homme, la pathologie se met en place progressivement et les 1ers symptômes de la CVDA débutent le plus souvent entre 20 et 40 ans (soit au stade adulte). Nous avons donc choisi d’analyser les animaux à l'âge de 3, 6, 9 et 12 mois (également au stade adulte donc). Pour l’étude pilote d’évaluation de l’efficacité d’une approche thérapeutique de thérapie génique, l’âge d’injection sera défini selon les résultats obtenus dans l’étude d’histoire naturelle, cet âge étant choisi pour être un âge où des 1ers symptômes de CVDA peuvent être observés chez les souris après application d'un stress adrénergique.
Rôle de l’Angiopoïétine-like 4 dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un choc cardiogénique post-arrêt cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent un arrêt cardiaque provoqué suivi d'une réanimation par massage cardiaque et ventilation mécanique, le porteur estimant que 20 pour cent meurent dans les trois heures et 40 pour cent dans les six heures malgré la réanimation. L'étude cherche une cible pour limiter la fuite capillaire au cours des chocs, l'arrêt cardiaque induisant selon le porteur un coma qui rendrait la procédure sans inconfort. Il affirme que les études in vitro préalables "ne sont pas satisfaisantes" et que le modèle animal est nécessaire pour intégrer les composantes physiologiques.
Objectifs
Ce projet de recherche fondamentale vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire (fuite de plasma au travers des vaisseaux) au cours des états de choc cardiogénique chez l’homme. Les états de choc constituent un enjeu de santé publique. Les admissions pour états de choc représentent un tiers des admissions en réanimation (environ 20.000 patients par an), et la mortalité associée reste de l’ordre de 40% actuellement. Il existe au cours des états de choc une fuite capillaire importante). Cette fuite capillaire est due à une augmentation de la perméabilité des vaisseaux du fait de l’activation de l’inflammation (syndrome de réponse inflammatoire systémique : SRIS). Lorsqu’elle est généralisée, cette fuite capillaire aggrave l’insuffisance circulatoire du fait de la baisse du volume sanguin, et participe à l’apparition de lésions sur l’ensemble des organes (syndrome de défaillance multiviscérale). Le contrôle de la fuite capillaire s’est avéré très bénéfique dans plusieurs modèles de choc chez l’animal. Cependant, les déterminants de cette fuite capillaire au cours des états de choc restent très peu connus chez l’homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons isolé plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire chez des patients atteints de SRIS. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’angiopoïétine-like 4 comme cible d’intérêt particulier. Notre objectif est de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 permet de diminuer la fuite capillaire et la mortalité au cours du SRIS.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de caractériser le rôle de l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 dans la fuite capillaire associée au choc cardiogénique post-arrêt cardiaque, et le potentiel intérêt de sa modulation. Le contrôle de la fuite capillaire au cours de ce syndrome est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, l’arrêt cardiaque restant associé à plus de 50% de mortalité actuellement, et la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients.
Procédures
Une antalgie prophylactique par injection sous-cutanée sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure (typiquement 1 à 2 secondes). Un cathéter veineux sera ensuite mis en place (la procédure complète dure environ 30 minutes). Toutes les différentes injections sont administrées via le cathéter et ne nécessitent donc pas d’interventions supplémentaires sur l’animal. La réanimation cardio-circulatoire comporte un massage cardiaque (8 minutes) et une ventilation mécanique (i.e. une assistance respiratoire) d’au moins 1h jusqu’à atteindre une fréquence respiratoire supérieure à 100/min. L’imagerie cardiaque par échographie (non invasive) dure typiquement 15 minutes.
Impact sur les animaux
De par la variabilité physiologique des animaux ou de par leur génotype, certains animaux répondent moins bien à la réanimation et le cœur reste en arrêt malgré la réanimation cardio-respiratoire : nous estimons une perte d’effectifs de 20% à 3h et 40% à 6h. Cependant, l’arrêt cardiaque induit une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (c'est-à-dire un coma), et les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Ceci est confirmé par notre suivi des animaux au cours de la mise au point du modèle.
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sérum et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS (Syndrome de Réponse Inflammatoire Systémique). La fuite capillaire est en effet d’origine multi-factorielle et l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 régule de nombreuses voies physiologiques. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le plan expérimental a été optimisé de façon à combiner les données obtenues pour chaque animal et réduire l’effectif nécessaire. Notamment, l'imagerie cardiaque par échographie sera effectuée sur les mêmes animaux que les mesures de fuite capillaire. De plus, les analyses sanguines et histologiques seront effectuées sur le sang et les organes non prélevés. En parallèle, notre équipe poursuit une veille bibliographique continue sur le sujet et sur le modèle de façon à ne par dupliquer d’éventuelles nouvelles données. De la même façon, l’ensemble des résultats du projet sera publié, pour les rendre accessibles aux autres équipes.
Raffinement
Nous tendrons vers les objectifs préconisés de raffinement. L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours des procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la manipulation. Ensuite, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie appropriée. L’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures. L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS secondaire à un arrêt cardiaque est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de notre cible d’intérêt dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si le gène d’intérêt peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement, ainsi que lors de nos expérimentations préliminaires sur ce modèle.
Utilisation de la transplantation mitochondriale dans l’ischémie-reperfusion périphérique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
30 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles subissent une anesthésie générale de quatre heures, pour deux tiers d'entre elles couplée à une chirurgie, et une partie voit l'apport d'oxygène du membre postérieur coupé pendant deux heures pour provoquer une ischémie-reperfusion. L'étude teste la transplantation de mitochondries comme moyen de limiter les lésions, avec en perspective déclarée un traitement adjuvant chez les patients menacés d'amputation. Le porteur indique travailler sur un modèle cellulaire dont les premiers résultats ne sont "pas concluants", et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
L’ischémie, définie par l’arrêt de l’apport sanguin artériel dans un territoire donné, entraîne une inadéquation entre les apports et les besoins de la cellule pour son fonctionnement et sa survie (i.e. apports en oxygène et en nutriments). La reperfusion, correspondant à la restauration de l’apport sanguin artériel nécessaire aux besoins de la cellule, est indispensable mais va paradoxalement provoquer des lésions supplémentaires avec une aggravation de l’état initial (dont la lésion la plus connue est une augmentation de la mort cellulaire). Les mécanismes contribuant aux lésions d’ischémie-reperfusion sont multifactoriels et complexes, mais la dysfonction des mitochondries (centrale énergétique de l'organisme), le stress oxydant et l’inflammation jouent un rôle majeur. Toute la problématique actuelle est de développer des stratégies permettant de lutter contre les effets délétères de l’ischémie-reperfusion. Nous avons ainsi développé des stratégies diverses dont la transplantation mitochondriale, qui a été développée dans l’ischémie-reperfusion cardiaque mais n’est actuellement pas appliquée au niveau des membres inférieurs. Dans ce contexte, l’objectif du présent projet est de développer la transplantation mitochondriale comme stratégie de prévention des effets délétères de l’ischémie-reperfusion périphérique.
Bénéfices attendus
Malgré l’influence des mitochondries dans les dommages engendrés par l’ischémie-reperfusion, peu de travaux se sont intéressés aux effets potentiellement protecteurs d’une transplantation mitochondriale afin de limiter le stress et les dommages engendrés par l’ischémie-reperfusion. Les applications potentielles de la transplantation mitochondriale dans de nombreux domaines thérapeutiques sont importantes. D’un point de vu clinique, la transplantation mitochondriale est un traitement qui pourrait être instauré chez les patients en adjonction à la revascularisation, pour pallier au déconditionnement musculaire lié à l’ischémie critique du membre inférieur. Le pronostic fonctionnel des patients en ischémie critique est extrêmement sombre, car 50% des patients nécessitent une amputation majeure à 1 an de l’évolution initiale de la maladie. Le développement de stratégies permettant de réduire le déconditionnement musculaire permettrait d’améliorer le pronostic fonctionnel des patients, et potentiellement de proposer un traitement aux patients non revascularisables. Cette technique thérapeutique est « simple » puisqu’elle repose sur un isolement de mitochondries afin de les adresser localement au tissu endommagé.
Procédures
Dans notre étude, un groupe qui servira de témoin sera soumis à une anesthésie générale de 4 heures. Deux autres groupes seront soumis à une anesthésie générale couplée à une chirurgie d'une durée de 4 heures.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux sera soumise à une diminution transitoire des apports en oxygène dans le membre postérieur pendant 2 heures. Cette procédure représente l'objet de notre étude et ne peut par conéquent pas être supprimée.
Devenir
Mise à mort des animaux à l'issue de la procédure pour prélèvement des tissus nécessaire à nos études sur la mitochondrie.
Remplacement
Notre équipe travaille actuellement sur un modèle in vitro (modèle cellulaire) d'anoxie-reoxygénation qui permettrait d'étudier les mécanismes sans avoir recours à l'expérimentation animale. Néanmoins, les premiers résultats sur ce modèle ne sont pas concluants et, par conséquent, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro permettant d’évaluer l’impact de l’ischémie reperfusion sur la dysfonction mitochondriale et les potentiels effets bénéfiques d’une transplantation de mitochondries. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d’étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés sur des modèles ex vivo ou in silico. Afin de mieux comprendre les avantages de la transplantation mitochondriale, il semble pertinent de considérer les organes dans leur intégralité et dans des conditions expérimentales les plus proches possibles des conditions physiologiques afin de potentiellement transférer ce modèle en clinique. Par conséquent, l’utilisation du modèle animal est indispensable à la réalisation de ce protocole.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés à leur hébergement 10 jours avant le début des expérimentations. Les animaux sont répartis en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Les animaux seront suivis quotidiennement pour détecter tout signe de malêtre et des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie et les animaux seront maintenus à température grâce à un tapis chauffant.
Choix des espèces
Notre équipe a développé les différents modèles d’ischémie-reperfusion sur la souris afin d’éviter de réaliser des expérimentations sur des gros animaux et pour avoir la possibilité de pouesuivre no travaux sur des modèles de souris génétiquement modifiées pour explorer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Les souris seront âgées de 9 à 15 semaines pour qu’elles aient un poids d’environ 30 grammes. Nous avons choisi de travailler sur des souris jeunes afin d’exclure tout impact du vieillissement sur les paramètres analysés dans notre étude. Il est de même pour le poids, nous avons choisi de travailler sur des souris de 30 afin d’exclure un potentiel impact de l’obésité (accumulation de masse graisseuse) qui pourrait également impacter nos résultats.
Optimisation des Performances In Vivo de Prothèses de Valves Textiles en Chirurgie Cardiaque chez la Brebis
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
10 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie cardiaque à cœur ouvert d'environ cinq heures pour l'implantation d'une valve en textile, puis est tuée au plus tard six mois après afin de récupérer l'implant. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie, d'infection, de pneumothorax voire de mort liés à la thoracotomie et à l'anesthésie. Il affirme que le modèle ovin est "le seul" reconnu pour l'étude des prothèses de valves cardiaques et qu'aucune méthode in vitro ne le remplace.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans le cadre de l'optimisation des implantations de valves cardiaques par chirurgie miniinvasive. Ce type de chirurgie, qui est moins lourde et plus confortable pour le patient, concerne en effet plus de 50% des remplacements valvulaires aujourd'hui. Cependant les valves biologiques utilisées aujourd'hui dans le cadre de cette procédure subissent des contraintes spécifiques qui tendent à dégrader les feuillets de la valve. Ces dégradations qui ne sont pas forcément apparentes au moment de l'implantation, peuvent mettre en péril la durée de vie de l'implant. Le phénomène est particulièrement critique chez les patients jeunes pour lesquels le matériau doit être durable. Le projet a pour objectif d'étudier le potentiel du matériau textile (polyester) comme candidat au remplacement du matériau biologique pour fabriquer des valves synthétiques plus durables pour la procédure transcathéter. La souplesse du textile favoriserait en particulier le pliage de la valve au moment de l’implantation. Des essais in vivo préliminaires réalisés sur le modèle animal de la brebis à partir de 2016 avait mis en évidence que la valve textile reste fonctionnelle à 6 mois, avec cependant une tendance à la rigidification du matériau. Il s'agit maintenant de tester une nouvelle structure textile plus à même de rester souple sur le long terme dans le but d'optimiser la durée de vie de l’implant.
Bénéfices attendus
Les essais in vivo devraient permettre de valider l'hypothese avancée: un textile monofilamentaire hydrophile en surface permet de limiter à la fois la calcification et le développement de la fibrose sur la valve obtenue à partir de ce textile en position mitrale.
Procédures
Les animaux subissent une intervention chirurgicale en chirurgie ouverte dans le cadre d'un remplacement valvulaire. La procedure se deroule sur une matinee (en incluant la mise en place). 10 animaux sont inclus dans l'etude. La durée prévue de l'intervention est de 5h de l’induction au réveil complet de l’animal.
Impact sur les animaux
Pas d'effet indésirable relatif à la biocompatibilité du matériau identifié. Le polyester utilisé est largement biocompatible. Les effets indésirables sont ceux liés à la chirurgie (infection de la plaie, diminution de la fréquence cardiaque/arrêt cardiaque) ainsi que ceux liés à l’anesthésie (allergie à un des médicaments, difficulté au réveil et à l’extubation). Certains effets peuvent être liés aux complications inhérentes à la thoracotomie: fistule bronchopleurale, hémorragie, infection, pneumothorax, douleur voire mort de l'animal. La durée prévue de l'intervention est de 5h de l’induction au réveil complet de l’animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à 6 mois au plus tard. Ils ne peuvent pas être réutilisés ni replacés ni adoptés car la valve implantée doit être récupérée pour analyse.
Remplacement
Les resultats attendus ne peuvent pas etre obtenus autrement que par la voie de l'implantation animale (ni in silico ni in vitro). En effet les mecanismes lies a la calcification et a l'encapsulation d'un implant par de la fibrose sont complexes et multifactoriels donc difficiles a reproduire in vitro.
Réduction
Dans une approche préliminaire, seulement 2 animaux (brebis) seront considerees. Il s'agit d'un nombre minimal qui permet de reproduire 2 fois la meme configuration tout en limitant les essais. En fonction des résultats obtenus, ce nombre pourra ensuite être augmenté juqsu'à 10 maximum poru confirmer la tendance. Malgre le faible nombre global d'animaux utilisés, il sera quand même possible de tirer des conclusions etant donne que des resultats ont deja ete obtenus avec d'autres textiles par le passe. Il sera de fait possible de comparer les comportements obtenus dans le cadre du present projet avec les resultats precedents.
Raffinement
Le Laboratoire où ont lieu les implantations animales est largement reconnu comme un laboratoire où tout est mis en œuvre afin que les contraintes subies par les animaux soient minimales et que leur bien-être soit préservé au mieux. Les animaux sont évalués quotidiennement ou 2 fois par jour et recevront un traitement approprié. S’ils ressentent des signes de souffrance, ils recevront un analgésique par voie intra-musculaire. La souffrance est prise en charge par l’utilisation de points limites précis et adaptés , un arbre décisionnel, et des critères d’arrêt des souffrances
Choix des espèces
Le modele ovin est le seul modele considere au niveau international comme significatif pour l'etude de protheses de valves cardiaques. En comparaison avec le modele porcin, pourtant tres utilise dans le cadre des chirurgies vaculaire et cardiaque, il apparait que ce dernier ne permet que difficilement de pratiquer l'arret cardiaque et la circulation extra corporelle avec reveil qui est necessaire dans le cadre de ce projet. Brebis de 30kg. Il s'agit de prendre un animal en croissance afin de favoriser l'effet calcification.