Troubles respiratoires

Une perte de poids supérieure à 20 %, une hyperventilation, une perte de poils, un isolement social ou une baisse d'activité en cage font sortir la souris du protocole. 1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 840 d'entre elles subissent une trachéotomie d'une vingtaine de minutes pour mesurer leur fonction pulmonaire et prélever un lavage broncho-alvéolaire, 320 des prises de sang à la queue ou à la joue, après deux à quatre semaines d'instillations nasales d'extrait d'acarien. Le porteur cherche à décrire le comportement de certaines cellules immunitaires dans le poumon asthmatique et ne situe qu'à long terme d'éventuelles retombées thérapeutiques.

Objectifs

Ce projet se focalise sur le rôle des populations immunitaires localisées aux interfaces épithéliales des bronches en conditions physiologiques et en conditions inflammatoires. L’inflammation asthmatique se caractérise par l’activation et le recrutement (local et périphérique) de cellules immunitaires connues pour provoquer des altérations physiologiques au niveau des parois bronchiques suite à une stimulation par des allergènes inhalés. Afin de comprendre la régulation de la réponse immunitaire médiée par ces cellules dans un contexte inflammatoire, les souris sont mises dans des conditions d’induction d’asthme allergique via une exposition à différents extraits d’allergènes comme la papaïne et l’extrait d’acarien (House Dust Mite, HDM), et des molécules stimulantes (IL-33). Ainsi nous étudierons les modifications à court-terme (induites par la papaïne et IL-33) et à long-terme (induites par le HDM) du comportement des cellules immunitaires. Nous effectuerons plus particulièrement des études sur l’activation, la prolifération, la motilité, et les altérations morphologique de ces cellules immunitaires au cours de l’inflammation. Ces études permettront de déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires orchestrés par ces cellules immunitaires, en plus des modifications physiologiques observées.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au cours de l’inflammation du poumon dans un contexte d’asthme allergique. À court terme, ce projet permettra d’établir les différences de comportement des cellules immunitaires en inflammation dans différentes lignées de souris génétiquement modifiées, engendrées par les différents modèles d’induction d’asthme. Les résultats de ce projet devraient communiquer la nature des mécanismes moléculaires et cellulaires entre certaines protéine et cellules immunitaires dans le poumon asthmatique. Cela permettra de déterminer si ces mécanismes contribuent à la progression vers une pathologie chronique, ou à un rétablissement à l’homéostasie. À long terme, ces résultats pourraient participer à de futures recherches sur des stratégies thérapeutiques ciblées contre ces mécanismes moléculaires, afin de lutter contre l’exacerbation de l’inflammation et d’atténuer les dommages physiologiques, au vu de l’impact important de cette maladie en santé publique.

Procédures

Les interventions prévues sont les suivantes : 320 animaux subiront des prélèvements sanguins venant de la veine caudale latérale ou de la veine submandibulaire. 840 animaux subiront une procédure chirurgicale (maximum 20 minutes) permettant d’accéder à la trachée afin d’effectuer des trachéotomies pour les mesures de fonctions pulmonaires et ensuite prélèvements de lavage broncho-alvéolaires.

Impact sur les animaux

La stimulation par certaines molécules en 3 jours consécutifs peut induire une inflammation des poumons à court-terme. Le modèle d'instillations intranasales d’extrait d’acarien sera appliqué pour une plus longue durée allant à 2 semaines dans certaines expériences pour simuler une inflammation asthmatique aigüe, et à 4 semaines dans d’autres expériences afin d’induire une chronicité. Ces inflammations des voies respiratoires peuvent provoquer les nuisances suivantes : des irritations et constrictions aux niveau des bronches, et possiblement une augmentation du rythme respiratoire. Nous nous attendons donc à ce que les animaux utilisés dans ce projet présentent un rythme respiratoire augmenté à l’œil nu. Mis à part cette nuisance, la littérature ne décrit pas d’autres signe de nuisance apparente, Il n’y aucune difficulté d’alimentation/d’abreuvement, ni de mortalité causée par l’inflammation pulmonaire induite par ces modèles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés à pour un accès à leurs organes et à l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.

Remplacement

La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossibles à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront néanmoins entreprises en culture 2 dimensions afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique d’inflammation car les effets des modèles d’asthme allergique sont déjà décrits dans la littérature. Par exemple, nous savons que les changements de comportement des cellules immunitaires ne sont à tester qu’à partir de 24 heures après la dernière instillation de la molécule testée. Les mécanismes moléculaires et cellulaires, ainsi que leurs modulations ne seront analysés qu’à des points de temps précis où des différences significatives des populations immunitaires sont détectées. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire, ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement après la validation des altérations de mécanismes moléculaires impliqués dans les changements de comportement des cellules immunitaires (prolifération, activation, motilité) chez les souris génétiquement modifiées, une étude du blocage des molécules concernées se fera par l’injection de molécules inhibitrices. Ainsi, nous vérifierons dans les organes cibles si les molécules bloquées avaient un effet favorisant ces changements de comportement. L’application de ces molécules bloquantes uniquement dans le cas d’une prolifération/ activation/ motilité statistiquement significative permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste. Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’analyser les différents organes pour les populations immunitaires.

Raffinement

Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences. Certains seront évalués pour leurs capacités respiratoires et leurs sérologies à des points de temps spécifiques. Une fiche d’observation tout au long des conditions permettra de vérifier leur état (pelage, poids, interactions, mobilité) et des scores seront tenus afin de vérifier que les modèles décrits n’induisent pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis : perte de poids importante (>20%), hyperventilation, modification d’état du pelage/alopécie, isolement social, et diminution de l’activité dans les cages. Le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de diminuer la dose des stimulants et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Dans le cas des anesthésies par voie gazeuse, nous veillerons à chauffer les animaux anesthésiés à l’aide d’un tapis chauffant lors des inoculations intranasales. Nous appliquerons également du gel hydratant sur les yeux des animaux anesthésiés afin d’éviter les dessèchements. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.

Choix des espèces

La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. En outre, il existe un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiés dont l’utilisation permettra la réalisation d’études sur les dynamiques et mécanistiques des cellules immunitaires impliquées dans l’asthme allergique. Le détail du nombre de souris dans chaque procédure est décrit dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte, et la mise en place des modèles d’induction de l’inflammation asthmatique débutera à 6 semaines. Dans une de nos procédures, nous analyserons l’effet de l’inflammation asthmatique à partir de 14 jours (2 semaines). Ces âges ont été retenus comme les plus significatifs pour observer la mise en place et le suivi de l’inflammation allergique des voies respiratoires chez la souris. De plus, comme le modèle HDM se pratique sur 4 semaines dans certaines expériences, les souris doivent être analysées à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après les inoculations intranasales et que l’on ne se situe pas sur l’interprétation d’un facteur de vieillissement.

Chaque souris subit, sous anesthésie, une incision de la peau et des tissus au-dessus de la trachée, puis une injection d'une molécule qui déclenche une fibrose pulmonaire, la plaie étant refermée par un ou deux points de suture. 480 souris, dont des porteuses d'une inactivation d'une copie du gène Parn, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique un risque de mortalité lié à la fibrose du septième au quatorzième jour après l'injection, une gêne respiratoire et une perte de poids possibles, atteintes qu'il déclare pourtant en souffrance modérée. Toutes sont tuées pour prélever les poumons, après un lavage bronchoalvéolaire par cathéter introduit dans la trachée.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie pulmonaire fréquente et grave. Environ 10% des cas de FPI sont associés à des cas familiaux. En dehors de la transplantation pulmonaire, aucun traitement permettant de guérir cette maladie n’est disponible pour les patients. La FPI résulte d'un dysfonctionnement de cellules pulmonaires : les pneumocytes de type 2 (P2), qui résulte notamment d’expositions environnementales, et d’anomalies génétiques favorisantes, le vieillissement constituant un facteur favorisant majeur. On détecte dans près de 30% des formes familiales une lésion génétique pathogène (délétère) sur un gène contrôlant la stabilité de l'extrémité des chromosomes. Parmi celles-ci, les anomalies dans le gène « poly(A)-specific ribonuclease » (PARN) sont parmi les anomalies les plus fréquemment rencontrées. Les phénomènes biologiques reliant ces anomalies génétiques de PARN et le développement de la fibrose demeurent inconnus. Les modèles de souris de fibrose pulmonaire sont la référence actuelle pour l’étude de la physiopathologie (mécanismes à l'origine d'une maladie) de la fibrogenèse (formation de la fibrose) pulmonaire. Le développement d’un modèle sur la souris de fibrose pulmonaire associée au défaut génétique de Parn est justifié par i) l’accès très limité aux prélèvements pulmonaires de patients atteints de ce défaut génétique ; ii) les limites de l’utilisation de modèle in vitro (culture cellulaire) pour l’étude de la fibrogenèse pulmonaire. L’objectif de ce travail est de caractériser l’impact du défaut génétique de Parn sur la fibrogenèse pulmonaire.

Bénéfices attendus

La fibrose pulmonaire idiopathique est une maladie progressive et fatale impliquant des interactions entre différents systèmes biologiques. Cette étude a pour objectif d’étudier le rôle du défaut autosomique dominant (la transmission d'une copie du gène muté est suffisante pour transmettre la maladie) de Parn dans des modèles sur la souris de fibrose pulmonaire. Atteindre cet objectif exige l’étude du rôle de Parn dans un organisme animal vivant respectant la complexité de la biologie pulmonaire qui implique de nombreux types cellulaires et médiateurs. Cette étude, réalisée d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins, assurera une meilleure connaissance de la physiopathologie de la fibrogenèse pulmonaire chez l’Homme. Ceci est un préalable indispensable au développement de nouvelles thérapies ciblées et curatives pour nos patients.

Procédures

Nous utilisons dans ce projet des souris contrôles, des souris transgéniques avec un défaut génétique inactivant l'une des deux copies du gène Parn. En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées à des temps différents après anesthésie profonde, après quoi un prélèvement de sang sera réalisé ainsi qu'un lavage bronchoalvéolaire (une petite incision au niveau de la trachée est réalisée pour permettre de placer un cathéter souple, une injection unique de sérum Physiologique est effectuée délicatement, et ré-aspirée) et le recueil des poumons sur l'animal euthanasié.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Dans les modèles de fibrose induite par deux molécules différentes, il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose à partir du 7ème jour, et jusqu'au 14ème jour après injection. Une fréquence respiratoire anormalement élevée ainsi qu’une gêne respiratoire sont des conséquences possibles de la fibrose . Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice, suite à l’intervention chirurgicale au niveau de la trachée, est également possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. En outre, la bonne compréhension des mécanismes cellulaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules issues d’autres tissus/organes via la circulation sanguine notamment. Ces affirmations se basent sur des discussions avec des confrères, des conférences en pneumologie/immunologie et une recherche bibliographique approfondie effectuée sur la période 2000-2023. Il faut noter que des méthodes alternatives comme les organoïdes (culture cellulaire en laboratoire) sont déjà utilisées dans notre projet mais ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions notamment parce que ce modèle n’intègre qu’un nombre restreint de sous-types cellulaires pulmonaires et ne peuvent pas reproduire le dynamisme du recrutement des cellules extrapulmonaires (c'est à dire l'arrivée de cellules non pulmonaires dans le poumon).

Réduction

Le nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures expérimentales. Des antalgiques seront donnés en pré et post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton et d’un tunnel de change dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’au moment de l'euthanasie. Les souris seront euthanasiée par dislocation cervicale. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins trois fois par semaine par l'expérimentateur. Elle se base sur une grille de points limites évaluant l’apparence de l’animal (yeux, poils, oreilles, posture...), son comportement (motricité, apathie, posture de repli, détresse respiratoire, hypothermie...), la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En cas d'atteinte des points limites, une euthanasie sera effectuée par une méthode réglementaire.

Choix des espèces

Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose pulmonaire humaine. Les souris offrent également la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et d’étudier spécifiquement le rôle d’un gène donné dans le poumon. Enfin, le modèle murin permet la mise en place de modèles pré-cliniques incontournable pour le développement précoce de thérapies innovantes. Actuellement, pour la fibrose pulmonaire, il n’existe pas de stratégie alternative pour modéliser la réponse d’un organe dans le contexte d’un organisme entier. La souris est donc un animal incontournable pour apporter des réponses à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 7 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

Un choc anaphylactique aux curares est déclenché chez 5 440 souris génétiquement modifiées pour porter des récepteurs humains aux anticorps, avec deux prélèvements de sang obtenus par section du bout de la queue. Les procédures sont classées en souffrance modérée et toutes les souris sont tuées, le résumé se bornant sur ce point à deux mots, "mise à mort". Le projet cherche les mécanismes cellulaires d'une réaction dont le porteur rappelle qu'elle tue 4,1 % des patients qui la subissent en France malgré l'adrénaline. La rubrique des effets attendus ne mentionne, elle, que le stress de la contention et la douleur de la piqûre, sans un mot sur le choc lui-même.

Objectifs

Le choc anaphylactique est l’expression la plus sévère des réactions d’hypersensibilité immédiate. La période périopératoire est associée à un risque particulièrement élevé de choc anaphylactique. C'est particulièrement le cas pour les curares, qui sont utilisés en anesthésie pour provoquer un relâchement musculaire, en agissant sur la jonction neuro-musculaire, ce qui empêche les muscles de se contracter. Le choc anaphylactique impliquant un curare est associé à une mortalité élevée, estimée à 4,1% en France, et ce, malgré une reconnaissance rapide de la réaction et l’administration très précoce d’adrénaline, le traitement de référence. Ceci indique que les mécanismes de l’anaphylaxie aux curares ne sont pas encore bien identifiés. L'objectif est de disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’anaphylaxie aux curares, ce qui permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour traiter cette pathologie.

Bénéfices attendus

Le présent projet a pour but d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires de l’anaphylaxie aux curares. Ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter l’anaphylaxie aux curares et en réduire la mortalité.

Procédures

Les procédures sont de sévérité modérées et seront réalisées dans le strict respect des règles mises en place pour veiller au bien-être des animaux. Les animaux vigiles subiront un stress au moment de l'anesthésie, lors de la contention de l'animal, mais ce geste n'est pratiqué que par des expérimentateurs habilités à le réaliser (donc rapidement). Une douleur peut être ressentie au niveau du site de piqure de l’aiguille lors de l’injection de l’anesthésiant (durée 5 s). Tous les autres gestes invasifs sont réalisés sur souris anesthésiées : il s’agit des traitements administrés par injection: soit 48h, soit 24h, soit 30 min ou 5 min avant le début des mesures. Ces injections ont une durée de 10s. Il s’agit également d’un prélèvement de petit volume de sang réalisé à deux reprises (durée de 15 s) espacées de 24h.

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles subiront un stress au moment de l'anesthésie, lors de la contention de l'animal. Une douleur peut être ressentie au niveau du site de piqure de l’aiguille lors de l’injection de l’anesthésiant. Une douleur peut être ressentie à l’extrémité de la queue après section pour prélèvement sanguin.

Devenir

mise à mort

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’anaphylaxie sont difficiles, voire impossible à étudier chez l’homme, vue l’imprévisibilité de l’évènement et sa rareté. De plus, l’anaphylaxie est un phénomène multifactoriel qui implique plusieurs types de cellules sanguines (basophiles, neutrophiles, monocytes, plaquettes) et tissulaires (mastocytes, macrophages) et faisant intervenir des intercommunications complexes entre les cellules circulantes, la paroi vasculaire et les cellules résidantes des tissus environnants, qui ne peuvent pas être reproduites de façon complète in vitro, tant sur le plan des identités en jeux que sur le plan temporel. La compréhension des processus physiopathologiques intégrés est donc pratiquement impossible chez l’homme et le recours à des études in vivo chez l’animal s’avère nécessaire. Occasionnellement, des études in vitro seront réalisées sur du sang de souris ou sur cellules isolées (plaquettes, neutrophiles). Cependant, elles ne pourront représenter à elles seules la pathologie étudiée.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum afin d’obtenir des données statistiquement significatives. Le n a été calculé par une analyse de puissance. Il s’agit de 4 animaux/groupe. Le maximum de prélèvements sera réalisé sur une même souris (organes, sang, liquides broncho-alvéolaires).

Raffinement

Le modèle animal est choisi dans le but de reproduire, le plus fidèlement possible, la pathologie étudiée et d’en tirer le maximum d’information. Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales: - Au moins 72h avant la procédure, les animaux sont répartis par groupes et mis dans les cages (tout en respectant les groupes sociaux) qu’ils occuperont tout au long du processus.

Choix des espèces

Le recours à l’étude in vivo chez l’animal est nécessaire, car l’anaphylaxie est un phénomène multifactoriel qui implique plusieurs types de cellules sanguines et tissulaires et faisant intervenir des intercommunications complexes entre les cellules circulantes, la paroi vasculaire et les cellules résidantes des tissus environnants, qui ne peuvent pas être reproduites de façon complète in vitro, tant sur le plan des identités en jeux que sur le plan temporel. Pour comprendre les mécanismes de l’anaphylaxie nous utilisons des souris modifiées génétiquement, dites «humanisées » pour l’expression du récepteur FcER1 des IgE ou pour le récepteur FcGRIIA (CD32A) pour les IgG. Les techniques de transgénèse sont maîtrisées chez la souris et ces souris sont disponibles au laboratoire. Ces modèles animaux nous permettent d’étudier in vivo les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’anaphylaxie. Le modèle d’anaphylaxie active ou médié par les IgE pratiqué chez la souris non transgénique, fait consensus dans la communauté scientifique car il représente fidèlement l’anaphylaxie survenant chez l’homme. Les animaux sont utilisés au stade adulte, entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.

Repris d'un projet en cours pour éviter d'en commander de nouveaux, les rats témoins non malades rejoignent ici une cohorte de 560 individus soumise à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placés à quatre semaines dans une atmosphère à 10 % d'oxygène pendant trois semaines consécutives pour reproduire l'altitude, ils reçoivent une injection abdominale par jour, subissent deux anesthésies pour échocardiographie puis un cathétérisme cardiaque, avant d'être tués pour le prélèvement des poumons et du cœur. Le porteur qualifie les effets de cette hypoxie prolongée de bénins, au motif que seule la phase précoce de la maladie est étudiée. Il affirme par ailleurs que trois modèles animaux complémentaires sont "indispensables" pour établir la preuve de concept, alors que les résultats de départ viennent d'échantillons pulmonaires humains et de cultures cellulaires.

Objectifs

L'hyperTension Artérielle Pulmonaire (HTAP) est une maladie qui affecte les petits vaisseaux du poumon qui vont s'épaissir par un processus appelé remodelage vasculaire pulmonaire. Cette altération va imposer un effort au cœur qui à terme va aboutir à une insuffisance cardiaque. Bien que les mécanismes restent encore méconnues, il est maintenant établi que les protéines osseuses morphogénétiques joue un rôle important dans ce remodelage vasculaire pulmonaire. Cependant, les connaissances autour du mode de fonctionnement de ces protéines dans les petits vaisseaux du poumon sont très limitées. C'est pourquoi nous souhaitons étudier leurs rôles dans l'HTAP et tester l’efficacité de molécules ciblant ces protéines pour lesquelles nous avons trouvé une efficacité sur des cellules de vaisseaux pulmonaires en culture.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet seront multiples et devraient permettre non seulement de mieux comprendre le rôle des protéines présentes dans les petits vaisseaux du poumon, mais aussi leur contribution au développement de l'HTAP. De plus, ce projet permettra de tester l'efficacité de certaines molécules ciblant ces protéines pour lesquelles de premiers résultats in vitro sont encourageants.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour effectuer une échocardiographie afin de valider le modèle avant les traitements (temps : 5 min/ rat). En fin de traitement les animaux seront à nouveaux anesthésiés afin de mesurer tous les paramètres nécessaires à l'étude (échographie et cathétérisme). Les rats seront en hypoxie à 10% d’oxygène pendant 3 semaines consécutives afin de mimer l’air ambiant en altitude. Les traitements effectués seront en intrapéritonéales et seront de la fréquence suivante : 1 fois par jour pendant 2 semaines pour la procédure 1 ; 1 fois par jour pendant 3 semaines pour la procédure 2.

Impact sur les animaux

Les procédures appliquées à ce projet nécessitent d'effectuer 2 types d'injection chez le rat : 1 injection sous-cutanée et des injections intra-péritonéales pour les traitements ou du placébo. Ces injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'une crème lidocaïne. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. Également, deux anesthésies gazeuses (isoflurane) seront pratiquées sur l'animal : la première pour valider le modèle expérimental avant traitement par échographie, et la deuxième pour évaluer l'efficacité du traitement par échographie et cathétérisme. L'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée. Le modèle implique une exposition à 3 semaines d'hypoxie (10% d'oxygène) afin de mimer l'effet de l'altitude. Ces effets seront bénins dans notre projet car nous étudierons la mise en place de la maladie en phase précoce.

Devenir

Des prélèvements d'organes (poumons et cœur) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.

Remplacement

Nous avons obtenu des résultats sur des échantillons pulmonaires humains et des cultures de cellules qui indiquent une altération de voies de signalisation dans les cellules endothéliales HTAP et que celle-ci peuvent être restaurées sous l'effet d'une molécule spécifique. Dans l'objectif de valider l'importance de ce défaut sur la fonction cardiaque et sur le remodelage des petites artères pulmonaires, nous souhaitons restaurer ces voies dans 3 modèles complémentaires d'HTAP reconnus internationalement et conclure sur son potentiel thérapeutique. L'HTAP est une maladie multifactorielle où plusieurs organes sont impliqués dont le coeur et le poumon. C'est pourquoi, le recours à des modèles animaux, différents et complémentaires, sont indispensables pour établir une preuve de concept avec cette molécule.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons choisi de cibler nos traitements sur les protéines de la voie ayant la plus forte dérégulation que nous comparons aux contrôles positifs et négatifs d'hypertension pulmonaire. De plus, les effectifs ont été calculés à l’avance et se basent sur nos études passées et celles récemment publiées autour de ce type de molécules. Le critère déterminant pour évaluer l'efficacité du projet est la mesure de la pression artérielle pulmonaire moyenne. Les données de ce projet seront traitées statistiquement à l'aide d'un logiciel spécifique. Egalement, nous réutiliserons les animaux non malades traîtés avec les différentes molécules d'un projet en cours pour ne pas réutiliser des rats similaires dans cette demande. Par ailleurs, les échantillons provenant d'animaux témoins non malades et témoins d'HTAP pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche en cours.

Raffinement

Les rats bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Pour la réalisation de la procédure, nous avons établi des points limites au moyen d'un score afin d'évaluer le bien-être animal. Les animaux seront donc suivis quotidiennement afin de veiller à ce bien-être et de prendre les mesures nécessaires développées dans la description de la procédure. Les rats seront anesthésiés 2 fois pour valider le modèle et les traitemants avec de l'isoflurane. Lors des traitements, une crème lidocaïne sera appliquée sur la zone où s'effectueront les injections.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards d’études de maladies cardiovasculaires. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des rats âgés de 4 semaines et pesant 100 grammes chacun seront utilisés.