Troubles musculosquelettiques
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation de principes actifs sur l’arthrose induite chez le rat par l’injection de composés chimiques dégradant le cartilage
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Une arthrose est provoquée par l'injection dans le genou d'un composé chimique qui dégrade le cartilage, suivie de traitements répétés pendant quatre semaines par la bouche, dans l'articulation, dans la veine, sous la peau ou dans le ventre. 300 rats vont être utilisés, tous tués et autopsiés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les prélèvements sanguins hebdomadaires se font sans anesthésie, et le porteur attend des cris et de l'agitation pendant les administrations, un œdème de l'articulation et une boiterie. Le dispositif permet d'évaluer de trente à cinquante conditions différentes de principes actifs, chaque animal atteignant un point limite étant pris en charge ou tué.
Objectifs
Alors que les affections ostéoarticulaires chroniques, comme l’arthrose, touchent tout particulièrement les adultes de plus de 50 ans. Si les traitements médicamenteux actuels soulagent en partie les douleurs intenses et l’inflammation causée par ces affections, aucun des traitements n’est capable de freiner la dégradation du cartilage ou de totalement guérir de la maladie. Aujourd’hui, seuls les traitements chirurgicaux très invasifs, comme la pose de prothèse permettent de retrouver la mobilité perdue due à l’arthrose. Ainsi, la découverte et le développement de nouveaux traitements agissant de façon globale sur l’inflammation, les atteintes de l’os et du cartilage ainsi que la douleur, caractéristiques de l’arthrose, est un enjeu majeur de santé publique alors que le vieillissement de la population ne fait qu’augmenter. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques dans un modèle d’arthrose chez le rat. Ce modèle est obtenu par injection de produit chimique directement dans le genou de l’animal, et permet le développement d’un modèle dont les signes cliniques sont proches de ceux observés chez l’humain. L’objectif du projet est d’évaluer la capacité de principes actifs à limiter la dégradation du cartilage et/ou régénérer le cartilage dégradé dans un modèle d’arthrose chez le rat, ou contrôler la réponse inflammatoire liée à la pathologie. Grâce à ce projet, différents principes actifs, à différentes concentrations, ou voies d’administration pourront être évaluées. En fonction du nombre d’animaux par groupe, de 30 à 50 conditions différentes pourront être évaluées avec le nombre d’animaux inclus dans ce projet.
Bénéfices attendus
Chaque étude réalisée au sein de cette procédure permettra de générer des informations sur l’efficacité de nouveaux principes actifs testés, tant sur l’inflammation que sur la reconstitution du cartilage ou le ralentissement de l’apparition des lésions dans un modèle d’arthrose induit par injection chimique. A plus long terme, ce projet permettra d’obtenir des données importantes dans le cadre du développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l’arthrose chez l’humain.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection intra-articulaire pour l’induction du modèle réalisée sous anesthésie. Cette opération dure 10 min par animal, et la prise en charge anti-douleur s’étale les jours suivants l’opération. Les traitements seront réalisés et/ou après l’induction du modèle par voie orale ou par injection dans l’articulation, en intra-veineuse, sous la peau, ou dans le ventre de l’animal, et répétés tout au long de la procédure pendant 4 semaines maximum. Des prélèvements sanguins pourront également être réalisés. Ces prélèvements auront lieu sur animal sans anesthésie, et dureront moins de 5 min par animal. Ils pourront être répétés une fois par semaine tout au long du protocole.
Impact sur les animaux
L’induction du modèle peut s’accompagner d’une possible réaction inflammatoire transitoire au niveau de l’articulation. De la même manière, l’apparition progressive des lésions arthrosiques est susceptible d’entrainer gène ou douleur. Les effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être un traumatisme exprimé par des cris/agitation pendant l’administration du traitement, ou le prélèvement de sang, une inflammation au niveau du site d’injection, un œdème articulaire ou une boiterie. Pour prévenir ces différents cas de figure, les animaux seront suivis avec précaution et des grilles d’évaluation clinique associée aux conduites à tenir en cas d’observation de ces signes ont été prévues.
Devenir
A l’issue de chaque protocole tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les articulations, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour évaluer les modifications de différents marqueurs induits par les traitements. Les organes et articulations prélevés seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques, histopathologiques et/ou d’imagerie.
Remplacement
De manière systématique, les principes actifs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des pathologies comme l’arthrose, il est pour le moment impossible de reproduire in vitro les mécanismes de l’articulation à l’origine de l’apparition des lésions. De la même façon, les interactions entre les différentes cellules et tissus composants l’articulation ne peuvent être mimées par un modèle simple de culture cellulaire. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de cette procédure.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux produits, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. L’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données d’études similaires, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu dans le cas où le traitement évalué est connu (par exemple : traitement de référence utilisé comme comparateur), et après analyse des résultats d’études préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente). Lors des prélèvements sanguins et des traitements, nous utiliserons un anesthésique, et des antalgiques dès l’apparition des premiers signes cliniques. Lors des traitements expérimentaux et lors des prises de mesures, nous maintiendrons les animaux dans une situation d’inconfort et de douleur pendant un minimum de temps. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus tôt possible au moment des suivis et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera pris en charge ou euthanasié.
Choix des espèces
Il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer les lésions ostéoarticulaires. L’animal demeure indispensable à l’évaluation de produits. De plus le modèle d’arthrose chez le rat, utilisé depuis de nombreuses années, est maintenant reconnu pour être un modèle très prédictif pour la recherche médicale humaine et vétérinaire. En effet, le rat est l’espèce mammifère dont les caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires sont proches de celles observées chez l'homme. Le rat, est fréquemment utilisé à des fins de recherche, car les résultats de produits thérapeutiques sont facilement transposables à l'homme, par simple approche/méthode statistique. La taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques analysables. Enfin, le rat est préféré à la souris pour l’étude de lésions cartilagineuses car le cartilage est plus épais et les effets de la pathologie chez le rat s’approchent de la pathologie humaine. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté au schéma thérapeutique des traitements étudiés. Bien que les pathologies rhumatiques puissent toucher des patients à n’importe quel âge, chez les rongeurs, la modélisation de ces maladies donne des résultats plus homogènes avec des rats adultes âgés de 8 à 10 semaines au début du protocole.
Evaluation de composés contre le développement d’arthrite rhumatoïde induite chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
500 souris vont être utilisées pour déclencher chez elles une polyarthrite, chacune pouvant subir jusqu'à sept prélèvements de sang et sept prélèvements d'urine sur animal vigile, en plus des injections de traitement. 350 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 50 d'un niveau modéré, et toutes seront tuées puis autopsiées pour prélever les pièces osseuses. Deux injections à la queue espacées de trois semaines déclenchent la maladie, avec gonflement des articulations, œdème articulaire et boiterie parmi les effets surveillés. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde restent au conditionnel et au long terme, alors que les effets indésirables seront "abordés avec le client" avant la mise en œuvre du projet.
Objectifs
Les affections ostéoarticulaires chroniques touchent plus de 20% de la population mondiale et tout particulièrement les adultes de plus de 50 ans. En raison de la croissance démographique et du vieillissement, le nombre de personnes atteintes d’affections ostéo-articulaires augmente constamment. La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire chronique et auto-immune qui affecte principalement les articulations. Cette pathologie invalidante est caractérisée par la déformation et la destruction progressive des articulations accompagnée d’inflammation, de douleur et de raideurs. Les traitements actuels visent à soulager les symptômes et ralentir la progression de la maladie, mais ne la guérissent pas et sont associés à d’importants effets secondaires, mal tolérés par les patients. Il y a donc un besoin urgent d’apporter de nouveaux traitements pour améliorer la prise en charge des patients afin de freiner l’inflammation, de soulager les symptômes, de prévenir les dommages aux articulations et d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’efficacité de différents principes actifs dans un modèle d'arthrite induite par le collagène (CIA - Collagen Induced Arthritis) chez la souris, qui est un modèle expérimental largement utilisé dans la littérature pour étudier l'arthrite rhumatoïde. L’efficacité des composés testés sera évaluée sur les signes clinique d'arthrite, comme le gonflement des articulations et la boiterie ; sur les paramètres inflammatoires à partir de prélèvements de sang et/ou d’urine réalisés chez l’animal au cours de l’étude ; ainsi que sur les modifications histopathologiques (analyse microscopique) ou biomoléculaires (analyse de gènes) à partir des tissus et d’organes prélevés à la fin de l’étude.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à générer des informations cruciales sur l'efficacité des nouveaux traitements dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde. Les protocoles mis en œuvre permettront d'évaluer : 1) L'impact sur l'inflammation ; 2) Les effets sur la dégradation de l’os et du cartilage ; 3) Les modifications physiologiques potentielles induites par ces traitements. À plus long terme, ce projet contribuera de manière significative au développement de nouveaux médicaments pour la polyarthrite rhumatoïde. Les données obtenues seront en effet essentielles pour : 1) Affiner la compréhension des mécanismes d'action de nouveaux composés ; 2) Guider la sélection des molécules les plus prometteuses pour les essais cliniques ; 3) Optimiser les stratégies thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients. En fournissant une base solide de connaissances précliniques, ce projet accélérera potentiellement le processus de développement de médicaments innovants, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de polyarthrite rhumatoïde.
Procédures
Les souris recevront deux injections au niveau de la queue de l’animal, espacées de 21 jours, de composés induisant une réponse immunitaire, pour induire le développement de l’arthrite, protocole expérimental largement utilisé dans la littérature pour étudier cette pathologie. Pour cela, les souris recevront des antidouleurs, puis seront anesthésiées avant l’injection. Chaque injection dure 1 à 2 minutes par animal. Les traitements à tester seront appliqués quelques jours avant et/ou après l’induction du modèle et répétés tout au long de la durée de l’étude, 4 semaines maximum après l’induction. Chaque administration dure 1 à 2 min. La fréquence d’administration des traitements sera définie selon le mode d’administration ainsi que selon le ou les principes actifs utilisés pour chaque étude. Une analyse de marqueurs liés au développement de la pathologie pourra être réalisé sur des prélèvements de sang et/ou d’urine au cours de l’étude. Les prélèvements de sang pourront être effectués sur animal vigile et dureront moins de 5 min par animal. Une période minimum d’une semaine de récupération sera nécessaire à l’animal avant de procéder à un nouveau prélèvement, avec au maximum 1 prélèvement par semaine sur la durée de l’étude (soit 7 prélèvements). Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, cette manipulation durera moins de 5 min par animal et pourront être répétés au maximum une fois par semaine tout au long du protocole (soit 7 fois). En point final, sur animaux euthanasiés, l’urine peut être prélevée directement en ponctionnant la vessie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront abordés avec le client avant toute mise en œuvre du projet. Ils seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyées d’une veille bibliographique inhérente au(x) principe(s) actif(s) à administrer. Plus précisément, nous surveillerons l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un traumatisme et une inflammation transitoire au niveau du site d’injection, ou encore un aspect ou comportement anormal de l’animal, e.g., une perte de poids, un œdème articulaire ou une boiterie.
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.
Remplacement
De manière générale, les principes actifs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des pathologies rhumatismale, il est pour le moment impossible de reproduire in vitro les mécanismes la complexité de la pathologie. De la même façon, les interactions entre les différentes cellules et tissus composants l’articulation ne peuvent être mimées par un modèle simple de culture in vitro. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable pour l’évaluation des composés à testés, tout en prenant en compte le bien-être animal.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué au moins deux fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures).
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Bien que les pathologies rhumatismales puissent toucher des patients à n’importe quel âge, chez les rongeurs, la modélisation des maladies rhumatismales donne des résultats plus homogènes avec des souris adultes au début du protocole.
Caractérisation de nouveaux agonistes des glucocorticoïdes
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
Rendues malades d'une inflammation de l'intestin par un produit ajouté à leur eau de boisson pendant six jours, une partie des 550 souris du projet développe des saignements, une douleur intestinale, une déshydratation et une perte de poids. Les autres reçoivent des glucocorticoïdes par injection dans l'abdomen ou par gavage quotidien pendant un mois, et certaines subissent une incision de la veine de la queue au scalpel pour mesurer leur glycémie. Le niveau de souffrance déclaré est modéré pour 480 d'entre elles et sévère pour 70, et toutes sont tuées à l'issue pour des analyses moléculaires et histologiques. Le porteur écrit que l'injection de glucocorticoïdes "n'est en général pas problématique pour l'animal", dans le même texte où il décrit la colite provoquée et le risque de fausse route au gavage.
Objectifs
Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. A ce jour, il n'existe pas de molécule dont les effets anti-inflammatoires sont dissociés des effets secondaires. Ce projet vise donc à caractériser de nouveaux composés.
Bénéfices attendus
Ces études permettront d'identifier le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules et ainsi promouvoir des avancées dans le traitement des maladies inflammatoires.
Procédures
Les animaux du groupe 1 qui nous permettront de comprendre les effets des molécules sur le système inflammatoire et l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü. Les glucocorticoïdes seront injectés une seule fois par jour pendant 3 jours par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 nous permettra de comprendre les effets d'un traitement prolongé aux glucocorticoïdes. Les souris de ce groupe seront traitées aux glucocorticoïdes par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant au maximum 1 mois. Les animaux du groupe 3 vont développer une inflammation de l'intestin par administration de Dextran Sulfate Sodium (DSS) dans l'eau de boisson pendant 6 jours. Ils subiront 3 injections par voie intrapéritonéale de glucocorticoïdes (1 min/ souris) afin de réduire l'inflammation.
Impact sur les animaux
L’inflammation chronique peut conduire à des saignements du fait de l'inflammation associés à une douleur intestinale, une déshydratation et une perte de poids de l’animal. Ce traitement durera 6 jours. Les premiers effets sont observables en général au 3è jour. L’injection de glucocorticoïdes par voie intrapéritonéale prend moins d'une minute par animal. Ces injections répétées (3 par souris) peuvent exceptionnellement causer des infections au niveau du site d'injection. Le gavage peut rarement conduire à des fausses routes et à une irritation. Les différentes administrations de traitement pourront éventuellement générer un stress chez l'animal ainsi qu'une douleur au niveau du site d'administration. Dans le cadre de la mesure des niveaux de glucose, un prélèvement de sang par incision au niveau de la veine caudal à l’aide d’un scalpel sera effectué pouvant engendré une douleur au niveau de la zone d'incision.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques sur le système immunitaire et l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le personnel qui effectuera les gestes techniques est formé et compétent. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection des glucocorticoïdes en vérifiant la présence d'un éventuel abcès. Cependant, l’injection de glucocorticoïdes n'est en général pas problématique pour l'animal. Le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue. La sévérité de la procédure impliquera une surveillance stricte des souris. Ainsi, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, l’abondance de diarrhées, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Cette évaluation sera faite en conditions normales d'hébergement avec enrichissement et en maintenant les liens sociaux entre les animaux.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Il en va de même pour les mécanismes d’inflammation. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Le projet s’intéresse au rôle des glucocorticoïdes dans l’organisme adulte. Les animaux seront donc traités entre 10 et 15 semaines d'âge.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 30000
Créées sur place ou reçues d'autres établissements, des lignées de souris et de rats génétiquement modifiés sont élevées, tatouées et biopsiées pour vérifier qu'elles portent bien la mutation commandée. 320 000 souris et 30 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, ceux qui ne partent pas vers un autre projet d'expérimentation étant tués, sans placement possible puisqu'ils appartiennent au scientifique commanditaire. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et quatre prélèvements sanguins par jour, et exprimer du seul fait de sa mutation un phénotype douloureux tel qu'une arthrite. Le porteur ajoute que la mise à mort peut être programmée à un âge précis pour éviter que l'animal n'exprime ce phénotype, et que les scientifiques "s'engagent par écrit" à ce qu'il n'existe pas de solution de remplacement à leur lignée.
Objectifs
Ce projet a pour premier objectif le maintien de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des modifications/symptômes physiques ou cliniques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes, et l’évaluation de l’impact de ces caractéristiques sur leur bien être ; comme deuxième objectif la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée génétiquement modifiées, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Ce test est important car dans l’élevage de lignée génétiquement modifiées, tous les animaux nés ne sont pas porteurs de la mutation, il est donc primordiale de le vérifier pour pouvoir utiliser les animaux d’interet uniquement et donner des résultats fiables. Enfin, certaines mutations génétiques ne font effet qu’après l’injection d’une hormone ou d’un antibiotique. Pour induire cette mutation d’interet et que l’animal exprime physiologiquement cette mutation, une injection de l’hormone pourra ainsi également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 350 000 animaux (ajout de 15% dû à l’augmentation de l’utilisation de ces modèles) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement modifiés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait du être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptée à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement modifiées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le bon modèle pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : - A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute - A des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite). Dans de rare cas, l’administration de ligands peuvent être fait via des injections en intrapéritonéale ou en gavage (durée : moins de 5 minutes, fréquence peut varier d’une expérimentation à une autre, mais n’excédant pas une fois par jour pendant 7 jours, en cas de protocole nécessitant de dépasser ces limites, cela devra au préalable être valider par la SBEA) (durée et fréquences décrites dans la procédure 4, et recommandées par la littérature).
Impact sur les animaux
EExpression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité inatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dûs à l'injection d’un produit.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit en utilisation continue dans des projets d’expérimentation, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, ne sont utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypag. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européenes (au moins 7 animaux de chaque sexes et génotypes, sur 2 générations).
Raffinement
En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Dans le cas de lignées pouvant présenter un phénotype dommageable, si le phénotype le requiére, des observations cliniques plus fréquentes et plus spécifiques avec des points limites et des raffinements précis seront mise en place. Afin de limiter la douleur pour l’animal, une euthanasie pourrait être demandé en automatique à un point limite ou âge précis afin d’éviter que l’animal n’exprime le phénotype. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5jours après la fécondation.
Méthotrexate pour le traitement curatif de l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Trois ponctions articulaires sous anesthésie provoquent chez 22 souris hémophiles une arthropathie du genou, avant qu'elles reçoivent par injection le traitement de référence, seul ou complété par du méthotrexate. Seize d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, six d'un niveau léger, et toutes sont tuées. Le porteur écrit pourtant que l'expérience de son groupe ne lui fait "attendre aucunes douleurs" après le réveil, et ne retient comme nuisances que la piqûre des injections et une toxicité du méthotrexate sur la moelle osseuse. La mise à mort est justifiée par la "nécessité" de prélever tout le sang, geste qu'il juge incompatible avec le maintien en vie de l'animal.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Les saignements articulaires répétés, peuvent conduire à une atteinte articulaire handicapante appelée arthropathie hémophilique. Il s’agit d’une complication grave, de la maladie. La présence anormale du sang dans la cavité articulaire conduit à une inflammation et à terme à la destruction progressive de l’articulation. L’arthropathie hémophilique partage certaines caractéristiques avec d’autres maladies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde. Comme dans le stade précoce de l’arthropathie hémophilique, chez les patients atteints de polyarthrite, il existe une inflammation articulaire. Le pilier du traitement de l'hémophilie est la substitution du facteur de coagulation manquant, cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire, alors que le méthotrexate utilisé dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde en première intention pourrait être efficace pour contrôler l’inflammation. Nous avons fait l’hypothèse que le méthotrexate pourrait réduire l’inflammation de la synovite comme traitement curatif chez les hémophiles et empêcher l’évolution de cette arthropathie handicapante, comme il fait dans la polyarthrite rhumatoïde. Lors d’un projet précédent, notre équipe a montré que le méthotrexate, comme traitement préventif administré avant les saignements articulaires, permet de réduire la synovite. Dans le cas de l’arthropathie, la première atteinte touche successivement la synoviale (membrane qui tapisse l’intérieure du genou), le cartilage et enfin l’os. Les premiers résultats nous montrent une diminution de la synoviale et du dépôt de fer sous forme d’hémosidérine. L’idée étant de proposer le méthotrexate comme traitement de manière temporaire et préventif à l’apparition d’une synovite L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité curative du méthotrexate pour traiter la synovite de l’arthropathie synoviale et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B.
Bénéfices attendus
La comparaison entre le traitement habituel par concentré de facteur de coagulation et le méthotrexate, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ce médicament dans le contexte d’arthropathie hémophilique, médicament couramment utilisée dans la polyarthrite rhumatoïde dont les dégâts articulaires sont similaires à ceux causés par l’hémophilie. Si les résultats de l’étude montrent une efficacité suffisante du méthotrexate dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité du méthotrexate chez des patients hémophiles.
Procédures
Les souris seront séparées en 2 groupes pour comparer l'effet d'un adjuvent au traitement de référence dans la prise en charge de l'arthropathie hémophilique. Pour cela, les souris auront trois ponctions articulaires pour mimer la maladie et recevront soit le traitement de référence seul par injection ou le traitement de référence plus l'adjuvent par injection. Au terme de l'expérimentation, un prélèvement de sang total sera effectué. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. Une ponction articulaire : 2-3 min 2. Un prélèvement sanguin: 1 min 3. La mesure du genou siège d’arthropathie : 30 sec 4. Une injection (groupe 1) et deux injections (groupe 2) : 1-2 min 5. Un prélèvement sanguin et mise à mort : 3-5 min
Impact sur les animaux
Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie et certains post mortem. Après le réveil suite à l’induction de l’arthropathie, l’expérience de notre groupe ne nous fait attendre aucunes douleurs. Les injections répétées des traitements peuvent provoquer une douleur légère (piqûre d’aiguille). Le traitement adjuvant peut avoir une toxicité au niveau de la moelle osseuse, sans incidence sur les plaquettes sanguines.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement tous le sang, non compatible avec le maintien en vie de l'animal.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaire handicapants induits par l’hémophilie et son traitement.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures biologiques et histologiques de chaque souris sont comparées à son propre genou droit (genou contrôle) pour l‘étude de l’articulation.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie. Une possible gêne locomotrice peut être attendue, en cas d’apparition, de l’eau et de la nourriture seront mis à disposition dans la cage, au sol, pour éviter la station debout aux souris et le redressement sur les pattes arrière pour chercher leur nourriture. Afin d'éviter toute souffrance pour les animaux, nous appliquons les points limites strictes et spécifiques du projet.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Étude sur la caractérisation des miRNA circulants associés à l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Génétiquement hémophiles, 32 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une ponction du genou droit sous anesthésie pour provoquer un saignement articulaire, geste douloureux qui peut entraîner boiterie et gêne locomotrice. L'objectif déclaré est de repérer dans le sang des micro-ARN servant de marqueurs précoces de la dégradation du cartilage et de l'os, deux de ces marqueurs ayant déjà été validés chez des patients hémophiles. Le porteur précise que la souris hémophile, contrairement aux malades humains, ne saigne jamais spontanément et ne saigne que si on la blesse, et justifie la mise à mort par la "nécessité" de prélever tout le sang de l'animal.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques où la forme sévère est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Les saignements articulaires répétés, peuvent conduire à une atteinte articulaire handicapante appelée arthropathie hémophilique. Il s’agit d’une complication grave, de la maladie. La présence anormale du sang dans la cavité articulaire conduit à une inflammation et à terme à la destruction progressive de l’articulation. Actuellement, le diagnostic d’une dégradation du cartilage et de l’os se fait par l’examen clinique, la radiographie, l’échographie et l’IRM. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de détecter à un stade assez précoce de l’arthropathie. Les biomarqueurs représentent des candidats pour le diagnostic précoce. Les micro-ARN circulants sont présents dans de nombreux fluides, notamment le sang. Ils sont stables et résistants aux analyses et représentent déjà de bons candidats comme biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic d’autres pathologies comme la polyarthrite rhumatoïde. Il existe des similitudes physiopathologiques commune entre la polyarthrite rhumatoïde et l’arthropathie hémophilique dont l’inflammation articulaire et la destruction du cartilage et de l’os. En amont, une étude clinique précoce réalisée par notre équipe a identifié et validé deux micro-ARN circulants comme biomarqueurs de l’arthropathie hémophilique chez les patients hémophiles ayant des lésions avancées d’arthropathie. Nous cherchons à identifier des marqueurs globaux de l’atteinte du cartilage et de l’os pour à terme proposer la détection de certains biomarqueurs permettant le diagnostic de l’arthropathie hémophilique à un stade le plus précoce. Nous avons fait l’hypothèse que l’identification de biomarqueurs précoce de l’arthropathie hémophilique permettrait la mise en place d’un nouvel outil de diagnostics simple et rapide, réalisé lors de bilan sanguin. L’objectif de ce projet est d’identifier des biomarqueurs pour un diagnostic précoce de l’arthropathie hémophilique. Afin de détecter le plus tôt possible la mise en place d’une synovite et ainsi bloquer l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B sévères et à terme chez les patients.
Bénéfices attendus
La comparaison entre les différents stades d’atteinte de l’arthropathie nous permet de cibler les microARN d’intérêts pour le diagnostic de l’arthropathie hémophilique à un stade précoce. La conservation inter-espèce de ces biomarqueurs nous permet également de proposer une étude clinique afin d’évaluer l’efficacité des micro-ARN comme outil de diagnostic clinique chez l’Homme.
Procédures
Les souris subissent une ponction du genou droit sous antalgie et anesthésie générale (2-3 minutes) pour simuler l’arthropathie hémophilique et l’évaluation de l’atteinte ostéochondrale. Le dernier jour, les souris sont mises à mort sous antalgie et anesthésie générale par prélèvement sanguin (5 minutes).
Impact sur les animaux
Le phénotype des animaux comporte une vulnérabilité du point de vue de la coagulation, avec risque de saignement prolongé en cas de blessure mais pas de saignement spontané comme dans la forme humaine de la maladie Les ponctions du genou engendrent une douleur. L’arthropathie induite par la ponction peut occasionner une gène locomotrice, une démarche anormale ou boiterie ainsi qu’une légère douleur lors des déplacements et redressements de l’animal sur ses pattes arrières.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement tout le sang, non compatible avec le maintien en vie de l'animal.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Dans cette étude, chaque souris constitue son propre contrôle pour les mesures biologiques et histologiques, réduisant le nombre de souris et participant à la robustesse de l’étude d’un point de vue statistique.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal dont l'application des points limites stricts et spécifiques du projet. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. En cas d’apparition de problème locomoteur (boiterie ou difficulté à la station debout), de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage sont mis à disposition dans la cage. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Effet d’un composé en développement sur les fonctions musculaires chez un modèle de myopathie de Duchenne chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Pour évaluer un composé développé par un client industriel contre les atteintes musculaires de la myopathie de Duchenne, 57 souris mâles porteuses d'une mutation spontanée vont être utilisées. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et tous les animaux sont tués pour le prélèvement des muscles des pattes, du cœur et du diaphragme. Chaque souris passe vingt-neuf pesées, quatre mesures de composition corporelle, deux mesures de force musculaire sous anesthésie, un rotarod, un grip test, un hanging test, deux tests d'endurance, une mesure de pression artérielle, cinq prises de sang et quarante-huit heures de mesure de l'activité spontanée. Le porteur reconnaît que la souris mdx ne présente ni espérance de vie réduite ni activité spontanée diminuée, contrairement aux patients, et qualifie l'étape in vivo d'incontournable pour le dossier réglementaire ouvrant les premiers essais chez l'humain.
Objectifs
La myopathie de Duchenne est une maladie d'origine génétique induisant une dégénérescence progressive de l’ensemble des muscles de l’organisme. Elle est liée à une anomalie positionnée sur le chromosome X, responsable dans la perte de fonctionnalité des fibres musculaires. Chez les patients atteints de cette maladie, qui sont à plus de 99% des hommes, les fibres qui constituent les muscles squelettiques et cardiaque se détériorent à chaque contraction et finissent par se détruire. Des cellules souches musculaires tentent de régénérer le tissu lésé, mais ce processus est vite débordé et la dégénérescence finit par l’emporter. Les patients atteints de la maladie de Duchenne présentent ainsi une espérance de vie très réduite, de l'ordre de 25 ans, du fait notamment de complications cardiaques et respiratoires. La recherche est ainsi très active concernant cette maladie et plusieurs pistes visant à mise au point d’un traitement curatif sont actuellement à l’étude. Néanmoins, à aujourd'hui, il n'existe aucun traitement curatif sur le marché. Le présent projet vise à étudier les effets d'un composé X en développement sur les symptômes musculaires liés à la myopathie de Duchenne. Le modèle employé est un modèle de souris qui possède une mutation génétique spontanée et qui présente des symptômes proches de la maladie de Duchenne chez l'humain, bien qu'ils soient beaucoup moins prononcés. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament (Composé X) sur les capacités musculaires du modèle de maladie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter les conséquences musculaires de la maladie de Duchenne chez l'humain. Alors que plusieurs molécules ont été testées ces vingt dernières années, il n'existe toujours aucun médicament permettant d'améliorer ou de traiter la maladie de Duchenne. Il s'agit donc une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la maladie de Duchenne.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (29 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Analyse non invasive de composition corporelle (4 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 3) Mesures in vivo de la force musculaire sous anesthésie avec réveil (2 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 20 minutes); 4) Mesures de la locomotion par Rotarod (1 mesure; Durée de la mesure : 10 minutes); 5) Mesure de la force de préhension des pattes avant par grip test (1 mesure, durée de la mesure 5 minutes); 5) Mesure de la force de préhension des 4 membres par hanging test (1 mesure; Durée de la mesure: 3 minutes); 6) Tests d'endurance (2 tests, Durée de la mesure : 45 min); 7) Mesures de pression arterielle (1 mesure; Durée de la mesure: 15 minutes); 8) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de l'activité spontanée totale et de dépenses énergétiques (1 session de mesures de 48h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les tests de mesure de composition corporelle et de pression artèrielle pourront être source de stress du fait de la manipulation et d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les tests d'activité locomotrice pourront également être source de stress. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Enfin, les prélèvements sanguin pouront être source de douleur légères. Enfin, bien que considéré comme un modèle de maladie de Duchenne d'intérêt, la souris mdx présente un phénotype bien plus léger que l'humain. Ainsi, bien que présentant une moindre force musculaire que les souris sauvages malgré une hypertrophie musculaire, les souris mdx ne présentent pas de réduction de leur espérance de vie, ni de différence dans l'activité spontanée, à la différence de l'humain. En effet, les défauts musculaires des souris mdx n'apparaissent que lors de tests impliquant un effort assez soutenu. Le phénotype de ces souris mdx n'est ainsi pas dommageable.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les muscles des pattes, le coeur et le diaphragme pour des analyses fonctionnelles (mesures de force musculaire ex-vivo), histologiques et pour comptage des mitochondries.
Remplacement
Le programme global dans lequel s'insère le présent projet implique un industriel pharmaceutique qui développe un composé d'intérêt dans le domaine de la Myopathie de Duchenne et deux Sociétés de Recherche sous contrat, l'une in vitro et l'autre in vivo. L'objectif du projet est de permettre de mener le développement du composé X au stade clinique. La première phase d'étude sera réalisée in vitro par le partenaire suédois. Le présent projet in vivo ne sera mené qu'uniquement en cas de résultats convainquants sur les modèles in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de tester, dans un second temps, le composé sur organisme entier afin de vérifier que les effets observés sur système in vitro se traduisent effectivement en un bénéfice dans le cadre de la pathologie. Par ailleurs, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre de 15 animaux par groupes utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés en tenant compte de l'hétérogénéité du modèle de souris utilisé. Le groupe contrôle du modèle, constitué de souris sauvages, a été réduit à 12 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu que la maladie de Duchenne touche à 99,5% des garçons, l'étude sera limitée au seul genre mâle.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés via la nourriture. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2/3 souris par cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs (50μL de sang par prélèvement) et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
La modèle de souris que nous avons sélectionné pour le présent projet est un modèle classiquement utilisé pour étudier la Myopathie de Duchenne et pour tester des candidats médicaments au stade préclinique visant à traiter cette pathologie. Le modèle récapitule de nombreux symptômes de la pathologie, tout en n'exhibant qu'une forme légère de la maladie comparativement à l'humain (espérance de vie non réduite et locomotion non affectée par la mutation). Les souris seront reçues à 5 semaines d'âge. Cet âge a été déterminé en fonction de la cinétique des défaut musculaires observés chez le modèle de souris employé. En effet, à partir de 12 semaines, ces souris commencent à présenter un développement musculaire exagéré par hyperactivation des cellules souches du muscle. Bien que la force musculaire des souris pathologiques reste inférieure à celle des souris sauvages à tout âge, et compte tenu de la durée du traitement, nous souhaitons que les souris ne présentent pas une hypertrophie musculaire trop marquée en fin d'étude.
Techniques d’imageries expérimentales non invasives chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 200
Jusqu'à quatre-vingt-dix administrations de traitement en trois mois, neuf séances d'imagerie de quatre-vingt-dix minutes sous anesthésie et douze prélèvements sanguins par animal : 3 600 souris et 200 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever sang, tumeur et organes. Certains reçoivent une greffe tumorale, et les séances d'imagerie peuvent être précédées d'une mise à jeun de quinze heures. Le laboratoire vend ces prestations d'imagerie et de radiothérapie interne à des équipes extérieures, en mettant en avant des équipements "équivalents voire supérieurs" à ceux de l'imagerie humaine. Une partie des souris est immunodéprimée pour faciliter la prise des greffes de tumeurs humaines, d'autres sont génétiquement modifiées pour développer les pathologies étudiées.
Objectifs
Le laboratoire prend en charge des projets scientifiques en proposant plusieurs techniques d’imageries expérimentales chez l’animal de laboratoire, avec des performances technologiques équivalentes voire supérieures à celles des équipements correspondants pour l’imagerie humaine. Des agents de contraste ou des radiotraceurs sont utilisables pour chacune des modalités, et se caractérisent notamment par leur capacité à marquer les espaces vasculaires et interstitiels, ou des évènements moléculaires et cellulaires spécifiques de pathologies (cancéreuses, cardiovasculaires, rénales, métaboliques, neurologiques). L’imagerie anatomique de scanner par rayons-X est en général choisie pour sa grande résolution spatiale. Elle apporte des informations structurelles dans les pathologies affectant le squelette. En effet, elle est largement utilisée pour étudier la structure et la densité osseuse chez les rongeurs. L’imagerie nucléaire permet-elle de l’imagerie fonctionnelle moléculaire et cellulaire et présente la sensibilité la plus importante pour détecter des tissus dont les caractéristiques métaboliques ou biologiques sont anormales. Elle permet de mesurer l’activité métabolique ou moléculaire d'un organe ou d’un tissu grâce à un produit radioactif injecté au préalable (traceur). Cette approche d’imagerie est non invasive. Le laboratoire propose également la réalisation d’études théranostiques, c’est-à-dire de diagnostic couplé à la thérapie. En effet, une thérapie spécifique peut être envisagée de type chimiothérapie, immunothérapie, hormonothérapie ou bien encore le radiotraceur peut être thérapeutique (thérapie innovante appelée : radiothérapie interne vectorisée). Les études d’imageries pourront permettre de suivre l’efficacité de ces traitements. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir prendre en charge des études nécessitant de l’imagerie anatomique ou nucléaire, couplée ou non à de la thérapie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont a) de réaliser des études d'imageries innovantes et non invasives permettant d'utiliser moins d'animaux pour obtenir des résultats fiables b) d'utiliser ces résultats chez l'Homme pour proposer des thérapies classiques adaptées ou des thérapies très innovantes comme la radiothérapie ciblée qui détruit précisément les cellules malades tout en limitant les effets sur les tissus sains.
Procédures
Les animaux pourront avoir une greffe tumorale (sous anesthésie, 1 fois, 10 minutes). Les animaux seront suivis par imagerie non invasive (sous anesthésie, 3 fois par semaine maximum et au total 9 imageries possible sur tout le protocole, 90 minutes maximum). Ces imageries pourront être précédées d'une mise à jeun de 15h maximum. Ils pourront également suivre une thérapie (animal vigile ou anesthésié suivant la voie de thérapie, 90 fois maximum pendant 3 mois pour certaines administrations, quelques minutes, 24 fois maximum pour d'autres) avec un suivi par prélèvement sanguin (animal vigile, 12 fois maximum pendant 3 mois, quelques minutes). En fin d'étude un dernier prélèvement de sang sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, quelques minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront développer un phénotype dommageable pouvant entrainer une sensibilité accrue aux infections, ou des douleurs modérées ou une réduction de la mobilité. Les animaux seront soumis à des anesthésies (greffe, imageries) qui pourront engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Ils pourront également ressentier de la douleur modérée et une perte légère de mobilité suite à la croissance des tumeurs greffées. L'administration des traitements pourront induire un stress aux animaux. Les injections intrapéritonéales et intramusculaires pourront induire une douleur légère au point d'injection. Les injections intraveineuse pourront induire une douleur légère au point d'injection et une irritation de la queue. Les administrations par voie orale pourront induire une irritation de l'oesophage et une fausse route dans de rares cas. Les traitements pourraient induire une perte de poids avec une altération de l'état général des animaux. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur légère de courte durée au point de prélèvement et un hématome dans de rares cas.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements pour analyse (sang, tumeur, organes).
Remplacement
Pour étudier la cinétique de biodistribution de nouveaux radiotraceurs, il n'existe aujourd'hui aucun modèle non vivant qui pourrait mimer le modèle animal vivant. Nous n'avons donc pas la possibilité de remplacer le modèle vivant utilisé.
Réduction
Ce projet nécessitera 3600 souris et 200 rats maximum sur les 5 ans d'autorisation. Ce nombre permettra de pouvoir conclure sur l'interêt d'un radiotraceur ou d'un traitement dans une certaine pathologie grâce à une bonne puissance statistique. Le nombre d'animaux a été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive sous anesthésie qui permet des analyses corps entier en 3D et un recueil de données longitudinales.
Raffinement
Tous les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation à l'animalerie d'au moins 7 jours. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes, ou batonnets à ronger) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettront de suivre le bien-être de l’animal. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limités en apportant une anesthésie gazeuse pour les actes techniques ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car les greffes de tumeurs humaines sont facilitées et validées sur ces animaux. Nous utiliserons également des souris avec un système immunitaire actif pour les greffes de tumeurs murines. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés suceptibles de développer certaines pathologies afin de les étudier grâce à l'imagerie. Nous utiliserons des rats pour réaliser des tests d'imagerie de radiotraceurs et ou produits de contraste sur des plus gros rongeurs. Les rats seront utilisés à l'âge de 12 semaines au stade de jeunes adultes et jusqu'à 17 semaines de vie maximum. Les souris seront utlisées à l'âge de 4 à 5 semaines au stade de jeunes adultes ou entre 1 et 3 mois de vie suivant le développement du phénotype le cas échéant. Le stade jeune adulte pour les rongeurs facilite la prise des greffes. Pour les lignées transgéniques, l'âge sera justifié par le développement du phénotype (entre 1 et 3 mois).
Développement de vecteurs non-viraux ciblant le système musculaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
322 souris vont être utilisées, réparties en trois groupes selon la voie d'injection, quarante-deux dans le muscle, cent quarante par voie intraveineuse et cent quarante dans l'abdomen. Chacune reçoit une ou deux injections de nanoparticules lipidiques puis des prélèvements sanguins échelonnés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avant d'être tuée pour que ses organes soient analysés. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer des difficultés locomotrices liées à l'inflammation et une élévation passagère des enzymes du foie. L'objet réel du projet reste de comparer des formulations et des voies d'administration, étape dont les traitements annoncés contre les maladies musculaires rares restent éloignés.
Objectifs
Ce projet vise à optimiser la thérapie génique pour les maladies rares touchant les muscles. Aujourd'hui, les vecteurs viraux sont les principaux outils utilisés, mais leur efficacité nécessite souvent des doses élevées, ce qui peut entraîner des effets secondaires graves, comme des inflammations du foie. De plus, ces vecteurs ne peuvent être utilisés qu'une seule fois à cause de la réaction immunitaire qu'ils déclenchent. Pour surmonter ces limites, le projet développe des nanoparticules lipidiques (LNP), des vecteurs non viraux prometteurs capables de transporter le matériel génétique directement dans les muscles, de manière précise et avec moins de risques pour les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de trouver la meilleure formulation de nanoparticules lipidiques (LNP) pour délivrer efficacement du matériel génétique dans les muscles d’un modèle murin adulte. L’étude cherchera également à identifier la méthode d’administration la plus adaptée. Les résultats obtenus serviront de base pour développer des traitements non viraux innovants contre les maladies musculaires rares, en visant à rendre ces thérapies plus sûres et plus efficaces.
Procédures
Les animaux recevront des injections selon les protocoles établis, avec un total de 1 ou 2 injections par animal. Chaque injection sera réalisée sous anesthésie lorsque nécessaire et nécessitera environ 1 à 3 minutes par animal. De plus, des prélèvements sanguins seront effectués à différents temps après l’injection initiale pour l’évaluation des marqueurs immunitaires et hépatiques, chaque prélèvement prenant environ 1 minute par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels liés aux procédures comprennent des réactions associées aux modes d'administration et aux doses des nanoparticules injectées. L'injection de nanoparticules peut entraîner des difficultés locomotrices chez les souris, liées à la réaction inflammatoire. Les différentes injections peuvent entraîner une inflammation transitoire et une sensibilité accrue au site d'injection, un saignement mineur ou une inflammation passagère. En cas de doses élevées de nanoparticules, une élévation temporaire des enzymes hépatiques pourrait survenir.
Devenir
À l'issue de chaque procédure, toutes les souris seront euthanasiées, afin de permettre la collecte des organes nécessaires aux analyses moléculaires et histologiques. Ces analyses sont essentielles pour évaluer la distribution et l'efficacité des nanoparticules dans les tissus.
Remplacement
Les analyses prévues ne peuvent être remplacées par des tests in vitro sur des lignées cellulaires musculaires, car ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité de la biodistribution des nanoparticules lipidiques (LNP) dans un organisme complet. Seul l'usage d'un modèle animal permet l'étude des interactions systémiques et des effets potentiels à l'échelle de l'organisme. Le choix du modèle murin est justifié par sa proximité physiologique avec l'humain, garantissant ainsi des résultats plus représentatifs de l'efficacité et de la spécificité des vecteurs non viraux envisagés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé sur la base d'études antérieures similaires, afin d'atteindre la validité scientifique tout en limitant le nombre d'animaux impliqués. Les cohortes à injection au niveau du muscle, intraveineuses et intrapéritonéales comportent respectivement 42, 140 et 140 animaux pour un total de 322 animaux. Les organes des animaux seront collectés pour réaliser l'ensemble des analyses histologiques et moléculaires, ce qui élimine la nécessité d'une cohorte supplémentaire pour les prélèvements de tissus, contribuant ainsi à une réduction notable du nombre total d’animaux. Pour la cohorte soumise à des injections au niveau du muscle, un même animal recevra une injection d'une condition différente par muscle (2 injections par animal au total), optimisant l'usage des animaux et réduisant leur nombre global.
Raffinement
Diverses mesures seront mises en œuvre pour améliorer le bien-être des animaux pendant l'étude. En cas de difficultés de déplacement, de la nourriture sera placée dans la cage pour réduire l'effort nécessaire pour se nourrir. Les animaux seront hébergés en groupes de 2 à 4 par cage et bénéficieront d'une bonne qualité de l'air grâce à un système de ventilation adéquat. Des nids seront fournis pour rendre leur environnement plus confortable, et l'accès à l'eau et à la nourriture sera illimité. La surveillance quotidienne des animaux permettra de détecter rapidement tout signe de souffrance, tels que l'apathie, la prostration, l'affaissement des paupières ou des difficultés de déplacement. Des points limites ont été mis en place et en cas d'atteinte de ces derniers, des mesures nécessaires seront appliquées.
Choix des espèces
Pour tester l'optimisation des vecteurs non viraux, des études préliminaires ont déjà été réalisées sur des lignées cellulaires musculaires murines et humaines. Toutefois, des expériences in vivo sont désormais nécessaires pour évaluer la performance des nanoparticules dans un contexte systémique. Le modèle murin a été choisi en raison de sa similitude génétique significative avec l'humain, sa facilité d'élevage grâce à sa petite taille et sa rapidité de reproduction, ainsi que sa disponibilité au sein de nos laboratoires. Deux types de souris seront utilisés dans cette étude, car leur réaction au traitement pourrait être différente. Des recherches précédentes ont montré que l'efficacité de certains vecteurs dépend du patrimoine génétique des souris. Comme nous utilisons ici un vecteur différent, il est important de vérifier s'il fonctionne bien dans les deux types de souris les plus couramment utilisés en recherche. Cela permettra de s'assurer que ce vecteur pourra être utile à de nombreux chercheurs pour des applications médicales. Les souris seront injectées à l'âge adulte, soit à 8 semaines, afin de réaliser une preuve de concept en thérapie génique à visée curative plutôt que préventive.
Evaluation d’une thérapie par transfert de gène sur les fonctions motrices d’un modèle murin de dysferlinopathies
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Nées dans l'établissement à partir d'une lignée porteuse d'une mutation du gène de la dysferline, 237 souris vont être utilisées, dont 111 pour le seul entretien de l'élevage. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 96 d'entre elles et modéré pour 141. Elles reçoivent une injection unique dans la veine caudale sous anesthésie gazeuse, puis deux tests de force musculaire tous les trois mois jusqu'à l'âge de douze mois, l'expérimentation s'arrêtant avant l'âge où la myopathie devient cliniquement visible. Le porteur écrit que la récupération fonctionnelle ne peut s'explorer que sur des modèles vivants et qu'un essai in vivo ne peut être évité.
Objectifs
Les dysferlinopathies sont un groupe de maladies musculaires rares et héréditaires caractérisées par des mutations dans le gène de la dysferline, ce qui entraîne une altération de la fonction de cette protéine. Les atteintes cliniques dans les dysferlinopathies incluent généralement : - une faiblesse musculaire progressive. Cette faiblesse affecte principalement les muscles des membres, en particulier les épaules, les hanches et les cuisses. - une perte de la force et de la fonction musculaire : Avec la progression de la maladie, les patients peuvent éprouver une diminution de la force musculaire, ce qui entraîne des difficultés à effectuer des activités quotidiennes telles que monter les escaliers, se lever d'une chaise, ou porter des objets lourds. - une dystrophie musculaire : La dégénérescence progressive des muscles peut conduire à une dystrophie musculaire, caractérisée par une perte de masse musculaire et une détérioration de la structure des fibres musculaires. Ces atteintes cliniques peuvent varier en gravité d'un individu à l'autre. Les souris présentant une mutation dans le gène de la dysferline présentent une atteinte musculaire très progressive avec un impact clinique pour l'animal au-delà de 13 mois. Au cours d'un projet antérieur, nous avons testé une approche thérapeutique par injection intramusculaire d'un AAV (adeno associated virus) codant pour une mini dysferline fonctionnelle (protéine plus courte que la forme normale mais ayant conservée sa fonction). Ces traitements ont permis d'améliorer le phénotype histologique du modèle murin. Ce nouveau projet, a pour objectif de tester l'efficacité de cette thérapie génique par administration par voie systémique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce travail seront principalement pour les patients atteints de ce type de myopathie. En effet si notre hypothèse s’avère valide la thérapie génique va pouvoir éviter la dégénérescence des fibres musculaires observée chez les patients et offrir une thérapie potentielle
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection dans la veine caudale latérale sous anesthésie générale gazeuse (une seule injection/ une seule anesthésie). Ils seront également soumis tous les 3 mois à 2 tests de force musculaire (moins de 30 minutes par test))
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés au cours de ce projet vont développer une atteinte musculaire progressive ayant surtout un impact histologique puisqu'aucun animal ne sera gardé au-delà de l'âge auquel la myopathie clinique se déclare. Les injections intra veineuses peuvent générer une douleur locale, de courte durée. Les animaux vont également participer à des tests fonctionnels qui sont des sources de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse d'organes.
Remplacement
Les techniques in vitro ne peuvent être utilisées qu’afin de voir un effet à l’échelle cellulaire de l’administration de la mini-dysferline. La récupération fonctionnelle permise par l’administration systémique ne peut être explorée que sur des modèles vivants. Les premières étapes de notre projet ont démontré que cette approche était fonctionnelle ; nous devons maintenant étendre cette étude à des injections intraveineuses. Malheureusement, l’approche thérapeutique envisagée ne peut pas éviter un essai sur un modèle in vivo.
Réduction
Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous avons utilisé des tests statistiques appropriés qui nous a permis de définir que nous aurons besoin d'au moins 9 souris par groupe expérimental. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 10 souris par groupe maximum, pour les souris traitées sur un an ce nombre est légèrement augmenté pour pallier les pertes, nous aurons donc 12 souris soit au total 126 souris. En prenant en compte les souris pour l’élevage ce nombre atteint 237 souris.
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 avant d’entrer en procédure. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft et de dômes en carton. Les animaux en procédure seront hébergés à plusieurs, sauf pour les mâles reproducteurs (procédure 1) qui auront alors un triple enrichissement (buchettes en bois). La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (mains en coupelles ou tunnels). Le modèle que nous allons utiliser a été caractérisé d'un point de vue clinique et nous connaissons l’âge d’apparition de signe de souffrance ou de détresse qui est très tardif. Nous allons étudier les animaux avant l’apparition des signes impactant le bien-être des animaux ; le suivi des points limites nous permettra de limiter au strict minimum l’apparition de souffrance éventuelle.Ce suivi se fera à l’aide d’une grille de scoring chaque semaine ou plus fréquemment si des anomalies sont observées. Les critères se basent notamment sur le poids, l’aspect de l’animal, son comportement ainsi que sa posture.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction des muscles squelettiques sont proches des muscles humains. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes du système neuromusculaire, de leurs physiopathologies et de leurs causes génétiques. Afin d'étudier l'évolution naturelle de la pathologie, les animaux seront étudiés de l'âge de 1 mois jusqu'à l'âge de 12 mois dans les procédures 2 et 3.
Elevage et maintien de la lignée de souris DMSXL utilisée comme modèle de la dystrophie myotonique de type 1 à des fins de recherche scientifique et visée thérapeutique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les souris homozygotes de cette lignée transgénique présentent dès leurs premières semaines un retard de croissance et une faiblesse musculaire, ce qui vaut à 1 250 d'entre elles un classement en niveau de souffrance sévère. 5 000 souris au total sont concernées par cet élevage destiné à fournir un modèle de la maladie de Steinert, avec pour seules interventions déclarées une biopsie de queue à sept jours, un microtatouage des phalanges au même âge et la coupe des incisives quand la mâchoire se déforme, ce qui survient dans 40 % des cas. Le porteur dimensionne la colonie sur l'historique des performances de reproduction, afin de "ne produire que le juste nécessaire d'animaux d'étude". Les souris au génotype recherché partent vers les laboratoires utilisateurs au sevrage, à trois ou quatre semaines, les surnuméraires sont tuées au même moment, et quelques porteurs sains sont gardés pour renouveler les reproducteurs.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de maintenir une colonie d'élevage de variant transgénique de la souris utilisé comme modèle de la maladie de Steinert afin de disposer de modèles d'étude pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dystrophie myotonique de type 1 (DM1 ou maladie de Steinert) ainsi que développer et tester de nouvelles approches thérapeutiques. La DM1 chez l'Homme se manifeste notamment par une faiblesse musculaire, une myotonie, une cataracte précoce, des troubles cardiorespiratoires, un hyperinsulinimisme ainsi que par des anomalies cognitives et comportementales très handicapantes. La forme la plus sévère se manifeste dès la naissance par une hypotonie, des troubles respiratoires graves, des difficultés de succion et de déglutition ainsi que par un retard psychomoteur et une déficience intelectuelle.
Bénéfices attendus
Pour étudier la DM1 au cours du développement ainsi que dans divers types cellulaires et tissulaires affectés par la maladie, nous avons développé un modèle de souris transgénique porteuse du gène muté responsable de la maladie. Ces souris reproduisent plusieurs caractéristiques moléculaires, cellulaires et physiologiques de la maladie notamment dans les mucles et le système nerveux. Ce modèle sera utilisé pour étudier les mécanismes spécifiques liés à la mutation et leurs conséquences physiopathologiques ainsi que pour identifier des biomarqueurs permettant d'évaluer la progression de la maladie et les réponses thérapeutiques développées dans notre laboratoire et des équipes de collaborateur travaillant sur la même pathologie.
Procédures
Les seules interventions auxquelles les animaux d'élevage seront soumis sont une biopsie caudale à partir d'un prélèvement d'un petit bout de queue (moins de 0,5 mm) à des fins d'identification génétique des animaux à 7 jours postnatal, un microtatouage à l'encre à l'extrêmité distale des phalanges au même âge et le cas échéant, une taille des incisives lorsqu'un risque de mal-occlusion des mâchoires apparaît.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour les animaux sont pour partie liées au prélèvement pour typage et pour autre partie au phénotype des individus homozygotes. Concernant le génotypage des animaux, cette identification nécessite la biopsie d'un petit fragment de queue (inférier à 0,5 mm) à 7 jours postnatal s'accompagnant d'une légère douleur passagère. Concernant les nuisances liées au phénotype, les animaux homozygotes présentent un retard de croissance et une faiblesse musculaire dès leur plus jeune âge, assimilables à un phénotype prospectif sévère. Cependant, les symptômes phénoypiques caractéristiques de la maladie ne sont pas exprimés avant 3-4 semaines, âge à partir duquel les animaux sont expédiés vers le(s) Laboratoire(s) utilisateurs ce qui permet de faire correspondre l'effet délétaire (retard de croissance et myotonie) à un degré de gravité sévère.
Devenir
Les animaux modèles (homozygotes) et leur contrôle sont envoyés au Laboratoire utilisateur après sevrage au plus tard à 3-4 semaines d'âge. Les animaux surnuméraires ne présentant pas le génotype d'intérêt sont éliminés au sevrage. Quelques animaux porteurs (sains) du gène responsable de la maladie (hétérozygotes récessifs) sont conservés pour le renouvellement des reproducteurs placés en accouplement suivant un processus dit d'utilisation continue pour fourniture aux utilisateurs.
Remplacement
Dans une optique de remplacement, des études sur des modèles cellulaires de la maladie ont été largement menées avant toute utilisation de modèles animaux. Ces travaux ont permis d’approfondir nos connaissances et d’établir un rationnel solide pour ce projet. Cependant, les modèles in vitro de cellules (notamment des cellules musculaires et neuronales) présentent des limites importantes car ils ne reproduisent pas la complexité du contexte tissulaire (muscle et cerveau) ni les interactions intercellulaires hautement spécialisées. La compréhension des mécanismes à l’origine de la maladie de Steinert et le développement de solutions thérapeutiques pour les patients nécessitent donc l’utilisation de modèles animaux pertinents de cette pathologie, tels que nos modèles murins qui expriment la mutation associée à la maladie et reproduisent des anomalies moléculaires et physiologiques similaires avec la maladie humaine.
Réduction
Afin d'adapter la production aux besoins de l'expérimentation et ne produire que le juste nécessaire d'animaux d'étude, la colonie d'élevage est dimensionnée à l'issue d'un historique de plusieurs années permettant de rationaliser la production sur la base d'une stratégie d'accouplement en couple bigame et des performances parentales connues.
Raffinement
Les animaux sont examinés individuellement attentivement une fois par semaine et contrôlés une fois par jour pour le relevé des naissances et la détection d'un changement brutal du poids corporel ou la survenue d'anomalies du comportement. De plus, compte tenu que les individus homozygotes présentent dans 40 % des cas une anomalie au niveau des incisives se manifestant par une mal-occlusion dentaire due à un allongement des incisives, les incisives sont coupées à l'aide d'une paire de ciseaux fins spécialement prévus pour cet acte. Le cas échéant, le mileu d'élevage est alors supplémenté avec des pellets d'aliment humidifiés. Le programme d'élevage prévoit par ailleurs des points limites pré-établis étant entendu que les animaux destinés à rejoindre les projets applicatifs ne sont jamais conservés au delà de 3 à 4 semaines post-natales dans l'élevage.
Choix des espèces
La nécessaire modélisation vivo de la maladie de Steinert a porté le choix de notre Laboratoire vers l'espèce souris compte tenu des possibilités offertes par la transgénèse qui nous a permis d'insérer le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie dans son génome et de mimer certaines caractéristiques moléculaires et physiologiques de la maladie chez le patient. Le phénotype des animaux se manifeste dès la naissance mais les animaux seront utilisés à l'état adulte entre 1 et 4 mois.
Biocompatibilité et pharmacocinétique de biomatériaux implantés chez le lapin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles urogénitaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Avant qu'un implant vasculaire ou un implant libérant un médicament ne soit mis sur le marché, la réglementation impose d'en tester la tolérance sur des animaux non-humains. 90 lapins vont être utilisés pour cela, tous tués à l'issue du suivi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit sous anesthésie générale, en une intervention d'une trentaine de minutes, plusieurs injections de biomatériau dans la peau et dans les muscles, en différents sites, puis jusqu'à huit prélèvements sanguins de 2 mL en vingt-quatre heures sur animal vigile. Le porteur reconnaît des démangeaisons et des douleurs au site d'implantation dues à une inflammation ou à une nécrose locale, et présente le cumul des implants sur un même lapin comme une mesure de réduction.
Objectifs
Les biomatériaux sont des matériaux conçus pour interagir avec les systèmes biologiques, qui participent à la constitution d'un dispositif à visée diagnostique, d’assistance fonctionnelle ou thérapeutique. Ils peuvent être de différente nature (métaux, céramiques, polymères) et remplir des fonctions très variées : valves cardiaques, stents, implants dentaires, lentilles, prothèses, sutures, organes artificiels, etc. Tous doivent répondre à des exigences de biocompatibilité et de performances en lien avec leur utilisation. Dans le cadre de ce projet, on s’intéresse plus particulièrement à de nouveaux biomatériaux polymériques synthétiques ou naturels. Ces matériaux se présentent sous la forme de particules solides ayant une taille de quelques dizaines de microns à quelques millimètres, ou sous forme de gel liquide. Deux utilisations sont à l’étude : agent d’occlusion vasculaire, pour dévasculariser des tumeurs ou des saignements par voie endovasculaire, et vecteur de principe actif pour libérer une substance active sur une période contrôlée (anticancéreux, anti-inflammatoire, analgésique). L’implantation de ces biomatériaux chez l’homme et chez l’animal est réglementairement précédée d’une phase au cours de laquelle ces biomatériaux sont évalués en termes de sécurité pour la personne ou l’animal qui les recevra. Le projet a pour objet l’évaluation de la biocompatibilité et de la libération de principes actifs de ces biomatériaux
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’ordre scientifique et technologique. Les études menées doivent permettre de vérifier la bonne tolérance de futurs produits de santé destinés à une utilisation chez l’homme ou chez les animaux, tels que des implants vasculaires ou des implants libérant de façon prolongée des molécules actives telles que des anti-douleurs. Elles correspondent à une obligation réglementaire pour le développement et la mise sur le marché de dispositifs implantables et produits combinant un agent pharmacologique.
Procédures
Les animaux subissent une intervention chirurgicale unique correspondant à l’injection du matériau sous forme de suspension en différents sites (ex. intradermique, intramusculaire). La procédure est réalisée sous anesthésie générale et dure environ 30 min. Des prélèvements sanguins peuvent ensuite être effectués pour doser une molécule libérée par le matériau ou doser un marqueur de l’état de l’animal (maximum 8 prélèvements de 2 mL sur 24h, puis repos sur une semaine). Ces prélèvements sanguins sont réalisés sur l’animal vigile et durent moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Outre le stress engendré par la contention et la manipulation des animaux, il est possible que l’implantation des biomatériaux, la réaction de l’organisme à ces matériaux ou les doses de médicament libérées par le matériau engendre des effets indésirables sur les animaux, tels que des démangeaisons et des douleurs au site d’implantation dues à une inflammation ou une nécrose locale (événement très rare). D’une façon générale et moins sévère, l’appétit des animaux peut être diminué pendant les premières 24 à 48 h suivant la procédure d’implantation.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la période de suivi et des échantillons sont collectés pour analyse microscopique de l’implant et des tissus environnants;
Remplacement
Des études de cytotoxicité sur cultures cellulaires in vitro sont réalisées au préalable dans les étapes précoces du développement du biomatériau. Des essais de libération de principes actifs dans différentes conditions sont également effectués pour les implants chargés. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse d’un organisme entier face à l’administration d’un implant ou d’une molécule thérapeutique. La réaction immunitaire, la pharmacocinétique d’un médicament ne peuvent être reproduites dans des modèles in silico ni dans des modèles in vitro. Ces modèles sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Le recours à des essais sur animaux vivants apporte des données à la fois supplémentaires et indispensables sur le comportement des biomatériaux dans les tissus vivants;
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé d’après les recommandations des normes applicables (ex ISO10993-6 préconisant 3 animaux et 10 échantillons d’essais pour une implantation sous-cutanée) afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques comparatives. On inclut parmi les implants des biomatériaux contrôle (matériaux référence ou produits commerciaux) dont les effets locaux sont connus. Le nombre total d’animaux est réduit d’une part en posant sur le même animal plusieurs types d’implants, en implantant le même biomatériau au même animal plusieurs fois en différents sites, et en effectuant plusieurs prélèvements sur le même implant au moment de l’analyse histologique.
Raffinement
L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale. Un protocole de suivi des animaux et de prise en charge de la douleur et des traitements analgésiques systématiques et symptomatiques sont mis en place. Des points-limites avec évaluation des paramètres de suivi sont utilisés afin de réduire au maximum la douleur animale. Une visite de minimum une fois par jour est effectuée pour évaluer ces paramètres. Les animaux sont hébergés et suivis dans des conditions qui respectent leur bien-être : température et hygrométrie de l’environnement contrôlés, espace suffisant, présence systématique d’enrichissement du milieu (bâtons de bois à ronger, jouets, plateformes) et alimentaire (foin, persil, carottes), nourriture et eau à volonté
Choix des espèces
• La taille et l’anatomie du lapin permettent d’utiliser le même matériel que dans les plupart des procédures cliniques sur espèces cibles. • La procédure d’implantation est simple et rapide. • Plusieurs biomatériaux et plusieurs sites d’implantation peuvent être étudiés sur le même animal • Les prélèvements sanguins peuvent être répétés sans sacrifice de l’animal, ce qui permet d’obtenir une cinétique plasmatique sur un animal et de réduire le nombre total d’animaux utilisés par rapport à des espèces plus petites. • L’espèce est couramment utilisée et référencée pour ce type de tests, qu’il s’agisse de médicaments ou dispositifs médicaux. Animaux jeunes adultes, âgé de 4 à 12 mois, de 3.5 kg ou plus. Les animaux devront avoir plus de 4 mois pour avoir atteint un poids qui permet d’injecter une plus grande quantité de matériaux que chez des animaux plus jeunes et ainsi diminuer le nombre total d’animaux utilisés. On évite également les animaux plus jeunes car les tissus sont encore en croissance. On limite l’âge maximum à 12 mois car les animaux plus âgés ne sont généralement pas disponibles chez les fournisseurs, ou bien ponctuellement avec des écarts d’âge importants ou des historiques différents, introduisant une hétérogénéité au sein du lot et un risque de biais des résultats. Tous les animaux inclus dans un protocole donné devront être du même âge à +/- 1 mois et du même poids à +/- 500g pour avoir un groupe homogène.