Troubles musculosquelettiques

Soumises chaque mois à un test de coordination motrice de deux à huit mois, puis à un test de douleur exposant leur queue à une source de chaleur, à vingt-quatre heures d'isolement en cage d'observation et à un effort forcé sur tapis roulant, 42 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, le muscle tibial antérieur étant disséqué sous anesthésie pour mesurer sa contraction. L'objectif déclaré est de vérifier qu'un gène candidat repéré chez des patients cause bien une myopathie, en reproduisant chez la souris mâle les douleurs musculaires à l'effort décrites par les malades. Un amendement indique que dix souris sur vingt-quatre ne se sont pas endormies après l'injection d'anesthésique lors de la mesure de contraction, qu'elles ont été tuées sans subir la procédure, et que celle-ci sera donc répétée sur vingt-quatre autres souris.

Objectifs

Notre travail est principalement axé sur l’étude de nouveaux gènes impliqués dans les myopathies congénitales. Après analyse de données de séquençage d’ADN de plus de 500 patients atteints de myopathies, trois mutations dans un même gène ont été identifiées. Néanmoins, nous ne savons pas si ces mutations sont la cause de la myopathie ou si elles sont là par hasard. Au cours de notre projet, des analyses moléculaires effectuées sur cellules humaines suggèrent que ces mutations mènent à la perte de fonction de la protéine et donc à un effet pathologique. La mesure de l’activité motrice et neuro-sensitive des souris présentant une invalidation du gène d’intérêt permettra éventuellement de confirmer la présence de symptômes associés aux myopathies, tels que retrouvés chez les patients, et cela à l’échelle d’un organisme entier. En dernier lieu, des analyses sur tissus prélevés chez les souris permettront de comprendre les mécanismes de la maladie liée à ce gène et ainsi d’ouvrir des perspectives thérapeutiques. Le gène étant sur le chromosome X, cette maladie concerne très rarement les femmes. Nous n'étudierons donc que les souris mâles. Nous utiliserons 12 mâles dont le gène d’intérêt est intact et 12 mâles dont le gène est invalidé que nous comparerons. Amendement : Seulement 10 souris sur les 24 prévues se sont endormies après injection d'anesthesiques lors de la procédure mesure des propritétés contractiles (Aurora). Les souris ne s'étant pas endormies ont été sacrifiées et n'ont pas pu subir la procédure. Afin de pouvoir obtenir des résultats pour au moins 10 souris par groupe, cette procédure sera répétée avec 24 autres souris dont 12 par groupe.

Bénéfices attendus

Les différents tests d’activité motrice et de neurosensibilité chez la souris permettront de rendre compte de symptômes similaire à ceux des patients atteints de myopathies et d’ainsi confirmer à l’échelle d’un organisme entier ce qui est observé au niveau moléculaire. Les souris analysées constitueront ainsi un modèle murin de myopathie. L’étude de l’activité des souris par test de coordination motrice chaque mois permettra d’observer ou non une différence d’activité en fonction de l’âge de la souris et ainsi de confirmer que nos études à l’âge de 8 mois sont appropriées. Les mesures de neurosensibilité et d’activité spontanée dans la cage sont réalisés avant et après effort sur tapis roulant. Cette décision a été prise car les patients ayant une mutation du gène présentent des douleurs et faiblesses à l’effort. Une fois que l’implication de ce gène dans les myopathies est confirmée, le diagnostic de patients présentant une mutation de ce gène sera facilité et leur prise en charge sera améliorée. Des études plus approfondies permettront de comprendre les mécanismes de la maladie et d’ainsi envisager des nouveaux traitements.

Procédures

Chacune des 24 souris seront soumises à une série de 5 tests au total. De 2 à 8 mois et de manière mensuelle, la coordination motrice des souris sera analysée une fois par mois pendant moins d'une heure sur animal vigile. A 8 mois, des tests de douleur avec exposition au chaud (~1h) et test de mesure d'activité spontanée dans une cage (~24h) seront réalisés avant et après effort sur tapis de course (~1h). Ces trois tests seront réalisés sur animal vigile. A la fin de ces tests, toutes les souris subiront une mesure d'activité contractile sur muscle tibial antérieur dissequé (~1h par souris). L'animal sera anesthésié au préalable. Les muscles seront conservés pour des tests histologiques et moléculaires. Une biopsie de phalanges des souris est effectuée autour du sixième jour de vie dans le but d’analyser l’ADN de l’animal et d’ainsi vérifier la présence ou non du gène d’intérêt. Cette même biopsie servira également à l'identification de l'animal.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à observer un phénotype dommageable après effort sur tapis, de manière similaire aux patients présentant les mutations du gène étudié. En effet, les patients présentent des douleurs musculaires après activité physique. D’anciens travaux préliminaires sur ce modèle animal n’ont relevé aucun phénotype dommageable avant 4 mois. Etant donné que nos tests débutent à 2 mois, nous nous attendons à potentiellement observer des nuisances dès l’âge de 2 mois. Une faiblesse physique et douleur chez la souris pourra mener à une difficulté à se déplacer dans les cages, une difficulté à manger et éventuellement à respirer et une diminution des comportements sociaux et d’exploration. Parmi les différents tests, nous nous attendons à observer des nuisances lors de l’activité sur tapis qui provoque une fatigue de l’animal. La locomotion de la souris après retour dans sa cage risque d’être impactée. Le test de mesure de la douleur qui expose la queue de la souris à une source de chaleur provoque une douleur de très courte durée, égal au temps de réaction de la souris. La mesure d’activité spontanée dans une cage implique un isolement social pendant 24h. La mesure des propriétés contractiles musculaires nécessite une injection d'anesthésique et d'antalgique au préalable. La biopsie des phalanges décrite en 5.6.1 provoque une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette étude afin de procéder à des analyses histologiques et/ou moléculaires.

Remplacement

Afin de limiter les tests sur animaux, des études de l’activité à l’échelle moléculaire et cellulaire sont réalisées sur cellules humaines. L'utilisation d’animaux est cependant indispensable car les symptômes observés chez les patients atteints de myopathies et mécanismes de la maladie ne peuvent être observés et confirmés que dans un organisme entier. En effet, l’ensemble du tissu musculaire en lien avec le système nerveux sont étudiés. Le produit du gène étudié est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire sur la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies.

Réduction

Etant donné que le suivi en fonction de l’âge par test de coordination n’est pas invasif, cela va permettre de réutiliser les souris pour les autres tests et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Chacune des souris subira la totalité des tests au cours de sa vie. Etant donné que le test de force musculaire nécessite l’anesthésie puis la mise à mort de l’animal, les tissus d’intérêt pour analyses histologiques seront prélevés au même moment. Aucun autre animal ne sera donc sacrifié à cet effet. En ce qui concerne les tests avant et après efforts, ceux-ci n’ont de sens pour comparaison statistique que si un même animal effectue les tests avant et après l’effort. Cela réduit encore une fois le nombre d’animaux utilisés. Enfin, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum tout en permettant d'obtenir une puissance statistique suffisante. Nous pouvons affirmer d’après la littérature qu'au total 24 souris seront nécessaires pour conclure sur le projet : 12 souris modèles de myopathie et 12 souris contrôles saines.

Raffinement

Une vigilance accrue aux moindres signes de douleur pendant les tests ou dans la cage sera appliquée grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Les nuisances sur l’animal seront évitées autant que possible et le test arrêté si une des nuisances apparait. La mise à mort de l’animal sera appliquée si la douleur est trop élevée. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage dès l'apparition des premiers signes de difficulté pour se déplacer et notamment après l’activité forcée sur tapis. A partir du sevrage, une perte de poids de 20% en moins de 2 semaines ou une immobilité prononcée conduira à la mise à mort. Le suivi du poids se fera une fois par semaine, voire 1 fois par jour si une baisse de poids est observée. Afin de réduire le stress des souris, celles-ci subiront une habituation à l’environnement du test un jour avant les tests et seront toujours manipulées à l’aide de tunnels. Lors de la mesure de force musculaire, les souris seront profondément anesthésiées à l’aide d’un anesthésique puissant. Afin d’éliminer toute forme d’inconfort et de douleur, une molécule à fort potentiel analgésique sera également administrée accompagnée d’un anxiolytique utilisé pour son fort pouvoir sédatif. L’animal est ensuite déposé sur une plaque chauffée afin d'éviter une hypothermie. Afin de protéger et humidifier l’œil, un gel sera appliqué. Avant de débuter l’opération, l’efficacité et la profondeur de l’anesthésie sont vérifiées par une pression exercée manuellement sur les pattes et la queue. Si le rongeur ne montre aucune réaction, l’opération chirurgicale et le test peuvent être réalisés.

Choix des espèces

La protéine issue de notre gène d’intérêt est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire propres à la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies. Les animaux subiront un test de coordination chaque mois de 2 à 8 mois afin d'obtenir un suivi de l'activité motrice selon l'âge. Cette gamme d’âges permettra d’avoir le plus de données possibles pour conclure, tout en maximisant le temps de repos des souris. Les autres tests moteurs et neurosensitifs seront effectués à l'âge de 8 mois, âge où la souris atteint ses capacités musculaires maximales. Les souris seront sexuellement matures lors de l’ensemble des tests. Elles seront adolescentes de 2 à 3 mois et adultes de 3 à 8 mois jusqu’à la fin des tests.

2 352 souris subissent soit une chirurgie du genou de vingt minutes, soit une injection intra-articulaire, pour leur provoquer une arthrose. Toutes vont être tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et une partie d'entre elles est exposée au froid une heure par jour, deux fois par semaine. Le projet porte sur la douleur arthrosique et teste des antiarthrosiques, et le porteur écrit qu'après l'induction "aucune douleur n'est attendue après 24h", que les souris "ne boitent pas" et que le froid n'entraîne "pas de stress particulier". L'effectif se décompose en 144 animaux par étude, trois études par an pendant cinq ans, plus 192 souris pour le volet froid, le chiffre de 24 animaux par groupe reposant sur les habitudes du laboratoire.

Objectifs

L’arthrose est une maladie détruisant le cartilage, remodelant l’os sous chondral et entrainant une inflammation de la synoviale. Ces changements, qui touchent l’ensemble de l’articulation, entrainent notamment chez le patient des douleurs chroniques et une impotence fonctionnelle (diminution de la mobilité et raideur). L’objectif de ce projet est de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie invalidante et de tester et comparer plusieurs médicaments anti arthrosiques sur la souris afin de déterminer leur efficacité sur la destruction du cartilage et sur la douleur induite par la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de tester et comparer des médicaments anti-arthrosiques en terme d’évaluation de la douleur et de dégradation du cartilage via deux modèles d’arthrose : un modèle mécanique (lié à un traumastime) et un modèle chimique mimant une arthrose à forte composante inflammatoire. Ces données permettront l’avancée de la recherche pour le traitement de l’arthrose chez les patients.

Procédures

L’arthrose est induite chez les souris par deux moyens : une chirurgie rapide (environ 20min) pratiquée sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée, soit par une injection intra-articulaire pratiquée sous anesthésie générale. Le traitement aura lieu soit par injection soit par prise orale 1 à 5 fois par semaine selon le protocole. Des tests de comportements auront lieu 3 à 4 fois par semaine et dureront 1h maximum par test. Certains animaux seront exposés au froid 1h par jour, 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

L’induction de l’arthrose chirurgicale peut entrainer des douleurs sur les souris liées à la chirurgie et à l’ouverture des différents plans (peau et muscle). Après les différents protocoles d’induction de l’arthrose, aucune douleur n’est attendue après 24h. D’après l’expérience du laboratoire, les souris ne boitent pas, n’ont pas de difficultés particulières à se déplacer et peuvent donc avoir des interactions sociales normales et se nourrir normalement. En cas de traitement par gavage régulier (pour l’administration de traitements), il existe un risque de fausse route ou de perforation de l’œsophage. D’après la littérature, l’exposition des souris au froid pendant une durée relativement courte (moins de 4h) n’entraine pas de stress particulier chez les animaux. D’autres études ont montré que les souris sont capables de s’habituer à une situation stressante, notamment un bain d’eau froide en fonction du temps et de la fréquence d’exposition. Les expositions au froid prévues étant relativement courtes et régulières, nous n’attendons de dégradation particulière de l’état des animaux après les expositions au froid.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de pouvoir procéder à l’analyse des tissus et notamment des articulations.

Remplacement

Les expériences in vitro de cultures cellulaires ne permettent pas de mimer parfaitement la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein de l’articulation. De plus, l’influence de la composante mécanique est fondamentale dans cette pathologie. Le modèle murin combine les avantages d’intégrer les différents tissus de l’articulation avec les possibilités de modifications génétiques. Par ailleurs les procédures comportementales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité visant à étudier les aspects fonctionnels de l’arthrose que sont la douleur chronique. De fait, les expériences ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différente de l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires dans chaque procédure a été défini sur la base des études réalisées historiquement dans le laboratoire. Pour chaque étude, deux modèles d’arthrose seront prévus car ils sont complémentaires : le modèle chimique permet de mesurer la dégradation du cartilage et d’évaluer la réponse à la douleur, tandis que le modèle chirurgical permet d’évaluer la dégradation du cartilage et le remodelage de l’os sous chondral (avec une réponse moindre à la douleur). De plus, cela permet de reproduire l’hétérogénéité de la pathologie « arthrose » observée chez les patients. Le nombre d’animaux par groupe a été porté à 24 : 12 souris mâles et 12 souris femelles. L’évaluation de la douleur nécessite un minimum de 12 animaux afin de produire des résultats significatifs. L’utilisation des animaux des deux sexes permettra la comparaison des données, car d’après la littérature, les modifications biochimiques et histologiques sont plus importantes suite à l’induction de l’arthrose chez les mâles comparées aux femelles. Dans chacun des modèles, les animaux seront distribués en 3 groupes, un groupe contrôle traité au véhicule, un groupe traité avec le médicament test et un groupe traité avec une molécule de référence. Ainsi un nombre de 72 animaux par modèle est nécessaire (modèle chimique et modèle chirurgical), soit un nombre de 144 animaux par étude. 3 études seront réalisées par an pour l’étude de nouveaux traitements anti-arthrosiques, ce qui porte le nombre total d’animaux à 144*3*5 = 2160 animaux pour 5 ans. Pour le projet froid, un nombre de 192 animaux sera nécessaire : les deux modèles d’arthrose seront comparés pour 4 lots de 24 animaux (12 mâles et 12 femelles). Soit un total d’animaux de 2160 + 192 = 2352.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux, dans un environnement enrichi (matériel pour nidification) avec l’eau et la nourriture ad libitum. Les animaux participant aux tests comportementaux seront hébergés en cycle inversé. Pendant les 10 à 12 semaines d’hébergement, la surveillance des souris sera effectuée quotidiennement, avec un intérêt particulier pour le comportement : état du poil, vocalisations, boiterie. Au moment de l’induction de l’arthrose chirurgicale, une injection d'un analgésique sera réalisée, 15min avant l’intervention. Si la souris montre des signes de douleur dans les heures suivant l’intervention, une seconde dose d'analgésique sera administrée. La procédure chirugicale ainsi que l’induction de l’arthrose par injection intra-articulaire se font sous anesthésie volatile (environ 20 min pour la chirurgie et 10 min pour les injections intra-articulaires).

Choix des espèces

L’induction de l’arthrose dans le modèle murin (C57BL/6) est un modèle reconnu dans la littérature et parfaitement accepté pour tester l’efficacité de nouveaux traitements anti-arthrosiques. De plus, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différente de l’homme. Les modèles d’arthrose seront induits sur des animaux âgés de 8 à 10 semaines, ce qui correspond à des animaux adultes, en fin de croissance.

Une lésion musculaire est provoquée chez 240 rats porteurs d'une dystrophie, par injection intramusculaire ou rétro-orbitaire sous sédation puis anesthésie gazeuse. Ils reçoivent ensuite un antidouleur deux fois par jour pendant au moins deux jours, certains des injections intrapéritonéales deux fois par jour pendant trois à six jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous sont tués entre six et huit mois pour que leurs muscles soient prélevés. L'objet est de comparer les cellules souches des muscles qui bougent les yeux, épargnés par la maladie, et celles des muscles des membres, qui se détériorent. Le porteur affirme que jusqu'à six mois aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome n'a été constatée, après avoir décrit une douleur inflammatoire modérée qui exige un morphinique.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. Certaines dystrophies sont causées par des changements dans le gène codant pour la dystrophine (porté par le chromosome X), générant la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), que touche surtout les garçons. Chez les patients, la production anormalement faible ou absente de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. Pour autant, les muscles qui contrôlent le mouvement des yeux conservent leur capacité de régénération, contrairement aux muscles des membres. Ce projet vise ainsi à comparer le comportement des cellules souches musculaires, responsables de la réparation du muscle, entre ces deux types de muscles. L’objectif est d’identifier les facteurs clés permettant le maintien de la capacité régénérative des cellules souches épargnées par le vieillissement précoce, ce qui permettrait d'ouvrir une nouvelle piste de traitement pour traiter l'ensemble des myopathies dystrophiques.

Bénéfices attendus

Nous comptons identifier les mécanismes protecteurs du vieillissement précoce des cellules souches. Avec ce projet, nous comptons in fine identifier de nouvelles molécules pour moduler les mécanismes identifiés en vue d'empêcher ou de retarder le vieillissement précoce des cellules souches musculaires dans certaines maladies et ainsi, favoriser la réparation musculaire par le maintien des capacités régénératives des cellules souches.

Procédures

Dans ce projet, tous les animaux seront sédatés une fois par injection sous-cutanée puis anesthésiés par inhalation de gaz. Une injection sera réalisée par voie intramusculaire ou rétro-orbitaire. Les animaux seront injectés 2 fois par jour avec un traitement anti-douleur par voie sous-cutanée pendant un minimum de 2 jours. Certains recevront des injections intrapéritonéales 2 fois par jour pendant 3 ou 6 jours.

Impact sur les animaux

L'expérience de réparation musculaire induite qui constitue la base de ce projet cause une douleur modérée d’origine inflammatoire que l'on peut efficacement contrer avec une un antalgique puissant ou un morphinique qui sera systématiquement administrée aux animaux. Les animaux seront mis à mort entre l’âge de 6 à 8 mois. Jusqu’à 6 mois, aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome en animalerie confinée n’a été constatée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé tous les essais approfondis sur les cellules souches musculaires en culture. Ces expériences in vitro ne peuvent pas reproduire toutes les interactions et réponses cellulaires observées de façon chronologique dans un organisme vivant. Ainsi, la validation chez l'animal est maintenant indispensable pour évaluer de manière complète et précise les mécanismes de coopération entre les cellules dans la réparation musculaire et dans un contexte physiologique qui respecte la complexité des contributions nerveuses et endocrines.

Réduction

De nombreuses données ont été cumulées sur les modèles animaux utilisés dans ce projet. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique et le calcul de puissance statistique nous recommande d'utiliser 8 animaux par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure qu'il était suffisant et approprié pour conclure de façon non ambiguë.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des pièces avec contrôle continu de la température et de l'humidité de l'air ambiant. Le cycle d'éclairage des pièces respecte une alternance jour/nuit fondée sur les besoins naturels des animaux. Nous avons choisi de les élever dans les plus grandes cages disponibles sur le marché, leur permettant de marcher et de se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est adapté à l'évaluation de leur capacité locomotrice. Dans les cages, les animaux ont un accès libre à la nourriture et à l'eau fournies à volonté. Nos animaux sont sociaux. Aussi, nous les hébergeons avec des congénères dans la même cage. Leur environnement est par ailleurs enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons en bois à ronger, des balles, des tunnels et des carrés de coton compacté. Pour éviter toute réponse de stress, les animaux sont habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, de la manière la plus douce possible. Le suivi des animaux est assuré par un personnel capable de reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur chez les animaux. Nous avons établi une grille d'évaluation de la douleur, avec des points limites définis et affichés dans les pièces d'hébergement. Les animaux sont constamment évalués en observant chaque individu, 7 jours sur 7. En cas d'anomalie, des mesures correctives sont prises. En cas d'absence de bénéfice suite au traitement prescrit, nous pratiquons une mise à mort compassionnelle. Elle permet d'éviter toute souffrance à l'animal. La survenue d'une éventuelle douleur modérée chez l'animal est anticipée et prévenue par l'administration préalable de molécules anti-douleur très efficaces sur ce type de procédures. Les molécules utilisées dans ce projet sont toutes des médicaments pour lesquels les risques de toxicité sont faibles, connus et anticipables.

Choix des espèces

Nos animaux appartiennent à une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, cette espèce est devenue un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Les animaux seront âgés de 6 à 8 mois, ce qui correspond au stade où la maladie progresse le plus et les muscles sont de plus en plus impactés, fonctionnellement et morphologiquement.

5 720 souris vont être utilisées pour une intervention de trente minutes chacune, l'implantation d'un dispositif dans la mâchoire sous anesthésie générale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui altère leur dentition et les expose à des difficultés de mastication et à une perte de poids pendant toute leur vie, indépendamment de la chirurgie. L'objet du projet est de tester des membranes synthétiques censées remplacer les greffes osseuses de la mâchoire chez de jeunes patients atteints d'une maladie génétique rare. Toutes sont tuées, une partie pour génotypage non conforme, les autres pour prélèvement de tissus, et le porteur ramène l'effectif à un calcul de puissance sans donner ni le nombre de groupes ni le nombre d'animaux par groupe.

Objectifs

La pathologie d’intérêt est une maladie génétique rare avec des conséquences variées incluant des troubles dans le développement des dents et des mâchoires, avec des complications osseuses et métaboliques associées. Dans les défauts dentaires, cette pathologie est très fréquente et représente environ 52% des cas, représentant alors un enjeu de santé publique majeur. A l’heure actuelle, les troubles dentaires et osseux de la mâchoire sont traités par réhabilitation orale incluant des implants, greffes osseuses et des prothèses. Il s’agit d’une procédure clinique chirurgicale en deux étapes à savoir une greffe osseuse pour établir un volume osseux suffisant puis une pose d’implant dentaire, avant la phase prothétique. La procédure est lourde et à l’origine de risques de comorbidités et de douleur importants, et ce avec des résultats à long terme non optimaux chez les patients atteints de la mutation ciblée. Nous proposons une stratégie efficiente et novatrice utilisant un implant pour remplacer les greffes osseuses afin de régénérer l’os au niveau de la mâchoire pour une population souffrant de sévères lésions osseuses dans le cadre de la pathologie ciblée, en particulier pour un public de jeunes patients. L’objectif principal est donc de répondre au besoin de stratégies thérapeutiques, notamment pour la reconstruction de la mâchoire, via une procédure légère et peu traumatique pour ces patients que ce soit au niveau psychologique ou physique, avec des complications et une douleur post-opératoire largement diminuée par rapport aux standards actuels. Notre stratégie sera évaluée In Vivo sur des souris portant la même mutation que l’homme. Cette phase permettra d’évaluer le potentiel de régénération osseuse des implants dans un contexte se rapprochant le plus des conditions cliniques existantes (opération chirurgicale, incision, troubles métaboliques sur modèle vivant).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer des options thérapeutiques moins invasives que les greffes osseuses tout en étant plus efficace pour ces patients. Notre objectif est donc d’optimiser la régénération osseuse en chirurgie maxillo-faciale ou traumatologique en développant des membranes synthétiques bioactives tout en privilégiant une approche peu invasive avec une diminution la douleur et du temps de cicatrisation. Ce projet permettra donc de mettre au point un protocole thérapeutique apte à répondre à la problématique des déformation osseuses au niveau de la mâchoire liées aux mutations génétiques.

Procédures

Un prélèvement pour génotypage sur animal vigile sera effectué. Une implantation sous anesthésie générale d’une durée de 30 min au niveau de la mâchoire.

Impact sur les animaux

La chirurgie induit une douleur modérée ainsi qu'une perte de poids principalement sur les 2 semaines post-opératoires. Le modèle génétiquement modifié ayant une dentition altérée, ces souris pourraient avoir des difficultés à mastiquer induisant un risque de perte de poids et ce tout au long de leur vie. L'implantation permet toutefois la reconstruction osseuse de la mâchoire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour génotypage non conforme et prélèvement de tissus pour analyse post-mortem

Remplacement

Après des études in vitro validant la non-toxicité et la biocompatibilité des implants, il est nécessaire de passer à des études in vivo étant donnée la complexité de l'environnement osseux et oral. Les modèles in vitro, possibles grâce à la collecte de cellules sur les modèles de l’étude, seront utilisés pour permettre une première évaluation, mais ils ne permettent pas de reproduire l’ensemble des paramètres lié à la régénération de l’os (inflammation, recrutement cellulaire, vascularisation, minéralisation…). La solution thérapeutique développée implique de plus un acte chirurgical. La faisabilité technique de cet acte n’est pas possible in vitro. De plus, la gestion de la douleur peri- et post-opératoire est une donnée importante à minimiser : cet élément n’est pas reproductible sur d’autres modèles. Ainsi, il n’existe à ce jour pas de modèle alternatif pour ce type d’étude.

Réduction

La réduction des effectifs est liée à une approche statistique adéquate et à l'utilisation de modèles standardisés. L’effectif animal de chaque groupe a fait l’objet d’une évaluation statistique via calcul de puissance. Globalement, la stratégie tendra à diminuer le nombre total d’animaux en priorisant certaines stratégies.

Raffinement

Tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale. De plus, une anesthésie locale et des traitements antidouleurs seront appliqués pour réduire la douleur péri- et post-opératoire. Compte tenu des potentielles douleurs pouvant être générées suite aux actes, un suivi rigoureux après l’intervention et une prise en charge précoce de la douleur seront effectués, en cas de signes de souffrance animale. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des conditions optimales. L’environnement des cages est enrichi à l’aide de carrés de cellulose et de frisure pour la construction des nids, de tunnels pour permettre aux animaux de se cacher et ainsi diminuer le niveau de stress. La nourriture sera adaptée pour les rongeurs ayant cette condition et l’eau de boisson seront donnés ad libitum. Des points limites ont été établis pour soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le modèle de la souris, un modèle d’étude vivant, a été sélectionné pour vérifier la régénération osseuse induite par un dispositif implantable formulé car malgré les variations inter-espèces, le phénotype dentaire chez la souris de la pathologie étudiée est reproduit. De plus, nous avons à disposition des techniques et des outils micro-chirurgicaux développés à ses fins permettant d’étudier la régénération osseuse de la mâchoire chez la souris. Les souris génétiquement modifiées utilisées pour nos procédures constituent donc un bon modèle pour mieux comprendre la maladie étudiée et la réponse métabolique aux traitements.

Trois heures de chirurgie pour implanter des cathéters permanents, une sonde débitmétrique et une canule dans l'iléon ou l'estomac, puis six journées de prélèvements de sept heures avec dix prises de sang simultanées sur deux cathéters, soit 54 millilitres par journée : 64 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste la digestibilité de régimes végétalisés et l'effet d'un probiotique sur l'assimilation des nutriments, en vue de recommandations pour l'alimentation humaine. Chaque animal reste hébergé seul dans une case aux parois transparentes, et le porteur ramène les douleurs abdominales postopératoires à quelques jours suivis d'une gêne qu'il qualifie de mineure. Tous sont tués à la fin des essais, pour récupérer le matériel implanté et prélever des muscles.

Objectifs

Notre unité de recherche aborde la nutrition de manière intégrée, depuis la qualité des aliments et des régimes alimentaires jusqu’à leurs effets sur la santé dans le cadre d’une transition vers une alimentation plus durable. Le projet s’inscrit totalement dans cette thématique puisqu’il a pour objectif de tester la qualité nutritionnelle de régimes alimentaires végétalisés en évaluant la digestibilité des macro et micro-nutriments qu’ils contiennent. Une optimisation de cette digestibilité permettra ainsi d’améliorer la qualité de l’alimentation et ses effets sur la santé. Nos pistes pour élaborer une stratégie nutritionnelle efficace sont 1) de tester des repas complets avec un apport optimisé à la fois en protéines de qualité et en fibres mais aussi avec un apport limité en facteurs antinutritionnels et 2) d’améliorer l’utilisation des nutriments par l’hôte à l’aide d’une stratégie d’amélioration du microbiote intestinal via l’apport d’un probiotique. Ce projet mettra en oeuvre un modèle de mini-porcs.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est l’élaboration de stratégies nutritionnelles adaptées à des situations physio-pathologiques. Le projet devrait donner à la fois des indications quant à la biodisponibilité des macro et micro-nutriments de régimes optimisés et des pistes sur leurs effets sur la santé de l’hôte. L’objectif principal est de trouver une matrice alimentaire qui soit la plus digestible possible permettant ainsi de contre-carrer un état physio-pathologique tel que l’insulino-résistance ou la résistance anabolique post-prandiale observée lors du vieillissement.

Procédures

Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale pour la pose de cathéters permanents, de sonde débit-métrique et de canule iléale et/ou gastrique (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours sera observée , entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 6 cinétiques post-prandiales d’une durée de 7h suivie d’une période de récupération de 7 jours minimum entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment un des régimes à tester. Des prélèvements de sang seront réalisés simultanément dans les 2 cathéters avant et après le repas selon la cinétique de 10 prélèvements sanguins en simultanés sur chaque vaisseau pour chaque animal, étalés sur une journée de 9 heures. Pour chacune des journées de prélèvements, 2.7 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter à chaque point de cinétqiue. Le volume total prélevé sera de 54 ml par cinétique (moins de 5% du volume sanguin de l'animal).

Impact sur les animaux

Des douleurs abdominales peuvent être ressenties par l’animal suite à l’intervention chirurgicale. Elles peuvent se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures.

Devenir

En fin d'expérimentation les animaux seront euthanasiés, afin de récupérer le matériel implanté et d'effectuer des prélèvements d'organes pour l'évaluation de l'effet des régimes sur la santé musculaire des animaux.

Remplacement

La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro.

Réduction

L'effectif prévu dans le schéma expérimental (8 animaux maximum inclus dans le schéma expérimental de la procédure 1 et 6 animaux par lot dans la procédure 2) est réduit à son minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré (apparition des acides aminés dans le sang), estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Cette variabilité est liée non seulement de la variabilité interindividuelle des animaux, mais aussi à la qualité des prélèvements effectuées et à la précision des données obtenues par l’analyse biochimique. Ces aspects sont parfaitement maitrisés par les expérimentateurs du projet qui ont une longue expérience dans le domaine. Le fait d’utiliser un schéma expérimental en carré latin permet de diminuer significativement le nombre d’animaux utilisés (chaque animal étant son propre témoin). L'équipe de recherche impliquée dans le projet a une longue expérience sur l'utilisation d'animaux porteurs de canules digestives et de cathéters sanguins, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans le projet, et de prévenir les processus douloureux. L’analyse statistique des données cinétiques (concentrations artérielles en acides aminés, flux de matière sèche et d’azote dans l’intestin chez le porc), sera réalisée avec l’animal comme variable aléatoire, et le temps, le repas et l’interaction temps x repas, comme facteurs. Pour les données représentant la valeur moyenne d’une variable (par exemple la digestibilité) une analyse de variance classique sera réalisée (repas, animal, semaine de prélèvement, comme effets principaux).

Raffinement

L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical lequel se déroule sous anesthésie général avec monitoring des constantes vitales. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages, individuelles, au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et interagir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.

Choix des espèces

Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Ce modèle animal est reconnu par la communauté scientifique comme pertinent pour des études sur la digestibilité d'aliments avec un tranférabilité facilité à des études de la physiologie humaine. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'expérimentation.

Caler les conditions d'injection d'une molécule anti-complément avant un futur protocole d'efficacité: 24 souris vont être utilisées pour cette mise au point, toutes tuées au dixième jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant neuf jours, chacune reçoit une injection quotidienne de complément humain dans le péritoine, trois injections d'anticorps prélevés sur des malades, trois injections sous-cutanées de l'inhibiteur testé et quatre microprélèvements de sang sous anesthésie. Le modèle repose sur une myopathie nécrosante auto-immune déclenchée chez la souris, et le porteur écrit pourtant n'attendre aucune nuisance des molécules, seulement l'inconfort des contentions, des injections et des prélèvements. Aucun résultat thérapeutique n'est attendu de ces 24 souris, dont le rôle se limite à un dosage préalable ouvrant sur un autre protocole.

Objectifs

Notre laboratoire a établi un modèle de myopathies nécrosantes auto-immunes par injection à des souris d'anticorps purifiés de malade et de complément humain. Ce modèle nous a permis de mettre en évidence le rôle pathogène de ces anticorps et du système du complément. Nous avons démontré par le passé l'efficacité préventive d'une molécule empêchant le système du complément de déclencher la maladie (Anti-C5, ou Zilucoplan) dans ce modèle murin. L'objectif général de notre programme est d'évaluer l'efficacité d'une nouvelle molécule inhibitrice du complément dans ce modèle (Anti-C2). L’étude des animaux se fera par une analyse sanguine pour doser la molécule thérapeutique anti-C2 et le complément humain injecté.

Bénéfices attendus

Ce protocole permettra de déterminer les conditions d'injection d'un nouvel inhibiteur spécifique du fragment C2 du complément humain et d'appliquer ces conditions dans un futur protocole qui visera à démontrer son efficacité thérapeutique dans notre modèle murin de myopathie nécrosante autoimmune ouvrant ainsi la porte à un éventuel essai clinique chez les patients atteints de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 microprélèvements de sang de 75 microlitres, prélèvement sur souris anesthésiée, durée de l'acte 20 secondes. Les souris seront injectées quotidiennement avec du complément, en intrapéritonéal, durant 9 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection des IgG en intrapéritonéal, 3 fois par souris , sur une période de 9 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection de l'anti-C2 en sous-cutanée., 3 fois par souris , sur une période de 9 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Cependant, des nuisances pourront être observées chez l'animal lors desphases de contention, des injections ou des prélèvements de sang prévus dans la procédure.

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effet indésirable des molécules ne sont attendues. Cependant, des nuisances pourront être observées chez l'animal lors des phases de contention, des injections ou des prélèvements de sang prévus dans la procédure.

Devenir

Les animaux ayant reçus des injections ne pourront être réutilisés dans un autre protocole. Tous les animau seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de molécules inhibitrices du complément dans une perspective future d’approche à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autres protocoles expérimentaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'auto-anticorps chez la souris et injection du Zilucoplan, inhibiteur du C5. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique de puissance pour déterminer les effectifs exacts nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures, ainsi que de la variabilité des réponses immunologiques (réponse primaire notamment) observées lors de ces protocoles.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de cellulose (cello dome) et des fibres de coton (Nestlets). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux seront euthanasiés par surdose de CO2 sous anesthésie générale à l'isoflurane en fin de procédure (Jour 10). En cas de douleur, du méloxicam sera administré par voie sous cutanée à la dose de 1mg/kg. Un examen visuel sera pratiqué quotidiennement par deux observateurs indépendants et permettra d’évaluer une éventuelle souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort (réduction de l'activité, dos vouté, poils ébouriffés,difficultés respiratoires, vocalisation, perte d’appétit…) seront mis à mort de manière éthique par surdose de CO2 sous anesthésie générale à l'isoflurane à 2.5% en air grâce à un matériel dédié (Tem Sega, Necrobox et MiniHub) et dans un lieu isolé des locaux d’hébergement.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.