Troubles musculosquelettiques

Tués douze semaines après leur première opération pour que leur mâchoire soit photographiée, scannée et découpée en coupes histologiques, 30 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les deux premières molaires du haut leur sont arrachées sous anesthésie, puis ils reçoivent du zolédronate en injection dans l'abdomen, éveillés, avant qu'un implant dentaire ne leur soit posé quatre semaines plus tard. Le porteur qualifie la douleur de modérée et les complications postopératoires de rares. Sur le remplacement, il indique qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer la cicatrisation osseuse autour d'un implant après la prise de ces médicaments, et présente son propre protocole comme un modèle réutilisable pour tester ensuite le tabagisme ou la maladie gingivale.

Objectifs

L'ostéonécrose des mâchoires associée aux médicaments est une complication potentiellement sévère qui affecte les patients atteints de pathologies concernant le tissu osseux, comme l'ostéoporose et certaines maladies oncologiques, en particulier les cancers du sein et de la prostate. Ces patients suivent des traitements médicamenteux qui modifient le renouvellement normal du tissu osseux, entraînant une augmentation de sa densité. Parmi ces médicaments, on retrouve les bisphosphonates De nombreux modèles précliniques ont été développés chez le rat, contribuant à des avancées significatives dans la compréhension de cette pathologie. Cependant, les mécanismes à l'origine du développement de la nécrose osseuse restent encore partiellement élucidés. La recherche animale a permis de mettre au point des modèles intégrant des facteurs de risque initialement observés chez l'humain. Il est clairement établi que la nature du médicament administré ainsi que le protocole de dosage influencent le risque de développer cette maladie chez les patients. En fonction de la dose administrée, les patients sous traitement avec ces médicaments sont classés en deux catégories : forte dose (patients oncologiques) et faible dose (patients atteints d’ostéoporose). Selon la littérature actuelle, outre les facteurs systémiques et médicamenteux, des facteurs locaux peuvent également favoriser le développement de cette maladie, notamment la chirurgie implantaire. Les recommandations scientifiques internationales contre-indiquent la pose d'implants chez les patients sous traitement à forte dose. En revanche, chez les patients sous faible dose, l'implantologie est autorisée, bien que le risque de développer une ostéonécrose des mâchoires reste incertain. LL'objectif de cette étude est de développer un modèle expérimental chez le rat afin d'évaluer l'effet de différentes doses de ces médicaments sur le processus d’ostéointégration dans un alvéole totalement cicatrisé. Plus précisément, le médicament choisi est le Zolédronate, qui appartient à la classe des bisphosphonates. Ce modèle exposera les animaux à deux dosages distincts, reproduisant ceux administrés chez l’humain pour le traitement de l’ostéoporose (faible dose) et des pathologies oncologiques (forte dose).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension du processus de cicatrisation osseuse autour de l'implant dentaire après l’administration de traitements avec des médicaments qui altèrent le fonctionnement normal du tissu osseux. De plus, il aidera à évaluer la faisabilité de la pose d’implants chez les patients recevant une faible dose de ces médicaments (qui représentent la majorité des utilisateurs), ainsi qu'à analyser les risques liés à une administration à forte dose chez les patients oncologiques. Pour les recherches futures, cette étude constituera un modèle expérimental permettant d'explorer le rôle d'autres facteurs de risque (ex. : tabagisme, maladie gingivale, etc.) dans le processus de cicatrisation osseuse autour de l'implantau sein de cette population vulnérable.

Procédures

Pour tous les animaux, une période d’acclimatation (minimum 7 jours) est appliquée avant l’initiation du protocole T0 : Extraction dentaire Au début de l'expérience (T0), une extraction de la première molaire maxillaire gauche et droite sera pratiquée sur tous les animaux. Ils recevront une injection d’analgésique (quelques secondes), puis seront anesthésiés pendant 15 minutes sur un tapis chauffant. L'administration de l'analgésique (renouvelée 2 fois par jour) se poursuivra pendant les deux jours suivants. T1 : Administration des traitements Quatre semaines après, l'administration des traitements assignés ou l’absence de médicament débutera sur animal vigile par une injection intrapéritonéale de quelques secondes. T2 : Chirurgie implantaire Quatre semaines après administration médicamenteuse, la pose d'implants sera réalisée sous anesthésie générale. Cette intervention durera 15 minutes. Une couverture analgésique sera mise en place. Le même protocole pré- et post-opératoire que celui décrit pour l'extraction dentaire sera appliqué. T3 : Analyses post-mortem Quatre semaines après la chirurgie implantaire, les rats seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : - L’extraction ainsi que la pose des implants peuvent entraîner une douleur modérée, qui peut être facilement contrôlée par l’administration d’analgésiques. Les complications post opératoires sont rares. - L’administration du traitement ou de l’analgésie peut induire une courte douleur (moins d’une minute) - Lors du reveil après les chirugies, les animaux peuvent être désorientés et stréssés

Devenir

Afin d’évaluer l'effet des traitements, il est necessaire • D’analyser le site avec l’implant et prendre des photographies. • De réaliser d'un scanner • De prélever des échantillons pour analyse histologique. Nous devons pour cela procéder à la mise à mort de tous les animaux du projet.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro permettant d’évaluer le processus de cicatrisation osseuse autour de l'implant en simulant le métabolisme osseux après la prise de médicaments. Cette étude constituera un modèle expérimental permettant d'explorer le rôle d'autres facteurs de risque (tels que le tabagisme, etc.) dans le processus d'ostéointégration au sein de cette population vulnérable.

Réduction

Les lots ont été réduits au minimun pour obtenir toutefois des résultats significatifs. Pour cela, nous nous sommes appuyés sur la littérature et sur une analyse statistique.

Raffinement

Une semaine d’acclimatation sera observée avant le début du projet afin de réduire le stress des animaux. Avant l’extration dentaire et la chirurgie, les animaux seront analgésiés. Les interventions seront ensuite réalisées sous anesthésie médicamenteuse et sur tapis chauffant. Le bien-être des animaux sera évalué par du personnel compétent à l’aide d’une grille de score. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. De même un arbre décisionnel ainsi que des critères d’arrêt sont définis si nécessaire.

Choix des espèces

Le rat représente une espèce appropriée pour cette expérience. En effet, la chirurgie d’implant dentaire est bien décrite dans la littérature, et les processus de cicatrisation et d’intégration d’implant sont largement documentés. Cependant, peu d’études se sont spécifiquement intéressées au risque associé à la chirurgie implantaire. Cette expérience pourrait ainsi offrir une opportunité de comparaison avec la littérature existante et d’apporter des données précieuses dans ce domaine. Les animaux utilsés auront de 8 semaines en début de projet. Les rats seront alors adultes, leur machoire ne se developpera donc plus.

1 968 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus articulaires. À dix semaines, chacune subit une chirurgie du genou droit d'environ quinze minutes qui déstabilise un ménisque et déclenche une arthrose, après des injections intrapéritonéales quotidiennes ou un régime alimentaire médicamenteux de deux à quatre semaines. Le porteur décrit une possible prostration dans les trois jours suivant l'opération, l'isolement de l'animal et l'arrêt du toilettage social, ainsi qu'un risque d'infection des sutures. Les retombées annoncées pour les 500 millions de personnes touchées par l'arthrose restent au conditionnel, et le porteur compte parmi les bénéfices du projet le fait d'y tester un mode d'administration moins invasif.

Objectifs

L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation semble correspondre à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). Dans le contexte de l’arthrose, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés via un mécanisme nommé « angiogenèse » se met en place. Cette invasion vasculaire favorise la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Cependant, à ce jour, aucune étude n’a rapporté, de manière précise, la phase de la maladie à laquelle les chondrocytes deviennent hypertrophiques, ainsi que le devenir de ces cellules au cours du temps. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le mécanisme de l’hypertrophie des chondrocytes qui survient lors de l’arthrose. Pour ce faire, nous souhaitons générer et utiliser une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant de visualiser les chondrocytes hypertrophiques grâce à une protéine fluorescente spécifique. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’apparition des chondrocytes hypertrophiques sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement les chondrocytes hypertrophiques.

Bénéfices attendus

Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle que tiennent les chondrocytes hypertrophiques dans le développement de cette maladie. Dans un second temps, les résultats obtenus, nous permettront d’évaluer l’intérêt de cibler l’étape d’invasion vasculaire du cartilage pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l’arthrose. Ce projet comporte également une partie dédiée à évaluer des modes d’administrations du traitement moins invasif et stressant pour les souris, ce qui permettra, in fine, une amélioration et un raffinement de ce protocole, dans un souci de respecter les 3Rs de l’expérimentation animale Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représente des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongé et aux intervention) exercées par l’arthrose sur notre société.

Procédures

Les animaux âgés de 8,10,12 ou 14 semaines recevront des injections intrapéritonéales du composé d’intérêt quotidienne de quelques secondes sur une période de 3/5 jours ou seront soumis à un régime contenant le composé d’intérêt pendant 2/4 semaines. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal. A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Cette opération sera effectuée dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire. Une injection sous-cutanée de solution saline physiologique sera également effectuée afin de prévenir la déshydratation des animaux.

Impact sur les animaux

Dans les trois premiers jours suivant la chirurgie, si des douleurs sont ressenties par l’animal, celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux de la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Cette douleur pourrait notamment être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Comme indiqué dans la littérature, la présence du composé d’intérêt dans la nourriture peut provoquer une aversion chez les animaux et donc entraîner une perte de poids significative. Une acclimatation des souris à ce régime spécifique sera réalisée, de même, la prise de nourriture et le poids des animaux feront l’objet d’une évaluation régulière. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué...) seront attentivement surveillés.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements post-mortem de tissus articulaires. Ces prélèvements sont indispensables pour évaluer la fiabilité et la reproductibilité d’induction de l’arthrose post-traumatique au sein de notre lignée de souris génétiquement modifiée, ainsi que pour mieux caractériser la progression de la maladie (notamment l’apparition de cellules hypertrophiques pathologiques) chez ces animaux.

Remplacement

Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communication cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Le nombre de 9 animaux de chaque sexe par groupe a été calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvement multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.

Raffinement

Cette étude prend en considération la règle des 3R en intégrant une optimisation du raffinement des protocoles par l’évaluation de l’efficacité de mode de délivrance alternatifs d’un composé actif, afin de réduire le recours à des gestes invasifs sur les animaux. Premièrement, nous déterminerons si l’utilisation d’un régime alimentaire contenant le composé actif peut se substituer aux injections intrapéritonéales, plus invasives et stressantes pour l’animal. Dans un second temps et uniquement si le premier protocole de raffinement ne donne pas de résultats satisfaisants, nous évaluerons l’intérêt d’un mode de délivrance qui associe un nombre réduit d’injections intrapéritonéales et un régime alimentaire à base de composé actif. Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée en avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur suceptible d'être ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 8-14 semaines, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial.

Améliorer les implants dentaires et les prothèses de hanche pour l'industrie médicale : 60 lapins néo-zélandais blancs mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun reçoit jusqu'à quatre implants en titane vissés dans ses deux fémurs et ses deux tibias au cours d'une chirurgie d'une heure, puis trois administrations de marqueurs fluorescents sur animal conscient. Le porteur indique que la douleur postopératoire peut être aiguë ou chronique, que la mobilité réduite empêche les lapins de se toiletter pendant deux à trois jours, et qu'une fracture osseuse ou une luxation du genou reste possible. Il présente le lapin comme le "gold standard" de la recherche sur les implants osseux et annonce un transfert des connaissances vers l'industrie médicale.

Objectifs

Ce projet vise à réduire les problèmes liés aux implants métalliques utilisés dans les os, comme les implants dentaires ou les prothèses de hanche. Ces implants servent à remplacer une articulation, combler des pertes osseuses ou stabiliser des fractures. Actuellement, les échecs d'implants sont encore trop fréquents et difficiles à prévoir. Ces échecs nécessitent des opérations supplémentaires qui présentent des risques, causent de la douleur et entraînent des coûts importants. Premier objectif : Améliorer les implants. Il est important de travailler sur l'amélioration de la surface du titane (un métal compatible avec le corps) pour que les implants s'intègrent mieux dans l'os. Les implants actuels présentent certaines limites qui doivent être surmontées. Deux modifications de la surface des implants sont étudiées : • L'ajout de polymères qui réduisent le risque d'infection • Un revêtement en diamant pour augmenter la durée de vie des implants. Avant d'utiliser ces implants chez les humains, leur efficacité doit être confirmée. Deuxième objectif : Mieux comprendre la régénération osseuse. Aujourd'hui, il n'est pas possible de reproduire par ordinateur la façon exacte dont l'os interagit avec l'implant. Pour concevoir de meilleurs implants, nous devons étudier comment ils se comportent dans des conditions réelles. En développant des modèles informatiques il est possible d’identifier les facteurs qui déterminent le succès d'un implant. Pour vérifier que ces modèles sont corrects, il est nécessaire d’avoir des données expérimentales fiables.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer les connaissances sur le comportement des implants en titane dans l'os et à produire des bénéfices pour les patients, les hôpitaux, l'industrie médicale et les services publics. Trois avancées principales sont attendues: 1. Faire progresser la recherche fondamentale en implantologie osseuse. En tant que chercheurs, il est important de comprendre pourquoi certains implants en titane s'intègrent bien dans l'os et d'autres non. À court terme, ce projet permettra d'identifier les facteurs qui déterminent le succès d'un implant, comme le contact avec l'os et la résistance à l'arrachement. À moyen terme, ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des cellules osseuses dans la zone autour de l'implant et l'importance de certaines protéines, ainsi que l’évolution des propriétés mécaniques pendant que l'os se remodèle autour de l'implant. À long terme, cette recherche pourrait permettre de développer des méthodes qui réduisent le besoin de tests sur les animaux, et les connaissances seront transférées vers l'industrie médicale. 2. Améliorer la conception et les performances des implants. Ce projet va tester deux nouveaux types d'implants avec des avantages précis : créer des implants qui durent plus longtemps, ce qui réduit le besoin de les remplacer et améliorer les propriétés qui combattent les bactéries pour diminuer le risque d'infection autour de l'implant. Ces améliorations auront des effets positifs pour les patients - moins d'opérations supplémentaires seront nécessaires - et également le système de santé - les coûts des soins médicaux seront réduits. À long terme, ce projet permettra de transférer les découvertes vers les entreprises qui fabriquent des implants médicaux. Cela encouragera l'innovation dans la conception des implants et dans les méthodes de fabrication. 3. Développer des outils pour aider les chirurgiens. À court terme, les résultats de ce projet pemettront de fournir aux chirurgiens des informations précises pour choisir les implants les plus adaptés à chaque situation. À moyen terme, ces travaux aideront au développement de techniques pour suivre l'intégration des implants, comme l'échographie qui permet d'évaluer la stabilité de l'implant. À long terme, ces avancées devraient contribuer à réduire les dépenses de santé publique liées aux complications des implants.

Procédures

Implantation de max 4 implants dans les 2 fémurs et les 2 tibias sous anesthésie générale et locale une fois, durée 60 min. Administation de marqueurs flurorescents sur animal vigile, 3 fois (à 2 semaines puis 4 semaines d’intervalle), durée 3 min à chaque fois.

Impact sur les animaux

Les potentielles nuisances associées à cette procédure sont les suivantes : Concernant l'alimentation, les animaux peuvent présenter une diminution d'appétit due à la douleur, au stress généralement limitée au 24h post-chirurgie. La mobilité peut également être réduite limitant l'accès à la nourriture et à l'eau. Cette mobilité réduite peut également limiter la capacité des lapins à se toiletter correctement, notamment les membres postérieurs dans les 2-3 jours post-chirurgie. En termes de confort, les lapins peuvent ressentir des douleurs post-opératoires aiguës ou chroniques. Une infection de la plaie, une fracture osseuse ou une luxation articulaire au niveau du genou restent possibles bien que rares. Enfin, les manipulations, les interventions pré et post-opératoires, l'anesthésie et le réveil peuvent provoquer de l'anxiété, du stress ou de la peur de façon transitoire chez les animaux.

Devenir

Afin de caractériser la cicatrisation osseuse, la mise à mort de l'ensemble des animaux du projet est nécessaire afin de prélever les os et les implants impliqués.

Remplacement

Cette recherche sur les implants médicaux accorde une priorité à la limitation du nombre d'animaux utilisés et à la réduction de leur souffrance en privilégiant les méthodes alternatives disponibles. Toutefois, certains aspects essentiels de la recherche sur les biomatériaux nécessitent encore le recours à des modèles animaux pour garantir la sécurité et l'efficacité des dispositifs développés. En amont de l’expérimentation animale des tests in vitro sont systématiquement réalisés, incluant la caractérisation physico-chimique des implants, des cultures cellulaires pour évaluer la cytotoxicité et des tests de biocompatibilité avec des cellules osseuses. Cependant, ces méthodes ne peuvent reproduire la complexité des interactions biologiques d'un organisme vivant comme la réponse immunitaire ou les processus d'intégration tissulaire. Des modèles numériques prédictifs du remodelage osseux et des propriétés mécaniques sont également développés, mais leur validation nécessite des données biologiques fiables. Les tests sur os isolés s'avèrent inadaptés car ils ne permettent pas d'observer le remodelage du tissu osseux vivant, essentiel à l’évaluation des implants. Pour les analyses biomécaniques, les échantillons synthétiques sont privilégiés, mais la cicatrisation et la formation osseuse autour de l'implant ne peuvent être fidèlement répliquées en laboratoire. Enfin, bien que prometteuses, les technologies émergentes comme les organes sur puce ou les bioréacteurs ne sont pas encore applicables à l'interface os-implant à cette échelle, même si de nombreuses recherches sont actuellement en cours pour développer ces alternatives.

Réduction

Cette étude sur les implants osseux met en œuvre plusieurs stratégies pour réduire significativement le nombre d'animaux utilisés tout en préservant la rigueur scientifique. Des études pilotes ex vivo ont permis d'affiner la sélection de revêtements de surface avant les tests in vivo. Des études pilotes in vivo réalisées précédemment ont confirmé la biocompatibilité de l’approche de greffage de polymère sur un nombre d’animaux restreint. Le protocole expérimental a été optimisé pour réduire le nombre d'animaux nécessaire, notamment en utilisant des implants de petite taille permettant de tester plusieurs conditions sur le même animal. Chaque lapin recevra plusieurs implants, avec à la fois des implants contrôles et des implants modifiés, ce qui renforce la puissance statistique. Enfin, les protocoles d'analyse des échantillons explantés sont conçus pour maximiser les informations obtenues à partir d'un même échantillon, permettant de corréler plusieurs propriétés biomécaniques sans nécessiter d'essais supplémentaires.

Raffinement

La procédure chirurgicale d’insertion d’implants osseux chez le lapin intègre plusieurs mesures pour assurer le bien-être animal et limiter la douleur. Pendant les interventions, les lapins sont installés sur des matelas chauffants pour maintenir leur température corporelle. Les protocoles d'anesthésie et d'analgésie sont spécifiquement adaptés à cette espèce animale pour une gestion optimale de la douleur. En période post-opératoire, le suivi bi-quotidien de chaque animal permet d’adapter les mesures de prise en charge de la douleur grâce à une échelle de douleur adaptée au lapin, attribuant un score pour chaque animal. Des points limites spécifiques au projet sont définis et appliqués pour garantir que les animaux ne souffrent pas.

Choix des espèces

Le lapin Néo-Zélandais blanc mâle, jeune adulte représente le "gold standard" pour la recherche sur les implants osseux. Anatomiquement, son fémur et son tibia offrent des dimensions adaptées aux implants testés, avec une architecture osseuse similaire à celle de l'humain. Son métabolisme osseux est 3-4 fois plus rapide que chez l'humain, permettant d'observer l'intégration complète en quelques semaines. À ce stade de développement, la maturité squelettique est atteinte, offrant un équilibre optimal entre formation et résorption osseuse.

58 souris porteuses d'une mutation qui affaiblit leurs muscles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent 37 gavages, quatorze pesées et deux mesures de force musculaire sous anesthésie, avant le prélèvement des muscles des pattes, du cœur et du diaphragme. Le porteur reconnaît que ce modèle ne reproduit qu'une forme atténuée de la maladie humaine, sans réduction d'espérance de vie ni baisse d'activité spontanée, et en conclut que le phénotype "n'est ainsi pas dommageable". L'étude est menée pour un client dont le composé doit franchir l'étape in vivo, que le porteur qualifie d'"incontournable" pour un dossier d'essai clinique.

Objectifs

La myopathie de Duchenne est une maladie d'origine génétique induisant une dégénérescence progressive de l’ensemble des muscles de l’organisme. Elle est liée à une anomalie responsable de la production d’une protéine impliquée dans le soutien de la fibre musculaire. Chez les patients atteints de cette maladie, qui sont à 99,5% des hommes, les fibres qui constituent les muscles squelettiques et cardiaque se détériorent à chaque contraction et finissent par se détruire. Des cellules souches musculaires tentent de régénérer le tissu musculaire lésé, mais ce processus est vite débordé et la dégénérescence finit par l’emporter. Les patients atteints de la maladie de Duchenne présentent ainsi une espérance de vie très réduite, de l'ordre de 25 ans, du fait notamment de complications cardiaques et respiratoires. La recherche est ainsi très active concernant cette maladie et plusieurs pistes visant à mise au point d’un traitement curatif sont actuellement à l’étude. Néanmoins, à aujourd'hui, il n'existe aucun traitement curatif sur le marché. Néanmoins, les patients sont le plus souvent traités par des molécules anti-inflammatoires Le présent projet vise à étudier les effets d'un composé X en développement sur les symptômes musculaires liés à la myopathie de Duchenne. Le modèle employé est un modèle de mutation génétique spontanée qui présente des symptômes proches de la maladie de Duchenne chez l'humain, bien que les symptômes soient beaucoup moins prononcés. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament (Composé X) sur les capacités musculaires du modèle de maladie de Duchenne.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter les conséquences musculaires de la maladie de Duchenne chez l'humain. Alors que plusieurs molécules ont été testées ces vingt dernières années, il n'existe toujours aucun médicament curatif de la maladie de Duchenne. Il s'agit donc d'une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la maladie de Duchenne.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (14 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 3) Administration de traitements par gavage (37 administrations; durée : 1 minute); 4) Mesures in vivo de la force musculaire sous anesthésie avec réveil (2 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 20 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et les administrations de traitement par voie orale pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Enfin, bien que considéré comme un modèle de maladie de Duchenne d'intérêt, le modèle de souris utilisé présente un phénotype bien plus léger que l'humain. Ainsi, bien que présentant une moindre force musculaire que les souris non génétiquement modifiées, notre modèle génétique ne présente pas de réduction de l'espérance de vie, ni de différence dans l'activité spontanée, à la différence de l'humain. En effet, les défauts musculaires n'apparaissent que lors de tests impliquant un effort assez soutenu. Le phénotype de notre modèle n'est ainsi pas dommageable.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les muscles des pattes, le coeur et le diaphragme pour des analyses fonctionnelles (mesures de force musculaire ex-vivo), et histologiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de tester, suite à une première série d'études menées in vitro, le composé sur organisme entier afin de vérifier que les effets observés sur système in vitro se traduisent effectivement en un bénéfice dans le cadre de la pathologie. Par ailleurs, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre de 12 animaux par groupes utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés et en tenant compte de l'hétérogénéité du modèle. Le groupe contrôle du modèle, constitué de souris non génétiquement modifiées, a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu que la maladie de Duchenne touche à 99,5% des garçons, l'étude sera limitée au genre mâle.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par gavage oral par des expérimentateurs parfaitement formés et rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2/3 souris par cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les procédures de mesure de la force des muscles de la patte arrière seront réalisée chez la souris anesthésié. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée .

Choix des espèces

Le modèle de souris choisi est classiquement utilisé pour étudier la dystrophie de Duchenne et pour tester des candidats médicaments au stade préclinique visant à traiter cette pathologie. Le modèle récapitule de nombreux symptômes de la pathologie de Duchenne, bien qu'il n'exhibe qu'une forme légère de la maladie comparativement à l'humain. Les souris seront reçues à 5 semaines d'âge. Cet âge a été déterminé en fonction de la cinétique des défaut musculaires observés chez le modèle employé. En effet, à partir de 12 semaines, ces souris commencent à présenter une hypertrophie musculaire. Bien que leur force musculaire reste inférieure à tout âge à celle des souris non génétiquement modifiées à tout âge, et compte tenu de la durée du traitement, nous souhaitons que les souris ne présentent pas une hypertrophie musculaire trop marquée en fin d'étude.

À J0, une injection d'iodoacétate de sodium dans l'articulation de la mâchoire, sous anesthésie générale, déclenche l'arthrose. À J60 vient une injection d'hydrogel, à J120 la pose d'une prothèse articulaire au cours d'une chirurgie de deux heures, le tout entrecoupé de trois à quatre scanners exigeant chacun deux heures d'anesthésie. 35 cochons adultes de 40 à 80 kilos traversent ces six mois dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une douleur mandibulaire persistante, une ouverture de bouche réduite, une gêne à la mastication et une perte de poids attendues, le porteur affirmant que ces études sont "indispensables" au dossier de mise sur le marché du dispositif et qu'elles ne peuvent être remplacées ni légalement, ni techniquement, ni éthiquement. Tous sont tués à la fin pour des analyses post-mortem.

Objectifs

Ce projet vise à créer un modèle d'arthrose de l'articulation temporomandibulaire chez le porc en utilisant une substance chimique, appelée iodoacétate de sodium. Ce modèle permettra ensuite de tester un nouveau gel médical contenant un anti-inflammatoire, afin d'en évaluer l'efficacité et la sécurité. Des tests ont déjà été faits sur des rats, avec des résultats encourageants, mais nous voulons maintenant utiliser ce modèle chez le porc, car son articulation temporo-mandibulaire est plus proche de celle des humains, tant en taille qu'en fonctionnement. En parallèle, nous allons tester une nouvelle prothèse innovante par son aspect « mini-invasif » et « sur mesure ». En effet, le concept de cette prothèse est réalisé à partir d’un scanner du patient (ici un notre mini-porc) afin de s’adapté à sa morphologie et ainsi de pouvoir être miniaturisé. Cela permettrait d’avoir une prothèse plus fonctionnelle et une intervention moins lourde. Cette prothèse sera implantée chez les porcs afin de vérifier si elle est bien tolérée par l'organisme et si elle fonctionne correctement. Ce test nous permettra de valider si ce concept peut être utilisé dans le futur chez l'homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Bénéfices scientifiques : • Création et validation d’un modèle d’ostéoarthrite (OA) chez le porc : Ce modèle d’OA de l’articulation temporomandibulaire (ATM) chez un grand mammifère est essentiel pour le développement de nouveaux dispositifs médicaux avant leur application clinique. La validation de ce modèle va au-delà de l'évaluation de l'hydrogel ou de la prothèse dans ce projet. Elle propose un modèle simple et reproductible d’OA de l’ATM, utilisable pour toute recherche ultérieure, notamment pour tester d'autres dispositifs médicaux dans la prise en charge des dysfonctionnements temporomandibulaires (DTM). • Acquisition de connaissances scientifiques sur l’hydrogel et la prothèse : Cette étude permettra de mieux comprendre l’efficacité de l’hydrogel chitosan/naproxène ainsi que celle de la prothèse "mini-invasive" et "sur mesure" pour l’ATM, développée dans le cadre de ce projet. En fonction des résultats obtenus in vivo, la conception de la prothèse et la formulation de l’hydrogel pourront être ajustées et optimisées. 2. Bénéfices cliniques : • Validation de l’hydrogel et de la prothèse : En validant l’efficacité de l’hydrogel chitosan/naproxène et la biocompatibilité de la prothèse "mini-invasive" et "sur mesure" pour l’ATM, ces dispositifs médicaux ont des implications cliniques potentielles importantes. Ils pourraient représenter des avancées significatives dans la prise en charge des DTM, en réduisant la douleur et en restaurant la fonction de l’appareil manducateur. • Perspectives de recherche clinique : Des résultats concluants obtenus sur grand mammifère concernant l'hydrogel pourraient ouvrir la voie à des essais cliniques à moyen terme, permettant ainsi de tester ces avancées directement sur l'homme.

Procédures

Pour la réalisation du projet, les animaux subiront quatre types d'interventions distinctes : 1. Scanners (3 scanners par animal sur 6 mois) : o Cette intervention est peu invasive et consiste en la réalisation de quatre scanners au total. o Le premier scanner sert de référence et sera utilisé comme comparateur (uniquement pour les animaux faisant parti du groupe induction du modèle). o Le deuxième scanner a pour but de confirmer la bonne induction de l'ostéoarthrite et sert de comparateur pour l’évaluation de l’hydrogel. o Le troisième scanner sera utilisé pour évaluer l’efficacité de l’hydrogel dans la deuxième procédure (uniquement pour les animaux faisant parti du groupe évaluation hydrogel). o Le quatrième scanner est réalisé pour vérifier la bonne ostéointégration de la prothèse. o Chaque scanner nécessite le transport de l’animal sous anesthésie générale jusqu’à l’appareil, suivi de l'acquisition des images. La durée totale de la procédure est d’environ 2 heures. 2. Injection de MIA : o Cette intervention vise à induire le modèle d’ostéoarthrite (OA) par une injection de iodoacétate monosodique (MIA) sous anesthésie générale. o Il s'agit d'une procédure peu invasive, réalisée par voie percutanée à J0. o La durée totale de la procédure est d'environ 30 minutes. 3. Injection de l'hydrogel (uniquement pour les animaux faisant parti du groupe évaluation hydrogel) : o Sous anesthésie générale, cette intervention permet d'évaluer la performance de l'hydrogel médical par une injection percutanée à J60. o Cette procédure, également peu invasive, est réalisée en une seule fois. o L’ensemble de la procédure dure environ 30 minutes. 4. Pose de la prothèse : o Cette procédure, réalisée sous anesthésie générale, est plus invasive. Elle consiste en la pose d’une prothèse articulaire. o En raison de son caractère invasif, les animaux bénéficieront d’un traitement analgésique ainsi que d'une antibiothérapie. o Cette intervention est réalisée à J120 et dure environ 2 heures.

Impact sur les animaux

Le projet présente plusieurs nuisances et effets indésirables potentiels, principalement liés à l’induction du modèle d’ostéoarthrite et à la chirurgie prothétique. Les principaux effets indésirables sont les suivants : • Douleur persistante au niveau de l'articulation temporomandibulaire (ATM) : La douleur, généralement légère, est due à l'inflammation initiale provoquée par l'injection intra-articulaire de MIA, suivie du développement de l'arthrose débutante. Cette douleur pourrait persister au fil du temps, en lien avec la progression du modèle d’ostéoarthrite. • Limitation des amplitudes mandibulaires : Une diminution de l'amplitude de l'ouverture buccale est attendue, en raison de l’inflammation et de la progression de l’ostéoarthrite, ce qui affecte la mobilité mandibulaire des animaux. • Perte de poids : Plusieurs facteurs peuvent contribuer à une perte de poids, notamment le stress expérimental, la limitation des amplitudes mandibulaires et la douleur à la mastication, qui pourrait affecter l'alimentation des animaux. • Complications per-opératoires lors de la pose de la prothèse (ces complications ne sont pas attendues mais possible) : o Perte sanguine : Les saignements per-opératoires sont possibles durant la chirurgie, en raison de la nature invasive de l’intervention. o Complications anesthésiques : Des complications respiratoires ou vasculaires liées à l’anesthésie générale pourraient survenir pendant la pose de la prothèse. • Complications post-opératoires suite à la pose de la prothèse (ces complications ne sont pas attendues mais possible) : o Infection et hyperthermie : Une infection au niveau de la zone opérée pourrait entraîner de la fièvre (hyperthermie) chez les animaux. o Désunion de la cicatrice pré-tragienne : Une mauvaise cicatrisation ou une désunion de la cicatrice au niveau de la zone pré-tragienne peut également constituer une complication post-opératoire.

Devenir

A la fin de la procédure, l’ensemble des animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Cette étude porte sur le développement préclinique de dispositifs médicaux destinés à l'articulation temporomandibulaire (ATM) dans la prise en charge des dysfonctionnements temporomandibulaires (DTM). Ces études animales sont indispensables pour constituer le dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché (AMM) du futur dispositif médical et ne peuvent être remplacées légalement, techniquement ou éthiquement par d'autres méthodes (tests in vitro, essais cliniques, etc.). Le modèle porcin est le plus approprié et couramment utilisé dans le cadre de l'ostéoarthrite en raison de la similitude anatomique avec l'homme, permettant ainsi une transposition fiable des résultats. De plus, les caractéristiques fonctionnelles et mécaniques de l'ATM du porc sont proches de celles de l'humain. Les tests préliminaires effectués sur des petits animaux pour l'hydrogel ont montré qu'ils ne peuvent se substituer aux études sur les grands mammifères, et la pose de prothèse ne peut techniquement pas être réalisée sur de petits animaux à cause de leur taille.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été optimisé. Ainsi, les 35 animaux utilisés pour la création du modèle ou pour tester l’hydrogel seront également réutilisés lors de la pose de la prothèse. Cependant, il est prévu d’interrompre la dernière étape (étape 3) dès que la validation de la prothèse est obtenue chez 6 animaux consécutifs. La validation de la prothèse est considérée acquise lorsqu'elle respecte les réglementations européennes en matière de mise sur le marché des dispositifs médicaux (Règlement (UE) 2017/745 relatif aux dispositifs médicaux). De plus, avant les expérimentations sur les porcs, les hydrogels ont été testés chez des rats, permettant ainsi de sélectionner les meilleurs hydrogel-candidats. Cette approche préliminaire a permis de ne retenir que les formulations les plus prometteuses, réduisant ainsi le nombre de porcs nécessaires aux tests, car seules les versions les plus performantes seront évaluées. Des moyens d’évaluation peu invasifs de l’OA, tels que le scanner ou l’examen clinique, seront utilisés afin de limiter le nombre d’animaux sacrifiés pour les analyses histologiques intermédiaires. Le nombre d’animaux du groupe témoin négatif a également été réduit, car la littérature a validé l’utilisation de sérum physiologique comme contrôle. Pour limiter le nombre d'essais par animal, la prothèse a été créée par Conception Assistée par Ordinateur (CAO), suivie d’un prototypage et réalisation d'essais mécaniques expérimentaux, permettant d'obtenir rapidement un modèle performant et adapté limitant une expérimentation animale « empirique ». Cette simulation numérique, associée à l’expertise d’une équipe chirurgicale expérimentée dans le domaine, nous permet d’optimiser les résultats attendus et de réduire encore le nombre d’animaux nécessaires, en limitant les risques d’échec lors des premières expérimentations. Le nombre d'animaux dans le groupe contrôle a été réduit, car la littérature valide l'utilisation de sérum physiologique comme contrôle. De plus, les études sur petits animaux (rats) menées sous le protocole Apafis 25897 ont permis de sélectionner les matériaux optimaux, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires pour les études chez le porc. Après euthanasie, des tissus pourront être prélevés par des utilisateurs du site pour leurs travaux nécessitant du matériel biologique porcin.

Raffinement

Le principe de raffinement sera appliqué à travers plusieurs mesures visant à améliorer le bien-être des animaux tout en garantissant la qualité des données expérimentales : • Conditions de vie optimales : Les animaux seront logés à deux par box pour leur bien-être, dans une salle à flux d’air contrôlé. Bien qu'aucune modification alimentaire ne soit prévue pendant l'induction du modèle, une attention particulière sera portée à leur capacité à s'alimenter correctement. En cas de fortes chaleurs, un glaçon enrichi sera mis à leur disposition dans le box. Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée pour habituer les porcs aux manipulations et à la présence des soignants. • Intervention sous anesthésie générale : Toutes les interventions (injections intra-articulaires, mesures de l'ouverture buccale, scanners, pose de prothèse) seront réalisées sous anesthésie générale, précédées d'une prémédication. Lors des interventions chirurgicales, des protocoles stricts d'asepsie seront suivis pour minimiser les risques d'infection post-opératoire. • Surveillance du bien-être des animaux : Plusieurs indicateurs seront surveillés pour s'assurer du bien-être des porcs : o Poids : Le poids sera mesuré quotidiennement les jours post-opératoires, puis une fois par semaine après chaque intervention (induction et pose de la prothèse). o Température corporelle : La température sera mesurée quotidiennement en post-opératoire pour détecter toute hyperthermie, signe potentiel d’infection post-opératoire. o Plaie post-opératoire : La plaie chirurgicale sera examinée quotidiennement durant les 7 premiers jours post-opératoires, pour surveiller la présence de désunion, de saignement ou d'hématome. o Analyse comportementale : Une observation régulière du comportement des animaux sera effectuée, avec une attention particulière portée à la posture, la sociabilité et la déambulation, pour détecter tout signe de détresse ou de souffrance.

Choix des espèces

Le porc a été choisi comme modèle animal de référence pour cette étude. Parmi les grands mammifères, il est le plus couramment étudié dans le cadre de l’ostéoarthrite temporomandibulaire, en raison de sa proximité anatomique et histologique avec l'homme, permettant ainsi une transposition fiable des résultats vers l'application clinique chez l'humain. De plus, l'articulation temporomandibulaire (ATM) du porc présente des similarités fonctionnelles et mécaniques importantes avec celle de l'être humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour les études sur les dispositifs médicaux liés aux dysfonctionnements temporomandibulaires (DTM). Les modèles murins, bien qu’utiles dans d’autres types d’études, sont jugés trop petits pour la pose d'une prothèse de l’ATM. En conséquence, ils ne sont pas adaptés pour obtenir des données transférables à l’homme dans ce contexte. L'utilisation de brebis a été envisagée, mais ce modèle présente plusieurs inconvénients, notamment un manque de données préexistantes et une fragilité apparente lors des expérimentations périmandibulaires, difficultés partagées par l'équipe de la plateforme d'expérimentation animale. Les porcs seront utilisés à l’âge adulte, avec un poids situé entre 40 et 80 kg. Cela garantit que l’articulation est pleinement mature et que la croissance est terminée, évitant ainsi des biais dans les résultats liés à des modifications anatomiques dues à la croissance.

124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection par jour pendant quatre semaines sur animal vigile, avec un risque de péritonite et d'infection aux points de piqûre que le porteur reconnaît, puis passent deux tests d'agrippement forcé et deux prélèvements sanguins sous anesthésie. La dernière étape est une chirurgie de mesure de la force musculaire, sous anesthésie profonde, immédiatement suivie de la mise à mort. Deux composés ont déjà montré leur effet sur des cellules de patients, le porteur affirmant que le passage in vivo reste une étape "indispensable" avant tout essai chez l'être humain.

Objectifs

L'objectif global du projet est d'évaluer l'efficacité de molécules pharmacologiques pour la ré-expression de protéines, dans des modèles murins bien caractérisés de maladies neuromusculaires rares. Il n’existe pas, à l’heure actuelle, de traitement pour ces maladies. Des études sont en cours afin de moduler les déficits secondaires liés aux mutations mais il est pertinent de développer une approche permettant de cibler le défaut primaire (l’absence de protéine en raison de la mutation génétique) en permettant la ré-expression de la protéine déficitaire. Les molécules dont nous voulons évaluer l'efficacité in vivo ont déjà démontré, in vitro dans des systèmes rapporteurs et des lignées cellulaires issues de patients, leur efficacité. Des résultats préliminaires de pharmacocinétique ont aussi été obtenus dans des souris contrôles permettant d’affiner le déroulement de ce projet.

Bénéfices attendus

Les maladies neuromusculaires sont des maladies héréditaires rares, cliniquement et génétiquement hétérogènes. La dystrophie musculaire de Duchenne est la maladie musculaire la plus commune chez l’enfant (prévalence estimée à 1-9 / 100 000) et les dystrophies liées au déficit en collagène VI sont la seconde forme de dystrophies musculaires congénitales en Europe dont la prévalence exacte est inconnue. Environ 10 pourcent des patients portent des mutations non-sens entraînant entraînant des codons de terminaison de la traduction prématurés (PTC pour premature termination codon), et une absence de synthèse protéique. A ce jour il n’existe aucun traitement curatif pour ces maladies très invalidantes. Le besoin de développer des stratégies ciblées est donc très fort. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer le bénéfice thérapeutique de nouvelles molécules contrecarrant spécifiquement les mutations non-sens, en forçant la synthèse protéique. A long terme, ces molécules pourraient bénéficier à des patients atteints d’autres maladies génétiques causées par des mutations non-sens. Des modèles murins portant des mutations non-sens dans les gènes impliqués dans ces maladies reproduisent de nombreux défauts moléculaires et fonctionnels, et sont donc des modèles parfaitement adaptés pour l’évaluation de cette approche thérapeutique. Le bénéfice attendu est la ré-expression de la protéine ciblée qui sera détectée sur tissus prélevés en post-mortem, et qui devrait améliorer la fonction musculaire.

Procédures

Les animaux feront l'objet d'injections quotidienne (sur animal vigil car procédure très rapide), sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend moins de 2 min par souris. Deux prélèvements sanguins sont prévus, un en tout début de procédure effectué sous anesthésie (durée de l'acte moins de 5min), un autre juste avant l'euthanasie, sous anesthésie (durée de l'acte moins de 5min). Des mesures de la force musculaire seront réalisées la 1ère semaine du traitement et lors de la 3ème semaine, grâce à un test d'agrippement qui consiste simplement à faire agripper une grille par la souris au niveau de ses membres antérieurs ou postérieurs (ou les deux) en appliquant une légère traction pour mesurer la force d’agrippement. Ce test comporte 3 mesures avec une minute de repos (soit une durée de 3-4 minutes environ). Enfin, les animaux feront l'objet d'une procédure de mesure de force de muscles spécifiques des membres postérieurs, nécessitant une intervention chirurgicale sous analgésique et anesthésie profonde et qui sera immédiatement suivie par l'euthanasie des animaux avant leur réveil. La durée de l'acte chirurgical est d'environ 30min par animal.

Impact sur les animaux

Certains animaux de cette étude présentent un phénotype dommageable, qui se traduit par une atteinte musculaire lorsqu'elles sont âgées qui n’altère cependant pas la survie des animaux, ni leur mobilité ou fertilité. Elles sont viables, fertiles, et possèdent une longévité normale. Les souris feront l’objet de procédures consistant essentiellement en des étapes d’injections, puis d’un protocole d’évaluation non invasive de la force musculaire (grip strength), et enfin d’un protocole d’évaluation de la fonction musculaire. Les souris pourraient donc ressentir une légère douleur de courte durée au point d’injection/prélèvement et un stress léger lors des manipulations quotidiennes, la pesée hebdomadaire ou les périodes d’adaptation aux différentes techniques. Les injections répétées peuvent induire un risque de péritonite et les sites d’injections peuvent s’infecter. Les tests de force musculaire peuvent générer un stress et une fatigue transitoire. Des prélèvements sanguins sont aussi prévus (en vigile ou sous anesthésie) et peuvent induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. Par ailleurs, les anesthésies, effectuées dans le cadre de certains actes, peuvent induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Tous les animaux qui entreront dans ce projet seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, dans le cadre de l'évaluation d'approches thérapeutiques comme celles décrites dans ce projet, nous devons vérifier la correction des symptômes moléculaires au niveau des tissus cibles. Dans le cas des modèles que nous allons utiliser, nous devons vérifier l'efficacité de notre traitement au niveau des muscles squelettiques, à la fois d’un point de vue de la force musculaire mais aussi grâce à des marqueurs moléculaires et à la réexpression de la protéine d’intérêt. Ces études d'efficacité seront complétées par l'analyse d’un marqueur sanguin couramment utilisé pour vérifier l’état des cellules musculaires.

Remplacement

Dans un objectif de remplacement, une sélection in vitro des composés thérapeutiques dans des modèles cellulaires de la maladie est effectuée avant toute utilisation dans un organisme vivant. Les molécules dont nous voulons évaluer l'efficacité in vivo ont déjà démontré leur potentiel dans des conditions in vitro. Cependant les modèles in vitro restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas la complexité tissulaire contenant plusieurs types cellulaires qui communiquent entre eux et avec leur microenvironnement. L’évaluation in vivo de l’efficacité des différents composés thérapeutiques nécessite d’avoir recours à des modèles de souris transgéniques qui expriment la mutation d’intérêt et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. Ainsi, sur la base des tests in vitro nous avons sélectionné 2 composés montrant une efficacité sans cytotoxicité.

Réduction

Afin de réduire et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés tout en tenant compte des connaissances sur les lignées utilisées pour optimiser nos chances de détecter un bénéfice thérapeutique. Des résultats préliminaires de pharmacocinétique ont aussi été obtenus dans des souris contrôles permettant d’affiner le déroulement de ce projet, et de choisir 3 doses pertinentes. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, biologie moléculaire, histologie et ce, sur plusieurs tissus. Nos études précédentes ainsi que la veille scientifique réalisées sur la littérature scientifique rapportant des études similaires nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés. Des analyses statistiques seront réalisées pour une interprétation fiable des résultats. Au maximum 124 animaux seront utilisés pour ce projet.

Raffinement

Dans le but de raffiner le protocole, toutes les précautions seront prises afin de réduire au mieux le stress et la souffrance animale. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Pour la lignée avec phénotype dommageable, des croquettes de nourriture seront laissées sur la litière. Pour les animaux très jeunes, de la nourriture hydratée sera laissée sur la litière des cages. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Des mesures de raffinement adaptées aux différentes procédures et corrélées avec les nuisances ou effets indésirables attendus seront mises en place afin de limiter la douleur et le stress : Lors de l’anesthésie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour éviter une chute de la température corporelle. Les sites d’injection seront examinés chaque jour afin de détecter tout signe d’inflammation ou d’infection, ce qui serait alors discuté avec la cellule du bien-être animal et le vétérinaire. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis.

Choix des espèces

Des modèles murins, drosophile et/ou poisson-zèbres ont été décrits pour la dystrophie musculaire de Duchenne et d'autres myopathies. L’approche thérapeutique testée cible un type particulier de mutation qui ne sont reproduites que dans des modèles murins. Le premier modèle utilisé présente un phénotype musculaire adapté pour l’évaluation d’approches thérapeutiques car permettant une meilleure évaluation des bénéfices fonctionnels. Ce modèle présente un phénotype dommageable. Le second modèle est le seul modèle disponible présentant une mutation essentielle pour le projet. Ce second modèle ne présente pas de phénotype dommageable. L’utilisation de ces modèles permettra de valider l’approche thérapeutique dans les tissus affectés. Les animaux sont utilisés à 4-6 semaines, stade auquel la croissance musculaire est bien avancée et afin de réaliser sans problème les injections.

1 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir un composé pendant dix-sept semaines et subir jusqu'à 342 tests, dont 210 observations de l'écartement des doigts, des électromyogrammes sous anesthésie répétés plusieurs fois par semaine et jusqu'à un prélèvement sanguin par jour. Les molécules testées peuvent altérer la fonction neuromusculaire, ce que le porteur reconnaît comme une gêne dans les activités quotidiennes des rats. Il prévoit quarante études de présélection sur les cinq ans de l'autorisation, et revendique un "important besoin d'innovation" dans le champ des maladies neuromusculaires.

Objectifs

La fonction neuromusculaire désigne l'interaction entre le système nerveux et les muscles, permettant le mouvement et le maintien de la posture. Les troubles de cette fonction sont à l’origine de nombreuses pathologies qui se manifestent par divers phénomènes : - des faiblesses musculaires comme dans les myopathies, les neuropathies périphériques ou la Sclérose latérale amyotrophique - des contractures ou des rigidités (spasticité) comme dans les paralysies cérébrales, certaines atteintes auto-immunes, les spasmes musculaires et les dystonies - ou d’autres type de dysfonctionnements sensori-moteurs comme dans la myasthénie, la Rhabdomyolyse, les Fibromyalgies et les syndromes de fatigue chronique. Le manque de médicaments disponibles pour traiter efficacement les pathologies neuromusculaires laisse de nombreux patients sans options thérapeutiques adaptées, il y a un important besoin d'innovation dans ce domaine. Ainsi le développement de nouveaux médicaments doit permettre de ralentir la progression des symptômes et améliorer la qualité de vie des patients. Il est également nécessaire de développer des thérapies pour traiter les causes sous-jacentes des maladies neuromusculaires. Et finalement, la recherche doit se concentrer sur des traitements symptomatiques efficaces pour réduire les contractures, la douleur et la fatigue musculaire. Dans ce projet nous proposons de tester l’efficacité de nouveaux composés sur la fonction neuromusculaire normale afin de présélectionner les projets qui pourront être poursuivi dans des modèles pathologiques de maladies neuromusculaires. Pour ce faire nous allons utiliser plusieurs méthodes complémentaires, largement décrites et utilisées : la quantification de l’écartement spontané des doigts, la répartition du poids de l’animal sur ses pattes lors de ses déplacements libres, l’activité locomotrice, la coordination motrice, la force musculaire et l’activité électrique neuro-musculaire selon une méthode proche de celle utilisée chez l’homme.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour les troubles neuro-musculaires.

Procédures

Dans ce projet, différents paramètres electromyographique et comportementaux sont évalués plusieurs fois au cours du temps. Pour tous les tests sauf l’observation de l’écartement des doigts, nous ferons au maximum 4 mesures le jour de l’induction, puis 4 mesures par semaine pendant 2 semaines et enfin nous passerons à un maximum de 2 mesures par semaine. L’observation de l’écartement des doigts pourra être fait au maximum 6 fois le jour de l’induction, puis 2 fois par jour pendant une semaine dont une fois en même temps que la prise du poids et enfin une fois par jour. En considérant un début de traitement des animaux en J0, les animaux subiront l’administration du composé à tester sur une durée maximale de 17 semaines selon ses caractéristiques pharmacologiques ainsi qu’un maximum de 342 tests dont 210 écartements des doigts. La réalisation d’électromyogramme prend environ 5-7 min en prenant en compte la partie anesthésie et la partie mesure, l’observation de l’écartement des doigts prend moins de 30 secondes et le test le plus long dure 20 min. En parallèle des tests des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon la voie de prélèvement choisie, les animaux pourront subir au maximum un prélèvement sanguin par jour en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, les molécules testées peuvent induire une modification de la fonction neuro-musculaire, ce qui pourrait gêner les animaux dans leurs activités quotidiennes. De plus, le test d’EMG (électromyogramme) nécessite une anesthésie générale qui peut créer un certain inconfort pour l’animal (désorientation lors de la phase de réveil). Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des nuisances au niveau des sites d’administration et de prélèvement : comme une douleur passagère, une irritation, une inflammation, une induration, un risque de fausse route et/ou un phénomène de mâchonnement (pour la voie oral). Un stress lié aux différentes manipulations (administration, contention, …) et aux tests comportementaux peut également apparaitre.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances à long terme.

Remplacement

La fonction neuro-musculaire est complexe et met en jeu plusieurs acteurs (muscles, nerfs, …) et différents processus de contrôle. De plus même si les tests in vitro fournissent de nombreux renseignements sur l’activité des molécules sur les systèmes cellulaires, les effets sur l’activité musculaire, la diffusion à travers l’organisme et la durée d’action dans le temps à l’échelle de plusieurs semaines ne peuvent être appréhendés que chez l’animal par des mesures directes sur le muscle ou des mesures comportementales. Pour toutes ces raisons, actuellement aucune méthode de remplacement n’est disponible pour étudier la problématique du présent projet (électromyographie). Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. Si des informations préalables existent pour permettre de tester seulement 8 animaux par groupe, nous le ferons. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Des analyses statistiques finales seront réalisées. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 40 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial pendant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre notamment une inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations : nourriture et eau ad libitum, température et hygrométrie strictement contrôlées. Les animaux seront hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres par un enrichissement important du milieu. L’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton et des boules de bois pouvant servir de matériel de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours, ils sont habitués à la manipulation par l’Homme deux fois par semaine et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours de traitement ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les mesures électromyographiques sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane/oxygène) afin d’éviter que l’animal ne bouge, l’administration par voie intra-veineuse ainsi que certains prélèvements de sang. Le prélèvement de liquide céphalo rachidien est fait sous analgésie et anesthésie profonde sans réveil. Les observations d’écartement des doigt sont autant que possible couplées à la prise du poids afin de ne manipuler les animaux qu’une seule fois. Les animaux sont systématiquement habitués à la pièce de comportement au moins 1h avant la mise en œuvre des tests. De plus, quand c’est possible, d’une période de familiarisation/d’apprentissage de l’environnement. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA (structure du Bien Être Animal) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Etant donné que ces études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures mais que nous n’étudions pas de pathologie liée à l’âge, des animaux adultes seront utilisés (début des traitements à 7-8 semaines).