Troubles musculosquelettiques

Opérées sous anesthésie générale pendant une heure à une heure et demie pour recevoir des vis en titane dans la hanche et dans la mâchoire, 140 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont tuées à la fin du projet pour prélever les os de la mâchoire et de la hanche. Les implants testés sont des produits orthopédiques ou dentaires en cours de développement ou déjà développés mais pas encore commercialisés, et leur nombre est fixé par la norme ISO 10993. Le porteur annonce une intervention unique sans autre nuisance que le stress de contention, puis énumère œdèmes, hématomes, hémorragies mineures, toux d'irritation jusqu'à la pneumonie, douleurs postopératoires avec boiteries ou difficultés à mastiquer, et fractures au niveau des trous de forage.

Objectifs

Le développement de biomatériaux implantables destinés à l’usage médical chez l’Homme passe par une évaluation de leur compatibilité tissulaire conforme à la norme iso 10993 et de leur efficacité. Les matériaux évalués dans ce projet sont des implants osseux à usage orthopédique ou en dentisterie, soit en cours de développement soit déjà développés mais non encore commercialisés. L'objectif primaire du projet est d'évaluer la stabilisation osseuse obtenue suite à l'utilisation de ces implants dans un modèle chirurgical ovin. L'objectif secondaire est de démontrer l'efficacité de la réponse osseuse/tissulaire suite au placement de ces implants dans des os de densités différentes (donc à différentes localisations), à différents temps de la guérison osseuse. Ces implants sont généralement différents types de vis en titane.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont le développement de nouveaux implants orthopédiques ou dentaires (ou leur validation pour mise sur le marché) permettant une cicatrisation osseuse plus rapide ou plus efficace chez l'Homme, lors de la prise en charge de fractures par exemple ou de chirurgie maxillo-faciale/dentaire.

Procédures

En dehors du stress lié à la contention, les brebis seront soumises à une unique procédure chirurgicale sous anesthésie générale consistant en l'insertion d'implants chirurgicaux (vis) dans la hanche et la machoire. La procédure chirurgicale dure de 1h à 1h30.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus incluent : - le stress lié à la manipulation et la contention, ainsi qu'au réveil de l'anesthésie générale, - des oedèmes, des hématomes ou des hémorragies mineures liés à l'intervention chirugicale (fréquents), - des problèmes respiratoires (de la toux d'irritation-peu fréquent- jusqu'à la pneumonie- rare-) liés à l'intubation et la ventilation lors de l'anesthésie, - des douleurs post-opératoires se manifestant soit par des boiteries, une difficulté à se déplacer (quand intervention sur les membres) ou des difficultés à mastiquer (quand intervention sur la machoire), occasionnellement - des infections de plaies, bien que rares - une fracture à partir des trous de forage des vis ou un bris d'implant bien que très rares.

Devenir

Les brebis sont mises à mort à la fin du projet afin de prélever les tissus osseux d'intérêt (machoire et hanche) pour analyses.

Remplacement

Les implants ont préalablement subi des tests biomécaniques (comme la résistance à la rupture, la dureté, l'élasticité...) in vitro. Cependant, la résistance à la corrosion et la biocompatibilité ne peuvent être évalués que dans un organisme entier. De plus, même lorsque le risque pour les patients est pressenti comme faible, cette évaluation d'efficacité et de sécurité préalable ne peut pas règlementairement être remplacée par des essais ex vivo.

Réduction

Le nombre d’implants à placer est défini par la norme ISO 10993 ou sa version américaine intitulée "FDAGLP biomaterials testing". Afin de répondre à cette norme tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires, nous nous sommes basés sur la littérature et des tests statistiques. Ces éléments nous ont conduit à considérer le nombre maximal de 7 individus par temps d'étude pour obtenir des résultats exploitables tout en prenant en compte le risque d'exclusion de certains animaux en raison de variations anatomiques ou de descellement d'implant.

Raffinement

Les animaux sont hébergés selon les standards de leur espèce dans une animalerie dont les paramètres d'ambiance sont contrôlés. Les brebis sont hébergées en groupes sociaux de 7 à 10 individus sur litière de copeaux de pin avec distribution de foin à volonté et pierres à sel à disposition. Une période d'acclimatation de minimum 7 jours est respectée et mise à contribution pour l'habituation des animaux à la présence et au contat de l'Homme lors du change des animaux et par la distirbution de granulés. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale volatile (dont les paramètres sont surveillés pendant toute la durée de la chirurgie), avec administration d'un antalgique de niveau 3. Cet antalgique est associé à un anti-inflammatoire. Les animaux sont installés sur un tapis chauffant tout au long de la procédure chirurgicale. Un traitement antibiotique est également effectué afin de limiter les risques d'infection aux sites chirurgicaux. Les animaux font l'objet d'une évaluation de leur comportement, de leur confort et des sites chirurgicaux a minima deux fois par jour pendant la période post-opératoire. Des points-limites précoces et adaptés ont été définis à la fois pour la période per-opératoire (suivi anesthésique et des événements chirurgicaux) et pour la période post-opératoire (état général, activité, éventuelle boiterie ou difficulté à s'alimenter ou à se déplacer) et seront appliqués.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet est celle recommandée par la norme iso 10-993 et les critères de choix des espèces sont les suivants : les ovins sont utilisés dans de nombreuses procédures impliquant une cicatrisation très longue ou des techniques chirurgicales identiques à celles utilisées chez l’Homme lorsque ces dernières ne peuvent être mises en œuvre chez le lapin. Les brebis utilisées doivent avoir un poids d'environ 70 kg pour mimer les contraintes rencontrées chez l'Homme, pour un âge moyen de 3-4 ans (adulte). Les brebis âgées de plus de 7 ans sont exclues afin d'éviter la variabilité/le biais d'une cicatrisation retardée en raison de l'âge.

Des aiguilles plantées dans le muscle, suivies d'une décharge électrique qui perce la membrane des cellules : 433 souris Swiss femelles subissent une électroporation intramusculaire dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des muscles injectés. Chaque animal peut recevoir jusqu'à huit anesthésies et sept injections intrapéritonéales, et passe chaque jour un test de réflexe, le "Digit Abduction Score". Le projet compare dix candidats myorelaxants à ARN messager destinés à traiter la dystonie et la spasticité chez l'humain. Le porteur classe le stress lié à ce test quotidien parmi les seules nuisances attendues, et le décrit ailleurs comme bref, indolore et peu stressant.

Objectifs

Cette étude a pour objectif dans un premier temps, de développer un modèle d’administration par électroporation (une brève impulsion électrique perce la membrane, permettant ainsi la délivrance de substances thérapeutiques à l'intérieur des cellules) de nos candidats médicaments pour le traitement des maladies la contraction musculaire, puis dans un deuxième temps, les comparer par dose réponse pour le traitement des maladies la contraction musculaire. Au final, l’ensemble de ces données de caractérisation serviront de base à la conception d’essai clinique chez l’homme. Nous démontrerons les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Ce projet expérimental d’optimisation concerne 10 produits d’intérêt identifiés suite à nos travaux précédents.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques (ayant un effet sur tout l'organisme) comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après administration, et dont les effets seraient durables. Ainsi, ce projet apportera les bénéfices suivants : - Traitement efficace plus rapidement. - Traitement efficace sur du long terme.

Procédures

Anesthesies pour injection, mesure bioluminescence et éléctroporation, au maximum 8 anasthesie de 10-15 min. 1 injection intramusuclaire (durant anesthesie) : 30 sec pendant l'anesthesie. 7 injections intraperitoneale maximum : 30 sec 1 éléctroporation (injection d'aiguilles en intramusculaire, suivi d'une onde éléctrique) : 30 sec pendant l'anesthesie. Mesure du "Digit Abduction Score" tous les jours, 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les seules nuisances attendues sont : - les douleurs associés aux injections (dans ce projet une injection intra-musculaire puis maximum 7 intrapéritonéal) - Stress associé au test du « Digit Abduction Score» - Stress lié aux anesthésies multiples

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront mis à mort. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. De plus, dans ce projet, les muscles injectés seront prélevés pour des analyses ultérieurs.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (processus par lequel un médicament ou une substance active se déplace à travers les différentes phases du corps qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés. Le test "Digit Abduction Score" nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.

Réduction

Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 5 animaux par groupe. Nous réaliserons lors la première section, des expérience sur seulement 3 animaux, afin de vérifier la bonne tolérance et la validité des constructions réalisées.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 5 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle "Digit Abduction Score" chez la souris : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous anesthésie par un expérimentateur entraîné, et les mesures de "Digit Abduction Score" sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. De plus, pour les étapes d’imagerie, les animaux seront également anesthésiés. Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine si l’étude est plus longue). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Souris swiss femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (20g) et 8-9 semaines maximum en fin d’expérimentation (35-40g). La souris à été choisi dans ce projet car elles expriment les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire il existe une limite de diffusion dans les tissus. Le test du "digit abduction score" chez la souris, déjà éprouvé lors d'études précédentes, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests "Digit Abduction Score". Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus, chacune passant deux séances d'imagerie par semaine pendant six semaines, soit jusqu'à douze anesthésies, avec pose d'un cathéter dans la veine de la queue. Deux injections de collagène à trois semaines d'intervalle déclenchent chez elles une polyarthrite, puis viennent deux injections de traitement par semaine pendant trois semaines et une contention quotidienne de cinq à dix minutes. Le porteur indique que le gonflement des articulations peut gêner le déplacement et la préhension jusqu'à faire perdre du poids, et que l'irritation au point d'injection peut conduire l'animal à se gratter jusqu'à la plaie. Il attend de ces expériences l'identification d'une cible thérapeutique et le repositionnement d'un anticancéreux déjà commercialisé, bénéfices renvoyés à des étapes ultérieures quand les gonflements et les plaies, eux, sont prévus au protocole.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, caractérisée par une atteinte articulaire, souvent bilatérale et symétrique, évoluant par poussées vers la déformation et la destruction des articulations atteintes. Il s’agit du plus fréquent rhumatisme inflammatoire chronique, touchant entre 0,5 et 1% de la population mondiale, et touchant 4 fois plus les femmes que les hommes. Les premiers symptômes se traduisent par des douleurs articulaires, des rougeurs et des gonflements des articulations, en particulier des mains et des pieds. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement de la PR, seulement des moyens de soulager la douleur ou réduire l’intensité des symptômes. Il est donc nécessaire de développer des médicaments à la fois efficaces contre la progression de la maladie mais aussi ses symptômes, ainsi que de développer des moyens diagnostics précoces. Différentes études suggèrent que la modulation d’EZH2, une histone méthyltransférase, pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour le traitement de la PR. En effet, des études in vitro et in vivo ont démontré que l’inhibition d’EZH2 permet de réduire l’inflammation dans de nombreux contextes physiopathologiques. Plus particulièrement, le laboratoire a démontré que dans des modèles murins d’arthrose, une autre pathologie articulaire inflammatoire, l’inhibition d’EZH2 par un médicament, l’EPZ-6438, permet de réduire la progression de la maladie (destruction de l’articulation), et la douleur associée. Dans la mesure où, comme dans l’arthrose, l’expression d’EZH2 est augmentée dans l’articulation des patients arthritiques, il a été proposé que l’inhibition d’EZH2 pourrait réduire la progression de la PR. Dans ce contexte, le but de cette étude est d’évaluer l’effet de l’inhibition d’EZH2 dans un modèle expérimental de PR afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’envisager de nouvelles pistes de traitements. L'étude du rôle d'EZH2 sera effectuée in vivo grâce à l'imagerie à particules magnétiques (MPI). L'objectif est de tester un nouvel agent de contraste qui a montré une sensibilité de détection en MPI supérieure à celle en imagerie par résonnance magnétique (IRM).

Bénéfices attendus

Plusieurs laboratoires dont le nôtre ont démontré que l’inhibition d’EZH2 par l’EPZ-6438 ralentit la progression de l’arthrose en réduisant la dégradation du cartilage et l’inflammation articulaire, et améliore les fonctions motrices des souris ainsi que la douleur, ce qui suggère qu’EZH2 serait une cible thérapeutique intéressante dans le traitement de cette pathologie articulaire. Pour cette étude, nous nous attendons à des effets comparables voire plus prononcés dans la mesure où l’arthrite est une maladie articulaire à forte composante inflammatoire. Les bénéfices attendus sont donc l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la PR, capable d’induire une réduction des signes cliniques (réduction du gonflement et de l’inflammation sur les pattes des animaux). L’EPZ-6438 étant un traitement déjà utilisé en médecine humaine pour le traitement de certains cancers, une stratégie de repositionnement du médicament dans cette nouvelle indication pourrait être envisagée. Par ailleurs, la mise au point du protocole d’imagerie de l’inflammation par imagerie à particules magnétiques (MPI) devrait permettre d'imager de manière ultrasensible, spécifique et précoce l'inflammation articulaire. Cette nouvelle méthode de diagnostic pourrait être extrêmement utile pour le suivi des troubles articulaires inflammatoires.

Procédures

Les animaux recevront deux injections à 21 jours d’intervalle pour induire l'arthrite ainsi que deux injections par semaine pendant 3 semaines pour le traitement. Une contention régulière afin d’observer les animaux et les signes cliniques de la maladie seront nécessaires quotidiennement (5-10 min par jour et par animal). Des examens d'imagerie auront lieu deux fois par semaine pendant 6 semaines (moins d'une heure par jour, sous anesthésie). Pour l’imagerie, la pose d’un cathéter dans la veine de la queue est nécessaire (intervention sous anesthésie, 15min environ).

Impact sur les animaux

L’induction de l’arthrite se traduit généralement par le gonflement des articulations des pattes ainsi que par l’apparition de rougeurs. Ces gonflements, s’ils atteignent un stade élevé, peuvent induire des difficultés à se déplacer et à la préhension et donc des difficultés à se nourrir et à une réduction de la mobilité. Une perte de poids significative peut donc être attendue. L'injection de collagène à la base de la queue peut générer une irritation conduisant la souris à se gratter au point d'injection et à former des plaies. Aucun effet secondaire ou mortalité n’ont été mis en évidence sur les souris après administration répétées du médicament, l'EPZ-6438, par gavage ou par injection dans la littérature. Les examens d’imagerie se dérouleront sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux dans la queue pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de procéder à des analyses des tissus.

Remplacement

Au sein de notre projet scientifique, nous étudierons l’impact d’un traitement contre la polyarthrite rhumatoïde, une maladie inflammatoire chronique qui touchent plusieurs articulations. La physiopathologie est complexe avec l’implication de nombreuses cellules immunitaires (lymphocytes, macrophages, etc) et articulaires (chondrocytes, synoviocytes), ne permettant pas de récapituler l’ensemble des processus in vitro. Ainsi, l’impact du traitement par un inhibiteur d'EZH2, l’EPZ-6438 sur l’évolution de la maladie (notamment gonflement des pattes et rougeurs) ne peut pas être évalué sur un modèle ex vivo ou in vitro. Des tests in vitro ont été réalisés sur l'agent de contraste utilisé en imagerie à particules magnétiques et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro et il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour les molécules d'adhésion présentes au niveau des vaisseaux sanguins exprimées en conditions inflammatoires. D'après des études pilotes, on sait que l'agent de contraste cible efficacement l'inflammation dans d'autres pathologies et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie MPI pour révéler l'inflammation articulaire dans la polyarthrite rhumatoide. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Dans des études précédentes, il a été montré que 10 animaux par groupe étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Cependant, les données cliniques de l’arthrite indiquent que le sexe a une influence significative sur le développement de la pathologie et notamment la mise en place de la réponse du système immunitaire, nous souhaitons donc étudier l'effet du sexe. Nous prévoyons donc des groupes composés de males et de femelles. Deux modèles d'arthrite seront étudiés : un modèle de poussée et un modèle précoce de la maladie. L'incidence de l'arthrite dans le modèle de poussée est compris entre 80 et 100% tandis que l'incidence de l'arthrite dans le modèle précoce est compris entre 30 et 60%. Ainsi, un total de 60 animaux pour le modèle de poussée est nécessaire, mais 120 animaux seront nécessaires pour le modèle précoce de la maladie. Un total de 180 animaux sont donc nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Des points limites ont été definis pour chaque procédure. Les gestes susceptibles d’entraîner une douleur ou un stress seront réalisés sous anesthésie et l'administration d'un analgésique est prévu pour limiter la douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de matériel de nidication et igloo en carton).

Choix des espèces

Deux souches de souris seront utilisées dans ce projet. L'injection de collagène de type II chez la souris DBA/1J entraine le développement d’arthrites sévères par réaction auto-immune, ce qui représente un bon modèle des phases de poussée de la maladie. La deuxième souche de souris mime les phases précoces de la maladie chez l’homme, avec l’apparition d’une arthrite moins sévère. Les souris utilisées sont âgées de 7 semaines, elles sont alors adultes et ont fini leur croissance.

2 640 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une aiguille est enfoncée dans un disque intervertébral du dos ou de la queue pour y créer une lésion, opération de dix à quinze minutes, suivie trois semaines plus tard chez certains d'une seconde injection dans le disque abîmé, pour tester des molécules ciblant les cellules sénescentes. Le porteur décrit une douleur discale pouvant conduire l'animal à la prostration, à l'isolement et à l'arrêt du toilettage social, et une douleur nerveuse liée au passage de l'aiguille le long des racines spinales. Il conclut qu'il est "inévitable" de travailler sur des animaux et que le recours aux rongeurs est "nécessaire", les explants de disque de queue de bœuf restant réservés à l'étude de la diffusion des molécules.

Objectifs

La lombalgie chronique constitue la principale cause d’années de vie vécues en situation de handicap et affecte plus de 600 millions de patients dans le monde. Si elle peut avoir plusieurs causes, la Dégénérescence du Disque Intervertébral (DDIV) en représente le contributeur majeur. La physiopathologie de la DDIV associe la mort cellulaire, l'inflammation et la dégradation de la matrice extracellulaire, mais n'est pas encore totalement comprise. Bien qu'il existe des traitements symptomatiques pour limiter la douleur, il n'y a actuellement aucune stratégie thérapeutique permettant de freiner les mécanismes dégénératifs et d'atténuer l'inflammation à l'origine de la maladie. Parmi les acteurs centraux de l'apparition et de la progression de la DDIV, un mécanisme de survie aberrante des cellules discales, appelé « sénescence », semble directement impliqué et pourrait représenter une cible thérapeutique pertinente. L’objectif premier de cette étude est de mieux comprendre la physiopathologie de la DDIV en examinant la présence et l’activité des cellules sénescentes dans et autour du disque intervertébral, au cours du développement de la DDIV post-traumatique chez le rat, que ce soit dans le dos ou sur la queue. Le second objectif est d’évaluer la pertinence thérapeutique d’un ciblage spécifique de ces cellules sénescentes (élimination ou modulation). Ces deux modèles de dégénérescence discale post-traumatique sont induits chirurgicalement de manière mini-invasive afin de choisir le modèle avec les lésions les plus reproductibles et la dégénérescence la plus proche de la physiopathologie humaine, tout en limitant le risque de dommages liés à la procédure. Par la suite, des thérapies innovantes visant les cellules sénescentes, appelées 'sénothérapies' seront évaluées contre la DDIV du rat. Ces thérapies seront soit administrées à l’ensemble du corps, soit localement, dans le disque malade, à l’aide de gels injectables. L'évaluation se fera sur le modèle jugé le plus approprié, soit dans le bas du dos, soit dans la région de la queue.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comparer les deux modèles dégénérescence discale post-traumatiques mini-invasifs décrits chez le rat et d’évaluer l’expression de cibles thérapeutiques au cours du développement de la pathologie. La prise en charge des patients atteints de dégénérescence discale reste insuffisante, ne traitant que les symptômes, ce projet permettra également de réaliser une preuve de concept avant les essais cliniques, pour évaluer l'efficacité de thérapies innovantes contre la DDIV post-traumatique chez le rat. Ces thérapies seront distribuées sous formes libres à l'échelle du corps entier ou bien transportées dans des gels injectables afin d’être administrées localement dans le disque malade. Ce traitement adapté pour la clinique pourra à terme être proposé pour des essais cliniques vétérinaires chez le chien malade, puis des essais en clinique humaine.

Procédures

Une partie des animaux sera soumise à une chirurgie d’environ 10-15 minutes consistant à introduire une aiguille dans l’espace intervertébral afin de créer une lésion dans des disques intervertébraux au niveau dorsal ou dans la queue de l’animal. Certains animaux entrant dans un protocole de test de molécules thérapeutiques seront 3 semaines plus tard soumis à une deuxième intervention: soit à une seconde chirurgie mini-invasive unique d’environ 10-15 minutes permettant l'injection intra-discale de molécules thérapeutiques à effet prolongé ; soit à une injection systémique unique intra-péritonéale de quelques secondes de molécules thérapeutiques.

Impact sur les animaux

Des nuisances modérées pour les animaux sont à attendre des procédures mises en place dans ce projet. Lors du développement de la dégénérescence, de la douleur discale peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration, diminuer son activité, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions, par exemple le toilettage social. L'intervention mini-invasive et percutanée minimise les risques d'infection au niveau des points de piqûre les rendant très peu probables. De plus, une douleur secondaire d’origine nerveuse (neuropathie), due au passage de l’aiguille le long des racines des nerfs spinaux pourrait être observée, n'allant pas au delà de 5 jours suivant la procédure dans le bas du dos de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Cette étude prend en considération la règle des 3R. Les expérimentations in vitro ne permettent pas à l’heure actuelle de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs tissulaires du disque intervertébral (noyaux pulpeux, anneau fibreux, plaques cartilagineuse, os vertébral…) et du système vasculaire. Il est ainsi inévitable de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors du développement de la maladie discale. Le recours aux rongeurs est ici nécessaire afin de valider le potentiel thérapeutique de nouvelles biothérapies. Il n’existe pas, pour le moment, de solution de remplacement in vitro complet, ni de modèles invertébrés.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les potentielles biothérapies seront testées et sélectionnées pour leur efficacité en amont, in vitro, sur les différents types cellulaires du disque intervertébral. Un modèle ex vivo d’explants de disque entier de queue de bœuf sera également utilisé pour étudier la biodistribution des biothérapies dans le tissu spécifique du disque intervertébral. In fine, uniquement les biothérapies les plus prometteuses seront utilisées dans cette étude in vivo. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au strict minimum. Ce nombre, fixé ici à 10 animaux par groupe expérimental, est calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative entre les groupes expérimentaux si celle-ci à un sens biologique dans le contexte spécifique de la maladie discale.

Raffinement

Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage avec de l’enrichissement physique (tubes en carton) pour stimuler leurs comportements naturels. Les animaux seront maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. De façon générale, un suivi hebdomadaire des rats permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi postopératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 5 premiers jours pour s’assurer de la bonne cicatrisation et de l'absence de douleur, puis une fois par semaine. Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront sous couverture anesthésique et analgésique adaptées, en pré- et post-opératoire. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, et la phase de réveil seront effectuées sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Dans le cas de la dégénérescence discale, plusieurs modèles animaux post-traumatiques ont été développés, le rat restant la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette maladie, devant la souris, le lapin et la brebis. Le rat présentant le double avantage de présenter une taille de disques intervertébraux compatible avec une injection intra-discale et une voie d’abord accessible à l’échelle expérimentale, sans le recours à de gros animaux. Notre protocole débutera chez des rats arrivés à maturité squelettique et âgés de 12 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de la dégénérescence discale est possible et documentée dans des études précédentes.

Injectés à trois mois d'âge par voie intraveineuse, mis à jeun douze heures avant chaque anesthésie, ponctionnés du liquide céphalo-rachidien six à neuf fois, passés quatre à cinq fois à l'IRM pendant une heure trente et sous immunosuppresseur oral pendant toute l'étude : quatorze chiens porteurs d'une mutation reproduisant la maladie de San Filippo A vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le traitement immunosuppresseur peut provoquer diarrhées, vomissements, atteintes cutanées et sanguines, prises en charge par un traitement symptomatique. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des injections, des prises de sang ni des ponctions de liquide céphalo-rachidien. Trois ou neuf mois après l'injection, les quatorze chiens sont tués pour prélever leurs tissus.

Objectifs

La Mucopolysaccharidose de type IIIA (MPS3A), ou maladie de San Filippo A, est une maladie rare dite de surcharge, et qui affecte 0.7 à 1.8 nouveau-nés pour 100000 naissances en Europe. La maladie survient lorsque des enzymes nécessaires à la dégradation et au stockage de molécules de sucres complexes font défaut à l'organisme : ainsi ce déficit engendre une accumulation toxique de ces molécules dans de nombreux organes dont le foie, la rate et surtout le cerveau. La maladie de San Filippo A est caractérisée par une atteinte sévère du Système Nerveux Central qui débute le plus souvent entre 2 et 6 ans avec un retard du développement psychomoteur, des troubles du comportement, un défaut d'attention, une hyperactivité et une agressivité. La régression des acquisitions intellectuelles est rapide et sévère. Dans la phase finale les patients deviennent grabataires et développent une encéphalopathie profonde. Le décès survient généralement au décours d'une surinfection respiratoire avec une espérance de vie de l'ordre de 15 à 20 ans. Actuellement, aucun traitement approuvé ne peut aboutir à la guérison. Les seuls soins apportés visent à traiter les complications liées à la maladie et améliorer la qualité de vie des malades et de leur entourage. Le produit de thérapie génique que nous souhaitons tester vise à corriger le déficit de l'enzyme à l'origine de la maladie. L'objectif principal de ce projet est de réaliser une étude de biodistribution, d'efficacité et d'évaluation de la tolérance chez le modèle animal du chien MPS3A après administration par injection intraveineuse du produit de thérapie génique, sur un suivi de 3 mois et de 9 mois post-injection.

Bénéfices attendus

Le syndrome de San Filippo A, MPS3A, est la conséquence d'une accumulation de molécules du sucre, partiellement dégradées, dans les tissus de l'organisme. Ceci est le fait d'une mutation génétique qui affecte l'activité d'une enzyme nécessaire pour cette dégradation. Ces molécules mal dégradées, qui ne peuvent pas être éliminées, entravent le développement normal du cerveau puis détruisent les cellules du cerveau. Les premiers symptômes de la maladie associent un retard du développement cognitif associé à une hyperactivité, un comportement autistique et des troubles du sommeil. Chez l'Homme, ils apparaissent habituellement avant l'âge de 3 ans. Par la suite, l'atteinte neurologique entraîne une déficience intellectuelle et une réduction des capacités motrices qui aboutissent à la perte d'autonomie vers l'âge de 10 ans et un décès survenant le plus souvent entre 15 et 20 ans. Actuellement, cette pathologie est incurable, le traitement n'est que symptomatique. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l'efficacité des produits thérapeutiques, études de dose...). Le présent projet vise à évaluer l'efficacité d'un traitement de thérapie génique sur des chiens atteints de la maladie. C'est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints. Elle permettra ainsi de générer toutes les données précliniques, mais aussi la tolérance globale de l'approche avec le suivi par imagerie par résonnance magnétique, et des bilans sanguins réguliers. Le but global de l'étude est de soutenir la demande d'un essai clinique de phase I/II chez des patients souffrant de la maladie de San Filippo.

Procédures

Chaque animal inclus dans cette étude sera soumis aux interventions suivantes : Procédure d'injection intraveineuse : Effectuée sur animal vigile ou sédaté (si besoin). Durée de l'intervention : environ 30 minutes. Prélèvements sanguins : Effectués soit vigiles sous légère contention (animaux sociabilisés et habitués aux manipulations), soit sous anesthésie (anesthésie destinée à une imagerie par résonance magnétique ou prise de sang). Total de 6 prélèvements sanguins pour les animaux suivis 3 mois, et 9 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l'acte : environ 5 minutes. Prélèvements de liquide céphalo-rachidien : Effectués par ponction, réalisés par des vétérinaires spécialistes sous anesthésie générale et analgésie. Total de 6 prélèvements pour les animaux suivis 3 mois, et 9 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l'acte : environ 10-15 minutes. Imagerie par résonance magnétique : Effectuée sous anesthésie générale et analgésie. Total de 4 examens pour les animaux suivis 3 mois, et 5 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l'acte : environ 1h30. Traitement immunosuppresseur : Administré par voie orale tout au long de l'étude. Durée de l’acte : environ 1 minute.

Impact sur les animaux

L'injection du vecteur thérapeutique par voie intraveineuse et les prélèvements sanguins sont des gestes peu invasifs pour lesquels aucun effet indésirable n'est attendu. Ces 2 actes seront réalisés sur animal vigile, sauf si une anesthésie est déjà prévue pour les autres gestes. Il est à noter qu’un jeûne d’une durée maximale de 12 heures sera mis en place avant leur anesthésie. Une nausée pourrait survenir dans les heures suivant l’anesthésie, cependant il est important de noter que les injections n’auront aucun impact sur leur consommation alimentaire ou hydrique. Avec ce protocole et par les expériences passées, il n'est pas attendu de réaction douloureuse. Les tests d’imagerie, examens non invasifs, seront réalisées sur les animaux anesthésiés. Les ponctions du liquide céphalo-rachidien seront réalisées par des vétérinaires spécialistes maitrisant ce geste technique sous anesthésie générale et analgésie adaptées. Il n'est pas attendu d'effet indésirable. Afin de limiter toute réaction inflammatoire au moment des injections du produit thérapeutique, un protocole d’immunosuppression sera mis en place tout au long de l'étude. Des effets secondaires d'ordre digestif tel que diarrhée et vomissements peuvent parfois être observés ainsi que des atteintes cutanées et hématologiques. Un traitement symptomatique pourra alors être mis en place avec un suivi rapproché des animaux concernés. Le phénotype ne devient dommageable qu'après 18 mois d’âge, voire après. L'évolution de la maladie est très lente. Si le phénotype se déclarait, il restera léger au vu de la période de suivi des animaux. De plus des examens cliniques et spécifiques sont prévus régulièrement et permettront d'adapter les soins.

Devenir

Les 14 animaux inclus dans ce projet seront suivis pendant une période de 3 ou 9 mois post-injection du produit thérapeutique, puis euthanasiés pour permettre le prélèvement de tissus post-mortem. La fin de protocole et euthanasie de tous les animaux est indispensable pour obtenir ces prélèvements, nécessaires à la réalisation des analyses moléculaires et histologiques prévues dans le cadre du projet. Ces analyses ne peuvent être effectuées sur des animaux vivants.

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des vecteurs. Nous arrivons ici aux dernières étapes précliniques nécessaires pour une demande d'essai clinique de phase I/Il pour lesquelles l'utilisation d'un modèle gros animal, permettant la mise en place d'approche chirurgicale similaire à celle effectuée sur les patients dans l'essai clinique est indispensable et nécessite donc l'utilisation de cette lignée de chiens MPS3A. Il n'existe pas aujourd'hui de méthode alternative pour tester l'effet d'un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l'efficacité du transfert du gène dans une lignée cellulaire in vitro n'est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L'animal est le seul organisme vivant permettant d'étudier l'impact d'un transfert du gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d'administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation d'un modèle animal, d’autant plus un chien MPS3A, est donc essentielle pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement de la Mucopolysaccharidose de type 3A.

Réduction

Un total maximum de 14 animaux sera utilisé comprenant : 3 animaux injectés avec du véhicule (2 euthanasiés 3 mois post injection et le troisième euthanasié 9 mois post injection), 9 animaux recevant l’administration du vecteur dont 6 euthanasiés à 3 mois post injection et 3 euthanasiés à 9 mois post injection, et 2 animaux non injectés (un suivi 3 mois et un suivi 9 mois). Ce nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience de précédents projets et des données sur les autres modèles, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Une analyse statistique sera réalisée pour les mesures où le nombre d'échantillons permettra d'avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, et sont réalisées par du personnel formé et expérimenté. Le bien-être animal passera notamment par : 1. De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur. Pour leur bien-être les animaux seront hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté (jeux divers disponibles dans les box, sociabilisation avec présence humaine, éducation, toilettage). Cet enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. 2. Un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement). 3. Afin de suivre efficacement l'état de santé des animaux et mettre rapidement en place une action, une liste de points limites a été établie. Elle permet de définir une conduite à tenir afin d'arrêter, minimiser ou diminuer toute souffrance à l'aide de mesures comme un traitement adapté ou une mise à mort anticipée. 4. La mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire, antibiothérapie, immunosuppressions, etc.). De plus, le nombre d'anesthésies sera minimisé en regroupant les procédures (prise de sang - volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire, ponction du liquide céphalo-rachidien ) au sein d'une même anesthésie.

Choix des espèces

Le choix du chien comme modèle d'étude (mix beagle et Zealand Huntaway) est basé sur la prédisposition raciale à la même mutation génétique chez l'homme lors de la Mucopolysaccharidose de type III A. Chez le chien, une anomalie génétique conduit comme chez l'homme au développement anormal du cerveau et à des troubles moteurs. De plus la transmission génétique est la même que chez l'homme en étant autosomale récessive. Le choix de l'espèce est également basé sur son homologie avec l'homme, au niveau des plans anatomiques et fonctionnels du système nerveux central et du point de vue immunitaire (tolérance semblable). Dans l'étude clinique, les enfants seront traités entre 4 et 12 mois. Les animaux seront injectés à l'âge de 3 mois et 15 mois. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles" ou « jeunes adultes », et mimant donc le stade auquel des patients atteints du syndrome de San Filippo pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants de moins de 5 ans).

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.