Troubles musculosquelettiques
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- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation de la biodistribution de nanoparticules dans un modèle murin sain
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Pour cribler des nanoparticules censées mieux acheminer des médicaments vers les muscles, 195 souris saines sont utilisées, toutes tuées à l'issue, 105 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 90 d'un niveau modéré. Elles sont rasées sur le ventre, reçoivent jusqu'à deux injections intramusculaires ou intraveineuses sous anesthésie, ou des injections intranasales sur animal vigile, et pour certaines une injection de toxine provoquant une lésion musculaire. Le porteur situe le bénéfice pour les personnes atteintes de dystrophie musculaire à deux étapes de distance, après des tests sur des animaux dystrophiques puis chez l'humain. Il indique que ces nanoparticules ont déjà fonctionné sur des cultures de cellules musculaires, tout en jugeant l'animal "indispensable" pour étudier des "organismes entiers".
Objectifs
Les dystrophies musculaires (telles que la myopathie de Duchenne) sont des troubles entrainant un handicap physique qui touche 20 personnes sur 100 000 dans le monde. Malgré une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques des dystrophies, presque aucun traitement n'est disponible. Ce projet vise à améliorer le transport des molécules médicaments en utilisant des nanoparticules vers les zones musculaires cibles pour augmenter leur efficacité.
Bénéfices attendus
Le présent projet permettra de démontrer l'efficacité des nanoparticules pour véhiculer des molécules médicaments dans les muscles d'animaux sains et en régénération musculaire. Ces études devraient permettre de cribler les nanoparticules qui ont une meilleure affinité pour le muscle. Ensuite elles pourront être testé chez des animaux avec dystrophie pour pouvoir ensuite être testé chez l'humain.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux seront rasés sur la face ventrale pour des raisons d'imagerie des animaux. Ensuite, certains animaux seront soumis à des injections intramusculaires ou intraveineuses (maximum 2 par animal) qui seront réalisées sous anesthésie gazeuse (temps d'anesthésie inférieur à 10 minutes). D'autres animaux seront soumis à des injections intranasales sur animaux vigiles (inférieur à 2 min) afin de permettre l'inhalation des nanoparticules.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, du stress peut être induit aux animaux lors des anesthésies et des contentions pour la réalisation des injections. De plus, une légère douleur passagère peut être induite à la suite de l’injection du traitement. L’injection de la toxine induisant la lésion musculaire peut induire une légère douleur musculaire. L'injection intranasale se faisant sur animal vigile peut occasioner du stress chez l'animal. Le rasage de la face ventrale de l'animal peut occasioner du stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée des différents organes prélevés qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Des études préliminaires ont démontré l'efficacité de nos nanoparticules pour délivrer des molécules thérapeutiques dans des cultures de cellules musculaires. Pour aller plus loin, l'utilisation d'animaux est indispensable pour ce projet car il vise à démontrer et optimiser l’efficacité thérapeutique de nanoparticules pour traiter préférentiellement les muscles tout en limitant leur impact sur les autres organes. Il est donc nécessaire de pouvoir étudier l'effet de ce traitement sur des organismes entiers.
Réduction
L'utilisation des animaux est réduite au nombre minimal et nécessaire pour l'obtention de données expérimentales statistiquement exploitables. Ce projet étant conçu par étapes successives, l'obtention de résultats positifs sera nécessaire pour passer à l'étude suivante. L'efficacité des nanoparticules ne sera pas uniquement étudiée au niveau du muscle mais également pour tous les organes vitaux, ainsi si ces nanoparticules démontraient une possible efficacité dans un organe spécifique autre, cela pourrait conduire à l'établissement de potentielles nouvelles applications.
Raffinement
Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage et de bien-être afin d'enrichir l'environnement des souris (incluant boules de coton, dôme et roue). Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Durant toute la durée des protocoles les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bien-être général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. Les souris devant être rasées sur la face ventrale, du coton sera placé dans les cages. Lors de l'injection d'une lésion musculaire dans la patte arrière de certains animaux, ceux-ci auront à disposition de l'eau gélifiée ainsi que des croquettes humidifiées dans leur cage pour éviter de devoir se dresser.
Choix des espèces
La structure et le fonctionnement du tissu musculaire de la souris sont très proches de ceux de l'homme. La souris représente donc un modèle expérimental privilégié pour les investigations des maladies musculaires survenant chez l’homme. Les souris utilisées seront adultes, âgées de 8 à 12 semaines, car à ce stade les souris ont un système nerveux et musculaire entièrement développé, ce qui permet des études plus précises et plus pertinentes de la progression des maladies et des traitements potentiels.
Evaluation de la biodistribution et de l’efficacité de nanoparticules lipidiques comme vecteur de thérapie génique dans un modèle murin de la Dystrophie Musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
718 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la dystrophie musculaire de Duchenne, elles subissent jusqu'à huit anesthésies générales par animal pour des injections et des séances d'imagerie, ainsi qu'un rasage et la pose d'une boucle à l'oreille. Le porteur teste des nanoparticules censées transporter une thérapie génique vers les muscles à la place des virus. Il présente l'ensemble comme une "preuve de concept" préclinique, sans bénéfice direct pour les patients à ce stade.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique mortelle entrainant un handicap physique qui touche 5 personnes sur 100 000 dans le monde. Malgré une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques de cette pathologie, presque aucun traitement n'est disponible. Les thérapies géniques utilisant des virus inactivés peuvent induire des effets toxiques et ne sont pas applicables à tous les patients. Ce projet vise à améliorer le transport des thérapies géniques en utilisant des nanoparticules à la place des virus vers les zones musculaires cibles pour augmenter leur efficacité et réduire les effets toxiques. Pour cela, nous utiliserons 2 modèles de souris de la myopathie de Duchenne : un modèle léger et un modèle modéré.
Bénéfices attendus
Le présent projet permettra de fournir une preuve de concept pré-clinique de l’efficacité thérapeutique de nos nanosystèmes pour délivrer la thérapie génique dans un modèle de souris de la myopathie de Duchenne, en vue de fournir des traitements innovants potentiellement transférables chez les patients.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux seront rasés sur la face ventrale pour des raisons d'imagerie sous anesthésie générale et juste après cela, les animaux seront soumis à une injection intramusculaire ou intraveineuse (temps d'anesthésie total inférieur à 5 minutes). Les animaux seront imagés chaque jour durant les 7 jours suivant l'administration des nanosystèmes sous anesthésie générale (temps d'anesthésie inférieur à 2 minutes). Au total, 8 anesthésies générales par animale seront donc réalisées pour les étapes d'injections et imageries. Les animaux seront identifiés par pose d'une boucle d'identification à l'oreille.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, du stress peut être induit aux animaux lors des anesthésies et des contentions pour la réalisation des injections. De plus, une légère douleur passagère peut être induite à la suite de l’injection du traitement. Le rasage de la face ventrale de l'animal ainsi que la pose de la boucle d'identification à l'oreille peut occasioner du stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée des différents organes prélevés qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Des études préliminaires ont démontré l’efficacité de nos nanoparticules pour délivrer des molécules thérapeutiques dans des cultures de cellules musculaires et chez la souris saine. Pour aller plus loin, l’utilisation d’animaux dans un modèle pathologique de la maladie est nécessaire pour démontrer l’efficacité thérapeutique de nos nanoparticules. Il est donc nécessaire de pouvoir étudier l’effet de ce traitement sur des organismes entiers.
Réduction
L’utilisation des animaux est réduite grâce des outils statistiques au nombre minimal et nécessaire pour l’obtention de données expérimentales statistiquement exploitables. Le projet étant conçu par étapes successives, si aucun effet bénéfique n’est observé sur le modèle léger de la maladie, il ne sera pas poursuivi sur le modèle modéré et également l'obtention de résultats positifs sera nécessaire pour passer d'une étude à la suivante.
Raffinement
Durant toute la durée des protocoles les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bien-être général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. Les souris devant être rasées sur la face ventrale, du coton sera placé dans les cages. Pour les animaux présentant une expression modérée de la maladie, ceux-ci seront maintenus jusqu'à l'âge de 5 mois avant qu'ils développent une expression aggravée de la maladie entravant leur qualité de vie. Les études histologiques et moléculaires permettront d'évaluer l'efficacité du traitement.
Choix des espèces
La structure et le fonctionnement du tissu musculaire de la souris sont très proches de ceux de l'homme. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour les investigations de la physiopathologie des maladies musculaires survenant chez l’homme. Les modèles de souris pertinents utilisés présentent des signes histologiques légers ou modérés de la pathologie des patients DMD dès l’âge de 2 mois. Pour les animaux présentant une expression modérée de la maladie, ceux-ci seront maintenus jusqu'à l'âge de 5 mois avant qu'ils ne développent une expression aggravée de la maladie entravant leur qualité de vie.
Evaluation sous-cutanée de la biocompatibilité et de la dégradation d’hydrogels injectables chez la souris C57BL/6
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie, chacune reçoit quatre injections d'hydrogels sous la peau du dos, avant une mise à mort échelonnée de 24 heures à 4 semaines pour prélever les matériaux et les tissus environnants. Le projet évalue la tolérance et la vitesse de dégradation de ces gels en vue d'applications allant de la régénération osseuse au comblement des rides. Le porteur affirme que les processus inflammatoires ne sont pas modélisables in vitro, ce qui justifie selon lui le recours à la souris.
Objectifs
L'étude de la littérature et nos études préliminaires in vitro ont montré l’intérêt de l'utilisation d'hydrogels comme nouveaux biomatériaux pour l'ingénierie tissulaire. De nombreuses études soulignent désormais l’importance de développer des matériaux ayant une vitesse de dégradation adaptée, et l’importance de la capacité des cellules à interagir et/ou à remodeler ces matériaux pour régénérer des tissus. L'objectif de ce projet est d'étudier la biocompatibilité de nouvelles associations d'hydrogels pour l’ingénierie tissulaire en conditions plus physiologiques que la culture in vitro. Le système inflammatoire et immunitaire joue en effet un rôle majeur dans la réponse de l'hôte dans le cadre des biomatériaux complexes. L'utilisation d'un modèle murin nous permettra de visualiser la réponse inflammatoire, paramètre majeur en vue d'une potentielle application chez l'Homme. Un deuxième objectif est d’étudier la vitesse à laquelle les hydrogels sont dégradés en conditions physiologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre l’influence de différentes formulations d’hydrogels sur les processus inflammatoires qui interviennent suite à l’implantation de ces matériaux, mais également sur les processus mis en jeu pour les dégrader. Ainsi, les résultats de cette étude devraient permettre de choisir des formulations d’hydrogels pertinentes pour des applications précises de médecine régénératrice, telles que la régénération de l’os et du cartilage mais également pour les comblements de rides et le remodelage corporel.
Procédures
Sous anesthésie gazeuse, le dos des souris sera tondu, désinfecté, puis les souris recevront chacune 4 injections en sous-cutané au niveau dorsal de nos formulations en conditions d’asepsie. Chaque injection sera très rapide, environ 10 secondes. Les souris seront ensuite surveillées jusqu’à leur réveil qui aura lieu environ 5 min après le début de l’anesthésie. Elles seront observées quotidiennement les 2 premiers jours suivant l’intervention, puis 2 fois par semaine ensuite par les expérimentateurs en plus de la surveillance quotidienne réalisée par le personnel de l’animalerie, afin de vérifier qu’elles ne présentent pas de signes de douleur ou d’infection au niveau du site d’injection. Les souris seront ensuite euthanasiées 24 h, 72 h, 1 semaine ou 4 semaines après l’intervention. Les hydrogels et leurs tissus environnants seront ensuite explantés pour réaliser des analyses histologiques qui permettront d’évaluer la biocompatibilité et la vitesse de dégradation de ces biomatériaux.
Impact sur les animaux
L’injection sous-cutanée est un acte mini-invasif qui est déjà pratiqué par notre laboratoire depuis plusieurs années, et qui ne cause habituellement pas de douleur chez les animaux. Si tel était le cas les souris recevraient une dose d’analgésique pour pallier à la douleur. Les souris peuvent également ressentir une gêne dû à l’emplacement des hydrogels au niveau dorsal mais rien qui n’altererait leur alimentation ou leurs déplacements au delà de la simple gêne.
Devenir
Afin d’évaluer la vitesse de dégradation des matériaux et leur biocompatibilité, il est nécessaire de récupérer les matériaux ainsi que les tissus environnants. Pour cette raison, tous les animaux devront être euthanasiés à l’issue de la procédure.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro ont été réalisées pour simuler une dégradation enzymatique des hydrogels. Ces études ont permis de sélectionner un nombre limité de formulations pertinentes pour nos objectifs de contrôle de la dégradabilité. Pour ce qui est de la biocompatibilité, des études in vitro ont également été réalisées pour vérifier la compatibilité des cellules avec les différentes formulations. Le remplacement de l'animal pour cette expérimentation n’est toutefois pas réalisable car les processus inflammatoires et immunitaires sont complexes et font appel à des systèmes non modélisables in vitro.
Réduction
Quatre injections seront réalisées par animal, ce qui limite le nombre nécessaire de souris pour ces expérimentations. La réalisation de ces 4 injections a montré une très bonne tolérance dans les expérimentations précédentes réalisées au sein du laboratoire. Par ailleurs, plusieurs types d’analyses (analyses d’imagerie, histologie, immunohistochimie) seront réalisées sur un même échantillon pour répondre aux deux questions posées par cette étude en même temps, ce qui diminuera aussi le nombre d’animaux nécessaires. Nous réaliserons 8 injections par condition, ce qui nous permet depuis déjà de nombreuses années de mettre en évidence des résultats statistiquement différents, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour cette étude, nous avons choisi d'injecter les biomatériaux à l'aide d'une aiguille sous anesthésie gazeuse, ce qui permet de limiter le stress qui pourrait être causé par l’injection. De plus, l’injection est un procédé qui permet de limiter l'inflammation du site d'implantation, car c'est un acte mini-invasif. Après l’intervention, Les souris seront observées par les expérimentateurs quotidiennement 48h après l’intervention, puis deux fois par semaine ensuite pour s'assurer de leur bien-être. Si toutefois un signe de mal-être ou de douleur était observé, les animaux recevront une dose d’analgésique. Nous avons en effet mis en place des points limites adaptés, une grille de score et un arbre décisionnel nous permettant d’agir si le moindre signe de douleur venait à apparaître.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin immunocompétent est essentielle pour visualiser la réponse inflammatoire, paramètre majeur en vue d'une potentielle application chez l'Homme. Les études seront réalisées avec des souris adultes, c'est-à-dire, âgées de 12 semaines. Cela correspond à de jeunes adultes avec une croissance terminée, une maturation sexuelle et un potentiel de régénération conservé.
Hydrogénothérapie et mesure de la biodistribution chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
200 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie unique pouvant durer jusqu'à trois heures, avec l'implantation de sondes destinées à mesurer la répartition du dihydrogène dans les organes, et le porteur signale des risques de détresse respiratoire et d'hémorragie. Le projet cherche à décrire la distribution et l'élimination du H2 selon la voie d'administration, présenté comme un candidat médicament. Le porteur affirme qu'aucun modèle sans animaux ne peut remplacer la complexité du corps et qualifie cette étape d'"incontournable".
Objectifs
Le dihydrogène (H2) est un candidat médicament très intéressant de par ses effets bénéfiques dans le traitement des maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénératives, troubles métaboliques ou encore du cancer. La petite taille de l'H2 lui permet de diffuser facilement dans les tissus et les organes. Lors de précédentes études, l'évolution de la concentration en H2 dans le coeur et dans le sang, pendant une administration par inhalation, a été explorée chez le rat. Au cours de ce projet, l'évolution de la concentration en H2 sera mesurée grâce à une sonde implantée dans différents tissus cibles. La présente étude permettra de déterminer la distribution et la vitesse d'élimination de l'H2 dans les différents organes suite à son administration par différentes voies et de qualifier chaque voie d'administration sur un plan qualitatif et quantitatif.
Bénéfices attendus
Ce projet est une étape incontournable pour la mise au point de nouvelles thérapies basées sur l'H2 qui permettront de soigner des maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénératives, troubles métaboliques ou encore le cancer.
Procédures
Chaque animal subira une intervention chirurgicale unique d'une durée maximale de 3 heures. Un même animal sera soumis à une anesthésie complémentée avec une analgésie, suivie d'une administration d'H2 par différentes voies possibles. La quantité d'H2 distribuée dans différents tissus sera mesurée à l'aide d'une sonde. Au terme de la mesure ou des trois heures, l'animal sera mis à mort sans réveil préalable.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent présenter des signes de détresse respiratoire ou des hémorragies.
Devenir
La procédure proposée est en classe "sans réveil", la mise à mort des animaux est donc incluse dans cette procédure et inévitable du fait du caractère lésionnel des abords chirurgicaux et de l'utilisation des sondes de mesure.
Remplacement
La présente étude a pour objectif de caractériser précisemment la distribution de l'H2 dans les différents organes et son élimination suite à un traitement à l'H2. Actuellement, il n'est pas possible de remplacer la complexité du corps humain par des modèles n'utilisant pas d'animaux, d'où la nécessité de leur utilisation dans ce projet.
Réduction
Un maximum de 200 rats sera utilisé dans ce protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux il est prévu d'effectuer les mesures d'H2 dans plusieurs organes par animal car nous disposons de plusieurs sondes. Il est envisagé qu'une dizaine de modes d'administration d'H2 seront testés, chaque groupe expérimental sera constitué de 20 animaux (10 contrôles et 10 traités ; prenant en compte une éventuelle mortalité due à l'opération d'environ 10%). Ce nombre d'animaux permettra de réaliser un test statistique afin de valider nos résultats. De plus, des animaux venant d'autres protocoles de contrainte légère à modérée pourront être utilisés.
Raffinement
Le projet est mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. L'ensemble des personnels impliqués est à jour des formations réglementaires exigibles pour les manipulations sur des animaux vivants. Le rat correspond à l'espèce animale la plus pertinente dans ce type d'étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. L'intégralité des gestes sera réalisée sous anesthésie générale complémentée par une analgésie.
Choix des espèces
Les similitudes d'anatomie et de physiologie entre le rongeur et l'Homme permettront d'obtenir une comparaison fiable des données obtenues et une meilleure compréhension de la distribution de l'H2 dans l'organisme. De plus, le diamètre des sondes utilisées (1,1-1,6 mm) est compatible avec la dimension des organes cibles de l'étude. Nous utiliserons des rats adultes de minimum 7 semaines pour les mâles et 10 semaines pour les femelles (d'un poids corporel supérieur à 300g). Ce sont les animaux les plus couramment utilisés en pharmacologie de sécurité.
Etude de l’impact de la perte de fonction de CFTR sur le développement de l’ostéoporose chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent le retrait chirurgical des ovaires sous anesthésie générale pour induire une ostéoporose, puis jusqu'à trois séances d'imagerie par an, pour étudier le lien entre une anomalie génétique de la mucoviscidose et la perte osseuse. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque de mortalité et prévoit d'abandonner la procédure si ce risque dépasse certains seuils. Il affirme qu'à sa connaissance il n'existe "pas d'alternative non animale efficace" et que les régulations en jeu ne sont pas modélisables sans un "animal complet".
Objectifs
L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Les patients souffrant de mucoviscidose présentent une forme particulière d’ostéoporose appelée maladie osseuse liée à la mucoviscidose. Cette maladie est due à un problème génétique dont l’effet précis sur l’os n’est pas aujourd’hui connu. Ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs a pour objectif donc de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de la problématique génétique sur la qualité osseuse, en étudiant les os de souris où l’ostéoporose sera induite par le retrait chirurgical des ovaires au cours du temps. Ces approches expérimentales permettent de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause chez la Femme, et de façon plus globale dans les deux sexes en lien avec le vieillissement de l’organisme. Ce travail permettra donc, à terme, de mieux comprendre l’impact de la problématique génétique sur les altérations osseuses dans des populations de plus en plus agées et donc de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre la pathologie osseuse liée à la mucoviscidose et plus généralement contre l’ostéoporose.
Bénéfices attendus
L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse, ou des substituts des hormones, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques et ne présentent qu’une efficacité limitée chez les patients souffrant de mucoviscidose. Les résultats de cette étude permettront une meilleure compréhension de l’impact de la problématique génétique dans l’établissement de l’ostéoporose post-ménopause ou liée à l’age et pourront orienter vers de nouvelles pistes thérapeutiques potentielles.
Procédures
Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30 min sous anesthésie générale pour la procédure de retrait des ovaires au sein du premier établissement utilisateur. Ils seront également soumis au maximum à trois séances d’imagerie de 30 min, sous anesthésie générale, par an, au sein du second établissement utilisateur
Impact sur les animaux
Toute approche chirurgicale implique un risque de mortalité lors de l’intervention et après. Néanmoins, si la mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie est supérieure à 10% pour le groupe d’animaux ne portant pas de problème génétique et supérieure à 50% pour le groupe portant l’anomalie génétique, la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée après les interventions chirurgicales est attendue dans les tous premiers jours avant une reprise de poids classique ensuite. A notre connaissance, aucun autre effet indésirable n’est attendu.
Devenir
A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner à haute résolution et analyses histologiques et immunohistochimiques et biomécaniques.
Remplacement
A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace qui permet d’étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme, ou en lien avec le vieillissement de l’organisme. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.
Réduction
Sur la base de nos expériences précédentes, un nombre optimisé d’animaux (10 par groupe) sera employé pour ces procédures afin que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique en fin d’expérimentation. Une logique d’arrêt des procédures est de plus mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux par groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Des tests statistiques adaptés à nos effectifs seront utilisés.
Raffinement
Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de d’acclimatation d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton...) permettant aux animaux d'améliorer leur cage. A chaque intervention les animaux seront endormis afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’intervention chirurgicale pour la procédure portant sur l’ostéoporose post-ménopause, une douleur après l’opération sera anticipée avec l’utilisation de médicaments antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les deux jours suivants la chirurgie et si des signes d’inconfort étaient détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours ensuite sur la première semaine puis deux fois par semaine ensuite. Les animaux engagés pour la procédure 2 seront visités deux fois par semaine. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés après anesthésie générale. Afin de réaliser les analyses par imagerie, sur un site distant abritant la plateforme dédiée, les animaux seront transportés par véhicule personnel climatisé afin de consevrer une température optimale pour les animaux de 20°C, (8 km, environ 10 minutes). Le transport sera effectué dans des cages de transport propres, spécifiquement préparées, et les animaux seront remis dans des cages habituelles avec eau et nourriture à volonté dès leur arrivée. Le retour s’effectuera de la même manière.
Choix des espèces
La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures ont donné des résultats exploitables. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.
Thérapie pour la myopathie à agrégats tubulaires en utilisant des ASOs dans le modèle souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie rare, elles subissent des tests de force répétés chaque mois, des prises de sang sous anesthésie, des injections du traitement et une mesure terminale de la force musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique que les souris malades sont plus petites et présentent des atteintes du muscle, de la peau, de la rate et des os. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité du muscle ni les effets sur "l'organisme entier".
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes, et des myalgies. La majorité des patients montrent des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multi-systémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Afin de corréler les dysfonctions cellulaires avec le développement de la maladie, nous avons généré et caractérisé un modèle murin portant la mutation TAM/STRMK la plus commune. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible ni pour prévenir ni pour atténuer ces signes mutisystémiques. Nous avons l’intention d'inverser les symptômes des souris TAM/STRMK par une régulation négative d'un gène important pour la maladie, afin de fournir une approche translationnelle pour les essais thérapeutiques prospectifs chez les patients. Nous avons effectué des études cellulaires et déterminé une réduction de l'expression du gène d'intérêt. Ces résultats préliminaires nous encouragent à tester la même approche dans un modèle murin de la maladie, afin de pouvoir à la fois prévenir et inverser le phénotype multisystémique des souris TAM/STRMK.
Bénéfices attendus
Il est attendu que cette étude apporte la première preuve que ce concept de traitement soit efficace pour la TAM/STRMK. Etant donné que nos résultats préliminaires ont montré un effet au niveau cellulaire, il reste à démontrer qu'il en est de même au niveau musculaire après l'administration du traitement, avec la même efficacité. Et vérifier egalement l'amélioration du phénotype des plaquettes, de la peau, de la rate, et des os, après traitement par injections systémiques. L'étape suivante sera de vérifier l'effet thérapeutique chez des patients TAM/STRMK dans des tests cliniques ultérieurs.
Procédures
Des tests de comportement seront réalisés une fois par mois chez l’animal vivant, à partir de l'âge de 4 ou 16 semaines selon la cohorte jusqu’à 4 ou 8 mois d’âge. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque test. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test de comportement permettant de mesurer la force musculaire des pattes antérieures de l’animal dure 10 secondes, et sera répété 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes. Le test permettant de mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 24h, et sera répété 2 fois dans la vie de la souris. Le test nécessitant le prélèvement de sang est utilisé pour évaluer la coagulation sanguine et la capacité de l'organisme à former un caillot en cas de lésions vasculaires. L'animal sera anesthésié avant chaque prise de sang afin de réduire la douleur et le stress que cela pourrait causer. Le prélèvement du sang sera répété 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Des injections musculaires et intraveineuse seront réalisées pour administrer le traitement. Entre l'anesthésie et l'injection, la procédure prendra environ 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris malades sont plus petites que les souris sauvages et manifestent des problèmes dans le muscle, la rate, la peau, les plaquettes et l'os, tout comme pour l'homme. Le modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie et l'effet thérapeutique attendu des traitements étudiés. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. Les injections du traitement peuvent causer douleur chez l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour prélever les muscles nécessaires aux analyses moléculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme ce qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.
Réduction
Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une nouvelle cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en veillant à obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, de la couleur de la peau, ainsi que l'évaluation de la nécéssité de la présence d'une poche de lait sera faite tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. L'environnement sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée avant le début du suivi longitudinal pour chaque test. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Si l'un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
Les souris sont nécessaires pour ces expériences afin de nous permettre d'évaluer les changements des propriétés physiologiques des différents muscles et organes après une modification génétique. Le modèle murin nous permet d'étudier l'amélioration potentielle du phénotype musculaire, ainsi que du phénotype observé sur d'autres organes, dans ce modèle de maladie murine multisystémique. Nous devons réaliser des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur des espèces plus éloignées de l'homme, car la structure musculaire diffère davantage. C'est pourquoi nous proposons d'utiliser des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires pour réaliser ces techniques. Les tissus de souris peuvent ensuite être utilisés pour d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et réduisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal, caractérisé par une faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît à l'âge de 2 mois et s'accentue avec l'âge, présentant un phénotype modéré à l'âge de 9 mois. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu'à 4 mois, puis à partir de 16 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement de la maladie), afin d'observer le développement des souris après le traitement.
Essai pré-clinique d’immunothérapie de la fibrose chez le chien modèle de myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Jusqu'à 14 chiens vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance sévère, les chiens malades tués en fin de suivi pour prélèvements et les chiens sains compagnons proposés à l'adoption. Les chiens atteints de myopathie de Duchenne subissent 38 prélèvements sanguins, quatre prélèvements urinaires, trois biopsies musculaires, des IRM et une chimiothérapie préparatoire, avec fièvre, perte d'appétit et risque de cystite hémorragique ou de syndrome de relargage de cytokines. Le porteur teste des cellules CAR-T contre la fibrose musculaire, en visant une "preuve de concept" pré-clinique. Il retient le chien comme le modèle reproduisant le mieux la maladie humaine.
Objectifs
En cancérologie, l'une des approches thérapeutiques actuellement utilisées est basée sur l'utilisation de cellules CAR-T (lymphocytes T tueurs =sous-population de globule blanc) modifiés artificiellement pour cibler des marqueurs tumoraux spécifiques. Les globules blancs du patient sont isolés par une procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple, puis modifiés ex vivo pour cibler un marqueur spécifique de la tumeur à traiter. L'idée d'appliquer cette méthode à d'autres contextes pathologiques dans lesquels un marqueur spécifique d'une cible à détruire est exprimé, a émergé. En particulier, un marqueur spécifique de la fibrose a récemment été identifié et des cellules CAR-T pourraient être utilisées pour attaquer la fibrose qui est présente dans de nombreux contextes pathologiques. Une maladie dans laquelle une fibrose s'installe et entraîne une perte de fonction majeure est la myopathie de Duchenne. Chez le chien modèle de cette maladie, une fibrose s'installe dans les muscles et le coeur, comme chez les patients humains, et il a été démontré que le marqueur de la fibrose est bien présent dans ces tissus. L'objectif de ce projet est de déterminer si le ciblage de ce marqueur par des cellules CAR-T permet de réduire la fibrose et d'améliorer la fonction musculaire chez des chiens atteints de myopathie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir une preuve de concept pré-clinique sur l'efficacité du ciblage d'un marqueur spécifique de la fibrose, pour réduire la celle-ci dans la myopathie de Duchenne. Si cette stratégie s'avère efficace, cette étude ouvrira la voie à la possibilité d'utiliser ce marqueur comme une cible thérapeutique chez les patients atteints par cette maladie.
Procédures
Des prises de sang seront effectuées aux âges de 2, 4 et 5 mois, puis de manière plus rapprochée autour du traitement préparant à l'injection de cellules qui a pour but de faire chuter le nombre de globules blancs circulants, afin de suivre au plus près la formule sanguine des chiens. Puis, des prises de sang seront effectuées lorsque les chiens auront reçu une injection de leurs propres globules blancs, prélevés par une méthode s'apparentant à celle utilisée pour les dons de plaquette, et modifiés ou non. Au total, 38 prélèvements sanguins sont prévus sur les chiens, dont 28 sur chiens vigiles (temps estimé 5 minutes y compris préparation et compression pour éviter la formation d'un hématome), et 10 à un cathéter au cours d'une anesthésie générale (temps estimé moins d'une minute). Quatre prélèvements urinaires sont également prévus (prélèvement directement dans la vessie, sous anesthésie générale, durée 1 minute). Des biopsies musculaires seront prélevées chirurgicalement, à 3 reprises (temps d'intervention 30 minutes environ). En outre, les chiens subiront également, sous anesthésie générale : trois examens IRM (durée 2h00), quatre mesures de force (durée 45 minutes). Vigiles, les chiens subiront des examens cliniques et neuf tests de marche (10 minutes), de fonction respiratoire (10 minutes) et d'enregistrement de l'ECG en holter (24 heures, équipement sans fil porté par le chien).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les chiens au cours de ce projet sont de trois ordres : - Celles liées à la maladie qui touche ces animaux : troubles locomoteurs, faiblesse des muscles respiratoires et de la déglutition. Les signes cliniques seront étroitement surveillés, et les animaux seront mis à mort en cas d'atteinte d'un point limite. - Celles liées au protocole préparatoire qui a pour but de diminuer la quantité de globules blancs circulants pour permettre une meilleure efficacité des cellules CAR-T. Les principales nuisances induites sont une perte d'appétit transitoire en cours de traitement, qui répond à un traitement anti-vomitif et une journée de fièvre avec abattement associée à la baisse des globules blancs dans le sang, environ une semaine après le début du traitement. La formule sanguine et l’état général se normalisent ensuite en quelques jours. Par ailleurs, malgré les mesures préventives recommandées mises en œuvre, il ne peut être exclu qu’un épisode de cystite hémorragique (saignement de la vessie) puisse survenir, s’agissant d’une toxicité connue d’un des agents pharmacologiques utilisés. - Celles liées à la survenue éventuelle d'un syndrome de relargage de cytokines (= état inflammatoire aigu). Il s'agit d'une complication grave connue chez l'Homme des traitements par cellules CAR-T, plus probablement liée à l'action des cellules CAR-T dans un contexte cancéreux donc a priori moins probable dans le contexte présent. Ce syndrome se traduit par une fièvre, une hypotension, une élévation de marqueurs sanguins de l'inflammation et à des stades plus avancés par des troubles respiratoires et/ou neurologiques. Nous serons très vigilants quant à la survenue possible d'un tel syndrome chez les chiens traités, et administrerions un anti-inflammatoire pour traiter ce syndrome s'il survenait.
Devenir
Les animaux inclus dans la procédure 1 (étude pré-clinique proprement dite) seront mis à mort en fin de suivi pour des prélèvements larges de tissus. Les animaux inclus dans la procédure 2 (animaux sains, compagnons de ceux inclus dans la procédure 1) seront mis à l'adoption.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer une stratégie de thérapie anti-fibrose, basée sur une injection de cellules du système immunitaire modifiées pour cibler spécifiquement un marqueur de la fibrose et aller détruire les cellules responsables de cette fibrose dans l'ensemble des muscles striés. Il apparaît donc incontournable de réaliser cette étude dans un organisme entier. Des tests réalisés in vitro ont confirmé que les globules blancs modifiés pour devenir des "CAR-T" détruisent bien d'autres cellules si elles expriment le marqueur de fibrose. Reste à déterminer si dans le contexte d'un organisme entier, le comportement de ces cellules est le même et si ces cellules arrivent bien à atteindre les zones de fibrose et les détruire.
Réduction
Un effectif de 5 chiens traités par des cellules CAR-T sont nécessaires et suffisants pour démontrer une réduction de la fibrose dans les muscles au niveau de celle mesurée chez des chiens malades traités de manière chronique par le traitement de référence actuellement pour la myopathie de Duchenne. Le même effectif de 5 chiens devra être inclus dans le groupe contrôle. Cependant, le projet proprement dit débutant à l'âge de 5 mois, nous envisageons l'éventualité selon laquelle certains chiens engagés sur ce programme à l'âge de 2 mois se seront dégradés sur le plan locomoteur au point d'atteindre un point limite avant l'âge de 5 mois. Nous prévoyons donc deux chiens supplémentaires par groupe afin de nous assurer de pouvoir inclure 5 chiens dans chaque groupe. C'est donc un minimum de 10 chiens et un maximum de 14 chiens qui seront inclus dans le projet.
Raffinement
Les chiens seront évalués à l'aide de nombreuses mesures non invasives développées, pour la plupart d'entre elles, à partir de méthodes utilisées chez les patients et adaptées aux chiens. Les chiens seront hébergés en petits groupes d'âges proches et de tempéraments compatibles, avec accès à un lieu de couchage, des plateformes et des jeux variés. Ils seront sortis quotidiennement en groupes plus larges dans des espaces extérieurs. Cependant, durant une quinzaine de jours entourant le protocole de chimiothérapie et l'injection de cellules, les sorties devront être interrompues pour les protéger d'éventuelles infections opportunistes. Du temps supplémentaire sera passé par les soigneurs avec les chiens afin de remplacer cette activité habituelle par du jeu ou des caresses. Des moments d'intéractions avec l'homme seront ménagés quotidiennement (temps de jeux, caresses). Ils bénéficieront d'un suivi vétérinaire quotidien afin de suivre au plus près les éventuelles complications liées à leur maladie. Des points limites précis, adaptés à cette maladie et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis. Dans le cadre du projet, les gestes potentiellement stressants seront réalisés sous anesthésie générale, et une analgésie sera mise en place pour tout geste potentiellement douloureux. Par ailleurs, des points limites adaptés aux effets secondaires possibles et connus chez le chien du protocole de chimiothérapie ont été déterminés, et permettront, suivant le cas considéré, de soulager la souffrance des animaux le plus précocement possible par des traitements adaptés, ou de les mettre à mort sans délai.
Choix des espèces
Cette étape préclinique de validation d'une approche thérapeutique anti-fibrose en développement est prévue chez le chien. En effet, il s'agit du modèle animal qui reproduit le mieux la maladie humaine notamment sur le plan de la fibrose et de l'expression du marqueur ciblé par cette thérapie. Par ailleurs, le chien permet la mise en oeuvre des mêmes procédures que celles mise en oeuvre chez l'Homme pour le traitement par des cellules CAR-T (prélèvement des lymphocytes T par cytaphérèse et injections autologues en particulier). Dans le cadre de ce projet, les chiens seront suivis de l'âge de 2 mois à l'âge de 6.5 mois, et les injections sont prévues sur des chiens âgés de 5.5 mois. Cette tranche d'âge est basée sur le fait que la protéine cible est fortement exprimée à cet âge là chez les chiens malades, et au fait qu'à cet âge là, les chiens ont atteint une taille compatible avec les procédures mises en oeuvre (prélèvement par cytaphérèse notamment).
Elevage d’un modèle murin de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (projet Site 2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
6 020 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit expédiées, soit tuées. Il s'agit du deuxième site d'un élevage de la lignée C3-PMP porteuse d'une duplication du gène PMP22, modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, dont les souriceaux développent dès trois semaines une atteinte neuromusculaire. Le génotypage se fait par biopsie de la queue ou de l'oreille sur animal vigile. Le porteur décrit ces animaux comme produits pour un partenaire développant un traitement et affirme que le modèle in vivo ne peut être remplacé.
Objectifs
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) correspond à un groupe hétérogène de neuropathies périphériques chroniques héréditaires rares avec déficits moteurs et sensoriels. C’est l'un des troubles neurologiques dégénératifs les plus courants qui, tout en étant qualifié de rare, présente un taux de prévalence "élevé" (prévalence moyenne de 2,63 / 10 000 personnes). La CMT se caractérise par une diminution de la force musculaire et une fonte des muscles au niveau des extrémités, une déformation du pied, des douleurs musculo-squelettiques et neuropathiques, la perte de dextérité, la fatigue et la perte sensorielle. A ce jour, il n’existe aucun traitement pour inverser ou ralentir le processus de la maladie. Le but de ce projet est d’élever des modèles de rongeur pertinents pour l'étude de cette pathologie ; ces modèles peuvent développer spontanément un ou plusieurs caractéristiques du modèle ou être génétiquement altérés. Les animaux issus de ces developpements serviront à favoriser la compréhension des mécanismes pathologiques, cognitifs et comportementaux suite à ces altérations ciblées, à identifier des substrats moléculaires et biologiques caractéristiques et à développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Certaines anomalies génétiques à l’origine de la CMT entraînent la démyélinisation des nerfs périphériques. A chacun des gènes mutés entrainant la démyélinisation, correspond un sous-type de CMT. Le but de cette étude est de produire des animaux pour un partenaire cherchant à développer un traitement pharmacologique capable de diminuer le stress cellulaire associé à la duplication du gène PMP22 afin de protéger les cellules de Schwann et ainsi palier au dysfonctionnement des nerfs périphériques.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ce modèle de souris C3-PMP, au plus proche de la maladie humaine, est donc très pertinent pour le développement de traitements pharmacologiques.
Procédures
Les souris présentent un phénotype dommageable de troubles de la locomotion. Une biopsie caudale et/ou d'oreille est réalisée sur l'animal vigile pour son génotypage.
Impact sur les animaux
Ces animaux commencent à developper les premiers signes de la maladie à 3 semaines, ils développent une insuffisance neuromusculaire associée à une capacité motrice anormale, des défauts de coordination ainsi qu’une hypoactivité. Ces signes de locomotion perturbée sont observables principalement chez la femelle. Ils n'handicapent pas l'animal pour sa prise de nourriture, d'eau et ses interactions sociales. Par ailleurs, une douleur légère peut être induite lors de biopsies pour génotypage.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés soit mis à mort.
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ces hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie de CMT, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Un hébergement standard sera réalisé. Une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement dès leur naissance afin de confirmer le degré de sévérité du phénotypage de la lignée. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Si, par exemple, une difficulté de locomotion apparait, cela entrainera une facilitation à l'accès à l'eau et la nourriture directement dans la cage d'hébergement (croquettes et gel dans la cage). Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. La souris est un modèle animal simple à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elle est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, de sa courte gestation, de sa durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d'ovocytes, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Elevage d’un modèle murin de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (projet site 1)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
6 020 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit expédiées à un partenaire, soit tuées. Ce projet consiste à élever une lignée porteuse d'une duplication du gène PMP22 reproduisant la maladie de Charcot-Marie-Tooth, les souriceaux développant dès trois semaines une atteinte neuromusculaire et des troubles de la coordination. Le génotypage passe par une biopsie de la queue ou de l'oreille sur animal vigile. Le porteur indique produire ces animaux pour un partenaire cherchant un traitement pharmacologique et affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer le modèle in vivo.
Objectifs
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) correspond à un groupe hétérogène de neuropathies périphériques chroniques héréditaires rares avec déficits moteurs et sensoriels. C’est l'un des troubles neurologiques dégénératifs les plus courants qui, tout en étant qualifié de rare, présente un taux de prévalence "élevé" (prévalence moyenne de 2,63 / 10 000 personnes). La CMT se caractérise par une diminution de la force musculaire et une fonte des muscles au niveau des extrémités, une déformation du pied, des douleurs musculosquelettiques et neuropathiques, la perte de dextérité, la fatigue et la perte sensorielle. A ce jour, il n’existe aucun traitement pour inverser ou ralentir le processus de la maladie. Le but de ce projet est d’élever des modèles de rongeur pertinents pour l'étude de cette pathologie ; ces modèles peuvent développer spontanément un ou plusieurs caractéristiques du modèle ou être génétiquement altérés. Les animaux issus de ces developpements serviront à favoriser la compréhension des mécanismes pathologiques, cognitifs et comportementaux suite à ces altérations ciblées, à identifier des substrats moléculaires et biologiques caractéristiques et à développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Certaines anomalies génétiques à l’origine de la CMT entraînent la démyélinisation des nerfs périphériques. A chacun des gènes mutés entrainant la démyélinisation, correspond un sous-type de CMT. Le but de cette étude est de produire des animaux pour un partenaire cherchant à développer un traitement pharmacologique capable de diminuer le stress cellulaire associé à la duplication du gène PMP22 afin de protéger les cellules de Schwann et ainsi palier au dysfonctionnement des nerfs périphériques.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ce modèle de souris C3-PMP, au plus proche de la maladie humaine, est donc très pertinent pour le développement de traitements pharmacologiques.
Procédures
Les souris présentent un phénotype dommageable de troubles de la locomotion. Une biopsie caudale et/ou d'oreille est réalisée sur l'animal vigile pour son génotypage.
Impact sur les animaux
Ces animaux commencent à developper les premiers signes de la maladie à 3 semaines, ils développent une insuffisance neuromusculaire associée à une capacité motrice anormale, des défauts de coordination ainsi qu’une hypoactivité. Ces signes de locomotion perturbée sont observables principalement chez la femelle. Ils n'handicapent pas l'animal pour sa prise de nourriture, d'eau et ses interactions sociales. Par ailleurs, une douleur légère peut être induite lors de biopsies de génotypage.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés soit mis à mort.
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ces hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie de CMT, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Un hébergement standard sera réalisé. Une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement dès leur naissance afin de confirmer le degré de sévérité du phénotypage de la lignée. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Si, par exemple, une difficulté de locomotion apparait, cela entrainera une facilitation à l'accès à l'eau et la nourriture directement dans la cage d'hébergement (croquettes et gel dans la cage). Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. La souris est un modèle animal simple à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elle est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, de sa courte gestation, de sa durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d'ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies antisens pour des maladies génétiques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 480
5 000 souris et rats vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère, la plupart tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, une partie gardée pour la reproduction. Elles reçoivent des injections répétées par voie intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, orale, oculaire ou intracérébrale avec pose de canule, sur une durée pouvant atteindre 24 semaines, avant une mesure terminale de la contractilité musculaire sous anesthésie. L'objectif est de sélectionner des candidats de thérapie génique ou antisens contre la myopathie de Duchenne, les retombées pour les patients étant renvoyées au long terme. Sur le remplacement, le porteur teste d'abord les molécules in vitro mais affirme que le recours aux modèles animaux reste "indispensable" pour le développement préclinique.
Objectifs
Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent essentiellement sur des pathologies neuromusculaires et en particulier sur la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Au-delà de l’atteinte purement musculaire nécessitant un traitement du corps entier par voie systémique, le système nerveux central (aspect cognitif) représente notamment aujourd’hui les cibles à traiter pour espérer un réel bénéfice thérapeutique. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie neuromusculaire notamment la myopathie de Duchenne. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une biodistribution sur le corps entier et une amélioration significative chez les modèles animaux étudiés, et à plus long terme chez les patients traités.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthésie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée seront plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Afin de permettre l’accumulation progressive, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 2, nous testerons la voie d’administration orale (intra-stomachal) moins invasives; afin de permettre l’accumulation progressive les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Afin de cibler plus spécifiquement certaines zones, nous testerons les voies d’injection oculaire et intracérébrale. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthésie et le réveil. Les injections oculaires pourront être plus brèves de l’ordre de 5 à 10minutes, et les animaux ne seront injectés qu’une seule fois. Pour les animaux en procédure intracérébrale, les injections ne seront pas répétées sauf s’il y a implantation de canules où l’animal pourra recevoir des administrations 1 fois par semaine pendant 6 semaines via la canule après anesthésie gazeuse. Ces ré-administrations seront brèves de l’ordre de 5 minutes. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. après anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxillaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de façon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine. Les animaux ayant recus des injections pourront également suivre la procédure terminale sans réveil de mesure de la contractilité musculaire pour mesurer l’efficacité de notre traitement sur l’amélioration de la force après anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses, les nuisances et effets indésirables sont donc faibles. Les animaux subissant la procédure d’administration intracérébrale pourraient présenter des difficultés d’alimentation et une potentielle douleur dans la première journée suivant la procédure. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoin. Ils seront particulièrement suivis après la chirurgie avec un tableau de suivi quotidien pendant les 3 jours suivants la chirurgie, et observés bi-quotidiennement le jour de la chirurgie avec ré-administration d’analgésie 8h post opératoire si l’évaluation d’après la grille le justifie (score >6). Dans ce cas, une vigilance accrue et une observation biquotidienne sera maintenue. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classés « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs : mobilité réduite et problème cardiaque. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si ces symptômes devaient apparaitre prématurément.
Devenir
Ormis pour la procédure d’élevage où les animaux seront gardés en reproduction, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter l’ensemble des tissus d’intérêt et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)
Remplacement
Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques, non toxiques sur cellules, et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant une biodistribution au corps entier avec un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.
Réduction
Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations à savoir l’administration par voie orale, par voie occulaire ou intracérébrale.
Raffinement
Dans le cas où les animaux seraient importés et non issus de nos élevages, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement lors de leur arrivée. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Les procédures se feront majoritairement sous anesthesie, avec analgésie post procédure si besoin. L’évaluation des points limites (poids, mobilité…) se feront selon la grllle de Morton et griffith. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, bien connus et documentés. Les points limites sont similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une procédure d’élevage (procédure 1). Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.
Choix des espèces
Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique préclinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces pouvant être exigée dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique. La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveau-nés à 4 semaines).
Évaluation d’une possible origine développementale de la Sclérose Latérale Amyotrophique et de la fenêtre optimale d’intervention thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
388 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une partie porte une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique et développe une paralysie progressive avec une perte de poids pouvant atteindre 40 %, les animaux étant tués avant la paralysie complète, tandis que d'autres subissent des chirurgies d'implantation d'électrodes cérébrales et des enregistrements sous anesthésie. Le projet cherche à savoir si un traitement administré tôt dans le développement bloque l'apparition de la maladie, à partir d'une observation faite "de manière entièrement fortuite" lors de travaux antérieurs. Le porteur justifie le recours à la souris par la nécessité d'un modèle reproduisant le développement du système nerveux et les symptômes de la maladie.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la plus fréquente des maladies neurodégénératives du neurone moteur adulte. Elle induit une paralysie progressive des patients, due à la perte des neurones moteurs du cerveau et de la moelle épinière, et conduit irrévocablement au décès 2 à 5 ans après l’apparition des premiers signes. Elle demeure encore incurable. Environ 10% des patients présentent des mutations dans des gènes qui ont été identifiés (cas familiaux) et ont permis le développement de souris transgéniques qui reproduisent les symptômes de la maladie. A l’instar d’autres maladies neurodégénératives, la SLA est suspectée d’avoir une possible origine développementale. En effet, il existe des cas de SLA juvéniles qui affectent les adolescents, lorsque le système nerveux central est encore en développement. Par ailleurs, les modèles murins de la maladie présentent des altérations du fonctionnement des neurones dès le développement embryonnaire. Notre hypothèse de travail est qu’il existe une origine développementale à la SLA, et qu’un traitement dispensé à un moment clé du développement permettrait de bloquer l’apparition de la maladie. Au laboratoire, nous avons observé il y a quelques années qu’un traitement particulier d’un modèle murin de SLA, dispensé sur quelques semaines, permettait de prévenir intégralement l’apparition de la maladie lorsqu’administré avant l’apparition des symptômes. Cependant, cette observation ayant été faite de manière entièrement fortuite, nous n’avons pu déterminer à quel âge précis les animaux qui ne développaient pas de symptômes avaient été traités. C’est ce que nous cherchons à déterminer à présent, par le biais d’une étude dédiée et contrôlée. Notre premier objectif sera, dans une étude pilote, de déterminer la fenêtre optimale de traitement permettant d’empêcher le déclenchement de la maladie dans un modèle murin de SLA, en traitant différents groupes d’animaux durant différentes périodes de développement. Notre second objectif sera, dans une étude plus approfondie, de comparer le traitement des animaux durant la fenêtre optimale de traitement déterminée lors de l’étude pilote au traitement des animaux durant la phase symptomatique de la maladie. L’ensemble de ces résultats permettra de mettre en évidence une possible origine développementale de la maladie et de déterminer la phase du développement durant laquelle une intervention médicamenteuse aurait le plus de chances d’être bénéfique.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, seul un traitement est proposé aux patients atteints de SLA, lorsque le diagnostic de la maladie est clairement établi, un processus qui peut prendre plusieurs mois. Il s’agit du Riluzole, dont l’efficacité est très faible puisqu’il ne permet d’augmenter la durée de vie des patients que de quelques mois. La SLA est une maladie neurodégénérative, et à l’instar des autres maladies neurodégénératives, elle a toujours été perçue comme une maladie de l’âge adulte, voire même une forme de vieillissement prématuré du cerveau et de la moelle épinière. Cependant, cette vision de la neurodégénérescence est en train d’évoluer, avec une démonstration récente d’altérations développementales dans la maladie de Huntington, et des séries d’arguments en faveur d’une origine développementale des maladies d’Alzheimer, de Parkinson, ainsi que de la SLA. La démonstration d’une composante développementale à ces maladies, et en particulier à la SLA, permettrait d’envisager 1) la recherche de biomarqueurs beaucoup plus précoces, par exemples parmi les familles de patients, 2) une administration des traitements en amont de l’apparition des signes cliniques de la maladie, et 3) éventuellement un enrôlement plus précoce des patients dans les études cliniques dans le but d’améliorer encore les traitements actuels.
Procédures
Les animaux seront soumis à six types d’interventions : - un premier groupe d’animaux sera soumis à un traitement médicamenteux (1) réalisée par 1 injection sous-cutanée quotidienne, sur animaux vigils, pendant 6 à 15 jours (6 à 15 injections totales selon les animaux). La durée d’une injection est de 2 à 3 secondes. Ce même groupe d’animaux sera suivi de manière hebdomadaire (2) pour mesurer leurs capacités motrices (force musculaire, coordination motrice) sur des appareils dédiés afin de déterminer les effets du traitement. L’ensemble des tests moteurs dure 40 minutes au total, entrecoupées de nombreuses phases de repos. - un deuxième groupe d’animaux subira une chirurgie d’une durée de 45 minutes pour implanter des électrodes d’enregistrement cérébral (3). Cette chirurgie sera suivie d’un un maximum de 4 enregistrements d’électroencéphalographie (4) qui requièrent un isolement de 24 heures, et seront effectués à intervalles de 30 jours. Ces animaux seront également soumis à un maximum de 4 enregistrements électromyographiques (5), sous anesthésie générale, réalisés à intervalle de 30 jours, au lendemain des enregistrements d’électroencéphalographie. La procédure dure 10 minutes. - un troisième groupe d’animaux subira une chirurgie permettant l’injection d’un traceur rétrograde dans la moelle épinière (6). La procédure dure 40 minutes.
Impact sur les animaux
Huit types de nuisances sont attendus au cours de cette étude : 1- une partie des animaux aura des altérations motrices évoluant des pattes arrière vers les pattes avant et une perte de poids pouvant aller jusqu'à 40%. 2- Un traitement médicamenteux, susceptible de diffuser dans le cerveau, et pouvant provoquer une somnolence et des désordres des mouvements, mais également une réduction des symptômes de la maladie. 3- Des injections sous-cutanées, pouvant entraîner localement une douleur et une infection, qui peuvent être ressenties comme gênantes ou stressantes, et entraîner des changements comportementaux (apathie, agressivité). 4- Des injections sous-cutanées à de jeunes souris, pouvant en outre perturber la relation mère-petit et entraîner éventuellement une séparation temporaire. 5- Un suivi moteur hebdomadaire des animaux qui peut s’avérer fatiguant. 6- 2 à 4 enregistrements d’électromyographie, à intervalles d’un mois, qui requièrent l’anesthésie générale des animaux et le positionnement sous-cutané de 4 électrodes aiguilles. 7- Des chirurgies qui peuvent entraîner saignements ou infections. 8- L’isolement des animaux durant les 24 heures nécessaires à l’enregistrement de leur activité cérébrale, avant retour dans la cage avec leurs congénères. 2 à 4 (suivant la durée de vie des animaux) enregistrements sont prévus à intervalles d’un mois.
Devenir
Tous les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures. Les animaux transgéniques développant des symptômes moteurs seront mis à mort avant paralysie complète, selon les points limites établis, et les animaux non-transgéniques seront mis à mort aux mêmes âges que les animaux transgéniques pour servir de contrôles aux expériences de biologie moléculaire et d’histologie prévues.
Remplacement
Ce projet consiste à déterminer si la SLA pourrait avoir une origine développementale, et s’il existe une fenêtre optimale d’intervention thérapeutique. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les étapes-clé du développement du système nerveux central ainsi que les caractéristiques de la SLA : déclenchement de symptômes moteurs à l’âge adulte et mort prématurée.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. De plus, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici d’utiliser les mâles pour les suivis longitudinaux de l’activité du cerveau, et les femelles pour les analyses histologiques et moléculaires. Pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles, sachant que le genre n’influence pas la survie de ces animaux.
Raffinement
L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Des points limites permettant de soustraire l’animal à la souffrance ont été établis. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie pré et post opératoire.
Choix des espèces
Parmi les modèles de SLA, les souris sont les plus appropriées à notre étude car 1) elles présentent le niveau de complexité du cerveau et de la moelle épinière adéquat, 2) leur développement pré- et post-natal mime celui de l’homme, 3) il existe plusieurs lignées de souris exprimant une mutation d’un gène causatif de la SLA, dont certaines, reproduisent parfaitement les symptômes de la maladie et sont donc adaptées à l’évaluation préclinique de traitements médicamenteux. Déterminer l’âge du développement durant lequel les animaux entrent en phase présymptomatique de leur maladie est un des objets précis de cette étude. Les stades suivants seront donc ciblés : - Prénatal : de 12 jours de gestation à la naissance - Périnatal : de 15 jours de gestation à 7 jours après la naissance - Postnatal : de la naissance à 14 jours après la naissance - Jeune adulte (troisième mois de vie).
Psoriasis et dysbiose vaginale, sont ils des déclencheurs des spondyloarthrites ?
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la majorité tuée à l'issue et 560 mâles susceptibles d'être réutilisés dans d'autres projets. Porteuses d'un déficit immunitaire, elles reçoivent des injections destinées à déclencher une arthrite qui se traduit par un gonflement des articulations, une baisse d'activité et une perte de poids pouvant être importante. Le porteur décrit aussi l'induction d'une inflammation cutanée de type psoriasis et d'une infection vaginale, croisées pour tester l'apparition de spondyloarthrites. Les femelles sont mises à mort pour examen des tissus articulaires, tandis que les mâles en excès sont tués au sevrage ou orientés vers d'autres protocoles.
Objectifs
Les spondyloarthrites sont des rhumatismes inflammatoires fréquents (0,3% de la population française) touchant les articulations, les tendons mais aussi d’autres organes (inflammation des yeux, de la peau et du tube digestif). Les spondyloarthrites entrainent une altération de la qualité de vie. Les raisons du déclenchement de cette maladie sont à ce jour mal comprises. Il y a parfois l’association d’une susceptibilité génétique et d’un environnement déclencheur comme une infection, parfois l'influence de la flore intestinale est suspectée, parfois la présence de lésions de psoriasis sur la peau, mais la relation de cause à effet reste non prouvée. 2% de la population française est touchée par le psoriasis, maladie inflammatoire chronique de la peau. 30% de ces patients développeront au cours de leur vie un rhumatisme psoriasique, en moyenne 10 ans après le début du psoriasis. Comparativement au psoriasis isolé, le rhumatisme psoriasique, comme toutes les autres spondyloarthrites, entraîne un surcoût important pour le système de santé, notamment du fait des traitements biologiques utilisés au long cours pour contrôler cette maladie. Notre premier objectif est d’étudier sur modèle animal la transition entre psoriasis local et le rhumatisme psoriasique. La dysbiose vaginale, est une perturbation de l'équilibre de la flore vaginale. C’est la maladie génitale la plus fréquente au monde chez les femmes en âge d'être sexuellement actives, avec une fréquence de 23 à 29 %. Elle est associée à une susceptibilité aux infections sexuellement transmissibles et à un risque accru de maladie inflammatoire. Nous suspectons une plus grande susceptibilité aux spondyloarthrites chez les femmes atteintes de dysbiose vaginale. Notre second objectif est d’établir une relation causale entre une dysbiose vaginale et la survenue d’une spondyloarthrites, dans notre modèle de souris. Le troisième objectif est d’élever les souris avec un déficit immunitaire les rendant susceptibles aux spondyloarthrites afin de pouvoir mener ces études.
Bénéfices attendus
Entre les premières lésions de psoriasis et le déclenchement du rhumatisme psoriasique, il y a l’opportunité de traiter par des médicaments afin d’éviter la survenue de ce dernier. Notre recherche, une fois le modèle de cette transition établie permettra d’identifier les types de traitements susceptibles de bloquer ou retarder cette transition, voire de tester des médicaments. De même, si nous arrivons à démontrer le lien entre dysbiose vaginale et spondyloarthrites, nous pourrons identifier les types de traitements susceptibles de bloquer ou retarder cette transition puis tester des médicaments.
Procédures
Les diamètres des chevilles et poignets des souris seront mesurées toutes les semaines, parfois deux fois par semaine. Suivant le protocole pour induire la maladie, elles auront une injection intrapéritonéale d’hormone pour synchroniser leurs chaleurs, et quelques jours plus tard un dépôt intravaginal, pour induire la maladie. Ce sera fait sous anesthésie générale courte (de 3 à 15 minutes) et couplé à une prise de sang. Elles pourront avoir jusqu’à 5 autres prises de sang. Il y aura aussi jusqu'à sept écouvillonnages vaginaux. Dans l’autre protocole, elles subiront jusqu’à 5 injections sous cutanées (éventuellement répété une fois après plus d’un mois) pour induire la maladie. Elles auront des prises de sang (maximum 6) sous anesthésie générale courte (de 3 à 15 minutes). Selon l’avancée de nos connaissances, elles pourront avoir des injections de traitements en intrapéritonéal, dont les fréquences pourront varier de 1 par jour pendant 4 semaines à 1 par semaine pendant 20 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des contentions pour les peser et mesurer le diamètre de leurs poignets et de leurs chevilles, une à deux fois par semaine. Le stress de ces mesures disparait après 2 à quatre mesures. Ils subiront des courtes anesthésies (3-15 min) pour l’injection qui déclenche la maladie et les prises de sang. Ils pourront aussi subir des injections (ip) jusqu’à une par jour, pour favoriser le déclenchement (synchronisation du cycle oestrale), induire un traitement, une atténuation des symptômes, ou de façon inattendue une exacerbation de ceux-ci. Il y aura une irritation et une inflammation locale après induction du psoriasis. Cette irritation sera inférieure à celle qui déclenche une réaction de grattage nuisible. L’infection vaginale déclenchera une inflammation de l’utérus (décrite en post mortem dans la littérature sans qu’il soit fait mention d’altération de l’état général). L’arthrite que nous cherchons à induire se traduit par un gonflement des articulations (chevilles et poignets), une baisse de l’activité (détectable par actimétrie continue sur une journée, il ne s’agit pas d’une prostration), une rougeur transitoire des oreilles, une possible conjonctivite. La perte de poids peut être importante quand la maladie est installée.
Devenir
Les femelles de la procédure d’élevage sont gardés en vie soit comme reproducteurs soit pour servir dans les expériences. A la fin des expériences, nous avons besoin de faire des examens sur les tissus articulaires des animaux donc ils sont mis à mort, tant pour les malades que pour les contrôles. Il y aura un excès d’animaux mâles (610-50, nos expériences se feront quasi-exclusivement sur des femelles). La majorité sera mise à mort au sevrage, mais la totalité de ces 560 animaux mâles pourront être potentiellement réutilisés dans d'autres projets. Il faudra que les conditions sanitaires de cette réutilisation permettent de les utiliser sans que leur déficit immunitaire les handicape.
Remplacement
Actuellement, il n’existe aucun modèle in vitro capable de mimer les spondylarthrites ou de comprendre son mécanisme, son déclenchement cellulaire ou moléculaire. Le développement de cette maladie complexe et donc son étude nécessitent l’intervention d’un système immunitaire complet en plus d'un tissus cartilagineux, voire d'une articulation, et des autres organes dont nous voulons démontrer l’implication (peau ou utérus). Nous faisons des expériences en complément de celles décrites ici ; in vivo : mesures d’activités enzymatiques, calibrage des inoculum bactériens ; ex vivo : mise en culture des cellules immunitaires, cytométrie sur les cellules immunitaires, analyses sanguines, histologie, PCR…
Réduction
Les effectifs des expériences ont été calculés afin de réduire le nombre d’animaux. Dans les expériences longues durée, nous tenons compte du taux de réussite habituel d’induction de la maladie, et de la variabilité de la grosseur des articulations. Nous synchronisons les chaleurs des femelles par une injection d’hormone afin d’augmenter les chances d’induction de la maladie. D’autres expériences seront faites sur des temps plus court pour explorer les mécanismes mis en jeu, elles se feront sur des effectifs très réduits car nous voulons alors détecter des effets tout ou rien et non des variations sur le diamètre des articulations Enfin, nous mettrons en commun les animaux contrôles sur la première expérience entre les procédures 1 et 2 et nous répéterons cela chaque fois que ce sera possible.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions sanitaires très strictes (air filtré, nourriture et eau stériles) qui font que leur déficit immunitaire n’est pas un handicap. L'enrichissement sera conforme aux préconisations de la structure de bien-être animal de l’établissement. Le geste technique de mesure des diamètres est toujours réalisé par la même personne afin que les souris soient habituées à cette manipulation qui est contraignante pour elles en termes de durée de contention et afin de réduire cette durée de contention. Les prises de sang seront faites sous anesthésie générale. Un analgésique sera administré après. Les anesthésies générales seront de courte durée (3 à 15 minutes) afin que la perturbation du rythme de vie soit de moins de 24h (l’équivalent d’un examen sous anesthésie générale en ambulatoire chez l’homme). Nous avons une grille d’évaluation des souffrances subies par les animaux. Les critères intermédiaires entrainent des mesures d’aide : ainsi en cas de perte de poids de 10%, pour un individu ou pour tout le groupe si plus de 4 en sont à ce stade, une alimentation riche et humide leur sera donnée dans la cage en plus des croquettes sèches habituelles. Les critères terminaux de cette grille correspondent à une mise à mort pour éviter des souffrances inutiles et ces critères sont atteints avant que la détérioration de l’état général ou la perte de poids n’atteignent un stade sévère.
Choix des espèces
Nous élevons une lignée de souris avec un déficit immunitaire qui les rend susceptibles à des maladies auto-immunes. Ces souris sont un bon modèle de spondylarthrite car elles vérifient assez bien ou très bien les trois critères d’un modèle animal de maladie humaine : - Elles développent des symptômes qui sont très proches de la maladie humaine. - La mutation génétique à l’origine de leur auto-immunité n’est pas décrite chez l’homme (donc ce modèle n’est pas parfait), mais la perturbation des cellules immunitaires qui en découle est retrouvée dans la maladie humaine. - Une des biothérapies efficaces en clinique est aussi efficace sur les spondyloarthrites classiques induites chez ces souris. Nous avons donc un grand espoir que pour les variantes de spondyloarthrites que nous voulons induire chez ces souris, leurs réponses aux médicaments seront prédictives de ce qui sera efficace dans l’espèce humaine. L’âge des souris au début des expériences est compris entre 5 et 10 semaines pour 1) avoir des animaux adultes ; et 2) ne pas avoir des animaux vieillissant en fin d’expérience. Pour l’élevage nous aurons des animaux de leur naissance à la réforme (à 6-8 mois).