Troubles musculosquelettiques

Porteurs d'une mutation qui les prive de dystrophine, 330 rats voient leurs muscles dégénérer et, passé dix mois, développent pour environ un sur cinq une tumeur musculaire, le plus souvent au muscle de la mâchoire. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le protocole se limite à les laisser vieillir et à les palper chaque semaine sur tout le corps pour détecter la masse, l'animal étant tué au plus tard quinze jours après la découverte, pour prélever la tumeur. Le porteur signale que ces rats perdent la mobilité au point de ne plus pouvoir se toiletter, et qu'il les loge avec des rats sains qui s'en chargent, avant de conclure qu'ils sont "irremplaçables" pour ce travail.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Les mutations décrites induisent l’absence d’une protéine appelée dystrophine, ce qui conduit à une dégénérescence de l’ensemble des muscles du cœur, de la locomotion et de la ventilation. Le pronostic de la DMD est très sombre, la plupart des jeunes patients meurent prématurément d’insuffisance cardio-respiratoire. Dans des modèles animaux de DMD, notamment chez les rats, des complications sont observées de façon précoce lors de leur vieillissement. En effet, à partir de 10 mois, les rats DMD peuvent développer de manière spontanée une tumeur musculaire, pouvant se retrouver au niveau de tous les muscles squelettiques mais majoritairement au niveau du muscle masséter permettant de fermer la mâchoire. Suivant la localisation, les conséquences à l’échelle de l’organisme varient et peuvent impacter différentes fonctions comme la prise de nourriture, la locomotion et le toilettage. Le but de ce projet est donc de déterminer globalement les différents signes cliniques tardifs chez les animaux DMD, incluant le développement de tumeurs musculaires et de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à l'apparition de ces tumeurs.

Bénéfices attendus

Le but du projet est de caractériser au mieux la DMD et son histoire naturelle en vue de proposer des traitements innovants permettant de contrer les mécanismes pathogéniques. Comprendre les possibles comorbidités en vue de les traiter dans un contexte de réparation musculaire est donc un étape essentielle. À court terme, il est attendu une amélioration du suivi et de la prise en charge des comorbidités associées à l’évolution tardive de la maladie. À moyen terme, il s’agira de mieux investiguer le rôle de suppresseur de tumeurs de la dystrophine – et de ses variants de forme (longeur variable de la protéine) - pour, à long terme, aboutir à des tests de stratégies thérapeutiques ciblant de façon spécifique ou en parallèle les tumeurs musculaires dans les modèles animaux dystrophiques. Il est en effet crucial d’identifier la signalisation moléculaire conduisant au développement de ces tumeurs musculaires chez le rat et d’inclure ces connaissances dans le design des solutions thérapeutiques pour qu’elles visent d’emblée à traiter le syndrome dystrophique dans son ensemble, au-delà de la seule récupération fonctionnelle cardio-respiratoire et locomotrice.

Procédures

Pour la procédure décrite dans la présente saisine, les animaux ne subiront aucune intervention particulière à part une manipulation régulière par les zootechniciens pour leur suivi clinique. S’ils présentent une masse tumorale, elle sera prélevée au moment de leur mise à mort en accord avec la grille de score et au plus tard 15 jours après la détection de la tumeur.

Impact sur les animaux

Jusqu’à l’âge de 10 mois, il n'a été constaté aucune entrave à une qualité de vie globalement compatible avec une vie en cage autonome pour les animaux DMD. Au-delà de 10 mois en revanche, un suivi individuel s’impose. Dans cette étude, les animaux seront plus âgés que 10 mois et auront atteint un stade sévère de la pathologie qui s’accompagne d’un développement spontané de tumeurs pouvant toucher les muscles squelettiques. Un personnel compétent pratiquera alors de façon hebdomadaire un suivi individualisé et complet des animaux en plus du suivi classique dispensé par une zootechnicienne. Les animaux seront donc palpés manuellement sur l’ensemble de leur corps afin de détecter une éventuelle masse tumorale. La locomotion des animaux sera également observée afin de détecter un possible déficit engendré par une tumeur sur les muscles mobilisant les articulations des membres postérieurs. L’impact de la masse tumorale dépend de sa localisation (locomotion, prise alimentaire, toilettage, …). Une perte de mobilité générale est observée lors de la phase sévère de la maladie, pouvant empêcher les rats DMD d’effectuer certaines tâches essentielles à leur bonne santé comme le toilettage. Pour cette raison, les rats DMD sont systématiquement allotés avec un ou deux rats de génotype sauvage qui, nous l’avons constaté, prennent soin des rats handicapés, par exemple en les toilettant. Ainsi, le pelage des rats DMD demeure entretenu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires ainsi que la mise en culture.

Remplacement

Le rôle de la dystrophine en tant que suppresseur de tumeur est connu et décrit. L'objectif de cette saisine n’est pas de tester des molécules antitumorales, ce qui pourrait être réalisé en partie sur des cellules, mais 1) de calculer l’incidence de la tumeur du muscle dans des modèles dystrophiques, 2) de quantifier la variabilité de l'âge de démarrage du processus cancéreux dans un contexte biologique, et 3) d’initier la caractérisation des tumeurs au niveau ultrastructural du tissu et moléculaire. Le modèle du rat étant celui qui mime le plus fidèlement et en une seule année l’évolution chez l’humain, ces animaux sont irremplaçables pour remplir en un temps court les objectifs de ce projet.

Réduction

De nombreuses études sont menées sur les lignées DMDdel52 et DMDdup10-17. Dans ces deux modèles, la survenue de tumeurs musculairesa été observée de façon assez fréquente (20%). Jusqu'à présent, les animaux qui présentaient ces tumeurs étaient écartés des procédures dans lesquelles ils étaient inclus pour être mis à mort sans autre utilité, la présence de la tumeur pouvant potentiellement altérer les résultats de ces études. Comme ce type de tumeur a également été décrite chez les patients DMD, le présent projet vise à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent à l'apparition de ces tumeurs dans les modèles de rats dystrophiques, et nous proposons d'inclure dans nos analyses les tumeurs détéctées chez les animaux enrôlés dans d'autres saisines afin qu'ils ne soient plus mis à mort sans que leur tissus ne soient prélevés et analysés. Ainsi ces animaux fourniront également des données biologiques grâce à l'analyse de leurs tumeurs. Ces animaux étant par ailleurs décomptés dans d'autres saisines, leur utilisation dans ce projet permettra de réduire le nombre de rats sur la cohorte dédiée. En effet, dès lors que le nombre de sujets nécessaires aux analyses sera atteint, il n'y aura pas de nouveaux animaux inclus. De plus, la diversité des animaux utilisés permettra par ailleurs un résultat biologique de meilleure qualité puisqu’il intègrera des rats au parcours de vie différent : parfois peu manipulés notamment ceux de la présente saisine, parfois manipulés régulièrement, parfois soumis à un exercice musculaire, autant de situations proches de la variabilité des modes de vie de l’enfant atteint.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventiléesde grande taille, de sorte qu’ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont les capacités locomotrices sont évaluéesen permanence. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. En cas de score clinique élevé, les animaux affaiblis seront suivis de façon rapprochée via une procédure de gestion spécifique à ces animaux. Tout dépassement des points limites sera suivi d’une action correctrice et en cas d’absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Par ailleurs, les animaux provenant d'autres saisines ne subiront aucune procédure supplémentaire puiqu'ils seront mis à mort dès lors qu'une tumeur sera détéctée.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l’humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d’édition du génome ont permis d’en faire un modèle de choix pour l’analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rats DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris mdx, mondialement utilisé, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s’insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d’environnement, format). Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 10 mois et plus, sans excéder 17 mois. L'étude de caractérisation montre que c’est à partir de 10 mois que les animaux entrent dans une phase de la maladie qui les rend prédisposés au développement de rhabdomyosarcome et éventuelles autres comorbidités.

Porteuses d'une mutation qui reproduit le syndrome NARP, ces souris présentent un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire attendus. 313 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à un, deux, quatre et six mois, des tests de force musculaire, de coordination et d'endurance sur tapis de course, rotarod et grip test, ainsi que des IRM et des échocardiographies sous anesthésie. Une grille de score commande la suite : entre 6 et 7, un antidouleur puis la mise à mort si rien ne s'améliore en vingt-quatre heures, entre 8 et 9, la mise à mort immédiate.

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

Des injections quotidiennes d'immunoglobulines prélevées chez des patients, pendant sept à dix-sept jours, provoquent chez la souris une myopathie nécrosante avec perte de force musculaire. 154 souris, dont une partie immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les muscles gastrocnémiens. Elles subissent en plus deux à quatre microprélèvements sanguins sous anesthésie, jusqu'à cinq tests d'agrippement et une mesure de force in situ de dix minutes. Le porteur affirme que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance, tout en décrivant une échelle qui va de la queue traînante à la paralysie du train arrière et un protocole arrêté au score 2.

Objectifs

Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante nécrose des fibres musculaires sans infiltrat inflammatoire. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) ; dont l'aAc anti SRPP (anti-3-Hydroxy-3-MethylGlutaryl-Coenzyme A Réductase) avec une corrélation du titre avec la myolyse. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris d'immunoglobulines G purifiées issues de patients porteurs cet d’aA anti-HMGCR. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’IgG et de molécules du sytéme du complément à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc et suggérant un rôle cytotoxique exclusif du complément. Nous avons déja démontré l'efficacité préventive d'un inhibiteur spécifique du complément. L'objectif général de notre programme est d'évaluer l'efficacité thérapeutique d'un nouvel inhibiteur spécifique du complément humain dans notre modèle murin de MNAI par transfert d'anticorps de malades et de la comparer à celle d'un autre inhibiteur commercialisé mais de spécificté différente et de la molécule antagoniste. Pour ne pas avoir de réponse xénogénique lors de la procédure évaluant le rôle curatif de cette molécule, nous aurons recours à des souris immunodéficientes. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.

Bénéfices attendus

Lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal, nous avons pu démontré l'efficacité de molécules thérapeutiques dans (i) l'apparition et (ii) le traitement de la myopathie. Cela s'est traduit par respectivement (i) une absence d'atteinte histologique et de diminution de la force musculaire et (ii) par une réduction significative de l'atteinte histologique et une restauration de la force musculaire. Avec ce nouvel inhibiteur du fragment C2 du complément nous pouvons nous attendre à une restauration partielle ou complète de la fonction musculaire de l'animal ouvrant ainsi la porte à un essai clinique chez les patients atteints de MNAI.

Procédures

Les animaux seront soumis à des microprélèvements de sang (2 à 4 en fonctions des groupes d'animaux) de 75 microlitres, prélèvement sur souris anesthésiée, durée de l'acte 20 secondes. Les souris seront injectées quotidiennement avec du complément, par voie intra péritonéale (IP), durant 7 à 17 jours selon les groupes, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection des immunoglobulines G en IP, de 2 à 5 fois par souris selon les groupes, sur respectivement une période de 7 à 17 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Une mesure de la force musculaire par test d'agrippement (grip test) sera réalisée pour chacune des souris, durée moins de 10 secondes, jusqu'à 5 tests sur le temps de suivi des souris. Mesure de la force musculaire in situ-sur souris anesthésiée, 1 seule mesure par souris, en fin de procédure, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal dans l'évaluation de molécules thérapeutiques a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercussion visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids.

Devenir

Le prélèvement des gastrocnémiens pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de moléculesinhibitrices du complément dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisée que chez l'animal.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autre protocoles expériementaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'auto-anticorps chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique excat des effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologique obervées lors de ces protocoles.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de celllose et des fibres de coton. De plus, en raison de leur sensibilité aux infections, les animaux seront maintenues en portoir ventilé. Les prélèvements sanguins, la mesure de la force musculaire et la mise à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie gazeuse grâce à un matériel dédié. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Cette échelle est définie de la façon suivante: Score 0 : condition physiologique (pas de signe clinique) ; Score 1 : faiblesse du train arrière, queue trainante ; Score 2 : diminution de l’activité locomotrice des pattes arrières, courbure du dos significative ; Score 3 : paralysie du train arrière. Elle permettra également d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. En effet, les animaux seront observés quotidiennement et l'apparition de signes cliniques, poils hirsutes, perte de poids visible (sans pesée) ou prostration, ou lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes seront atteints entraineront la mise en place de dispositions pour réduire la douleur. Un traitement préventif quotidien de la douleur sera mis en place lors de la première injection des anticorps pour les animaux de tous les lots. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. Un analgésique sera administré en sous cutané 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement par un des tests adaptés.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.

Réformées de l'élevage plutôt qu'élevées pour l'expérimentation, quatorze brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe trois heures sous anesthésie générale pendant que des chirurgiens entaillent cinq de ses disques intervertébraux lombaires et y posent trois types de biomatériaux à tester, avec radiographies et IRM du rachis. Quatre sont tuées au bout d'un mois, dix au bout de six mois après deux passages supplémentaires sous anesthésie pour l'imagerie, afin de prélever leurs soixante-dix disques lombaires pour analyse histologique et tests mécaniques. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative à l'utilisation de l'animal" pour cette évaluation préclinique, une étude préliminaire sur des disques prélevés après la mort ayant déjà confirmé la faisabilité de la pose de l'implant.

Objectifs

La lombalgie est un problème de santé publique majeur, ayant des conséquences socio-professionnelles et économiques considérables. Il est estimé qu’environ 80 à 90% de la population mondiale souffrira de lombalgie à un moment donné au cours de la vie. Entre 8 et 20% des lombalgies chroniques sont associées à une hernie discale (HD), survenant lorsque le disque intervertébral (DIV) ne joue plus son rôle essentiel d’amortisseur dans la biomécanique de la colonne vertébrale. En effet, le DIV est composé de deux tissus, le noyau pulpeux NP en son centre, et l’anneau fibreux (AF) en périphérie. Avec le temps, des microfissures et des déchirures de l’AF peuvent amener le NP à faire saillie dans le canal rachidien : il s’agit d’une hernie discale, ayant pour conséquence une compression de la moelle épinière et/ou de racines nerveuses à l’origine de douleurs d’intensité variable. Lorsque les traitements antalgiques ne suffisent pas pour garantir le confort du patient, il est possible de pratiquer une intervention chirurgicale afin de retirer la partie herniée du NP exerçant une compression sur les structures nerveuses adjacentes. Toutefois, les lésions de l’AF persistent : le risque de récidive de HD est élevé et le DIV entre dans un processus dégénératif accéléré pouvant rapidement conduire à la perte totale de ses compétences biomécaniques. Dans ce projet, nous proposons d’évaluer une nouvelle stratégie de médecine réparatrice reposant sur la réparation de la déchirure de l’AF par comblement à l’aide d’un biomatériau électro-tissé. Ce biomatériau présente une structure fibreuse mimant celle de l’AF et servira de tuteur à sa colonisation cellulaire et sa réparation. Avant de pouvoir envisager des études cliniques chez l’Homme, nous souhaitons évaluer son efficacité à moyen terme dans un modèle ovin de réparation discale à l’aide de radiographies, d’imageries par résonance magnétique (IRM), d’analyses histologiques et d’une évaluation biomécanique des DIV ainsi réparés. 14 brebis seront utilisées afin d’évaluer 3 types d’implants différents en deux temps : une première phase d’une durée de 1 mois concernant 4 animaux et une seconde phase d’une durée de 6 mois concernant 10 animaux.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à développer une nouvelle approche de médecine régénératrice pour traiter les patients atteints de hernie discale. L'objectif n'est pas seulement de combler le défaut de l'anneau fibreux (AF) et d'atténuer la douleur, mais aussi de stimuler la réparation de l'AF, restaurant ainsi le disque intervertébral (DIV) dans son état fonctionnel. À court terme (première phase de 1 mois), ce projet vise à évaluer la sécurité, la stabilité et les premiers signes de réparation de l’AF après mise en place des implants dans la déchirure de l’AF (3 types d’implants différents seront utilisés). À moyen terme (deuxième phase de 6 mois), il vise à évaluer l’efficacité de ces mêmes implants dans un modèle ovin de lésion de l’AF. Enfin, à long terme, nous espérons mettre en place une étude clinique chez l'Homme, en nous appuyant sur les résultats prometteurs obtenus dans notre étude animale préclinique. Cette étape ouvrirait la voie à un nouveau paradigme thérapeutique pour le traitement de la hernie discale.

Procédures

4 brebis seront manipulées 3 fois sur une période de 1 mois (une fois pour le prélèvement sanguin, une fois pour la chirurgie et une fois pour l‘euthanasie) et 10 brebis seront manipulées à 5 reprises sur une période de 6 mois (une fois pour les prélèvements sanguins, une fois pour la chirurgie, deux fois pour l’imagerie seule et une fois pour l’euthanasie). L’ensemble des procédures à l’exception de la prise de sang sera réalisé sous anesthésie générale : - à J-1 (n=14, animaux vigiles, durée de la manipulation = 2 minutes) : prise de sang, - à J0 (n=14, durée de l’anesthésie = 3h) : radiographies et IRM du rachis lombaire, randomisation des DIV lombaires (5 conditions expérimentales), réalisation des défauts de l’AF dans les DIV concernés et mise en place des 3 différents biomatériaux évalués, - à 1 et 3 mois (n=10, durée de l’anesthésie = 1h) : radiographies et IRM du rachis lombaire, - à 1 (n=4) ou 6 (n=10) mois : euthanasie des animaux, radiographies et IRM du rachis lombaire (les DIV étant des tissus non vascularisés, leur aspect à l’IRM reste inchangé pendant plusieurs heures après la survenue de la mort), prélèvement de la totalité des DIV du rachis lombaire. Par ailleurs, les animaux seront soumis à un examen clinique quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation, sur leur site d’hébergement (pas de déplacement prévu pour les animaux). L’examen clinique se fait dans un premier temps à distance (temps mis à profit pour que les animaux s’habituent à la présence humaine) puis de manière rapprochée et individuelle (quelques minutes par animal, sans douleur).

Impact sur les animaux

La chirurgie, réalisée sous anesthésie générale, entraîne un risque réduit de douleur ou de lésion neurologique. La technique chirurgicale choisie est peu invasive, supprimant la manipulation des muscles ou des nerfs dorsaux. Le risque de douleur postopératoire ou de lésion nerveuse est ainsi significativement réduit. La procédure sera réalisée par des chirurgiens du rachis expérimentés dans ce type d'intervention sur ce modèle animal. Des douleurs modérées et transitoires peuvent être ressenties par les animaux dans les jours suivant l'opération, et l’administration d’anti-douleur est prévue si nécessaire. Le risque infectieux associé à cette chirurgie est très faible car elle sera réalisée en salle d'opération dans des conditions stériles et dans un temps réduit. L'implant utilisé sera stérile. Pour minimiser le stress sur les animaux, tous les examens d'imagerie médicale programmés pendant la période de suivi de 6 mois seront réalisés sous anesthésie générale. Les animaux seront sédatés dans leur enclos et puis transportés vers les salles d'imagerie seulement après que la sédation a pris effet.

Devenir

L’euthanasie des brebis aura lieu à la fin du premier mois (n=4) ou du sixième mois (n=10), c’est-à-dire à la fin de la procédure. Cette euthanasie est indispensable afin de pouvoir réaliser les analyses histologiques et immunohistochimiques ainsi que les tests mécaniques sur l’ensemble des DIV lombaires des brebis concernées par l’expérimentation (70 DIV au total). Ces résultats permettront de caractériser la tolérance des biomatériaux par le DIV ovin, tant au niveau de ses propriété biomécaniques qu’au niveau cellulaire et moléculaire (informations non disponibles par d’autres techniques, notamment d’imagerie médicale).

Remplacement

Ce projet correspond à une étude préclinique d’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un nouveau dispositif médical in vivo, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de l’animal. Toutefois, nous avons choisi de faire appel à des animaux de production réformés plutôt qu’à des animaux élevés spécifiquement pour l’expérimentation animale. Une étude préliminaire réalisée sur des DIV isolés (DIV prélevés sur des animaux après leur mort) a d’ores et déjà confirmé la faisabilité de l’installation d’un implant. Une phase d’étude chez l’animal vivant est incontournable pour vérifier que l’implant est correctement colonisé par des cellules à long terme.

Réduction

Une étude statistique préliminaire nous a permis de calculer le nombre de DIV lombaires à inclure dans notre étude : 70 DIV au total. L’animal étant son propre témoin (5 DIV lombaires par animal répartis au hasard parmi les 5 conditions expérimentales), nous réduisons le nombre total d’animaux utilisés à 14 (5x14=70) tout en garantissant la validité des analyses statistiques qui seront réalisées après obtention des résultats. De plus, la réduction du nombre d’animaux est également assurée par la mise en place de procédures raffinées (anesthésie, suivi et soin des animaux, prise en charge de la douleur, alimentation et enrichissement) limitant les pertes animales et l’atteinte de points critiques en cours de protocole. La méthode de suivi choisie (par imagerie médicale et ne faisant appel qu’à une euthanasie terminale) limite également le nombre d’animaux utilisés (par comparaison avec des procédures où des animaux seraient euthanasiés à chaque temps de suivi). Enfin, la première phase de la procédure décrite dans ce projet, concernant 4 animaux, sera réalisée dans un premier temps : les résultats obtenus seront analysés et la seconde phase, concernant 10 animaux, ne sera effectuée que s’ils sont favorables aux dispositifs médicaux étudiés. Nous réduisons ainsi le nombre total d’individus utilisés à 14 (4 animaux à 1 mois et 10 à 6 mois).

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe (espèce grégaire) dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement et à volonté au foin et à l’eau. L’alimentation est complétée par des granulés et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille adaptée à l’espèce ovine (intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture - debout, couchée-, port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres pelviens, confort global). Procédure expérimentale : L’ensemble des manipulations est réalisé sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. La technique chirurgicale choisie pour ce protocole limite le risque de lésion nerveuse et de douleur chirurgicale par comparaison à d’autres (absence d’ouverture de la cavité abdominale, absence d’exposition de la moelle épinière ou des racines nerveuses). La chirurgie est effectuée par un chirurgien expérimenté qui maitrise les gestes, ce qui permet de réduire le temps d’intervention et le risque infectieux. Par ailleurs, les implants utilisés sont stériles et l’intervention est réalisée dans un bloc chirurgical en conditions stériles. La gestion de la douleur pendant et après la chirurgie est assurée par un vétérinaire qualifié qui suit les règles en vigueur afin d’assurer un confort optimal pour l’animal. Des anti-douleurs seront administrés pendant la chirurgie ainsi que les 5 jours suivants. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-opératoire.

Choix des espèces

L’espèce ovine est un modèle animal de défaut de l’AF couramment utilisé. Les similitudes avec l’Homme concernent la biomécanique du disque, la physiopathologie de la dégénérescence du DIV et de la hernie discale, les anomalies détectées à l’IRM au niveau des DIV atteints et l’évolution clinique. Ainsi, la brebis est un modèle classiquement utilisé en médecine régénératrice du DIV. Par ailleurs, la taille des animaux facilite la réalisation des techniques chirurgicales (taille relativement proche de celle de l’Homme) et leur hébergement en stabulation est aisé (contrairement aux porcs par exemple). Nous avons choisi d’utiliser des brebis adultes (maturité squelettique) âgées de 1 à 3 ans chez lesquelles il est peu probable que des lésions de dégénérescence discale soient déjà présentes (contrairement à des brebis plus âgées).

55 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant sept jours des injections quotidiennes d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de patients atteints de myopathie nécrosante, subissent trois microprélèvements de sang et deux tests de force par traction, avant le prélèvement de leurs muscles gastrocnémiens. L'objet du projet est de vérifier si les anticorps de quatre nouveaux malades déclenchent bien la maladie chez la souris, pour disposer d'un modèle où tester des médicaments. Le porteur écrit que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance ou de perte de poids, tout en prévoyant une gêne de la mobilité du train arrière et un traitement antidouleur quotidien pour tous les lots.

Objectifs

Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante nécrose des fibres musculaires sans infiltrat inflammatoire. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) anti-Signal Recognition Particle (SRP) ou, plus récemment, d'aAc anti-3-hydroxy-3-méthylglutaryl- Coenzyme A réductase (HMGCR) et la corrélation de leur titre avec le myolyse. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris C57BL/6J d'IgG purifiées issues de patients porteurs d’aAc anti- HMGCR ou anit-SRP. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’IgG et de C5b-9 (ensemble de protéines formant un pore dans la membrane) à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc et suggérant un rôle cytotoxique exclusif du complément. Ce modèle nous a permis récemment de tester de nouvelles thérapies avec succès. Cependant, les aAcs de certains malades n'induisent pas de myopathies chez la souris pour des raisons inexpliquées. Les IgG anti-HMGCR et anti-SRP sont purifiées à partir de plasmaphérèse de patient qui sont extrêment rares à obtenir. En relation avec différents hôpitaux en France, nous avons réussi à obtenir des plasmaphérèses de 4 nouveaux malades. L'objectif général de notre programme est d'évaluer la pathogénicité des anticorps de ces nouveaux patients dans le but de les utiliser en cas de résultat positif dans des protocoles d'évluation de l'efficacité de nouveaux médicaments. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.

Bénéfices attendus

Lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal , nous avons pu démontré l'efficacité de molécules thérapeutiques dans (i) l'apparition et (ii) le traitement de la myopathie. Cela s'est traduit par respectivement (i) une absence d'atteinte histologique et de diminution de la force musculaire et (ii) par une réduction significative de l'atteinte histologique et une restauration de la force musculaire. Les plasmaphères de pateints sont rares et épuisables. La possibilité de disposer de nouvelles sources d'anticorps de malades permettra de tester de nouvelles molécules thérapeutiques qui ne peuvent pas être testées dans les modèles in vitro que nous développons parallèlement.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à 3 microprélèvements de sang, d'une durée de moins de 5 secondes chacun. Les souris seront injectées quotidiennement en IP durant 7 jours soit 7 injections d'une durée de moins de 10 secondes chacun. 2 grip test seront réalisés pour chacune des souris à 8 jours d'intervalle, durée moins de 10 secondes. Les gastrocnémiens de tous les animaux seront prélevés sur les souris euthanasiées en fin de protocole.

Impact sur les animaux

L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux autorisés avec ce modèle animal a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercution visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids. Lors des injections IP les souris pouront ressentir un peu de stress du à la contention et l'injection en elle même, mais qui sera de très courte durée. Pour les souris de l'étude qui développeront une myopathie consécutive à l'action pathogéne des anticorps testés une gêne dans la mobilité du train arrière pourra être observée.

Devenir

Le prélèvement des gastrocnémiens pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de la pathogénicité des anticorps de malades dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisée que chez l'animal.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autre protocoles expériementauxautorisés utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'aAcs chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique excat des effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologique obervées lors de ces protocoles.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de celllose et des fibres de coton. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Elle permettra également d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. En effet, les animaux seront observés quotidiennement et l'apparition de signes cliniques, poils hirsutes, perte de poids visible (sans pesée) ou prostration ou lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes seront atteints entraineront la mise en place de des dispositions pour réduire la douleur (conférer paragraphe suivant). Un traitement préventif quotidien (par voie orale) de la douleur sera mis en place pour les animaux de tous les lots. En cas de douleur, un traitement en sous cutané (s.c) sera administré. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. Un analgésique sera administré 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ (injection en s.c).

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.