Troubles musculosquelettiques
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- Troubles urogénitaux
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
3 613 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère, la plupart tuées à l'issue. Le modèle exprime une protéine humaine qui s'accumule dans le système nerveux et provoque une paralysie progressive, dont le porteur bloque l'apparition par antibiotique pendant l'élevage puis la laisse se développer pour tester des candidats médicaments. Les souris malades présentent perte de poids, atrophie musculaire et déficits moteurs, suivies par un score clinique jusqu'à leur mise à mort, les reproducteurs étant conservés pour la lignée. Le porteur qualifie le "besoin médical" d'"immense" et juge le modèle animal "indispensable et non substituable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire à évolution rapide qui conduit au décès des patients dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. Elle se caractérise par une disparition progressive et irréversible des neurones moteurs (les cellules qui commandent les muscles), provoquant une perte progressive des capacités vitales par paralysie des muscles: locomotion, alimentation, respiration,… Bien que les recherches, réalisées ces dernières années, aient permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes mis en jeu au cours de l’évolution de la maladie, les origines de la maladie restent inconnues dans la plupart des cas. Il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Seuls deux composés (qui ralentissent modestement la progression de la maladie dans certains cas) ont été approuvés. Le besoin médical est donc immense et totalement insatisfait. Le modèle murin choisi dans ce projet exprime très fortement une protéine humaine qui va s’accumuler dans le système nerveux central et la moelle épinière. Cette accumulation va entraîner la mort des cellules nerveuses. Ce modèle reproduit la quasi-totalité des signes cliniques de la SLA à travers ses caractéristiques moléculaires - L’accumulation toxique de protéines dans les cellules nerveuses du cerveau et de la moelle épinière, est très représentatif des formes cliniques de SLA (plus de 90% des cas de SLA). - Les signes cliniques sont engendrés par la mort progressive des cellules nerveuses, induite par l’accumulation de protéine, et qui conduit un déficit moteur puis une paralysie musculaire.
Bénéfices attendus
A ce jour il n’existe aucun traitement curatif de la SLA. En parallèle de la prise en charge multidisciplinaire des patients pour diminuer et soulager les symptômes, il existe que deux molécules approuvées qui permettent, au mieux, de ralentir modestement la progression de la maladie. La SLA est une maladie multifactorielle et complexe, dont la plupart des mécanismes sont encore très mal connues. Ce projet permettra : - de mieux comprendre la physiopathologie de la SLA - de développer de nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de la SLA. - La mise en perspective des signes cliniques et des analyses moléculaires effectuées sur les prélèvements de sang permettra de comprendre les mécanismes complexes conduisant à la maladie.
Procédures
Durant l’élevage, tous les souriceaux seront identifiés avec un microtatouage au niveau des doigts puis analysés par génotypage via un prélèvement d’un petit bout de queue. Durant cette phase, aucun animal n’aura de signe clinique, ils seront tous en parfaite santé. Aucun autre prélèvement ne sera réalisé sur ces animaux. Pour l’évaluation des médicaments, les animaux présenteront les signes de la SLA (déficit moteur progressif) et par conséquent seront suivis de manière étroite et rigoureuse afin d’évaluer de manière objective mais non invasive l’évolution de la maladie : - Observation quotidienne des signes cliniques - Evaluation des capacités motrices hebdomadaires (force et endurance musculaire) Les candidats médicaments seront administrés soit par voie oral soit par voie intraveineuse en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques qui seront déterminées. Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. A l’issu de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Durant l’élevage, aucun animal ne développe de signes cliniques dommageables. En effet, le développement des signes cliniques est bloqué par un traitement antibiotique. Tous les animaux seront donc en parfaite santé. Durant la phase de test, les animaux présentent la quasi-totalité des signes cliniques de la SLA après l’arrêt de l’antibiotique : - Perte de poids progressive des animaux - Mort progressive des cellules nerveuses et perte des liaisons nerveuses avec les muscles qui se traduit par des déficiences motrices (tremblements, perte de la coordination des mouvements, pattes postérieurs qui se recroquevillent), une perte de poids et une atrophie musculaire. La toxicité et la tolérance des candidats médicaments seront préalablement déterminées dans des études de tolérance et de pharmacologie. Dans ce projet, aucun effet indésirable n’est donc attendu. Lorsque le produit est administré par voie oral, aucune nuisance n’est attendue. Lorsque le produit est administré par voie intraveineuse, la nuisance est uniquement liée à la piqûre. Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine à l’aide de capillaire, la nuisance est uniquement liée à la piqûre. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. La nuisance est uniquement liée à la piqûre lors d’injection de l’anesthésie par voie intrapéritonéale.
Devenir
A l'issue de la phase d’élevage : - Certains animaux seront utilisés comme reproducteurs pour maintenir la lignée. Les animaux surnuméraires seront euthanasiés. - Certains animaux ne pouvant pas développer la maladie à cause de leur patrimoine génétique seront utilisé dans le groupe contrôle pour les tests d’efficacité (195 animaux). Les animaux surnuméraires seront euthanasiés. - Les animaux développant les signes cliniques de la SLA seront utilisés pour les tests d’efficacité. A l'issue des tests d’efficacité, tous les animaux seront euthanasiés. Ils ne peuvent pas être réutilisés à cause de leur phénotype et l’issue fatale de la maladie.
Remplacement
Les candidats médicaments testés feront l’objet d’une sélection minutieuse avant leur utilisation. Les substances sont préalablement testées, caractérisées et auront fait la preuve de leur efficacité in vitro, avant d’être utilisé sur des animaux. Cependant, aucune étude vitro ou ex-vivo ne peut permettre de faire un lien entre les mutations génétiques, les mécanismes moléculaires et les signes cliniques. La SLA est une maladie multifactorielle complexe. Elle ne peut donc en aucun cas être réduite à une simple mutation ou à un simple mécanisme, le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour : •Etudier, analyser les paramètres physiologiques tels que la réponse immunitaire, le passage de la barrière hémato-encéphalique, l’évolution des biomarqueurs au cours de la maladie ou la correspondance avec les signes cliniques observés. •Valider l’effet thérapeutique sur le phénotype et en confirmer le mécanisme d’action chez l’animal vivant. •Mettre en perspective les effets moléculaires avec les signes cliniques observés et ainsi, comprendre les mécanismes conduisant à la maladie.
Réduction
La phase d’élevage va permettre la génération de souris qui développeront la SLA nécessaire à l’évaluation de l’efficacité des candidats médicaments. Pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux utilisé sera déterminé mathématiquement pour n’utiliser que le strict minimum d’animaux nécessaire mais néanmoins suffisant pour des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. D’après les calculs, le nombre d’animaux à utiliser est de 13 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux est inférieur aux effectifs communément utilisés (± 15 animaux par groupe) dans le cadre des recherches académiques ou dans les ou dans les laboratoires de recherche privés. Pour l’élevage, nous utiliserons la méthode proposée par les éleveurs agréés dans le but de déterminer de manière précise le nombre minimal nécessaire et suffisant de souris reproductrices à la conduite du projet et à la préservation de la lignée.
Raffinement
Pour l’élevage, les animaux seront hébergés en trio de reproducteurs. Dans cette procédure, aucun animal ne développe aucun signe dommageable car l’expression des signes cliniques est bloquée par un traitement antibiotique administré dans l’eau de boisson. Durant la phase de test d’efficacité, les animaux seront observés quotidiennement. Les observations cliniques seront évaluées selon un scoring strict et validé par un grand nombre de laboratoire. Afin de renforcer le suivi des signes cliniques, nous allons donc utiliser plusieurs méthodes de mesures indépendantes : - Score basé sur l’observation clinique - Poids qui reflète l’évolution de la maladie - Evaluation de la force musculaire qui permettra de détecter les signes de faiblesse musculaire et de paralysie - Evaluation de la coordination des membres et des performances motrices Ces mesures permettent de garantir une évaluation précise de l’évolution de la maladie. Le croisement des informations facilitera les analyses et d’étayer les conclusions par plusieurs variables. Cette analyse associée à la parfaite connaissance du modèle, permettra de prévenir de manière plus précoce l’apparition du phénotype dommageable. De plus, une attention particulière sera prêtée à l’environnement local, étant donné que les animaux ayant contracté la SLA présenteront des déficits moteurs significatifs. Les cages comporteront un sol en dur, une litière de sciure, des refuges et des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger. Des croquettes mouillées disposées sur le fond de la cage ainsi qu’une supplémentation en nourriture enrichie humide (complément alimentaire gélifié) sera apportée aux animaux pour faciliter la nutrition et l’hydratation.
Choix des espèces
Pour les maladies neurodégénératives, les signes cliniques dépendent essentiellement de la localisation des lésions (cerveau, moelle, …) et l’efficacité d’un médicament dépend de sa capacité à atteindre les lésions. Le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour évaluer l’efficacité d’un médicament notamment : -la capacité à accéder à la zone d’intérêt (comme franchir la barrière hémato-encéphalique pour accéder au cerveau) - son action au niveau moléculaire et son impact sur les signes cliniques observés. Le modèle animal de souris a été choisi à cause de ses similitudes avec la pathologie humaine : - Au niveau moléculaire : l’accumulation « toxique » d’une protéine humaine dans les neurones du cerveau et de la moelle qui représente, en clinique, 90% des cas de SLA - Signes cliniques: mort des cellules nerveuses de la moelle épinière et perte de la connexion musculaire qui a pour conséquence un déficit moteur progressif menant à la paralysie totale des muscles. Pour l’élevage, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’être en capacité de se reproduire. Pour les tests d’efficacité, nous cherchons à nous rapprocher au plus près du contexte physiopathologique de la maladie qui touche des adultes afin de pouvoir transposer nos résultats à l’Homme. Les animaux des 2 sexes seront utilisés. En effet, d’après les études ayant permis le développement du modèle, les mâles et les femelles développent des signes cliniques comparables, ils peuvent donc tout deux être inclus dans des analyses groupées.
Le rôle de la protéine C activée dans le développement de l’arthropathie hémophilique chez des souris hémophiles A sévères – Projet Multi-établissement EU 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
88 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Elles subissent des ponctions du genou provoquant des saignements articulaires répétés, des injections, une IRM de deux heures et des prises de sang, avant dissection des pattes arrière. Le porteur décrit comme seule nuisance une gêne locomotrice et applique un point limite de perte de poids de 20 %. Il vise à étudier le rôle d'une protéine dans la destruction articulaire et justifie le recours à l'animal par le "besoin d'un modèle vivant, dynamique et doté d'un système vasculaire et locomoteur".
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Pour cela, l’étude du rôle de l’APC nous semble intéressante puisque cette protéine régule d’autres qui sont chargées de la dégradation et du remodelage du cartilage articulaire. Si notre hypothèse est confirmée, alors un inhibiteur de l’APC peut être un candidat thérapeutique pour l’atteinte articulaire chez les hémophiles.
Procédures
Afin de mimer la maladie chez l’homme, les souris vont développer une atteinte articulaire suite à des saignements articulaires répétés. Le rôle de la protéine C activée (APC) va être étudié 7 et 30 jours après 2 ponctions du genou induisant un saignement articulaire. Cette atteinte articulaire va être étudiée en utilisant des méthodes complémentaires : mesures de marqueurs d’inflammation, de dégradation cartilagineuse, l’étude de modification des ARN au niveau des tissus articulaires et du sang, étude histologique avec marquage de molécules responsables de la dégradation articulaire. L’APC sera bloquée par un inhibiteur spécifique et les conséquences de cette inhibition seront comparées à la situation où l’APC est active au niveau du sang et du liquide synovial. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et si douloureux après administration d’un médicament anti-douleur. Après anesthésie et antalgie, les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrières seront disséquées pour l’étude histologique après marquages et colorations spécifiques. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min), la mesure du genou droit (30 sec), une injection (1-2 min), une IRM du genou (120 min), une prise de sang et mise à mort (3-5 min). Les temps exprimé ne comptent pas l’induction et la vérification de la profondeur de l’anesthésie, compter 5min. Afin d’éviter de multiple anesthésie générale, le maximum de geste est groupé comme suit • Anesthésie générale + mesure du genou droit + ponction articulaire à J0, J15 et J30 : temps estimé : 9 min • Injection seule tous les 4 jours: temps estimé : 7 min • Injection d’inhibiteur tous les 4 jours: temps estimé : 9 min • Imagerie par IRM à J42 : temps estimé : 125 min • Prise de sang : 10 min. tous les gestes sont effectués dans l'UE1 à l'exception de l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qsui sont réaisée dans l'UE2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
Les animaux ne ressortent vivant de cette procédure car des prélèvements terminaux pour analyses histologiques et immunohistochimies sont prévus.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie préalables. Au cours de l'étude, les points limites sont appliqués avec comme limite stricte une perte de poids de plus de 20% due à une gêne locomotrice, gravité d'un hématome au point d'injection si les actions de corrections ne sont pas suffisantes.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un inhibiteur des myosines rapides dans la dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme sévère de dystrophie musculaire de Duchenne, ils reçoivent par voie orale un inhibiteur des myosines rapides, subissent des prises de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie et des tests d'agrippement, avant d'être tués pour analyses des muscles. Le porteur affirme tester un modèle qui "mime fidèlement" la maladie de l'enfant et renvoie le bénéfice thérapeutique au "long terme". Il conclut que la question ne peut être obtenue que chez "l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire. En l'absence de la protéine dystrophine, les fibres musculaires sont affaiblies et fragiles, au point de rompre lors d’une contraction musculaire qui agit comme un stress mécanique. Cela conduit à des cycles répétitifs de régénération et de dégénérescence des fibres, accompagnés d'une inflammation chronique douloureuse et d’une perte permanente des fibres musculaires par épuisement de la capacité de réparation du muscle. L'objectif de notre étude est de stopper la progression de la maladie à l'aide de nouvelles molécules qui réduisent la mort des fibres musculaires. L'efficacité d’un composé similaire a déjà été démontrée sur un modèle de souris DMD, cependant moins sévères que notre modèle de rat. Ce projet permettra de valider chez le rat l'efficacité de trois nouveaux composés dans une situation qui ressemble beaucoup à celles des enfants atteints de DMD.
Bénéfices attendus
Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la DMD pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Nous proposons ici de tester des composés innovants qui via un mécanisme protecteur de la membrane des fibres musculaires, améliore la survie de l'ensemble des muscles et réduisent la douleur de l'inflammation causée par la disparition massive des fibres. Ces composés permettront sur le long terme d'accélérer la récupération motrice. Nous projetons ainsi d'identifier une piste innovante qui pourrait devenir un traitement utilisable chez l’enfant en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Procédures
Le traitement sera administré une seule fois par voie orale afin de maîtriser la dose administrée. Le geste dure 15 secondes. Le sang des animaux (1,7 ml au total) sera prélevé en deux fois au sinus rétro-orbitaire, sous anesthésie générale légère et locale. Le prélèvement dure 30 secondes, l'anesthésie complète environ 20 minutes. La durée d'une séquence de grip test est de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Il a été montré que les produits administrés ne sont pas toxiques jusqu’à une inhibition de 50% de l’activité des fibres musculaires rapides (qui confère leur protection contre la mort). Le dosage utilisé, inférieur, sera limité à 15% d’inhibition, ce qui garantit l‘absence de toxicité. La procédure de ce projet inclut des animaux de 4-5 semaines chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont très limitées et ne gênent l'exécution d'aucune de leurs tâches quotidiennes. Ils se déplacent, mangent, boivent, se toilettent et jouent comme leurs frères de portée non atteints par la maladie. L'administration du traitement par gavage utilisera une sonde plastique souple à bout arrondi qui supprime les perforations possibles de l'oesophage avec l'usage d'anciennes sondes métalliques. La contention pour ce geste, les prises de sang et le test d'agrippement est réalisée délicatement, ce qui élimine la réponse de stress de l'animal. Un effet indésirable du test d'agrippement est la cassure d'une griffe trop longue lors du saisissement de la barre, raison pour laquelle nous vérifions avant le test leur longueur et les raccourcissons si besoin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.
Remplacement
Ce qui a pu être testé de l'efficacité des composés sans l'usage d'animaux a été réalisé en amont de ce projet. Les composés que nous allons administrer engage leur cible biologique et réduisent la contraction des fibres musculaires rapides. Leur innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l'éventuelle toxicité du produit administré, mais aussi de tous les composés issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé testé permet-elle dans le modèle sévère de la maladie (le rat que nous utiliserons) de protéger suffisamment les muscles pour que cela confère un bénéfice fonctionnel quantifiable à l’échelle des muscles squelettiques, associée à une diminution également quantifiable des lésions musculaires délétère à l’échelle histologique.
Réduction
Notre laboratoire a cumulé de nombreuses données sur ce modèle de rats DMD. Les calculs de puissance statistique nous recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce que nous avons validé avec d'autres projets terminés. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Puis, nous utilisons une analyse statistique adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible ici de ne pas inclure d'animaux WT, sans perte d'information biologique de référence. Les molécules ont par ailleurs déjà été testées sur des rats sauvages.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage respecte l'alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les outils récents d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle de chien DMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Nous utiliserons des animaux à l'âge de 4 à 5 semaines. Notre étude de caractérisation ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 4-5 semaines permettra d’évaluer la capacité des composé testé à réduire l’endommagement musculaire et par conséquent, à différer l’installation progressive de la fibrose et ses conséquences fonctionnelles sur la musculature striée.
Evaluation d’une immunothérapie pour traiter la fibrose dans la Dystrophie Musculaire de Duchenne dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes d'une forme de myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections d'un traitement, des prélèvements de sang, une échographie cardiaque sous anesthésie et des tests de force, pour évaluer une immunothérapie censée réduire la fibrose musculaire et cardiaque. Le porteur indique que la maladie induit un affaiblissement musculaire et un décès prématuré des souris. Il affirme que les modèles murins restent une "source unique et indispensable" pour évaluer le traitement, les modèles cellulaires servant au préalable.
Objectifs
La myopathie de Duchenne est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations d’un gène qui assure la stabilité structurelle des muscles. Chez les patients, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. Si la recherche d’un traitement curatif pour cette maladie est plus forte que jamais, le besoin médical reste à ce jour non satisfait. En effet, l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement est la difficulté d’accès à leurs cibles en raison d’une fibrose excessive. C’est pour cette raison qu’il est cliniquement pertinent d'explorer une réduction de la fibrose comme une nouvelle piste. L’une de ces pistes consiste à cibler une protéine exprimée spécifiquement à la surface des fibroblastes activés, à l’aide de cellules immunitaires ou particules génétiquement modifiés qui ciblent spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept a préalablement montré que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin d’hypertension. Cette pathologie diffère toutefois de la myopathie, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de traitements innovants dans un modèle murin de myopathie. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la myopathie.
Bénéfices attendus
La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes T spécifiques dans des modèles murins de la myopathie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. Le terme ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la maladie à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permettra également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront 1- l’Injection du traitement (5 min) 2- les Prélèvements sanguins espacés d'une semaine pour les deux premiers et 1 mois plus tard pour le dernier (1 min chacun) 3- Echographie cardiaque réalisé sous anesthésie (5 min) 4- Test de force (10 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues causées par la maladie consistent en un affaiblissement musculaire (respiration haletante, démarche incertaine, fatigue) et une réduction modérée de la fonction cardiaque. Il est à noter que cette maladie induit un décès prématuré (11 mois par rapport à une espérance de vie d’environ 2 ans chez les souris saines). Le pré-traitement peut induire un état transitoire de fragilité (4-7 jours) chez la souris avec notamment une perte de poids. Les prélèvements sanguins et injections peuvent générer du stress chez l'animal et une douleur minime. Les prélèvements et injections n’induisent qu’une très faible douleur. L’échocardiographie nécessite une anesthésie pour garantir l’immobilité de l’animal pendant la mesure (5 min) et occasionne un stress chez l’animal.
Devenir
A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera mise à mort par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (cœur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les données indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.
Remplacement
En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité est mise en place sur des modèles cellulaires. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur la sécurité de ce traitement.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est calculé grâce à des tests statistiques qui seront réalisés pour analyser les résultats et l’utilisation de calcul de puissance statistique pour évaluer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Ces calculs se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe, en prenant en compte des sorties des animaux de protocoles (atteinte de points limites ou décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception de l’injection intra-veineuse et du prélèvement de sang, sont des tests indolores, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse étant donné qu’elle est non invasive. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et de manière hebdomadaire par les expérimentateurs. Une grille d’évaluation des points limites est établie afin de prévenir et limiter la survenue de la souffrance animale. L’animal sera mis sous surveillance accrue et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité.
Choix des espèces
La souris est l’espèce permettant de reproduire la complexité de la myopathie puisqu’aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la myopathie. En outre, les modèles pré-cliniques de la myopathie ont été développés chez la souris et récapitulent la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. L’âge choisi de la souris constituant le modèle sera au stade adulte, plus précisément entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant atteint la fin de leur croissance musculaire et cardiaque. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ce modèle à partir de 4 mois.
Caractérisation de la souris DNM2 R369W et approches thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par amputation de phalanges, subissent des prélèvements de sang à la veine temporale, des injections et des mesures de force musculaire, pour tester une thérapie génique et une thérapie pharmacologique contre une myopathie rare. Les souris des procédures thérapeutiques sont tuées pour l'analyse histologique des muscles, tandis que la lignée d'élevage est gardée vivante pour des projets ultérieurs. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "essentiel" et la souris "indispensable", les modèles cellulaires ne reflétant pas selon lui un tissu vivant.
Objectifs
Les myopathies centronucléaires (CNM) sont des maladies rares avec un fort impact sur la qualité et la durée de vie. Les CNM se caractérisent par une faiblesse des muscles volontaires (= muscles squelettiques). Les patients montrent des retards moteurs ou n’apprennent jamais à marcher, et ils ont des restrictions respiratoires. Notre projet vise à : -Comprendre les étapes du développement de la maladie afin d’identifier des biomarqueurs qui serviront à diagnostiquer cette maladie à un stade précoce à partir d’une simple prise de sang, et à évaluer l’efficacité d’un traitement en comparant la valeur de ces marqueurs avec des sujets sains. -Tester une approche thérapeutique génique en injectant des petites molécules qui seront injectées avant et après l’apparition des premiers signes afin de pouvoir évaluer l’efficacité du traitement d’anticiper (= empêcher le début de la maladie) et d’invertir la maladie (= guérir les souris déjà malades). -Tester une approche thérapeutique pharmacologique en injectant des composés chimiques avant et après l’apparition des signes de la maladie pour évaluer leur potentiel d’anticiper et d’invertir la maladie. Suite aux injections des molécules et composés chimiques, nous évaluerons la force et la structure musculaire des souris afin de pouvoir quantifier l’efficacité des traitements.
Bénéfices attendus
Le projet vise à fournir de nouvelles connaissances sur les voies cellulaires impliquées dans le développement des CNM, et ainsi permettre de valider des biomarqueurs circulants (= dans le sang) permettant l’évaluation de l’efficacité d’un traitement. En outre, nous allons tester deux nouvelles approches thérapeutiques sur un modèle souris de CNM : une approche de thérapie génique et une approche de thérapie pharmacologique. Les résultats sont d’un grand intérêt médical et pourraient conduire à des essais cliniques dans l’objectif de traiter les patients CNM.
Procédures
Nous prévoyons les interventions suivantes : 1) Identification de souris par amputation de phalanges - une fois entre 7 et 10 jours - durée 2 minutes. 2) Prélèvement sanguin à partir de la veine temporale - durée 2 minutes. 3) Injection de petites molécules - durée 2 minutes. 4) Injection de composés pharmacologiques - durée 2 minutes. 5) Mesures de force musculaire - durée 20 minutes
Impact sur les animaux
Les souris CNM présentent une faiblesse musculaire modérée sans impact majeur sur la qualité et la durée de vie. Les approches thérapeutiques par molécules ou composés pharmacologiques visent à augmenter la force musculaire des animaux. Il est néanmoins possible que les traitements aient des effets secondaires indésirables. L'identification, de même que les injections a visées thérapeutiques ou d'anesthésiants pour la mesure de force musculaire peuvent engendrer un stress ou une douleur temporaire chez l'animal.
Devenir
Procédure maintien de la lignée : les souris seront gardées pour des projets ultérieurs. Procédure thérapie génique et pharmacologique : les souris seront soumises à des test de force musculaire puis mis à mort pour des analyses histologiques des muscles.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les voies cellulaires impliquées dans le développement de la myopathie centronucléaire (CNM) et à évaluer l’effet d’approches thérapeutiques sur la fonction musculaire. Pour ces raisons, un modèle animal est essentiel et nous ne pouvons avoir recours à des modèles cellulaires (qui ne reflètent pas un tissu vivant). Les connaissances du système musculaire sont très développées chez la souris, qui représente de ce fait un modèle approprié et indispensable pour étudier la CNM et établir des approches thérapeutiques qui pourraient être transférées aux patients dans l’avenir.
Réduction
Pour l’étude transcriptomique (étude des voies cellulaires), nous prévoyons d’utiliser 6 souris par groupe (souris malades et souris saines), et pour les approches thérapeutiques un nombre de 8 par groupe pour la thérapie génique et la thérapie pharmacologique. Ces nombres ont été calculés pour s’assurer que l’étude soit statistiquement et scientifiquement valable, et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées chez les mêmes souris lors des traitements par approche génique ou pharmacologie, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes sociaux, dans des cages ventilées et enrichies (barreaux à ronger, matériel de nidification), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera vérifié quotidiennement afin de détecter des signes des souffrance à l’aide d’une grille de suivi adaptée. Cette grille de score prend en compte les points des catégories suivants : 1) L'aspect général de l'animal (hérissement des poils, yeux clos, flancs creusés, perte de poids …) : 2) Le comportement / la mobilité́ de l'animal (mobilité́, prostration, dos voûté, isolement par rapport aux autres animaux). Ce suivi sera réalisé de manière journalière sur toute souris traitée par approche thérapeutique et sur les souris CNM non traitées à partir du sevrage et jusqu’à la mise à mort pour expérimentation.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent et courant dans le domaine des myopathies. Son système musculaire est bien étudié et de nombreuses techniques d’analyse sont établies afin de mener à bien les analyses. La dissection des muscles pour les études transcriptomiques se fera à l’âge de 7 semaines afin de pouvoir analyser la régulation des gènes musculaires et de comparer les données avec d’autres résultats obtenus préalablement sur d’autres modèles souris de la maladie au même âge. Pour évaluer l’efficacité des approches thérapeutiques géniques (molécules) et pharmacologiques (composés chimiques), nous allons traiter les souris avant et après l’apparition des signes de la maladie, soit à 4 et à 8 semaines.
Criblage chez le rat (Rattus norvegicus) de molécules d’intérêts dans le traitement des maladies de la contraction musculaire.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
1 377 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ils reçoivent une injection intramusculaire de molécules myorelaxantes, dont certaines jamais testées sur des animaux, puis passent le test du "digit abduction score", une simulation de chute évaluant le réflexe d'écartement des doigts, avant mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur indique attendre pour principales nuisances le stress de la contention et une douleur liée à l'injection. Il juge la pertinence des modèles cellulaires "encore débattue" et conclut qu'ils ne prennent pas en compte la diffusion dans le muscle.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser une nouvelle génération de produits potentiellement d’intérêt identifiés récemment. Cette étude a pour objectif de caractériser le pouvoir myorelaxant de nouvelles molécules ; ces molécules ont été décrites dans la littérature scientifique, notamment en termes d’efficacité in vitro sur les cellules cibles (IC50). Dans cette étude, le produit sera injecté localement aux rats, dans les membres postérieurs pour un suivi de de la tolérance sur un petit nombre d’animaux dans un premier temps. Puis dans un second temps, nous réaliserons un suivi du « digit abduction score » (DAS : Procédure qui consiste en une simulation de chute afin de verifier le reflexe d'ecartement des doigts de la patte pour se receptionner). Cette procédure (injection et test DAS) est brève, indolore, et peu stressante pour les animaux. Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence afin de s’assurer de leur bénéfice.
Bénéfices attendus
Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier plusieurs produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide, et d’autres offrent un effet durable par exemple . Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 1 injection, durée 30 secondes / animal - Pesée des animaux = maximum 8 pesées / animal => 30 secondes / pesée => 4 minutes / animal - Test du DAS (uniquement pour les animaux suivant la procédure 2) = 30 sec / test DAS (environ 28 stimulations sur la durée de l'étude / animal ) => 14 minutes / animal
Impact sur les animaux
Bien que certaines des 25 molécules de ce projet n’aient jamais été injectées chez l’animal, elles font partie de la même famille. Or, certains membres de cette famille ont été injectés, sans aucun signe clinique rapporté. Nous n’attendons ainsi pas de signe clinique particulier après injection de nos molécules. De plus, dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendues sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection et le test du DAS ; une douleur liée à l’injection i.m.
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés car les muscles injectés seront prelevées pour des analyse histo-pathologiques.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Le test DAS nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.
Réduction
Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux.
Choix des espèces
La comparaison de la rapidité d’action entre nos molécules et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est encore débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test DAS chez le rongeur, déjà éprouvé lors de notre étude princeps, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations.
Evaluation de l’efficacité d’un candidat médicament, le masitinib dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de son impact sur la réponse inflammatoire à l’aide d’un modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE).
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 189 étant classées en souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par trois injections pour reproduire une paralysie progressive des muscles proche de la sclérose latérale amyotrophique, avec administration orale de masitinib jusqu'à 42 jours et tests moteurs hebdomadaires de force, coordination et endurance. Le porteur décrit un déficit moteur menant à des paralysies chroniques et une perte de poids, et indique qu'aucun animal ne pourra être réutilisé du fait de ces signes irréversibles. Il présente l'évaluation du masitinib comme "critique et nécessaire" pour renseigner les agences réglementaires et affirme que le modèle animal est "indispensable et non substituable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire qui conduit généralement au décès des patients dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. Elle se caractérise par un déficit moteur puis une paralysie progressive des muscles (incapacité à marcher, manger, parler, respirer). Cette paralysie est dû à la mort progresse des cellules nerveuses dans le cerveau et dans la moelle épinière. La SLA est la plus fréquente des maladies du neurone moteur (2.7 cas/an pour 100 000 habitants en France). Il n’existe aucun traitement curatif à ce jour. Un seul traitement est approuvé en Europe, le Riluzole (Zentiva) qui ralenti modestement l’évolution fatidique de la maladie. Le besoin médical est donc urgent et critique. Le masitinib est une molécule qui un effet protecteur des neurones dans le système nerveux central et périphérique. Il actuellement est en dernière phase de développement clinique pour la SLA et la sclérose en plaque (SEP). Cette molécule a reçu la désignation de médicament orphelin dans la SLA à la fois de l’Agence Européenne du Médicament (EMA) et de la Food and Drug Administration américaine (FDA). En 2023, la FDA a validé une molécule appelée neurofilament comme marquer de l’efficacité d’un candidat médicament pour les maladies du système nerveux. Le but de ce projet est d’étudier l’impact du masitinib sur la libération de ces marqueurs comme le demande la FDA. De plus, la mise en perspective des signes cliniques et des analyses biomoléculaires effectués sur les prélèvements de sang permettra également de comprendre les mécanismes biologiques conduisant à la maladie. Le modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle le plus couramment utilisé pour étudier les maladies neurodégénératives telles que la SLA, SEP, la maladie de Huntington (HD),…. L’EAE a été choisi pour ces nombreuses similitudes avec la SLA: - Les signes cliniques : déficit moteur lié à la mort progressive des cellules nerveuses - Les mécanismes biologiques impliqués (comme l’inflammation) qui conduisent à la mort des motoneurones - Les marqueurs de la maladie tels que les neurofilaments demandés par les agences règlementaires.
Bénéfices attendus
Le masitinib est actuellement à la fin de sa phase de développement clinique dans plusieurs pathologies neurodégénératives dont la SLA, la SEP et la maladie d’Alzheimer. Il a d’ores et déjà reçu la désignation de médicament orphelin pour la SLA à la fois de l’EMA et de la FDA. En 2023, la FDA a validé l’application d’une molécule appelée neurofilament comme marqueurs des pathologies neuro-dégénératives. Ce marqueur est un point de terminaison nécessaire aux développements d’un candidat médicament. Il est donc aujourd’hui critique et nécessaire d’évaluer l’impact des nouvelles thérapies, dont le masitinib, sur le taux de neurofilament dans des modèles précliniques dédié à la SEP et la SLA. Les résultats de ce projet permettront donc de renseigner les agences réglementaires et ainsi d’accélérer la mise à disposition du masitinib aux patients, avant même l’achèvement des études cliniques en cours. Le masitinib pourrait ainsi devenir la première molécule thérapeutique dans le traitement de la SLA. Par ailleurs, la mise en perspective des modifications des signes cliniques avec les analyses biologiques des échantillons de sang permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de la molécule et potentiellement d’étendre son utilisation à d’autres pathologies (Parkinson et Huntington) qui partagent les mêmes marqueurs et certains mécanismes biologiques.
Procédures
Le modèle utilisé consiste à induire les signes cliniques en stimulant le système immunitaire. L’induction de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est effectuée en 3 injections : 1 injection en sous-cutanée et 2 injections en intrapéritonéale. Pour étudier l’action neuro-protectrice du masitinib, la molécule sera administrée par voie orale 1 fois par jour pendant au maximum 42 jours. Tout au long de la période expérimentale, les souris feront l’objet d’un suivi très étroit : - observations quotidiennes. - Enregistrement du poids et les observations cliniques au minimum 3 fois/semaine - Evaluation des capacités motrices (force, coordination, endurance) 1 fois par semaine Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. A l’issu de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont essentiellement liées au modèle EAE et les signes cliniques associés: - L’induction se fait par une injection d’un produit qui peut être irritant. En effet, le produit injecté induit une réaction inflammatoire désiré sur le même principe que la vaccination. Cette réaction peut générer une douleur modérée et transitoire (
Devenir
Le modèle d’EAE utilisé reproduit chez l’animal les signes cliniques de la SLA. Aucun animal ne pourra donc être réutilisé en raison de ces signes sévères, irréversibles et inévitables. A la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le masitinib est actuellement en phase final de développement clinique et a donc été caractérisé de manière très précise par des études préalables. Pourtant, aucune de ces études vitro ou ex-vivo n’a pu permettre d’étudier les liens entre les mutations génétiques, les mécanismes moléculaires et les signes cliniques. En effet, les maladies neurodégénératives comme la SLA sont des maladies multifactorielles et complexes. Ces maladies ne peuvent être réduites à une simple mutation ou à un simple mécanisme dans des cellules isolées. Le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour : •Analyser les paramètres biologiques tels que la réponse immunitaire, l’accès de la molécule au cerveau, l’évolution des marqueurs au cours du traitement comme le demande les agences règlementaires (FDA). •Valider l’effet du médicament sur les signes cliniques et donc confirmer le mécanisme d’action à l’échelle moléculaire.
Réduction
Le candidat médicament testé est le masitinib qui est actuellement en phase final de développement clinique. La toxicité de la molécule et les schémas de traitement sont donc parfaitement maîtrisés. Le nombre d’animaux utilisé sera donc réduit au strict minimum pour répondre à la problématique du projet. Le nombre d’animaux a été déterminé mathématiquement sur la base d’une méthode validé et consensuelle de façon à n’utiliser que le strict minimum d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. D’après les calculs, le nombre d’animaux à utiliser est de 13 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux par groupe est inférieur aux effectifs communément utilisés (± 15 animaux par groupe) dans le cadre des recherches académiques ou dans les laboratoires de recherche privés.
Raffinement
Pendant toute la durée du projet, les souris sont suivies quotidiennement, leur poids sera enregistré et les observations cliniques seront évaluées 3 fois par semaine. L’EAE est un modèle très utilisé et très bien décrit. Dans la majorité des publications, la progression de la maladie est évaluée sur la base des observations cliniques selon un scoring strict, validé et utilisé par l’ensemble de laboratoire utilisant ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser plusieurs méthodes de mesures indépendantes (score + poids + 2 tests de performances musculaires) pour garantir une évaluation précise, quantitative et donc objective de l’évolution de la maladie. Le croisement des informations facilitera les analyses et permettra conclusion étayée par plusieurs variables. Cette analyse associée à la parfaite connaissance du modèle d’EAE, permettra de prévenir de manière plus précoce l’apparition des signes cliniques dommageable. De plus, une attention particulière sera prêtée à l’environnement local, étant donné que les animaux ayant contracté l’EAE présenteront des déficits moteurs significatifs. Les cages comporteront un sol en dur, une litière de sciure, des refuges et des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger. Des pellets mouillés (disposées sur le fond de la cage) et un complément alimentaire gélifié (riche en eau et en ions) seront apportés aux animaux pour faciliter la nutrition et à l’hydratation.
Choix des espèces
Le modèle d’EAE a été choisi par ce que c’est un modèle éprouvé et largement utilisé pour étudier les maladies neurodégénératives tel que la SLA, sclérose en plaque (SEP) ou encore la maladie de Huntington (HD). Pour étudier le masitinib, l’EAE a été choisi pour ces nombreuses similitudes avec la SLA: - Les signes cliniques: déficit moteur progressif menant à la paralysie des muscles - les mécanismes : inflammation du système nerveux central et périphérique qui entraîne la mort des cellules nerveuses - Les marqueurs de la maladie: neurofilament qui est désormais demandé par les agences règlementaires Le modèle d’EAE est développé et utilisé uniquement sur des souris. Ce modèle mime parfaitement la SLA et la SEP qui se développe très majoritairement chez les adultes. De plus, en termes de méthode, l’ensemble des publications indiquent qu’il faut utiliser des souris de 9-13 semaines lors de l’induction. Nous utiliserons par conséquent dans ce projet des souris adultes. Les animaux utilisés seront uniquement des femelles comme préconisé par la littérature scientifique. En effet, il existe une différence significative entre les 2 sexes. Les femelles sont beaucoup plus sensibles à l'induction que les mâles : - Le taux d’immunisation est supérieur chez la femelle que chez le mâle ce qui aura pour conséquence la réduction du nombre d’animaux dans ce projet. - Les signes cliniques sont plus marqués chez la femelle que chez le mâle, les effets seront donc plus marqué ce qui améliore la significativité des résultats.
Evaluation du potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes pour traiter les dysferlinopathies 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
163 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie musculaire rare, elles subissent des tests de force et de coordination, une course forcée jusqu'à l'abandon entretenue par de petits chocs électriques, un isolement de douze heures et des prélèvements allant jusqu'à 15 % de leur volume sanguin, avant un test terminal sous anesthésie et la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur signale une faiblesse musculaire dès quatre mois, une angoisse modérée et des douleurs musculaires liées à la course forcée. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne suffit pas à évaluer une thérapie et qu'il faut mesurer les effets sur l'ensemble de l'organisme.
Objectifs
Les dysferlinopathies font partie des maladies rares du muscle et regroupent notamment la myopathie distale de Miyoshi et la myopathie des ceintures 2B. Les principaux signes cliniques sont la faiblesse musculaire et une atrophie prononcée des muscles, pouvant mener à des déficiences fonctionnelles sévères. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces maladies, et aucune preuve de concept thérapeutique permettant de restaurer les fonctions motrices de souris modélisant cette myopathie. L'objectif de ce projet est ainsi d'étudier le potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes jouant un rôle important dans le muscle et s'étant déjà montrée efficace pour d'autres types de myopathies présentant des dérégulations similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'évaluer deux potentielles thérapies et pourrait permettre de fournir une première preuve de concept thérapeutique en vue de traiter des patients atteints de dysferlinopathie. En outre, cette étude apportera de nouvelles clés de compréhension sur les mécanismes associés à cette maladie et sur les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force et de coordination non invasifs réalisés sur un temps court (une minute environ et 5 mins respectivement) seront réalisés trois fois durant la période d'étude des souris (de 4 à 6 mois d'âge). Chaque test sera réalisé trois fois avec un temps de repos de 10 minutes. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à abandon sera réalisé 1 à 3 fois durant la vie de l'animal et durera au maximum 1h40. Les mouvements spontanées de l'animal seront également quantifiés durant 12h en laissant l'animal seul dans une cage. Des prélèvements de sang de 15% du volume total de l'animal seront réalisés toutes les deux semaines au maximum. Un dernier test sous anesthésie précédant l'euthanasie des animaux permettra de mesurer la force musculaire des souris. Ce test durera au maximum une heure, et l'animal sera surveillé.
Impact sur les animaux
Les premiers signes cliniques apparaîssent à 4 mois chez les souris et se limitent à de la faiblesse musculaire au niveau des membres, pouvant induire une angoisse modérée chez l'animal. Les animaux seront euthanasiés à 6 mois afin d'éviter la progression de la maladie et pour réaliser par la suite des analyses moléculaires. Les nuisances causées par les différents tests sont la chute de l'animal dans une cage remplie de litière entraînant une légère peur chez l'animal, l'extension de l'animal par tirement progressif de la queue par l'expérimentateur, l'isolement de l'animal pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques pouvant entraîner des douleurs musculaires sur le court terme et l'anesthésie générale de l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des deux procédures afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et histologiques. Les animaux issus des accouplements ayant pour but le maintien de la lignée durant la durée du projet seront euthanasiés avant l'apparition des signes cliniques.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de thérapies sur les fonctions locomotrices et la fatigue musculaire. Malheureusement, l'utilisation d'un modèle cellulaire ne suffit pas pour évaluer le potentiel d'une thérapie dans le cas d'une maladie musculaire. En effet, il est nécessaire de pouvoir évaluer les effets sur la contractilité du muscle ainsi que sur l'ensemble de l'organisme. Le modèle murin, étant suffisamment proche de l'homme physiologiquement et structurellement, permet de pouvoir étudier la physiopathologie ainsi que les effets d'une thérapie.
Réduction
Les tests phénotypiques prévus sont faiblement invasifs et permettent donc un suivi longitudinal des souris, ce qui réduit fortement le nombre de souris nécessaires. Les analyses histologiques et moléculaires seront effectuées sur les mêmes animaux après euthanasie. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans une étude traitant des déficits moteurs du même modèle de souris et permettant d'observer des différences de démarche, d'activité locomotrice et de poids de muscles entre les souris myopathes et les souris saines dès 15 semaines d'âge.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre. En cas de difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Lors des mesures in situ, le stress et la douleur liés à la procédure seront éliminés par injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésiants et d'analgésiques. Durant toute l'expérience, la température corporelle de l'animal sera maintenue à sa valeur basale au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Un contrôle visuel de sa respiration sera effectué. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et observé quotidiennement pour vérifier que leur état ne se dégrade pas. Dès lors qu'une perte de poids est observée, les animaux seront alors pesés quotidiennement. L'animal sera sorti de sa cage par les mains du manipulateur disposées en coupe. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour minimiser son stress.
Choix des espèces
Les souris sont suffisamment semblables à l'homme physiologiquement pour être un bon modèle d'étude des maladies musculaires. Dans notre projet, par exemple, la mutation présente chez les souris provient d'une mutation spontanée d'une lignée murine récapitulant les principaux signes cliniques observés chez l'homme. Les souris seront utilisées entre 4 mois et 6 mois d'âge, i.e. adultes. Cet âge correspond à l'apparition des signes cliniques moteurs chez les souris déficientes en dysferline. Le phénotype dégénère progressivement tout au long de la vie de la souris, il est donc préférable de réaliser les tests phénotypiques le plus tôt possible afin de limiter l'angoisse animale.
REALISATION DE TESTS DE TOXICITE ANORMALE CHEZ LE RONGEUR
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons d'Inde : 5000
16 250 souris et cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent une injection unique d'un produit pharmaceutique, déjà commercialisé ou nouveau, par voie intraveineuse, intrapéritonéale, orale ou sous-cutanée, pour un test réglementaire dit de toxicité anormale. Le porteur affirme s'attendre à prouver l'"innocuité" du produit et écrit qu'aucune mortalité ni signe clinique n'est attendu, alors qu'il déclare 5 625 souris en gravité sévère. Sur le remplacement, il indique qu'il n'existe "pas d'équivalent in vitro" et que ce test devient obligatoire dès qu'il figure au dossier d'autorisation de mise sur le marché.
Objectifs
L’objectif de ce test est de détecter une éventuelle toxicité d’un produit pharmaceutique, après son administration aux animaux. Les produits administrés aux animaux sont des produits pharmaceutiques déjà sur le marché ou nouvellement produits. Nous recherchons par ce test une toxicité anormale, c’est-à-dire que nous nous attendons à prouver l’innocuité du produit. A noter que ce test est réalisé en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments à des patients. Le test de toxicité anormale sur rongeurs est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques.
Procédures
Administration par injection intraveineuse, sur souris uniquement : volume maximum 0,5 ml / souris, Administration par injection intrapéritonéale : volume maximum 1 ml / souris et 5 ml / cobaye, Administration par voie orale : volume maximum 1 ml / souris et 25 ml / cobaye, Administration sous-cutanée pour les cobayes : volume maximal 10 ml. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Des injections uniques sont prévues dans les deux procédures de ce projet.
Impact sur les animaux
Les tests sont réalisés sur des produits pharmaceutiques fabriqués selon les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF). Ce test est à visée libératoire – c’est un test requis pour la mise à disposition de certains médicaments aux patients. La mortalité d’un animal ou l’apparition d’un signe clinique sur celui-ci n’est donc pas attendue sur ce type de test libératoire. Les principales nuisances pour l’animal sont : Douleur et stress liés à l’administration des produits pharmaceutiques (par injection IP, IV, SC ou gavage), Stress lié à la contention, Tous signes cliniques potentiels faisant suite à la toxicité anormale, L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés par inhalation d’une concentration progressive de CO2 en fin de protocole ou en cas d'atteinte de points limites (sauf pour la procédure 1). La réutilisation des animaux pour un autre test de toxicité anormal n’est pas possible car cela pourrait interférer avec le résultat de ce second test.
Remplacement
Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : Il n’existe pas aujourd’hui d’équivalent in vitro au test de toxicité anormale. Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM du produit pharmaceutique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal requis par les pharmacopées et les demandes réglementaires (e.g. dossiers d’Autorisation de Mise sur le Marché – AMM). Si l’intervalle de poids requis pour réaliser le test est faible, deux animaux supplémentaires peuvent être commandés. Ce cas peut se présenter par exemple en cas de retest selon la pharmacopée Russe ; il est demandé l’utilisation de 5 souris pesant entre 19 et 21 grammes le jour de l’injection. La marge de poids étant faible, 1 animal supplémentaire sera commandé.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée du protocole Les souris disposent d’un enrichissement de type enviro-dri, spécialement conçue pour améliorer l'activité de construction de nids afin de pouvoir se cacher. Les cobayes disposent d’un enrichissement de type tunnel afin de pouvoir se distraire et se cacher. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse. Une observation quotidienne est réalisée : elle consiste à vérifier l’état clinique des animaux, leur alimentation et leur boisson. En cas de point limite observé, l’animal est euthanasié (sauf pour la procédure 1).
Choix des espèces
Espèces décrites dans les Pharmacopées pour le test de toxicité anormale. Les critères de sélection des animaux sont décrits par les Pharmacopées, ou les dossiers d’AMM : - Entre 17g et 30g au début du protocole pour les souris - Entre 200g et 400g au début du protocole pour les cobayes
Optimisation de vecteurs viraux en thérapie génique dans le système musculaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Différents vecteurs viraux dérivés de l'AAV9 leur sont injectés, dès le premier jour de vie pour une partie, par voie abdominale, intraveineuse ou derrière l'œil, avec un suivi hebdomadaire par bioluminescence. Le porteur reconnaît que l'injection derrière l'œil peut provoquer un gonflement de l'œil, une proptose ou une cécité, et que les anesthésies prolongées peuvent causer des troubles cognitifs. Il compare l'efficacité de ces vecteurs pour la thérapie génique musculaire et juge le recours à l'"organisme entier" nécessaire.
Objectifs
Les vecteurs viraux sont des outils largement utilisés en thérapie génique. Parmi eux, les virus adéno-associés (AAV) présentent de nombreux avantages comparés aux autres vecteurs car ils ne sont pas pathogènes chez l’Homme et présentent une faible immunogénicité ainsi qu’une grande stabilité génétique. Il existe plusieurs sérotypes d’AAV dont l’AAV9 présentant un tropisme pour les muscles. Une des limites de l’utilisation des AAV en tant que vecteur est le manque de spécificité. D'autres AAV dérivés de l'AAV9 décrit dans différentes publications présenteraient une augmentation de la spécificité musculaire en vitro et en in vivo. L’objectif du projet est donc de pouvoir comparer l'efficacité des différents dérivés de l'AAV9 avec l'AAV9 ainsi qu'entre eux chez la souris et par la suite de sélectionner celui qui montrera la meilleure optimisation de l’efficacité et la spécificité dans le muscle tout en limitant celle dans les autres organes. Le but final est d’améliorer la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques du système musculaire.
Bénéfices attendus
L’identification du meilleur sérotype d’AAV ciblant le plus spécifiquement les muscles et moins les autres organes permettra une meilleure efficacité des thérapies géniques applicables aux maladies musculaires.
Procédures
La cohorte « injections intrapéritonéales » seront soumises aux procédures suivantes : -Injection intrapéritonéale unique au premier jour post-natal, 1 minute par animal -Injection sous cutanée (1minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte « injections intraveineuses » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intraveineuse (1 minute) unique par la veine caudale chez la souris éveillée -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte "injections rétro-orbitales" seront soumises aux procédures suivantes :- Injection rétro-orbitale (1 minute) unique chez la souris sous anesthésie -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence
Impact sur les animaux
L’injection peut provoquer chez l’animal un stress dû à l’acte, ainsi qu’une perte de poids. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur transitoire chez l’animal. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal. L’injection rétro-orbitale peut provoquer l'apparition de gonflement oculaire au site d'injection, une proptose ou encore une cécité. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal.
Devenir
Notre projet nécessite la collection d’organes pour l’analyse au niveau histologique et moléculaire
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être remplacées par des tests in vitro sur des lignées cellulaires musculaires car celles-ci ne permettent pas l’étude de l’impact de l’AAV sur un organisme entier. En effet seul le modèle animal pourra nous permettre l’étude de la bio distribution d’un produit injecté. De plus, le modèle murin est physiologiquement assez proche de l’Homme, ce qui va nous permettre une étude représentative de l’efficacité et de la spécificité des différents vecteurs viraux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur le nombre de virus et de doses à tester par âge. Ce nombre a été basée sur de précédentes études similaires et permet d’assurer une robustesse statistique nécessaire à l’interprétation des résultats. L’expérience de bioluminescence, qui est une expérience permettant de visualiser la localisation du virus dans l'animal, nous permet d’avoir un suivi hebdomadaire de l'expression du virus chez la souris, ce qui nous évite la création de plusieurs groupes de souris à différents âges.
Raffinement
Une alimentation enrichie en plus de l’alimentation inscrit dans l’agrément de l’EU sera mis en place si une perte de poids (inférieure à 22 grammes) est observée suite à l’injection des virus. Les animaux seront surveillés chaque semaine jusqu’à leur mise à mort. Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. De l’ocrygel sera appliqué dans l'ensemble des procédures expérimentales pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les point limites seront déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement, réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration de l’efficacité et de la spécificité du vecteur viral, nous avons besoin d'effectuer des expériences in vivo sur modèle animal. Des projets similaires sur ce modèle animal ont déjà été publié, l’utilisation de ce modèle s’inscrit donc dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale utilisera des souris dès le premier jour de naissance. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intraveineuse utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. A partir de la modification, La cohorte RO à P1 utilisera des souris dès le premier jour postnatal. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte RO à 6w utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. Le groupe de 10 souris pour l'apprentissage du geste RO à P1 utilisera des souris à P1.
Traitement de la fibrose par des cellules T génétiquement modifiées pour améliorer la thérapie génique dans les maladies musculaires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère, pour tester des cellules immunitaires modifiées contre la fibrose musculaire. Ces souris modèles de dystrophie reçoivent des injections de cellules anti-fibrose puis de vecteurs de thérapie génique, une échographie cardiaque sous anesthésie et un test de force par pincement de la queue, avant d'être tuées pour prélever muscles et cœur. Le porteur annonce peu de toxicité attendue et décrit des douleurs liées aux piqûres. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et que l'interaction des lymphocytes avec les cellules cibles exige un milieu physiologique.
Objectifs
Notre laboratoire cherche à traiter un certain type de myopathies (maladie des muscles) qui comprennent en particulier la dystrophie musculaire de Duchenne et les dystrophies musculaires des ceintures. Ces myopathies sont des maladies génétiques rares, progressivement invalidantes et conduisent à la perte de la marche. Le muscle sans ses protéines structurales finit par se détruire puis l’apparition de la fibrose rigidifie le tissu et entraîne de sévères complications. Aucun traitement curatif n'est actuellement disponible. Des approches de thérapie génique sont en cours d’étude et consistent à introduire un gène médicament dans l’organisme du patient à l’aide d’un vecteur viral inoffensif pour remplacer le gène malade et rétablir le fonctionnement de la protéine. Cependant, la présence de fibrose qui se développe au cours du temps, empêche le vecteur de thérapie génique de pénétrer correctement dans les tissus atteints réduisant ainsi son efficacité thérapeutique. Récemment, il a été montré dans des modèles de souris que certains types de cellules pouvaient être utilisés pour éliminer les cellules responsables de la fibrose. Il s’agit de lymphocytes T qui sont des cellules du système immunitaire et qui participent naturellement à la lutte contre les agents pathogènes menaçant notre intégrité physique. Ces cellules possèdent un récepteur qui va leur permettent de reconnaitre et de se fixer sur un déterminant que l’on appelle antigène, présent à la surface d’autres cellules et ainsi pouvoir éliminer ces cellules ciblées. Il est possible de modifier ce récepteur pour obtenir une cellule avec un récepteur spécifique de la fibrose. Ces cellules sont déjà utilisées chez l’homme dans le traitement de certains cancers du sang. Nous avons déjà démontré l’efficacité de ces cellules pour réduire la fibrose du muscle squelettique dans un premier modèle de souris. Nous souhaitons maintenant étendre cette preuve de principe à un autre modèle présentant des problèmes de fibrose à la fois dans le cœur et le muscle squelettique pour définir si l’approche peut être généralisée. Nous souhaitons enfin modéliser chez la souris une approche thérapeutique combinant un traitement par ces cellules ciblant la fibrose avec une thérapie génique pour traiter les dystrophies musculaires.
Bénéfices attendus
Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Il vise à valider l’effet thérapeutique des cellules anti-fibrose pour un groupe de maladies humaines sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie, et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.
Procédures
- Prélèvement de sang: 1 seul prélèvement sous anesthésie gazeuse pour vérifier la présence des cellules anti-fibrose, durée 5 minutes. - Injection des cellules anti-fibrose sous anesthésie gazeuse : 2 injections à une semaine d'intervalle, durée 5 minutes. - Injection de vecteurs de thérapie génique sous anesthésie gazeuse : 1 seule injection 15 jours après la dernière injection de cellules, durée 5 minutes. - Pour l’évaluation de la fonction cardiaque, les animaux sont soumis à une échocardiographie en fin de protocole. Les animaux sont anesthésiés et maintenus dans cet état tout au long de l’examen d’une durée de 20 minutes. - Pour le test de force musculaire, le test est limité à 5 min et ne peut être réalisé qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : douleur de piqûres pour injection du traitement et pincement de la queue pour le test de force musculaire. Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies.
Devenir
Les animaux de chaque procédure seront tous euthanasiés pour collecter les muscles squelettiques et le cœur et analyser au laboratoire les effets de nos traitements.
Remplacement
Nous réalisons systématiquement des tests préalables in vitro pour exclure les cellules anti fibrose de mauvaise qualité. En effet, les cellules sont d’abord contrôlées et testés fonctionnellement in vitro avant leurs injections. Nous vérifions le phénotype des cellules en mesurant l’expression de différents marqueurs d’activations et de différenciations, et nous testons leurs capacités à reconnaître et à tuer leur cible. Afin de valider l’effet ces cellules sur la fibrose in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro n’est capable de développer cet aspect de la pathologie. En effet, il n’existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et l’interaction et l’élimination des cellules fibrotiques par les lymphocytes T nécessite un milieu physiologique où la réponse immunitaire peut avoir lieu.
Réduction
Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 212 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôle pour les différents modèles évalués. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Nous administrerons les cellules anti-fibrose par voie sanguine car c’est le moyen le plus efficace et le moins invasif pour cibler tous les muscles de l’organisme. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Nous privilégierons des prélèvements de sang à la veine submandibulaire plutôt qu’au sinus rétro-orbitaire. Les quantités de cellules anti fibrose injectées sont faibles donc aucune toxicité n’est attendue. Les doses de vecteurs de thérapie génique administrées aux souris ne seront pas suffisantes pour induire de toxicité hépatique ou cardiaque ni même de douleur. Néanmoins une surveillance de l’état général des animaux sera effectuée régulièrement. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi. Aucun animal n’est seul dans une cage, sauf si problème d’agressivité.
Choix des espèces
Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Les modèles murins inclus dans ce projet portent des anomalies génétiques ciblant le gène de la pathologie chez l’homme qui va entraîner le plus souvent des désordres musculaires sans impact sur l’activité naturelle de la souris. Ces modèles permettent d’analyser les perturbations de la fonction musculaire et sont donc pertinents pour nos études. Le développement de la fibrose musculaire est progressif et varie d'un muscle à l’autre. Typiquement, dans les deux modèles de souris, pour des souris âgées de 2 mois, le diaphragme et un muscle spécifique du mollet (gastrocnemius) sont déjà très fibrosés alors que le cœur n’est pas encore atteint. Il faut attendre minimum 6 mois pour voir apparaitre du collagène dans le cœur de souris malades. D'autres muscles du mollet (par exemple le tibialis anterieur) présentent une fibrose variable à 2 mois alors qu’à 6 mois le processus fibrotique est déjà terminé. Chacun des deux modèles étudiés développent de la fibrose entre 2 et 6 mois en fonction des cycles de régénération musculaire. Nous utiliserons donc pour ce projet des souris jeunes d’environ 2 mois pour lesquelles le processus de fibrose est juste présent dans les muscles squelettiques et des souris plus âgées de 6 à 10 mois dans lesquelles le processus de fibrose est présent dans le cœur.
Thérapie pour les myopathies à agrégats tubulaires – Orai1V109M, caractérisation et preuve de concept
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour tester une lignée porteuse d'une mutation proche de celle des patients atteints de myopathie à agrégats tubulaires. Elles subissent des tests de force et de locomotion répétés chaque semaine, un test de saignement pour évaluer la coagulation et des injections de traitement, avant une mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur présente la plupart des tests comme non invasifs tout en décrivant du stress et des douleurs liées aux injections. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité musculaire ni les effets sur un organisme entier, s'agissant d'une maladie multisystémique.
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM), associée au syndrome de Stormorken (STRMK) est une maladie touchant notamment les muscles, la coagulation sanguine et la peau. Cette myopathie peut être causée par différentes mutations génétiques, et il manque encore des modèles adaptées pour étudier la maladie et la traiter. Ce projet vise donc à étudier une nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Si les principaux signes de patients sont trouvés chez les souris, cette lignée serait confirmée comme un modèle approprié pour le TAM/STRMK. Ce modèle permettra de mieux comprendre le syndrome TAM/STRMK, en fonction de la mutation. En plus, dans ce projet, nous mettrons également en œuvre une stratégie thérapeutique visant à prévenir et à inverser la maladie dans le modèle murin en ciblant un acteur clé de la cause de la maladie.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d’approfondir notre connaissance des causes et du fonctionnement de la maladie. De plus, avoir en notre possession des modèles TAM/STRMK nous permettra de trouver la thérapie la plus appropriée, en fonction de la cause génétique spécifique. Enfin, cette étude présente un intérêt pour un éventail plus large de maladies comme la dystrophie de Duchenne ou la pancréatite aiguë.
Procédures
Des tests de comportement seront réalisés une fois par semaine sur les souris vivantes, à partir de 1 mois (cohorte 1) ou 4 mois (cohorte 2) et jusqu'à 4 mois (cohorte 1) ou 8 mois (cohorte 2) d'âge. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test permettant de mesurer la force musculaire des pattes de l’animal dure 10 secondes, et sera répété 3 fois par jour. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement, utilisé pour évaluer la coagulation sanguin, sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. Le test de production de force du muscle durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera euthanasié. Le test pour l'obtention du sang sera répété 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections pour administrer le traitement prendront environ 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Le nouveau modèle peut avoir un impact indésirable sur l'animal. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. De plus, les injections administrées pour le traitement peuvent causer de la douleur à l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.
Réduction
Dans le cadre de notre expérimentation, nous employons des tests phénotypiques non invasifs, ce qui signifie que nous n'occasionnons aucun préjudice aux animaux que nous étudions. Cette approche nous permet d'effectuer un suivi longitudinal en répétant les expériences sur les mêmes individus au fil du temps. En ce qui concerne les analyses moléculaires et histologiques, elles seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui évite de constituer un groupe d'animaux pour chaque point du suivi sur la durée. . Nous cherchons également à réduire au minimum le nombre d'animaux afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nos recherches antérieures ont montré que l'utilisation d'un maximum de 15 souris par groupe est nécessaire pour mener à bien une étude concluante. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysées avec des statistiques adaptés.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 h jour/nuit sera imposé. Les animaux recevront de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. Le milieu sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l’aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo ce qui limite le développement de la douleur. Afin de diminuer le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi longitudinal. Pour le temps de saignement et les prélèvements sanguins, l'animal sera anesthésié. Ainsi, pour les mesures de force musculaire, l’animal sera anesthésié avec un mélange de produits anesthésiants et analgésiants permettant d’éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L’animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure afin de maintenir la température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de souffrance de l'animal, nous mettrons en place des mesures pour minimiser son inconfort et sa douleur. Nous utiliserons une grille de scoring pour évaluer le niveau de douleur observé chez l'animal. Si nous constatons un niveau de douleur élevé, nous prendrons les mesures appropriées pour soulager la douleur et assurer le bien-être de l'animal. La grille de scoring nous permettra de surveiller attentivement l'état de l'animal et d'adapter les interventions nécessaires pour réduire toute souffrance.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris afin de mieux comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes suite à une modification génétique, ainsi que pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Cette approche globale de l'organisme revêt une importance particulière dans le cadre de notre étude sur le TAM/STRMK, une maladie multisystémique. Ayant précédemment étudié le TAM/STRMK dans un autre modèle murin de la maladie, nous souhaitons approfondir nos connaissances en utilisant cette nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Les souris utilisées seront étudiées à l'âge adulte, après 4 semaines jusqu'à 8 mois (pour la caractérisation de l'animal), et après 4 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement).