Troubles musculosquelettiques

64 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose quatre biomatériaux sous la peau par chirurgie, avec un suivi au microscanner toutes les deux semaines pendant deux mois, pour tester un nouveau support destiné à la régénération osseuse. Le porteur n'attend comme seul effet indésirable qu'une réaction inflammatoire qu'il juge "peu probable". Le résumé décrit le réveil des rats après l'opération sans indiquer leur sort final, que le tableau du RNT classe pourtant comme une mise à mort, cohérente avec l'analyse des implants.

Objectifs

La consolidation des pertes de substance osseuses lors des reconstructions osseuses représente un problème majeur dans les domaines de la chirurgie orthopédique, de la traumatologie et de la chirurgie maxillo-faciale. Ces troubles peuvent nécessiter l’utilisation d’une greffe osseuse afin d'obtenir une consolidation osseuse. Bien que la greffe osseuse soit toujours considérée comme la référence pour les reconstructions osseuses, elle est associée à un taux important de complication au niveau du site de prelevement de la greffe. En outre, les quantités d'os disponibles pour un seul patient sont limitées. Par conséquent, les substituts osseux ayant une composition aussi proche que possible de celle de l'os natif offrent des alternatives intéressantes. Parmi eux, l'allogreffe ainsi que les céramiques représentent les substituts osseux les plus utilisés. Outre la greffe osseuse ou les substituts osseux, l'un des moyens les plus efficaces pour améliorer la formation et la reconstruction osseuses est la thérapie protéique, qui consiste en l'application locale de facteurs de croissance favorisant la production osseuse, tels que les protéines morphogéniques osseuses (BMP). Actuellement, la BMP-2 et la BMP-7 sont utilisées en pratique clinique et ont donné des résultats prometteurs. Ces BMP ont besoin d’un support afin d’être déposé sur le site chirurgical. Les supports utilisés aujourd’hui sont des éponges ou des pâtes de collagène. Néanmoins, la BMP a une faible faible affinité pour le collagène, ce qui nécessite des doses très importantes de BMP entrainant un risque de complication plus important et un coût beaucoup plus élevés. Dès lors, afin d'augmenter les applications cliniques de la BMP, il est indispensable de disposer de différents types de supports présentant une forte affinité pour le BMP. Le but de cette étude, est l’étude d’un nouveau support pour la BMP.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre de montrer que le film réticulé avec et sans BMP2 est biocompatible et n'est pas à l'origine de phénomènes locaux ou systémiques néfastes pour la santé du receveur et d'autre part que les tissus du receveur ne sont pas susceptibles d'altérer le matériau au détriment de ses qualités intrinsèques ou au risque de générer des produits de dégradation toxiques. Cette étude servira donc à prouver l'absence vraisemblable d'effet délétère du film et de la BMP2, et d'autre part, accumuler des données prédictives du comportement in vivo du matériau.

Procédures

1 seule procédure sera réalisée sur les 64 rats : - Mise en place de 4 implants en sous cutanés (4 incisions). Fermeture de la plaie à l’aide d’un surjet intradermique avec un monofilament 4-0 (polyglecaprone 25). L’intervention durera 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les seules nuisances ou effets indésirables de cette étude sur les animaux seraient une réaction inflammatoire anormale ce qui semble peu probable au vu des tests préalables.

Devenir

A l’issue de l’intervention chirurgicale d’implantation, les rats seront reveillés dans une cage à induction chauffée et seront ensuite remis avec ses congénères une fois réveillé.

Remplacement

De nombreux modèles in vitro ont été mis en place pour étudier la dégradation d’un matériel. Cependant, les interactions matériel-hôtes sont importantes et nécessitent une étude in vivo. Les données manquantes sur les propriétés anti-inflammatoires, sur la biocompatibilité et la dégradation de matériel ne peuvent être menées que sur l’animal entier vivant : la réaction inflammatoire et hémodynamique sont des processus vivants et dynamiques, mettant en jeu des mécanismes complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro. Lorsque les mécanismes biologiques entrent en jeu dans le processus inflammatoire de dégradation, on ne peut vérifier la biocompatibilité que dans un organisme vivant.

Réduction

Des études in vitro ont été menée au préalable afin de sélectionner les formulations d’implants les plus intéressantes à tester in vivo pour réduire au maximum le nombre de tests et le nombre d’animaux. De plus des études bibliographiques ont été menées afin de choisir au mieux le modèle animal et le matériaux contrôles. Afin de réduire le nombre d’animaux, les mêmes animaux seront utilisés pour l’étude de biocompatibilité et l’étude de biodégradation du film.

Raffinement

64 rats seront inclus dans l’étude. Tout le projet sera conduit dans des locaux agrées, avec du personnel dédié et expérimenté. Un protocole précis de prémédication, d’analgésie, d’anesthésie est mis en place. Les rats auront une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant l’implantation. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnée, avec eau et alimentation ad libitum, dans des conditions de température et d’hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. L’injection d’hydrogel sera réalisé sous anesthésie générale avec analgésie préopératoire et post-opératoire par un vétérinaire. Les animaux seront observés quotidiennement : état général, alimentation, abreuvement, nettoyage, respiration, morbidité et mortalité. En cas d’animal considéré comme anormal, la personne en charge des observations : -manipulera l’animal pour confirmer ou infirmer cet état -Toutes anomalies cliniques seront signalées au vétérinaire pour un examen clinique complet si nécessaire. La douleur et le bien-être sont évalués selon des paramètres précis. En cas de signe de douleur importante, des antalgiques seront administrés jusqu’à disparition des signes. Si une souffrance et/ou une détresse de l’animal est mise en évidence, des mesures seront directement mise en place : fin de la procédure, traitement afin de soulager la souffrance. Les animaux seront hébergés en cage collective, dans un milieu enrichi avec des maisonnettes, de la paille, du coton et des bois à ronger. Différents enrichissements seront proposés en alternance pour introduire de la nouveauté.

Choix des espèces

Le rat est un modèle couramment utilisé pour évaluer l'inflammation et pour étudier le délai de dégradation et l'effet de différentes modalités de traitement. L’évaluation de la dégradation au contact du tissu hôte est primordial dans l’étude des biomatériaux. Cette évaluation a été traditionnellement réalisée dans des modèles d'implantations sous-cutanées, intrapéritonéales et intramusculaires chez les rongeurs (souris et rats). Les modèles murins sous-cutanés, intramusculaires et intrapéritonéaux sont des outils utiles pour évaluer l'effet des médiateurs anti-inflammatoires et inflammatoires. Quelle que soit l'application finale prévue des biomatériaux, les modèles d'implantation sous-cutanée et intramusculaire offrent des informations sur l'effet direct du biomatériau au niveau du site d'implantation. L'application clinique finale étant une implantation osseuse, l'implantation sous cutanée est choisie. Les implants seront insérés dans le tissu sous cutané de rats adultes, conformément aux dispositions de la norme ISO 10993-2. Pour plusieurs de ces raisons, nous avons choisi d'utiliser des rats comme modèle pour réaliser l'étude de dégradation et de biocompatibilité du film enrichi en BMP-2.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie d'implantation sous-cutanée de biomatériaux destinés à la régénération osseuse, puis est tuée à deux ou quatre semaines pour analyse histologique de la vascularisation. Le porteur signale une gêne ou une douleur légère et de rares complications comme une infection ou une réouverture de suture, reprise sous anesthésie. Il indique que ces dispositifs destinés à l'humain doivent d'abord être testés chez un petit animal faute de méthode in vitro évaluant à la fois formation osseuse et vascularisation.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses en chirurgies orale et orthopédique représentent un réel défi. Les moyens de reconstruction actuels font souvent appel à des greffes autologues qui sont disponibles en quantité limitée et peuvent être source de complications post-opératoires pour les patients. L’ingénierie tissulaire osseuse cherche à développer de nouveaux substituts osseux d'origine naturelle pour pallier aux inconvénients de l'autogreffe. A titre d'exemple, dans le cadre de la pose d’un implant dentaire, il est souvent nécessaire de régénérer l’os manquant pour stabiliser ce dernier. Cette régénération peut employer différents dispositifs médicaux tels que : (i) des matériaux de comblement qui remplacent l'os ou favorisent la régénération osseuse et/ou (ii) des membranes qui jouent un rôle barrière pour prévenir l’infiltration cellulaire des tissus mous et préserver les cellules osseuses pour régénérer l’os. L’objectif de ce projet est de synthétiser des substituts osseux d’origine naturelle qui vont favoriser la cicatrisation de l'os et par conséquent, favoriser la formation de nouveaux vaisseaux sanguins.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouveaux dispositifs médicaux implantables favorisant la néovascularisation et la régénération osseuse.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie d'implantation sous-cutanée (acte chirurgical unique d'une durée maximale de 10 minutes).

Impact sur les animaux

L'implantation en site sous-cutané peut entraîner une gêne voire une douleur légère. De rares complications post-opératoires sont à envisager : infection au site de l'incision ou ré-ouverture des points de suture. Pour toute complication, un nettoyage du site opératoire par l’application d’un antisesptique sera réalisé. La rupture d'un point de suture entraînera éventuellement une reprise de ce dernier en fonction de la cicatrisation de la plaie. Cette opération sera réalisée sous anesthésie et avec application d’un analgésique. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie.

Devenir

Après les temps pré-définis (T0, 2 et 4 semaines après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider la biocompatibilité et le pouvoir angiogénique du biomatériau étudié.

Remplacement

La cytotoxicité des matériaux utilisés aura au préalable était évaluée in vitro selon les recommandations de la norme NF EN ISO 10993. Brièvement, les matériaux sont incubés dans du milieu de culture pendant 72h à 37°C. Deux tests sont employés pour évaluer la cytotoxicité des matériaux par contact indirect. Leur potentiel à favoriser la formation de vaisseau sanguins aura également était analysé. Les produits destinés à être implantés chez l'homme doivent au préalable être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro qui permettrait d’évaluer simultanément la formation osseuse et la vascularisation. Ces matériaux doivent au préalable être testés dans un modèle de petit animal (ici la souris). Si les résultats obtenus sont satisfaisants d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré in vitro une absence de cytotoxicité, et une seule lignée de souris sera utilisée. Trois temps expérimentaux sont envisagés pour récolter les données permettant la mise en évidence de l'inflammation aigüe, de la reconnaissance de corps étrangers, de la fibrose, et des différents processus de vascularisation et d’ostéo-induction. Pour chaque temps expérimental : - un groupe témoin négatif : poche sous-cutanée laissée vide, pour évaluer l’impact de la lésion seule ; - un groupe de référence : matériau sans principe actif, pour tester la capacité du matériau seul à induire et soutenir le processus d'ostéo-induction ; - 2 groupes expérimentaux : matériau avec le principe actif incorporé de différentes manières. Enfin, 6 échantillons par condition expérimentale doivent être analysés pour permettre une analyse statistique des données (avec le test de Kruskal-Wallis). Ces échantillons explantés à l'issue des temps expérimentaux seront utilisés pour plusieurs types de marquages et détections, permettant de collecter un maximum d'informations sur les animaux utilisés. Deux implantations seront réalisées par souris, en tenant compte de la taille du matériau et de la taille des animaux, ce qui permet de diviser par deux le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse des animaux, une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux (5 souris par cage). Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toute source de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. La chirurgie se déroulera sous anesthésie générale à l’isoflurane. Afin de réduire la souffrance des animaux, des analgésiques seront utilisés lors de l’opération, puis de nouveau en cas de douleur après l’opération. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, la souris reviendra dans sa cage d’origine. Ensuite, un suivi hebdomadaire sera effectué pour chaque animal en complétant une grille de score pour évaluer son bien-être. Concernant les compétences des expérimentateurs, ceux-ci possèdent les qualifications nécessaires, la formation réglementaire et des formations continues (formation à l'expérimentation animale de niveau expérimentateur et/ou concepteur). La maîtrise de la contention et des différents types d'injections à appliquer sont également maîtrisés par les expérimentateurs. Le personnel de l'animalerie possède toutes les compétences pour s'assurer du bienêtre et du suivi des animaux au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, présence de litière en copeaux de peupliers et des jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.

Choix des espèces

L’espèce C57BL/6 est connue pour son fond génétique uniforme permettant une meilleure reproductibilité au sein d’une même condition. Ces souris sont courrament utilisées et décrites dans la littérature ce qui permettra de comparer les données obtenues avec celles de la littérature. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines (25-30 g) afin de faciliter leur manipulation pour l´implantation en sous-cutanée

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à huit ou neuf semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles reçoivent des injections de virus dès les premiers jours de vie, puis huit tests dont l'immersion de la queue en bain chaud et la plaque chauffante pour mesurer leur sensibilité à la douleur, et une mesure musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur vise une "preuve de concept" de thérapie génique présentée comme une étape vers les essais cliniques, bénéfice formulé au conditionnel. Il affirme que les effets sur les nerfs et les muscles ne s'évaluent que sur l'organisme entier, hors de portée d'une culture de cellules.

Objectifs

Le but de ce projet est de consolider une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques d’injections de virus adéno-associés, couramment utilisés dans la recherche médicale.

Bénéfices attendus

Le succès de ce projet fournira une première stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert. Ce projet permettra également de déterminer si une myopathie coexiste avec la neuropathie chez les patients.

Procédures

Une partie des animaux (10) sera utilisée pour un entrainement à une technique d’injection. Les autres animaux (320) seront injectés (durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés. 80 animaux seront injectés entre le 3ème et 5ème jour après la naissance et 240 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 9 semaines, les animaux seront soumis à une série de 8 tests comportementaux : - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x20s max en tout), -mesure de réactivité sur plaque chauffante (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse ; et, -mesure des propriétés contractiles musculaires in situ, sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil) pour évaluer la force musculaire développée.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le second modèle utilisé dans cette étude présente des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Le phénotype général des souris n’a pas été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale de même que la mesure de force musculaire in situ.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 ou 9 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage et leur souffrance sera évaluée quotidiennement : capacité à se retourner/à se mouvoir, couleur de la peau. Après le sevrage, les animaux seront hébergés à plusieurs par cage, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson/nourriture. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. La zone d'injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) pendant les 3 jours suivant l'injection afin de prévenir l’apparition d’une infection. Afin de réduire le stress lié à certaines expériences, une session de familiarisation avec le matériel sera effectuée. Pour la mesure d’électromyographie, l’animal aura une anesthésie gazeuse tout au long de la procédure afin de supprimer le stress lié à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale et celle-ci sera contrôlée à l’aide d’une sonde rectale. Un produit sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. De même lors des mesures de force, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, la température de l’animal sera maintenue par une plaque chauffante, sa respiration surveillée et l’animal sera mis à mort avant son réveil pour prélèvement et analyse des tissus. En cas de douleur au cours de l’étude, un analgésique sera administré. En revanche, si l’animal devait réaliser des tests sensitifs, les antidouleurs risquant de perturber les résultats aux tests, il sera mis à mort prématurément.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice, la conduction nerveuse et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous testerons différentes conditions d’une thérapie génique (prévention ubiquitaire, réversion ubiquitaire et réversion tissu-spécifique). Nous étudierons les effets de ces injections à 8 ou 9 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si les différentes modulations sont bénéfiques.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à huit semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles passent par des tests de force et de coordination, suspension à une grille retournée, tapis roulant et barre crantée, puis une mesure de la force musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur cherche une "preuve de concept thérapeutique" par croisement génétique pour une maladie qu'il décrit comme incurable, bénéfice formulé au conditionnel. Il affirme qu'une étude sur cellules ne peut suffire car les effets sur la coordination et la force ne s'évaluent que sur l'organisme entier.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable.

Procédures

Une partie des animaux (14) sera utilisée pour évaluer le phénotype des souris transgéniques (analyses purement observatoires de la naissance à 8 semaines). Une partie sera utilisée uniquement pour les croisements (21 ou 42). L’autre partie des animaux (entre 80 et 160 en fonction des résultats obtenus) seront soumis à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire et la coordination motrice. Pour évaluer leur force générale, leur durée de suspension à une grille retournée sera mesurée (durée 3x60s). Pour évaluer leur coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant (max 60s) et une barre crantée (10x30s environ). Pour évaluer la force musculaire développée, la mesure des propriétés contractiles se fera sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil).

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Pour les animaux transgéniques, la modulation d’expression du gène d’intérêt peut engendrer une faiblesse musculaire, nous effectuerons une étude de phénotype dommageable. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force générale, le fait d’être suspendu à une grille engendre du stress physique chez l’animal.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement quotidiennement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. Des nids seront disposés dans chaque cage et la litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Si les animaux transgéniques sont très faibles, de la nourriture en gel leur sera procurée. La plupart des tests réalisés sur les animaux dans cette étude sont non invasifs, ce qui limite la probabilité d’apparition de douleur. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de douleur observée au cours de l’étude, un analgésique sera administré (buprénorphine à différentes doses selon l'intensité de la douleur). L'étude sera stoppée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous ferons un croisement génétique de souris et nous étudierons les effets de ce croisement à 8 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts moteurs et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si la modulation de ce gène est bénéfique.

254 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles transgéniques de myopathies, elles subissent jusqu'à quatre prélèvements sanguins, des gavages quotidiens pendant quinze semaines et des tests d'effort et d'agrippement, pour évaluer deux molécules candidates. Le porteur indique que ces modèles développent faiblesse et lésions musculaires dès les premières semaines de vie, et que les gavages et tests peuvent provoquer inconfort et fatigue. Il décrit des essais préalables sur cellules et affirme que l'étape animale reste indispensable pour confirmer les résultats sur des organismes entiers.

Objectifs

Les myopathies des ceintures se caractérisent par une dégénérescence progressive des muscles du bassin et des muscles des épaules conduisant à une perte de motricité des membres supérieurs et inférieurs. Elles évoluent de façon extrêmement variable. L'atteinte musculaire s'étend progressivement vers les muscles du tronc et les muscles distaux qui s'affaiblissent. Une atteinte cardiaque et/ou respiratoire affecte l'espérance de vie. Il n’existe aucun traitement spécifique. Ces pathologies sont dues à des anomalies sur certaines protéines qui assurent la contraction du muscle. Chez des souris modélisant la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), un traitement pharmacologique (molécule 1) a réduit les symptômes. Ici, nous souhaitons évaluer l’efficacité de ce traitement sur des modèles murins de myopathies des ceintures, car les patients ont un tableau clinique similaire aux patients DMD. Le but étant que cette molécule réduise l’atteinte musculaire chez les patients. Dans un second temps, nous allons évaluer la possibilité de stopper la dégradation des protéines anormales présentes dans ces modèles. Nous souhaitons ici sélectionner la dose efficace d'un traitement (molécule 2) engendrant le moins d’effets toxiques/secondaires. L’étape suivante sera de combiner les deux molécules (molécules 1 et 2) pour restaurer les protéines fonctionnelles dans le muscle dans les modèles de myopathies (demande d’autorisation de projet à part).

Bénéfices attendus

Nous pensons que le traitement avec la molécule 1 aura un effet bénéfique sur les souris atteintes de myopathies des ceintures, en améliorant l’état des muscles squelettiques, aussi bien au niveau de l’architecture des muscles que de la force musculaire. La combinaison avec la molécule 2 pourrait plus tard permettre la restauration des protéines dans le muscle. De tels résultats ouvriraient la porte à des essais cliniques sur des patients souffrant de ces maladies, pour lesquelles il n’existe actuellement aucun traitement.

Procédures

Les animaux subiront : - au maximum 4 prélèvements sanguins chacun durant environ 20 minutes - des gavages 1 fois par jour pendant 15 semaines (durée : quelques minutes) - 2 tests d'effort (durée cumulée maximale 110 min) et 2 tests d'agrippement (durée : 3x 60 secondes)

Impact sur les animaux

Le test d'effort peut entrainer une fatigue de l'animal (musculaire et/ou cardiaque). Les gavages quotidiens avec la molécule 1 peuvent entrainer un inconfort. A partir de trois semaines d’âge les souris MDX (modèle DMD) présentent une faiblesse musculaire et des lésions musculaires. Concernant les souris alpha sarcoglygane, les muscles squelettiques sont fonctionnellement altérés à partir de l'âge de 2 mois et un schéma dystrophique modéré est présent à partir de l'âge de 6 mois. Les souris gamma sarcoglygane développent une dégénérescence et régénération du muscle squelettique dès 4 semaines et une fibrose précoce.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux seront euthanasiés et les muscles seront prélevés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Des premières études avec les deux molécules ont été préalablement réalisées sur des modèles cellulaires. Cela a permis d’étudier leurs effets et leur mécanisme d’action. Néanmoins, notre étude préclinique est indispensable pour confirmer les résultats préalablement observés et les confirmer sur des organismes entiers (mammifères comme la souris). Cela permettra d’ouvrir la porte à des essais cliniques chez l’humain.

Réduction

Pour la première étude avec la moléculé 1 nous utiliserons 8 souris par groupe. Ce nombre nous confère une force statistique suffisante afin de comparer les résultats obtenus dans chaque groupe et condition de traitement. Par ailleurs, dans la suite de notre stratégie de réduction, les groupes témoins (non porteurs du gène de la maladie) ne seront pas exposés aux doses croissantes du traitement expérimental. Pour la deuxième étude avec la molécule 2, nous utiliserons 6 souris saines par dose. Les résultats des études sur les groupes d’animaux traités ou non avec la molécule d’intérêt seront analysés au moyen de tests statistiques paramétriques ou non en fonction de la distribution des données. Ceci permettra de déterminer si le traitement induit des différences significatives.

Raffinement

Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel.

Choix des espèces

Dans le cadre des 2 études, le choix s’est porté sur la souris principalement car il s’agit d’une part d’un modèle mammifère vivant qui présente beaucoup de similitudes avec l’être humain notamment au niveau de la composition et la structure du muscle squelettique. D’autre part, la disponibilité de certains modèles murins de maladies musculaires commerciaux particulièrement d’intérêt dans cette étude ont participé à orienter le choix sur la souris pour ces études précliniques. Par ailleurs, les modèles utilisés sont des modèles transgénique et la souris est un modèle de choix pour la génération de ces derniers. Les animaux seront reçus à l’âge de 4 semaines, ils seront habitués au nouvel environnement pendant une semaine et les premiers tests (comportementaux) commenceront à 5 semaines d’âge. Le traitement quant à lui sera initié à 6 semaines d’âge. Au vue de la physiopathologie étudiée et des études préliminaires avec ces modèles et les drogues choisies, il est important de faire ces études à un âge ou les symptômes sont réversibles et sur des animaux qui sont dans un développement qui sera proche des populations ciblés chez l’humain (adolescent/adulte).