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Etude de la micro-architecture osseuse dans un modèle murin d’hémiplégie vasculaire: HemiPLOS
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- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une occlusion de l'artère cérébrale moyenne, un modèle d'AVC provoquant un déficit moteur, une perte de poids et une anorexie possible, l'autre moitié une opération témoin, toutes recevant des injections et des prélèvements sanguins avant d'être tuées à quatre semaines pour prélèvement des fémurs. Le porteur décrit une douleur peropératoire et une mobilité réduite, et justifie le modèle par la "nécessité" d'un contexte pathologique homogène. L'étude vise à décrire la fragilité osseuse après un AVC et l'effet de bisphosphonates, des retombées thérapeutiques renvoyées "à terme".
Objectifs
L’ostéoporose représente l’une des maladies métaboliques osseuses les plus fréquentes ayant comme principale conséquence la fracture, dont les paralysies ou parésies (paralysie partielle) constituent elles aussi un facteur de risque. La fracture est un facteur d’altération de la fonction et de la survie chez les patients ayant eu un AVC. La densité minérale et la micro-architecture osseuse sont deux déterminants clefs de la solidité osseuse. Les modifications concernant la micro-architecture de l'os chez les patients paralysés ou parétiques sont elles peu décrites. Les bisphosphonates (traitement ayant pour but de prévenir la perte osseuse) sont un des traitements les plus utilisés dans l’ostéoporose. Mais il n’existe à ce jour aucune stratégie thérapeutique chez les patients post-AVC afin de prévenir de l’ostéoporose et de leurs conséquences pouvant être dramatiques (les fractures). L’objectif principal de notre travail est l’étude de la densité minérale osseuse et de la micro-architecture osseuse au cours des paralysies ou des parésies. Ce travail permettra d’explorer les mécanismes de la fragilisation osseuse induite par ces conditions. Il sera mené chez l’animal dans un modèle de souris hémiplégiques. Ce choix est motivé par la nécessité d'un contexte pathologique homogène, la fréquence des hémiplégies vasculaires chez l’homme et de leurs complications osseuses ainsi que par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physiopathologiques. L’objectif secondaire de notre travail est l’étude de l’effet des bisphosphonates sur la micro-architecture osseuse dans ce même modèle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la caractérisation de la micro-architecture osseuse, de son lien avec la différenciation des ostéoclastes (cellules qui résorbent l'os) et de l’effet des bisphosphonates après un accident vascualire cérébral. La connaissance de ces modifications micro-architecturales osseuses survenant après une hémiplégie et la connaissance des effets des bisphosphonates sur ces modifications sont essentielles pour l'établissement d'une stratégie de prévention des fractures par fragilisation dans ce contexte. Notre travail pourrait ainsi contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes de la fragilisation osseuse conduisant à la fracture chez les patients paralysés. Il pourrait à terme conduire à l'ouverture de perspectives thérapeutiques visant à prévenir les modifications micro-architecturales osseuses et à réduire le risque de fractures ainsi que leurs complications trop souvent dramatiques, chez des patients fragiles et particulièrement exposés.
Procédures
La moitié des souris subira une intervention chirurgicale d'occlusion artérielle de l’artère cérébrale moyenne transitoire (2 heures en tout, modèle d'AVC) puis l'autre moitié subira une procédure sham (procédure controle, sans occlusion de l'artère). Toutes les souris auront une injection sous cutanée de biphosphonates ou vecteur le jour de la chirurgie. Puis auront lieu pour toutes les souris des injections intra péritonéale de molécules fluorescentes visibles en imagerie et anesthésiants. Ainsi que des prélèvements sanguins avant intervention, à 1 semaine et 4 semaine.
Impact sur les animaux
Les nuisances concernent principalement les souris qui subiront l'intervention "occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne (OACM)", avec pour conséquence un déficit moteur diminuant la mobilité, la perte de poids et l'anorexie possible. Ce modèle induit également une douleur peropératoire. Les injections péritonéales sont également une nuisance pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront tous mise à mort 4 semaines après la chirurgie afin de pouvoir prélever les fémurs pour l’étude de la microarchitecture osseuse et la moelle osseuse des tibias sera extraite en culture pour l’étude de la différentiation ostéoclastique chez toutes les souris afin de pouvoir répondre aux objectifs de l'étude.
Remplacement
Ce choix du modèle murin type souris est motivé par la nécessité d'un contexte pathologique homogène, la fréquence des hémiplégies vasculaires chez l’homme et de leurs complications osseuses aggravant le pronostic fonctionnel et vital chez ses patients, ainsi que par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physio-pathologiques. Il est en effet impossible de reproduire in vitro les conditions de motricité/marche de cellules isolées nécessaires pour cette expérimentation.
Réduction
A des fins de puissance, le protocole comportera 10 souris sur 4 groupes soit un total de 40 souris. Il était impossible de réutiliser un groupe afin de valider scientifiquement notre étude, ni même d’utiliser le côté non hémiplégique d'une souris car dans la littérature le côté non hémiplégique présente également une perte osseuse et représenterait donc un mauvais témoin. Nous avons décidé d'avoir 10 souris par groupe, en sachant qu’avec cette procédure nous avons 20% d'échecs, cela reviendra à 8 souris par groupe, ce nombre sera nécessaire pour une puissance statistique suffisante.
Raffinement
L'environnement sera adapté et une limitation des contraintes et des douleurs sera mise en place. Les souris à la réception dans l'animalerie, seront réparties de façon aléatoire dans un environnement enrichi (jeux, abris, substrats, cachette, blocs de bois). Une période d'acclimatation de 7 jours sera respectée avant toute intervention sur l'animal. Les animaux seront élevés dans un environnement calme et surveillé de façon quotidienne. Si l'animal montre des signes de souffrance (stéréotypies, repli, perte de poids, vocalisations), il sera isolé dans un environnement riche et recevra un traitement analgésique. La chirurgie sera effectué sous anesthésie et les procédures de mesure de la densitométrie seront réalisées après une anesthésie également. Au vu de la procédure, l’analgésie est assurée avant le début de la chirurgie, en per-opératoire et dans les 72 heures post-opératoire (matin et soir). Les souris seront placées dans une couveuseaprès l'intervention et jusqu'au réveil de l'animal. Après avoir vérifié que l'animal retrouve sa mobilité, la souris sera remise dans sa cage et laissée sous le coussin chauffant pendant 12 heures. Parce que la perte de poids post-chirurgicale est généralement observée, la nourriture en purée sera placée dans une boîte de Pétri pour encourager à manger. Les 48 1ères heures, les animaux sont surveillés deux fois par jour, puis après cette période de manière quotidienne par l’animalier.
Choix des espèces
Ce choix est motivé par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physiopathologiques, au vu de la capacité de mobilité de cet animal semblable à l'homme et permettant les explorations adaptés pour répondre aux objectifs de l'étude. Les expérimentations in vitro ne permettent pas d'appréhendrer l'objectif de l'étude. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. Les animaux auront entre 8 et 10 semaines, un age ou les animaux sont dit matures que ce soit pour le modèle hémiplégique et osseux. De plus les animaux sont pris à cet âge-là dans la littérature.
Caractérisation de molécules myorelaxantes par la méthode de l’activité de course volontaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
3 504 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces femelles reçoivent une injection intramusculaire puis sont hébergées en cages à roues pour mesurer leur activité de course, dispositif servant à comparer des molécules myorelaxantes destinées à la dystonie et à la spasticité. Le porteur annonce n'attendre aucun signe clinique après l'injection et justifie le projet par les recommandations de l'agence du médicament ainsi que par la politique de sa société, qu'il présente comme un gage de "respect de l'animal". À l'issue, les muscles injectés sont prélevés pour analyse histopathologique.
Objectifs
Ce projet vise à caractériser des produits myorelaxants à effet rapide et durable pour traiter les maladies neuromusculaires telles que la dystonie et la spasticité chez l’homme. Conformément aux recommandations de l’Agence Européenne du Médicament, nous devons mettre en évidence les propriétés pharmacologiques et pharmacodynamiques de ces molécules avant la mise en place d’essais cliniques chez l’homme. De plus, ce projet a été initié, évalué et validé par la direction de notre société dont la politique est basée sur un gage de qualité, de professionnalisme, d’intégrité et de respect de l’animal.
Bénéfices attendus
Les troubles du mouvement sont des pathologies neuromusculaires, souvent chroniques, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces pathologies neuromusculaires implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène…Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents (somnolence, nausée, fatigue). Une solution pour diminuer ces effets secondaires consiste à administrer le baclofène via une pompe intrathécale ; cette approche est toutefois invasive. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces pathologies : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente de clairs avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Toutefois, cette approche peut encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. Il n’existe à ce jour pas de test in vitro qui permette de tester la pharmacologie
Procédures
Injection des composés : 1 injection x 1 minute / animal Pesée tout le long de l'étude : minimum 5 pesée x 30 sec / animal = 2.5 min / animal. Mesure du DAS tous les jours : 30 sec / animal pendant environ 28jours soir 14 min/ animal. Mesure de l'activité roue : les rats sont continuellement herbergés dans les cages à roues.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette procédure, aucun signe clinique n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans l’étude princeps et la littérature. En effet lors de notre précédent projet, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à l’injection n’a été observé. Cependant, dans le cas où l’injection serait mal réalisée les signes observés et les mesures mises en oeuvre sont décrits dans le tableau fourni dans l’annexe jointe.
Devenir
Les animaux seront euthanasié à la fin de procédures. Nous prélévrons les muscles injectés pour des analyses histopathologiques
Remplacement
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test de la course volontaire sur une roue en accès libre chez le rongeur, a été développé pour comparer les myorelaxants, et a permis par le passé de développer de nouvelles molécules.
Réduction
Pour chacun des protocoles, 6 animaux par groupe seront étudiés afin d'obtenir des résultats qui soient statistiquement comparables et qui permettent d'apporter des conclusions fiables qui ne peuvent être remis en question ce qui nécessiterait la réalisation d'un nouveau protocole pour confirmer les résultats. En plus des groupes impliquant les traitements avec les principes actifs, un groupe avec un produit de référence seront ajoutés aux protocoles.
Raffinement
les animaux seront hébergés en groupe avec enrichissement du milieu (bille en verre, et roue), et surveillés quotidiennement. L’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, diminuant le stress pour les animaux. De plus, de la réception jusqu'à la fin du protocole, une observation quotidienne des animaux sera réalisée (état général, comportement, souffrance, stress et détresse, inconfort, réponse aux stimuli externes). De J0 à jusqu'au jour de l'euthanasie, il conviendra de suivre : - l’état général de l’animal (plusieurs fois la première semaine après l’injection), puis à chaque suivi clinique (1 à 2 fois par semaine) - la réaction à l’administration des principes actifs et du produit de référence - le poids (2 fois la première semaine, puis 1 fois par semaine jusqu’à la fin du protocole.
Choix des espèces
Afin d’évaluer l’activité myorelaxante sur ce modèle, nous souhaitons avoir recours au test de la course volontaire sur une roue libre d’accès chez le rongeur. En effet, la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Au contraire, ce test est un modèle pertinent pour évaluer l’efficacité de molécules myorelaxantes. Par souci de continuité avec les premières études, nous utiliserons le rat, afin de pouvoir réutiliser certains paramètres déterminés et optimisés dans les études précédentes. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6-7 semaines en début d’expérimentation et 18 semaines maximum en fin d’expérimentation. Des animaux juvéniles seront choisis par souci de continuité avec les études précédentes.
Caractérisation d’une thérapie génique sur modèle murin de myopathie liée au gène Mtm1.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Selon les cohortes, elles reçoivent une injection intramusculaire ou intrapéritonéale de thérapie génique, passent des tests de suspension et d'actimétrie, puis une mesure chirurgicale de la force musculaire sous anesthésie. Le porteur décrit un phénotype sévère de myopathie, avec perte de poids, apathie, paralysie progressive des membres postérieurs et dos arrondi, tout en affirmant qu'aucune douleur n'y serait associée. Il conclut que seul le modèle animal permet d'étudier la maladie dans sa globalité.
Objectifs
Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions d’une protéine impliquée dans certaines myopathies ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine étudiée ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Procédures
Les 240 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 3 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 8 semaines d’âge. Les 390 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 8 semaines d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 8 semaines d’âge.
Impact sur les animaux
La souris atteinte de myopathie myotubulaire présente un phénotype sévère. Des points limites pour nos souris incluent des signes de douleurs comme la perte de poids, l’apathie, les yeux fermés et une paralysie progressive des membres postérieurs avec l’apparition d’une cyphose (dos arrondi). Cependant, les premiers signes du phénotype dommageable n’apparaissent qu’à l’âge de 4-5 semaines pour atteindre un maximum à environ 8 semaines. A noter qu’il existe une certaine variabilité phénotypique entre les animaux mutant et que tous ne développeront pas l’ensemble des signes de la maladie. De la nourriture en gel sera déposé dans la cage dès l'apparition des premiers signes de difficulté pour se déplacer. A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures car notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus.
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement après l’injection intramusculaire afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance éventuels comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et les difficultés ambulatoires. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole et la mise à mort des animaux par dislocation cervicale. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré (buprénorphine à la dose de 0.1 mg/kg). Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous traiterons ces animaux à des stades très précoces (premier jour post natal) pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également au stade adulte (4 semaines) pour étudier l’effet après l’apparition des symptômes.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs en robotique chirurgicale.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons : 80
Moutons : 80
Bovins : 20
200 chiens, cochons, moutons et bovins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des prélèvements de sang répétés puis une ou deux chirurgies sous anesthésie, parfois précédées de la création d'une lésion par anastomose, ligature ou occlusion de vaisseaux, pour évaluer des dispositifs de robotique chirurgicale. Le porteur indique une douleur postopératoire pouvant durer plusieurs jours. Il affirme que l'expérimentation sur l'organisme entier est incontournable et relève d'une obligation réglementaire avant l'usage de ces dispositifs chez les patients.
Objectifs
La chirurgie assistée par ordinateur (CAO) regroupe un ensemble d'outils informatiques destinés à aider le chirurgien dans la préparation et la réalisation d’une opération, particulièrement en chirurgie des tissus mous (chirurgie viscérale, urologique ou cardiaque) et en chirurgie orthopédique avec implantation de dispositif ou non. Elle a pour objectif de faciliter la réalisation des gestes diagnostiques ou thérapeutiques par le chirurgien, afin qu’ils soient les plus précis, les plus efficaces et les moins invasifs possible. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet. Ce projet de recherche a pour objectif la validation de robots ou d'éléments robotiques innovants, l’apprentissage des personnels de santé, le développement de nouvelles stratégies pouvant réduire le traumatisme tissulaire, améliorer le diagnostic et pallier une dysfonction. Ces dispositifs innovants doivent être étudiés sur des modèles animaux vivants pertinents, dans le but de valider leur faisabilité, leur innocuité et leur efficacité. Ces nouvelles techniques moins invasives et ces approches originales permettront de mettre à profit pour les patients et les équipes soignantes les avancées de la robotique dans un environnement chirurgical et interventionnel. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs/méthodes et techniques en robotique chirurgicale par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase de recherche et de développement. Les différentes versions de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés du projet sont : - Une amélioration de la sécurité et/ou de l'efficacité des machines, dispositifs et techniques évalués. - Pour les aspects thérapeutiques, une réduction du tremblement et de la fatigue du chirurgien, une amélioration de la précision et de la technicité du geste chirurgical par un traitement informatisé de l’image, une vidéo 3D nette pendant toute la durée de l’intervention et une fiabilité du système plus importante, entrainant une plus grande précision du positionnement des prothèses et des implants et permettant par exemple d’éviter les ré opérations parfois multiples des patients. La réduction de l'invasivité du geste chirurgical et des temps opératoires (permettant par exemple la réduction du traumatisme tissulaire et du risque infectieux secondaires, corollaires de ces interventions) sont d'autres bénéfices attendus du projet. - Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients, une amélioration des capacités diagnostiques de la pathologie visée peut également être obtenue. - Les avantages peuvent aussi être éducationnels, avec des applications dans la formation des chirurgiens à des techniques opératoires complexes, la planification précise d’interventions chirurgicales délicates et la téléassistance en opérations extérieurs (OPEX) dans le cadre de la chirurgie et la médecine militaire.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'évaluation de dispositif en robotique d'assistance chirurgicale avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'évaluation de dispositif robotique d'assistance chirurgicale associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif robotique, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type anastomose, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).
Devenir
Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs et techniques testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs robotiques d’assistance chirurgicale dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs robotiques d’assistance chirurgicale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.
Choix des espèces
Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Cela impose l’expérimentation de ces dispositifs sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille, d’où la nécessité de tester sur les espèces citées ci-dessus. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les ovins sont par exemple, le modèle le plus pertinent pour la durabilité des stratégies opératoires et dispositifs testés dans ce projet. Leur intérêt principal réside dans le fait qu’ils ne sont pas en croissance et sont particulièrement robustes. Les porcins sont par exemple, un modèle très pertinent pour la durabilité de l’ancrage des dispositifs (feuillets valvulaires épais par exemple lorsque le dispositif est implanté dans le cœur). Les porcs sont également le modèle plus proche de l’homme pour ce qui est chirurgie viscérale et seront privilégiés, de ce fait, pour la robotique utilisée en chirurgie viscérale. Les bovins sont par exemple, un modèle très pertinent pour leur grande taille et le débit élevé des dispositifs cardiovasculaire potentiellement testés dans ce projet (robotique chirurgicale utilisée pour la chirurgie cardiovasculaire). Les canins ne seront utilisés que plus rarement, lorsqu’ils sont le seul modèle à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle la plus proche de l’homme. Par exemple les canins sont le seul modèle à présenter un auricule gauche avec ostium comme chez l’homme, un comportement du tissu de conduction cardiaque proche de l’homme, etc. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Développement d’une stratégie de ciblage des macrophages synoviaux pour le traitement personnalisé des différents pathotypes d’arthrose dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
3 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie de déstabilisation du ménisque du genou, une autre reçoit des injections de collagénase dans l'articulation pour induire une arthrose, et toutes reçoivent des injections intra-articulaires d'un traitement ciblant les macrophages. Le porteur indique que l'arthrose peut provoquer douleur, prostration et isolement, et que des infections des sutures ou des points d'injection restent possibles. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit simultanément tous les paramètres de la maladie.
Objectifs
L’arthrose est une pathologie dégénérative et inflammatoire affectant 50% de la population mondiale de 65 ans et plus. Cette pathologie atteint l’ensemble de l’articulation (cartilage, os, membrane synoviale) et est caractérisée par des douleurs et une raideur articulaire importante. Alors que l’arthrose est la plus commune des maladies rhumatismales, seuls des traitements traitant les symptômes de la douleur et non les causes précises de l’arthrose existent, ne permettant pas d’enrayer la dégradation articulaire. Il apparaît donc primordial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques de l’arthrose. L’inflammation de la membrane synoviale (tissu entourant la zone d’interface entre deux os, lubrifiée par du liquide synovial) semble être un mécanisme clé dans l’initiation et la progression de l’arthrose. Les macrophages, cellules immunitaires impliquées dans la surveillance de notre organisme et dans certaines réactions inflammatoires, représentent la population immunitaire la plus importante dans la membrane synoviale et plusieurs études ont montré leur rôle pathologique au cours du développement et de la perpétuation de l’arthrose. De plus, nos résultats préliminaires ont identifié plusieurs sous-populations de macrophages d’intérêt au sein d’échantillons de membranes synoviales de patients atteints d’arthrose. L’objectif de ce projet vise donc (1) à valider chez la souris l’identification d’une ou plusieurs populations de macrophages de la membrane synoviale impliquées dans l’arthrose ; et (2) à développer une stratégie de ciblage de ces macrophages pour le traitement spécifique de l’arthrose. Pour cela, l’utilisation de trois modèles murins différents est nécessaire afin de représenter au mieux les différents sous-groupes de patients atteints d’arthrose observés en clinique. L’ensemble de ces données ouvrira la voie à l’étude de cette stratégie de ciblage spécifique des macrophages dans l’arthrose pour une utilisation thérapeutique. Enfin, dans la littérature, des données montrent une association entre les modifications du microbiote intestinal (ensemble des microorganismes du système digestif) et le développement de l’arthrose. Ainsi, nous mettrons à profit les expérimentations précédentes et nous analyserons le microbiote intestinal des trois modèles murins d’arthrose afin d’étudier le lien, à l’heure actuelle incompris, entre composition de ce microbiote et développement de l’arthrose.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints d’arthrose est à ce jour peu efficace et, compte-tenu l’absence de traitement curatif permettant de réduire ou de stopper la dégradation articulaire, le développement de traitements de l’arthrose représente un défi majeur. Ce projet permettra d'une part, de confirmer l’implication des macrophages de la membrane synoviale dans le développement et la progression de l'arthrose ; et d'autre part, d’apporter la preuve de concept de l’efficacité d’un nouveau traitement spécifique de cette maladie, ciblant les macrophages de la membrane synoviale dans différents modèles murins représentant la diversité des manifestations cliniques et biologiques observées chez les patients. Ces travaux pourront, à plus long terme, permettre de proposer des stratégies thérapeutiques personnalisées pour des essais cliniques chez le patient chien (animal présentant naturellement de l’arthrose, de façon similaire à l’Homme) puis chez l’Homme. En parallèle, ce projet permettra également d’approfondir l’axe de recherche du microbiote dans l’arthrose. Il permettra, pour la première fois, d’évaluer l’impact du développement de l’arthrose sur la composition microbienne intestinale. Ainsi, ces résultats préliminaires ouvriront la voie à des études ultérieures et leur impact pour les patients sera majeur.
Procédures
Une partie des animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d'un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs à l’articulation) du genou droit. Une autre partie sera soumise à deux injections intra-articulaires de collagénase (molécule permettant d’induire une dégradation précoce du cartilage) dans le genou droit. L’ensemble des animaux recevra une ou plusieurs injections intra-articulaires du traitement spécifique, appelé lipoplexes, permettant de modifier l’activité des macrophages de la membrane synoviale pour le traitement de l’arthrose. Ces opérations seront effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire.
Impact sur les animaux
Lors du développement de l’arthrose, de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer se proster, s’isoler des autres animaux et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Dans le modèle d'induction chirurgicale de l'arthrose, une déchirure de la peau, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant la chirurgie, pourrait avoir lieu. De plus, dans de rares cas, une infection pourrait intervenir au niveau des sutures post-chirurgicales, au niveau du point d’injection du modèle d'induction chimique de l'arthrose ou au niveau du point d’injection des lipoplexes servant au ciblage des macrophages de la membrane synoviale. De façon générale, les animaux sont suivis régulièrement et différents indicateurs précoces d’une éventuelle douleur et/ou détresse (points limites) seront attentivement observés (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) afin d’apporter les soins nécessaires et le plus rapidement possible aux animaux.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter des tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et cellulaires.
Remplacement
L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires, ainsi que d’un liquide synovial. L'ensemble de ces composants agissent ensemble pour maintenir un état sain stable. Cependant, dans certains cas pathologiques, ces différents composants peuvent interagir et participer au maintien d'une pathologie, comme dans le cas de l'arthrose. Cette dernière a des causes et des conséquences multiples pour laquelle il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro (expérience en laboratoire, réalisée hors d’un organisme vivant) permettant de reproduire simultanément tous ces paramètres associés. C’est pourquoi, ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles utilisant des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum mais suffisant pour démontrer des différences pertinentes (statistiquement significatives) et reproductibles entre les groupes. De plus, pour mettre au point l'utilisation des lipoplexes, permettant le ciblage des macrophages dans les animaux, des tests préliminaires in vitro seront réalisés sur des cellules en culture et sur des cultures de membrane synoviale, ainsi que des tests préliminaires in vivo sur des souris non arthrosiques, permettant in fine de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. L’association du projet principal, concernant le ciblage des macrophages dans les trois modèles murins d’arthrose, avec le projet secondaire, portant sur l’étude préliminaire du microbiote intestinal dans l’arthrose, permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l'obtention de conclusions fiables concernant les deux questions de recherche distinctes.
Raffinement
De façon générale, un suivi hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-opératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux. Les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec des frisottis et un dôme, permettant de l'amélioration ou enrichissement du milieu de vie. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de chacun 12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront sous couverture anesthésique et analgésique adaptée, en pré- et post-opératoire. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, et la phase de réveil seront effectuées sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De plus, de nombreux outils et méthodes d'analyse sont disponibles. Dans le cas de l’arthrose, plusieurs modèles murins ont été développés, faisant de cette espèce la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette pathologie. D’autres part, elle permet la constitution de groupes d'animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des analyses pertinentes et reproductibles. Enfin, des études précédentes dans notre laboratoire ont montré qu’il était possible d’injecter des volumes suffisants et de manière précise dans l’articulation, assurant la faisabilité de notre stratégie. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose est possible et documentée dans la littérature. Dans le cas du développement d’une arthrose spontanée, les protocoles débuteront chez des souris âgées de 12 mois (âge minimum à partir duquel une arthrose spontanée se développe).
Caractérisation d’un modèle murin reproduisant une myopathie liée à une déficience en cavéoline 3 et évaluation de potentielles thérapies. 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour une myopathie qui reste sans symptômes marqués, elles subissent des tests de force, des courses jusqu'à épuisement contraintes par de petits chocs électriques et des prélèvements sanguins répétés, avant la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur évalue deux thérapies et attend du projet de "premières preuves de concept" pour de futurs patients. Il écarte le modèle cellulaire, qui n'évalue pas la contractilité du muscle, et juge l'évaluation in vivo "indispensable".
Objectifs
Les cavéolinopathies sont des maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. Actuellement, aucun traitement n’existe. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de deux thérapies, capables d’améliorer les fonctions motrices de souris atteintes d’autres maladies du muscle et présentant des symptômes similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra fournir les premières preuves de concept pour soigner des patients atteints d'une maladie rare du muscle. Elle permettra, en outre, de mieux comprendre cette maladie et les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force non invasifs et durant 1 minute au maximum seront réalisés une fois par semaine entre 7 et 12 semaines. Chacun de ces tests sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 mins. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à épuisement sera réalisés entre 1 et 3 fois durant la période de test des animaux et durera au maximum 1h40. L'animal sera également laissé libre dans une cage pendant 12h afin d'étudier ses mouvement spontanés. Des prélèvements de sang seront effectués toutes les deux semaines au maximum et ne dépasseront pas 10% du volume total de l'animal. Durant ces prélèvements, les souris seront maintenues dans un tube pendant moins de 5 mins afin d'avoir accès à leur queue pour la prise de sang. Des tests cardiaques seront réalisés sur des souris anesthésiées au cours de la même expérience, afin de limiter le nombre d'anesthésies. Ces tests dureront au maximum 30 mins. Un test final sera effectué sur souris anesthésiées précédant l’euthanasie des animaux pour mesurer la force musculaire des souris. Ce test dure au maximum une heure. Une biopsie auriculaire durant moins de 2 mins sera effectuée à 3 semaines afin d'identifier les animaux ainsi que leur mutation grâce à l'ADN qui sera extrait de cette biopsie.
Impact sur les animaux
Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont la contention temporaire de l’animal, la chute de l’animal dans une cage remplie de litière, l’extension de l’animal par tirement progressif de la queue par l’expérimentateur, l’isolement de l’animal dans un cage spéciale pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques et l’anesthésie générale de l’animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de deux thérapies sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisament proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.
Réduction
La grande majorité des tests étant non invasif, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre ainsi que du carton, pour permettre aux souris de ronger. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 à 2 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. L’animal sera sorti de la cage à l’aide d’un tube ou les mains du manipulateur disposées en coupe pour réduire leur stress. Lors de l'évaluation des fonctions cardiaques sous anesthésie, une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Durant les mesures de force, l'animal sera anesthésié et analgésié afin d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. Pour chaque anesthésie, la température corporelle de l'animal sera maintenue au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Pour chaque expérience de phénotypage, l'animal sera tout d'abord familiarisé avec le matériel pour minimiser autant que possible son stress.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé reproduit les problèmes de dégénérescence de fibres musculaires retrouvés chez les patients. Les souris malades ne présentent cependant pas de symptômes cliniques importants et peuvent vivre aussi longtemps que des souris saines sans être handicapées au quotidien. Dès 8 semaines, on retrouve des défauts de fibres musculaires, et à 12 semaines une forte régénération des fibres. Les tests seront donc réalisés entre 7 et 12 semaines, sur souris adultes.
Test de thérapie génique pour deux syndromes mitochondriaux chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
153 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 144 tuées et 9 réutilisées comme reproducteurs. Génétiquement modifiées, elles reçoivent une injection de vecteur viral puis subissent tests de course, de tolérance au glucose et mesures de force sous anesthésie, les mutantes pour un second gène mourant dans leur premier mois de vie. Le porteur teste une thérapie génique pour deux affections mitochondriales et renvoie les bénéfices pour les patients au conditionnel, "en cas de succès". Il affirme n'avoir "pas d'autre choix" que d'étudier un "organisme entier".
Objectifs
Les cellules de l’organisme possèdent des centrales énergétiques, nommées mitochondries, indispensables à leur fonctionnement. Un défaut de production d’énergie par les mitochondries provoque une maladie nommée affection mitochondriale. Les affections mitochondriales constituent l’un des plus grands groupes de maladies héréditaires. Pratiquement toutes sont actuellement orphelines de traitement et beaucoup sont mortelles à brève échéance. En raison de leur forte consommation d’énergie, les muscles, le foie et les reins font partie des organes souvent atteints dans ces affections. Notre groupe étudie des souris mutantes pour deux gènes dont nous avons démontré le rôle dans le fonctionnement des mitochondries. Les souris mutantes pour le premier gène constituent un modèle pertinent d’une myopathie congénitale décrite chez l’être humain et le chien. Les chiens atteints présentent une réduction de la masse et de la force musculaire assez forte, accompagnée d’une intolérance marquée à l’effort. Chez l’être humain, ces mêmes caractéristiques nécessitent le recours à une alimentation par sondage gastrique des nouveau-nés et conduisent à un important retard à l’acquisition de la marche, avec impossibilité de courir une fois la marche acquise. L’atteinte des souris mutantes est nettement plus modérée mais les mécanismes cellulaires mis en jeu sont similaires. Nous avons mis en évidence que la réduction de la masse musculaire est due à un défaut de fusion des cellules musculaires au cours du développement et qu’une dysfonction mitochondriale restreinte aux muscles est à l’origine d’une réduction de l’efficacité de production d’énergie et de la réduction des performances musculaires. Par ailleurs, nous avons pu générer une mutation pour le second gène chez la souris et montrer que cette situation est létale : les animaux meurent dans le premier mois après la naissance. Nous avons pu prouver qu’une atteinte mitochondriale était à l’origine de la mort des animaux, avec une atteinte du foie et des reins. Il s’agit donc là d’un modèle pour les formes les plus sévères d’affection mitochondriale chez l’être humain. Notre objectif est de tester une stratégie de thérapie génique pour ces deux affections mitochondriales grâce à un vecteur viral, nommé AAV.
Bénéfices attendus
L’une des missions de notre équipe est de développer des thérapies pour des maladies rares afin d’améliorer à terme la qualité de vie, voire la survie, des patients atteints, grâce à des modèles animaux. Grâce aux données poussées que nous avons pu accumuler ces dernières années sur l’atteinte mitochondriale liée à la mutation de ces deux gènes et grâce à l’avancée marquée des projets de thérapies géniques utilisant des AAV, nous sommes en mesure de proposer une stratégie de thérapie génique pour deux affections mitochondriales. En cas de succès, ce projet fournira des éléments clés aux pédiatres pour envisager une prise en charge des patients atteint de la myopathie congénitale correspondante, en particulier concernant l’importance cruciale ou non d’intervenir avant la fin de la fusion des cellules musculaires. En parallèle, en cas de succès, l’efficacité d’une thérapie commune pour les 2 mutations apportera des éléments forts pour envisager le traitement des affections mitochondriales et s’avèrera très précieuse en cas de découverte d’une mutation du second gène dans des cas d’affections mitochondriales encore orphelines de diagnostic moléculaire.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - Une injection sous anesthésie, une fois dans leur vie. L’anesthésie sera réalisée par le froid ou par deux injections. Cette intervention durera, de l’anesthésie au réveil, de 30 min à 1h. - Mesure du lactate dans le sang par un prélèvement d’une très faible quantité de sang, de 20 s, 1 fois dans la vie. - Test de tolérance au glucose : mise à jeun de 14h ou 11h puis 7 prélèvements d’une très faible quantité de sang, de 20 s, sur 2h, 1 fois dans la vie. - Epreuves de course, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la vitesse maximale aérobie environ 30 min, l’endurance environ 1h30 et la mesure du lactate dans le sang après une épreuve d’endurance à nouveau environ 1h30. Pour la mesure du lactate dans le sang, les animaux subiront deux prélèvements d’une très faible quantité de sang, de 20 s, l’un avant et l’autre après la course. - Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale avec analgésie forte, 1 fois dans leur vie : chaque intervention durera au maximum 1h, soit 2h30 de manipulation au total en comptant depuis la première injection d’analgésique et jusqu’au réveil complet. Tous les tests fonctionnels (test de tolérance au glucose, mesure de la vitesse maximale aérobie, endurance, mesure du taux de lactate dans le sang, mesure de la force musculaire) seront séparés a minima de 4 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress léger lié à la contention, aux injections ou aux prélèvements, ou modéré lors des épreuves de course, minimisés par l’attention portée au respect physique et émotionnel des animaux pour le réduire autant que possible. Les injections et prélèvements pourront causer une douleur légère et brève aux animaux, minimisée par un protocole adapté et l’utilisation d’une aiguille très fine. Les animaux mutants pour le second gène, dans le groupe contrôle ou dans le groupe recevant la thérapie génique si elle ne s’avère pas suffisamment efficace, subiront une baisse de vitalité et une perte de poids sur 2 à 3 jours.
Devenir
La grande majorité des animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires. Une partie des animaux seront réutilisés comme reproducteurs.
Remplacement
A ce stade de notre étude, la mise au point d’une stratégie de thérapie génique pour deux affections mitochondriales affectant des fonctions complexes de l’organisme, et jusqu’à la survie des animaux, nous n’avons pas d’autre choix que d’étudier un organisme entier, ici la souris, dans deux contextes mutants dont nous avons pu établir la pertinence.
Réduction
Les premiers tests que nous allons réaliser sur des animaux non mutants vont nous permettre de définir la meilleure voie d’injection, la meilleure dose et le meilleur choix de vecteur pour la réalisation de la thérapie génique, ce qui nous permettra d’enrôler le moins d’animaux mutants possible lors de l’essai préclinique. De plus, grâce aux connaissances accumulées ces dernières années sur les souris mutantes et les tests réalisés, nous pourrons optimiser le nombre d’animaux utilisés pour les réduire autant que possible, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Le comportement des mâles est particulièrement surveillé et en cas de bagarre grave amenant à des plaies, le mâle agresseur est séparé de ses congénères et ses congénères sont pris en charge de manière adaptée (mise à mort compassionnelle si blessures trop graves, soins dans les autres cas). Pour l’optimisation de la fonction locomotrice des animaux réalisant des tests de course, nous rajoutons une grille amovible sous le couvercle des cages. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft ou du coton, un bâton de bois à ronger et une maison en carton. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Tous les gestes seront réalisés avec une attention très forte au respect physique et émotionnel des animaux. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice, au besoin pharmacologique, et en cas d'absence de bénéfice, nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Grâce à la génération de mutations d’intérêt par manipulation du génome, la souris est un mammifère particulièrement pertinent pour l’étude des affections humaines et notamment des affections mitochondriales, que ce soit pour l’étude des mécanismes en jeu ou la réalisation d’essais thérapeutiques. Elle présente par ailleurs des atouts zootechniques (temps de reproduction court, petite taille, effectifs importants) et techniques (familiarité et facilité de manipulation). Les animaux non mutants qui nous permettront d’établir les meilleures conditions d’injection seront utilisés soit à la naissance, soit à partir d’un mois, pour répondre aux besoins des études sur les animaux mutants. Les animaux mutants pour le 1er gène recevront l’injection d’AAV à la naissance ou à un mois, pour étudier l’efficacité respective de ces deux approches. Ils seront ensuite soumis à l’âge adulte, soit entre 2 et 9 mois, à des tests fonctionnels pour évaluer leur fonction musculaire et leur métabolisme. Les animaux mutant pour le 2° gène seront étudiés à partir de leur naissance et jusqu’à l’âge de 3 mois, si la thérapie permet leur survie jusqu’à ce stade.
Evaluation du potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes pour traiter les dysferlinopathies
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
163 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, pour 35 d'entre elles, et modéré, pour 128. Modèles d'une myopathie, elles subissent des tests de force et une course forcée jusqu'à l'abandon, entretenue par de petits chocs électriques, ainsi que des prélèvements pouvant atteindre 15 % de leur volume sanguin, avant d'être mises à mort à six mois pour prélever leurs muscles. Le porteur affirme qu'un modèle cellulaire "ne suffit pas" pour évaluer une thérapie sur la contractilité musculaire et l'organisme entier. Il justifie la mise à mort précoce par la volonté d'éviter la progression de la maladie.
Objectifs
Les dysferlinopathies font partie des maladies rares du muscle et regroupent notamment la myopathie distale de Miyoshi et la myopathie des ceintures 2B. Les principaux signes cliniques sont la faiblesse musculaire et une atrophie prononcée des muscles, pouvant mener à des déficiences fonctionnelles sévères. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces maladies, et aucune preuve de concept thérapeutique permettant de restaurer les fonctions motrices de souris modélisant cette myopathie. L'objectif de ce projet est ainsi d'étudier le potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes jouant un rôle important dans le muscle et s'étant déjà montrée efficace pour d'autres types de myopathies présentant des dérégulations similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'évaluer deux potentielles thérapies et pourrait permettre de fournir une première preuve de concept thérapeutique en vue de traiter des patients atteints de dysferlinopathie. En outre, cette étude apportera de nouvelles clés de compréhension sur les mécanismes associés à cette maladie et sur les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force et de coordination non invasifs réalisés sur un temps court (une minute environ et 5 mins respectivement) seront réalisés trois fois durant la période d'étude des souris (de 4 à 6 mois d'âge). Chaque test sera réalisé trois fois avec un temps de repos de 10 minutes. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à abandon sera réalisé 1 à 3 fois durant la vie de l'animal et durera au maximum 1h40. Les mouvements spontanées de l'animal seront également quantifiés durant 12h en laissant l'animal seul dans une cage. Des prélèvements de sang de 15% du volume total de l'animal seront réalisés toutes les deux semaines au maximum. Un dernier test sous anesthésie précédant l'euthanasie des animaux permettra de mesurer la force musculaire des souris. Ce test durera au maximum une heure, et l'animal sera surveillé. Afin de savoir quels sont les animaux myopathes et/ou traités, une biopsie sera obtenue par poinçonnage de l'oreille entre 14 et 28 jours d'âge. Les animaux seront identifiés par tatouage d'un numéro à la base de la queue.
Impact sur les animaux
Les premiers signes cliniques apparaîssent à 4 mois chez les souris et se limitent à de la faiblesse musculaire au niveau des membres, pouvant induire une angoisse modérée chez l'animal. Les animaux seront euthanasiés à 6 mois afin d'éviter la progression de la maladie et pour réaliser par la suite des analyses moléculaires. Les nuisances causées par les différents tests sont la chute de l'animal dans une cage remplie de litière entraînant une légère peur chez l'animal, l'extension de l'animal par tirement progressif de la queue par l'expérimentateur, l'isolement de l'animal pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques pouvant entraîner des douleurs musculaires sur le court terme et l'anesthésie générale de l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des deux procédures afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et histologiques. Les animaux issus des accouplements ayant pour but le maintien de la lignée durant la durée du projet seront euthanasiés avant l'apparition des signes cliniques.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de thérapies sur les fonctions locomotrices et la fatigue musculaire. Malheureusement, l'utilisation d'un modèle cellulaire ne suffit pas pour évaluer le potentiel d'une thérapie dans le cas d'une maladie musculaire. En effet, il est nécessaire de pouvoir évaluer les effets sur la contractilité du muscle ainsi que sur l'ensemble de l'organisme. Le modèle murin, étant suffisamment proche de l'homme physiologiquement et structurellement, permet de pouvoir étudier la physiopathologie ainsi que les effets d'une thérapie.
Réduction
Les tests phénotypiques prévus sont faiblement invasifs et permettent donc un suivi longitudinal des souris, ce qui réduit fortement le nombre de souris nécessaires. Les analyses histologiques et moléculaires seront effectuées sur les mêmes animaux après euthanasie. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans une étude traitant des déficits moteurs du même modèle de souris et permettant d'observer des différences de démarche, d'activité locomotrice et de poids de muscles entre les souris myopathes et les souris saines dès 15 semaines d'âge.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre. En cas de difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Lors des mesures in situ, le stress et la douleur liés à la procédure seront éliminés par injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésiants et d'analgésiques. Durant toute l'expérience, la température corporelle de l'animal sera maintenue à sa valeur basale au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Un contrôle visuel de sa respiration sera effectué. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et observé quotidiennement pour vérifier que leur état ne se dégrade pas. Dès lors qu'une perte de poids est observée, les animaux seront alors pesés quotidiennement. L'animal sera sorti de sa cage par les mains du manipulateur disposées en coupe. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour minimiser son stress.
Choix des espèces
Les souris sont suffisamment semblables à l'homme physiologiquement pour être un bon modèle d'étude des maladies musculaires. Dans notre projet, par exemple, la mutation présente chez les souris provient d'une mutation spontanée d'une lignée murine récapitulant les principaux signes cliniques observés chez l'homme. Les souris seront utilisées entre 4 mois et 6 mois d'âge, i.e. adultes. Cet âge correspond à l'apparition des signes cliniques moteurs chez les souris déficientes en dysferline. Le phénotype dégénère progressivement tout au long de la vie de la souris, il est donc préférable de réaliser les tests phénotypiques le plus tôt possible afin de limiter l'angoisse animale.
Etude de la physiopathologie du syndrome de Marfan dans un modèle de poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
2 814 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Porteurs de mutations reproduisant le syndrome de Marfan, ils subissent des prélèvements de nageoire, des exercices de nage forcée pour mesurer vitesse et endurance et un protocole d'entraînement de plusieurs semaines, pour étudier les atteintes musculo-squelettiques de la maladie. Le porteur décrit une possible émaciation et des comportements d'anxiété ou de résignation, avec arrêt du protocole au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme que le poisson zèbre est le modèle vertébré "le plus simple" pour cette étude, plus rapide et moins coûteux que le rongeur.
Objectifs
Le syndrome de Marfan (SM) est une maladie génétique rare (1/5000), touchant aussi bien les hommes que les femmes. Les patients présentent des atteintes cardiovasculaires, oculaires et musculo squelettiques. Les anomalies cardiaques sont responsables d’une mortalité précoce, qui est maintenant contrôlable grâce aux progrès dans la prise en charge de la maladie. Par contre, la fatigue chronique et la moindre endurance physique sont des affections fréquentes des patients atteints de SM avec un impact important sur la qualité de vie, aussi l’intérêt de recherche s’est tourné vers une meilleure compréhension des atteintes musculosquelettiques. Une fragilité des tissus de soutien et un déficit musculaire, à l’origine d’un stress accru sur le système musculosquelettique, pourraient participer à ces symptômes. Une étude clinique a rapporté un déficit en masse maigre dès l'enfance et s'aggravant avec l'âge, et la pertinence d'un programme d'entraînement est actuellement évaluée. Comprendre les mécanismes à l’origine de ce déficit musculo-squelettique pourrait permettre l’identification de cibles thérapeutiques spécifiques et le développement de traitements. Nous proposons donc de développer un modèle animal original de la maladie et d’explorer les paramètres osseux et musculaires. Le poisson zèbre représente le système vertébré le plus simple disponible à ce jour pour évaluer l’impact d’une mutation d'un gène associé à une maladie génétique sur le système musculo squelettique à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire et de pouvoir évaluer les bénéfices éventuels d’un entrainement. Nous souhaitons donc développer et caractériser des lignées de poisson zèbre portant des mutations équivalentes aux mutations responsables du SM chez l'Homme. Leur comparaison permettra de mieux comprendre la physiopathologie du SM, afin d’identifier de possibles cibles thérapeutiques et d’optimiser les protocoles d’entrainement personnalisé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux documenter la physiopathologie du SM, qui est à l’heure actuelle mal comprise, et d’identifier des stratégies thérapeutiques allant de programme d’entrainement à des approches pharmacologiques qui pourront toutes deux être testées dans ce modèle poisson -zèbre de la maladie.
Procédures
-Prélèvement unique à la nageoire caudale pour génotypage sous anesthésie -Mesure mensuelle de la taille et du poids sous anesthésie -Analyse locomotion et comportement; durée 3h avec acclimatation; isolement -Exercice de nage forcée pour détermination de la vitesse maximale; durée
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus concernent essentiellement le phénotype associé à la perte de fonction du gène muté chez les patients atteints du syndrome de Marfan, qui devrait reproduire le syndrome de Marfan humain, et associe des malformations cardiovasculaires, oculaires et musculo-squelettiques. D’après les quelques données de la littérature, le développement du phénotype chez le poisson zèbre ne s’observe qu’à l’état homozygote (c'est-à-dire quand les 2 exemplaires du gène sont mutés) ou sur des doubles mutants. Cependant, le SM étant une maladie dominante (c'est-à-dire que la mutation sur un seul exemplaire du gène suffit à déclencher la maladie) chez l’Homme, une attention sera portée sur les hétérozygotes (un seul exemplaire du gène muté). En lien avec ces atteintes, les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnée de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qui sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Pour les procédures expérimentales, le prélèvement caudal pour le génotypage est réalisé sous anesthésie et les animaux recouvrent leur capacité à nager normalement dès le réveil. L’analyse du comportement de nage nécessite l’isolement du poisson dans le bac où le film est réalisé, isolement qui est maintenu pendant une durée maximale de 3 heures. Pour la nage forcée, la durée de nage à la vitesse maximale est une source de stress, mais ne pourra excéder 3 minutes. L'ensemble des points limites est détaillé dans chaque procédure.
Devenir
A l'issue des différentes procédures les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus pour des analyses histologiques et de l'expression génique (taille des fibres musculaires, structure des tissus de soutien, analyse du squelette, inflammation).
Remplacement
Comprendre la physiopathologie du SM nécessite l’utilisation d’un organisme intégré dans lequel l’étude des différents systèmes (cardiovasculaire, musculosquelettique) altérés dans cette maladie soit possible de même qu’une évaluation comportementale transposable à l’Homme. A ce jour, ces informations ne peuvent être obtenues à partir de modèles non animaux (cultures cellulaires ou organoïdes). Le poisson -zèbre représente pour cela le modèle vertébré le plus simple à ce jour, avec de nombreux systèmes moléculaires et cellulaires conservés avec les mammifères, et présente l’avantage de pouvoir facilement réaliser de la mutagenèse in vivo et produire des lignées transgéniques d’intérêt.
Réduction
A notre connaissance, 3 équipes ont développé des modèles de SM (perte de fonction) mais qui ne sont pas rendus disponibles à ce jour. De plus, dans l’idée de réaliser des corrélations phénotype/génotype entre ces mutations perte de fonction et des mutations ponctuelles générées de façon originale par notre équipe, il est essentiel de comparer des animaux de même fond génétique afin de s’affranchir de l’effet de gènes influenceurs pouvant différer d’un fond génétique à un autre. Nous effectuerons cependant une veille régulière des différents dépositaires afin de stopper la production de modèles redondants avec ceux disponibles. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observés au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 8 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour le suivi longitudinal des cohortes, des sous-groupes de 4 animaux seront nécessaires pour documenter les différents phénotypes au cours du temps. Les différents tissus seront biobanqués (congélation et inclusion paraffine) afin d’optimiser l’utilisation des animaux. Si un phénotype est présent sur les lignées simple mutation, les autres lignées ne seront pas produites. De même, si un phénotype est présent dès le stade hétérozygote, les élevages seront réalisés de façon à ne pas produire d’homozygotes. Afin de réduire le nombre d’animaux, les expérimentations n’ayant pas d’impact les unes sur les autres seront réalisées sur les mêmes animaux.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres pourra induire une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% du poids de référence de l'animal (poids maximal atteint) conduira à l'arrêt du protocole expérimental. Lors des expérimentations, des phases d’isolement ou des mises en reproduction, les bacs seront posés sur des photos représentant des fond aquatiques. Pour les suivis longitudinaux nécessitant une séparation des différents animaux d’une même ponte, les animaux d’intérêt seront maintenus avec des animaux d’un autre fond génétique afin de ne pas rester isolés. Pour les tests fonctionnels (tunnel de nage), une phase d’habituation au nouvel environnement sera systématiquement réalisée. Tous les poissons sont nourris deux fois par jour, avec notamment des artémies (crevettes fraiches) vivantes, cultivées sur place, qui représentent une source de nutriments frais et une forme d'enrichissement, puisque les poissons les chassent dans le bac.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est génétiquement modifiable, rendant aisé la génération de mutant d’un gène d’intérêt reproduisant une maladie génétique humaine comme le SM, et permet des études de grande envergure tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses que celles menées chez le rongeur. Le poisson zèbre est aussi un modèle pertinent pour étudier les dysfonctions musculo- squelettiques et cardiovasculaires, et récapitule les processus physiopathologiques observés chez l'Homme. De plus, beaucoup d’événements biologiques sont analysables par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées rapportrices ont été générées et sont facilement disponibles dans la communauté scientifique, permettant de répondre à de vraies questions biomédicales. Pour toutes ces raisons, le poisson zèbre est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration mécanistique. Un suivi du développement des signes de la maladie sera réalisé depuis le stade larvaire jusqu’au stade adulte, le SM étant une maladie se développant dès l’embryogenèse mais évoluant tout au long de la vie. De plus, une finalité du projet étant d’identifier des leviers thérapeutiques potentiels, l’évaluation du potentiel curatif d’approches thérapeutiques sur des traits cliniques installés est nécessaire.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements dans des modèles d’arthrose chez la souris ou le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Rats : 4290
8 970 animaux non-humains, soit 4 680 souris et 4 290 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une arthrose leur est provoquée par section de ligaments du genou ou par injection intra-articulaire d'un produit toxique, avant l'administration de molécules à tester et des tests comportementaux mesurant la douleur. Le porteur décrit une maladie douloureuse et handicapante chez l'humain et attend un dépistage de molécules efficaces. Il qualifie ses procédures de "stricte nécessité" et affirme qu'aucune méthode sans animaux n'apporterait le même niveau d'information.
Objectifs
L’arthrose ou ostéoarthrite (OA) est une pathologie qui appartient à la famille des rhumatismes et entraine des douleurs au niveau des articulations. C’est une affection chronique inflammatoire qui se manifeste par des douleurs persistantes aux articulations causées par l’usure anormale (dégénérescence) du cartilage et de l’ensemble de l’articulation. Elle affecte des millions de personnes chaque année et est la maladie articulaire avec le plus de prévalence chez la population âgée. Cette maladie rhumatismale touche une part importante de la population (environ 70% de la population à un certain moment dans leur vie) et a donc des impacts sociaux et économiques majeurs sur les patients et le système de santé. Les thérapies actuellement disponibles pour traiter cette maladie ne réussissent pas à lever de façon adéquate la douleur chez beaucoup de patients, et les effets secondaires des traitements limitent considérablement leur utilisation. De plus, les traitements utilisés ne traitent que les conséquences de la maladie, c’est-à-dire l’inflammation et la douleur. Il y a donc un besoin urgent de trouver des molécules efficaces qui pourraient réverser ou tout du moins ralentir l’évolution de la pathologie tout en soulageant les symptômes. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de l’arthrose avec la mise en place de différents modèles animaux d’arthrose chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la réponse à la douleur et l’inflammation mais aussi la structure de l’articulation dans des modèles animaux mimant l’OA chez la souris ou le rat. Ce projet a déjà été déposé en 2019.
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans l’arthrose. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui soulageraient à la fois les symptômes de l’arthrose (inflammation, douleur) et ralentiraient l’évolution de la pathologie (dégénérescence articulaire).
Procédures
tous les animaux de la procédure 1 (sauf le groupe 1, opéré à blanc) subiront une chirurgie pour sectionner certains ligaments du genou pour induire une arthrose. La chirurgie de 30-45minutes aura lieu au jour 0 sur animal anesthésié et analgésié. tous les animaux de la procédure 2 subiront une injection intra-articulaire de monoiodoacétate ou de collagénase II (sauf le groupe 1, sérum physiologique) pour induire l’arthrose. La procédure d'injection dure moins de 10 minutes et se fera sur animal anesthésié. les traitements pourront être administrés après l'induction du modèle. selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra- veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale (sur animal vigile) ou par voie intra-articulaire (sur animal anesthésié). tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Des tests comportementaux pour mesurer la douleur (test de von Frey) ou l’inconfort (incapacitance) seront également réalisés : une fois avant le début des traitements mais après l’induction du modèle afin de procéder à l’allocation des groupes (durant la 1ère semaine), puis 1-2 fois par semaine pendant 12 semaines après la chirurgie pour la procédure 1 ou 4-6 semaines après l’induction du modèle chimiquement induit pour la procédure. Le premier type de test dure une trentaine de minutes (incluant l’acclimatation) et le deuxième type de test (procédure n°4) dure environ 5 secondes de mesure et le test est répété trois fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque répétition.
Impact sur les animaux
Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer une arthrose (dégénérescence articulaire) associée à de la douleur (visible par les tests comportementaux mis en place) sans autre effet indésirable attendu. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) ni aux tests comportementaux (procédure légère pour évaluer la douleur).
Devenir
euthanasie pour récupérer différents organes, dont les articulations, pour analyses histologiques ou autre
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation et la douleur implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie de l’arthrose humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur la réponse à la douleur et l’inflammation ou la structure de l’articulation, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (kruskal-wallis test).
Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, injection intra-articulaire) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque). Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Nos études étant basées sur des modèles de douleur, l’utilisation d’analgésiques ou d’anti-inflammatoires n’est pas applicable. Toutefois, pour les modèles d’induction d’OA par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique sera administré en phase pré- et post-opératoire. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 10-15 premiers jours qui suivent l’induction puis de façon bi-hebdomadaire ensuite pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, de par leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études d’OA en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat SD est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Cependant, il est envisageable d’utiliser d’autres souches de rat comme par exemple le rat Lewis ou wistar qui sont également des modèles de laboratoire bien connus. Chez la souris, la souche C57Bl/6 représente la souche de choix pour les études d’OA mais d’autres souches pourront également être utilisées dépendant de leurs susceptibilités à l’induction de la pathologie en fonction du modèle. Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier des objectifs et besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés de 6-12 semaines au début de l’étude selon les recommandations de la littérature pour ce type de modèle (Disease Models & Mechanisms 2015 8: 17-30).
Evaluation de l’efficacité de nouveaux promoteurs muscle-spécifiques chez le rat sain et chez le rat DMDmdx, modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
82 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne et des rats sains reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique, puis des prélèvements sanguins mensuels et un prélèvement terminal, pour tester de nouveaux promoteurs censés cibler le traitement sur les muscles. Le porteur justifie le choix du rat en écartant la souris, au phénotype jugé trop peu marqué, et le chien, jugé trop lourd à manipuler. Les bénéfices annoncés pour les patients, des doses plus faibles et moins de toxicité, sont renvoyés au conditionnel.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD qui code pour une protéine appelée Dystrophine. La Dystrophine est essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité de l'ensemble des muscles de l'organisme (y compris le coeur). L’absence de Dystrophine dans les muscles provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. Aucun traitement n’est disponible à ce jour pour la DMD. La thérapie génique, qui vise à corriger ou remplacer le gène DMD est aujourd’hui une approche prometteuse pour le traitement de cette maladie. Pour réaliser un transfert de gène efficace, il est possibile d'utiliser des vecteurs viraux dérivés des Virus Adéno-Associés (AAV) produits en laboratoire dans des systèmes cellulaires. Ils assurent un transfert de gène thérapeutique sûr et efficace dans différents tissus/organes (oeil, muscle, foie ou cerveau). Les AAV sont des produits thérapeutiques performants mais des essais précliniques et cliniques ont montré des limites à leur utilisation, avec notamment la nécessité d'utiliser de fortes doses, et un transfert de gène dans certains tissus non ciblés (tissus non musculaires), avec un risque de toxicité associé. Une approche pour contrer cet effet secondaire indésirable des vecteurs AAV repose sur l'utilisation, dans ces vecteurs AAV de séquences d'ADN particulières (appelées promoteurs "tissus-spécifiques"), qui vont permettre de restreindre le traitement uniquement dans les tissus ciblés dans la pathologie à traiter, soit, dans le cadre de la Dystrophie Musculaire de Duchenne, dans les muscles squelettiques et le coeur. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité et la spécificité de nouveaux promoteurs "muscle-spécifiques" portés au sein de vecteurs AAV. Cette évaluation se fera chez le rat DMDmdx, modèle animal pertinent de la DMD, mais également chez le rat sain, afin d'évaluer les potentielles différences d'activité de ces promoteurs entre un tissu pathologique et un tissu sain.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d'identifier un (ou plusieurs) promoteurs "muscle-spécifiques" et de rendre les traitements utilisant les vecteurs de thérapie génique de type AAV beaucoup plus sécuritaires et plus efficaces: plus sécuritaires via le ciblage du traitement uniquement dans des tissus ciblés (ici les muscles), et plus efficaces car permettant d'obtenir un effet théraputique à une plus faible dose de vecteur AAV que celles actuellement utilisées. Une réduction des doses à injecter permettra de réduire la toxicité associée à l'injection de ces fortes doses, et de réduire le coût du traitement. L'identification de tels promoteurs "muscle-spécifiques" aura une application directe pour le traitement des patients atteints de DMD à l'aide de vecteurs AAV. De plus, si ces promoteurs montrent la même efficacité dans les muscles sains et dans les muscles dystrophiques, il pourra alors être envisagé de les utiliser dans des vecteurs AAV thérapeutiques visant à traiter d'autres types de maladies musculaires.
Procédures
(i) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 10min. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine jugulaire le jour de l'injection, puis une fois par mois jusqu'à la mise à mort de l'animal (2 prélèvements pour les animaux suivis 2 mois post-injection, et 4 prélèvements pour les animaux suivis 4 mois post-injection). Prélèvements effectués sous anesthésie, pour un volume correspondant à 7.5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal. Durée de l'intervention: maximum 10min. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.
Impact sur les animaux
(i) L'injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale se fera sous anesthésie et ne provoquera donc pas de stress ou de douleur aux animaux. Les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Prélèvements sanguins mensuels au niveau d'une veine jugulaire: les animaux pourraient être stressés par les anesthésies, mais celles-ci seront espacées d'au moins 4 semaines, et les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.
Devenir
A l'issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et immunohistologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs). Ce projet, qui vise à évaluer l'efficacité et la spécificité d'éléments géniques régulateurs, à la fois dans un contexte malade (DMD) et un contexte sain, et dans plusieurs tissus différents, ne peut donc être réalisée in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets sur le modèle de rats DMDmdx, lors desquels des résultats d'analyses moléculaires et immunohistologiques cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Pour les rats DMDmdx, nous nous laissons la possibilité d'inclure un animal supplémentaire par groupe (avec un maximum de 10 animaux DMDmdx supplémentaires sur l'ensemble de l'étude), en cas de sacrifice prématuré d'un animal du fait de l'évolution de la maladie chez ces animaux avec phénotype dommageable.
Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois), un hébergement à deux animaux (par groupe expérimentaux), accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
Il existe un modèle de rat possèdant un défaut génétique dans le gène codant pour la protéine Dystrophine, le rat DMDmdx. Dans ce modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD), l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype sévère. Les modèles animaux atteints de cette maladie les plus classiquement utilisés : souris déficientes en dystrophine (souris mdx) et chien Golden Retriver déficient en dystrophine (chien GRMD), présentent des limites pour les projets pré-cliniques : -La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec un phénotype peu marqué. -Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients atteints de la Dystrophie Musculaire de Duchenne et un phénotype sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Afin de comparer les résultats obtenus dans un contexte sain et un contexte dystrophique, des rats sains de type Sprague Dawley (même fond génétique que les rats DMDmdx) seront utilisés. Les animaux seront injectés à l'âge de 1 mois au niveau de la veine caudale. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients DMD pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants ou jeunes adolescents, pré-pubères). Les animaux injectés seront ensuite suivis sur une durée de soit 2 mois, soit 4 mois après injection pour documenter l’efficacité du traitement à 2 temps différents. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette myopathie est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation devient sévère (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation) pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la neurologie
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Lapins : 300
Chiens : 100
Cochons : 100
Chèvres : 100
Moutons : 200
900 animaux non-humains, dont 300 lapins, 200 moutons, 100 chèvres, 100 cochons, 100 chiens et 100 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Chaque individu subit une chirurgie d'implantation d'un dispositif médical de une à deux heures, parfois suivie d'une seconde chirurgie de retrait, avec prélèvements sanguins, imagerie et enregistrements cérébraux pouvant durer jusqu'à quatre heures pendant lesquels l'animal peut être isolé. Le porteur décrit une activité de prestation menée pour un donneur d'ordre et indique que les tissus entourant l'implant sont prélevés après mise à mort pour analyse. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et que la réglementation impose le recours aux animaux avant les essais cliniques.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en neurologie (exemple : électrode cérébrale pour la stimulation ou l'enregistrement de signaux cérébraux, implant pour soulager les douleurs de la colonne vertébrale, les hernies discales, implant pour la réparation des os du crane...). Ces produits, destinés à être mis en contact avec le corps humain et particulièrement avec le système nerveux (cerveau, moelle épinière) doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur sécurité et efficacité lors de l'utilisation clinique. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, ainsi que de la sensibilité et fragilité du système nerveux, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet, avant de pouvoir passer aux tests chez l'humain. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux de données de performance et de tolérance des produits de santé en neurologie. Ainsi, il est possible d'analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une mise sur le marché. Pour chacune des procédures, qui décrivent différents modèles animaux permettant d'évaluer les dispositifs médicaux en fonction de leur indications cliniques (par exemple : électrode implantée dans le cerveau, système de stabilisation de la colonne vertébrale ...), les bénéfices susceptibles sont principalement de faire avancer les connaissances sur la réaction de l'organisme après mise en contact avec le dispositif médical mais aussi sur son efficacité. Cela permet d'obtenir des données sur la sécurité du produit (exemple : il n'induit pas de réaction inflammatoire anormale), et des données sur la performance du produit (exemple : le produit a engendré une stabilisation de la colonne vertébrale, évaluée par le biais de la fusion de 2 vertèbres entre elles). Ainsi si les différents produits obtiennent des résultats satisfaisants à ce stade, ils pourront ensuite passer à l'étape suivante des tests cliniques, chez l'homme, avant d'être proposés à l'ensemble de la population, après validation des instances réglementaires.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h et 2h). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), analgésie et antibiothérapie. Certains animaux peuvent être soumis à une intervention chirurgicale supplémentaire si le but de l'étude est aussi d'évaluer la cicatrisation après retrait du dispositif de son site d'implantation (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h et 2h). Cette intervention aura lieu dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Des prélèvements sanguins peuvent etre réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude (plusieurs années possibles), 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude). De même, des enregistrements cérébraux suite aux stimulations électriques des électrodes implantées (procédures 3 ou 6 par exemple) pourront être réalisées en cours d'étude. Ces enregistrements sont non douloureux et peuvent etre réalisés chaque jour de la semaine (5x/semaine), pendant quelques minutes à 4 heures maximum par session, ou bien durant la nuit (12 heures maximum). Lors de ces enregistrements, l'animal pourra être isolé.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, une douleur et stress liés à la chirurgie, une perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours, un risque infectieux à la chirurgie, un hématome sur le site opératoire, pouvant entrainer, selon la localisation : déficit sensitif et/ou moteur des membres postérieurs (troubles de la locomotion), trouble de la commande vésicale ou anale (incontinence), signes neurologiques (port de tête anormal, tremblements corporels, convulsions).
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des vertèbres pour évaluer la fusion dans le cadre de la procédure de stabilisation de la colonne vertébrale). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d'évaluer la sécurité et la performance des dispositifs médicaux utilisés en neurologie, en raison des interactions complexes s'établissant entre le tissus ciblé (exemple : cerveau, moelle épinière) et le dispositif lui-même. De plus, l’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation que doivent suivre les tests précliniques sur les dispositifs médicaux, avant de pouvoir lancer les tests cliniques.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Le dispositif à tester est le dispositif final, celui qu'il est prévu d'implanter chez l'homme ensuite. Il ne s'agit pas d'un produit en cours de développement, pouvant subir encore beaucoup de modifications de sa composition ou de sa forme. Cela implique donc que l'utilisation des animaux n'a lieu qu'en dernier lieu et assure qu'il n'y aura pas d'animaux utilisés inutilement sur un dispositif qui ne serait pas finalisé. Avant de lancer une étude réglementaire à grande échelle sur un dispositif médical, il est aussi possible de lancer des études pilotes qui permettront, sur un faible nombre d'animaux, de comparer plusieurs produits entre eux afin de sélectionner le produit pour l'étude à grande échelle. De plus, l’interprétation des résultats nécessite toujours de comparer ceux obtenus chez des animaux qui reçoivent le produit à évaluer avec ceux obtenus d’animaux qui reçoivent un produit « contrôle », dont l’effet attendu est déjà connu. Pour réduire encore le nombre d’animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "controle", pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Le nombre d'animaux à inclure en étude est imposé par les normes en vigueur (exemple : minimum 10 sites d'implantation sur un minimum de 3 animaux par groupe et par délai d'analyse, et pour les produits au contact du cerveau : minimum 8 animaux par groupe et par délai d'analyse).
Raffinement
Le stress des animaux est limité par la mise en place d'une période d’acclimatation à leur arrivée dans l'établissement utilisateur, pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable. Ensuite, pour les procédures le nécessitant, une période d’habituation et d'entrainement aux actes spécifiques (contention, palpation, isolement, mise en place d'éléments pour les sessions d'enregistrement cérébraux…) est réalisée pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (jouets, plateforme de repos, augmentation de la quantité de litière…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires par exemple pour certaines espèces). Afin de limiter au maximum la douleur des animaux, les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie chimique et gazeuse, et analgésie (à base de morphiniques). En cas de signes de douleur et signes cliniques, le traitement adapté sera mis en place. Les animaux sont suivis de façon quotidienne, 7 jours sur 7 sur la base des critères suivants : apparence et état général, consommation alimentaire et hydrique et transit, attitude, comportements, signes cliniques. Si des points limites sont atteints pour plusieurs de ces critères, relevant d'un inconfort ou souffrance importants, et si le traitement mis en place n'a pas d'effet, l'animal est alors euthanasié. En phase post-opératoire, le suivi est renforcé et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements s'il y a lieu, désinfection des sites chirurgicaux…). En cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, l’équipe vétérinaire assure l’examen clinique et le suivi de l’animal, afin de mettre en place une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Le risque infectieux est controlé par l'administration d'antibiotique en phase per-opératoire.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisé seront testés préférentiellement chez le rat ou le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le chien, les ovins/caprins ou les porcs/miniporcs. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Le choix entre les grands modèles repose aussi sur les similarités avec l’Homme: -Développement du cerveau, myélinisation, biochimie, surface du cerveau et proportion de matière blanche similaire chez le porc. -Caractéristique anatomique de la moelle épinière, vertèbres cervicales similaires et modèle reconnu pour la recherche sur la colonne vertébrale chez les ovins -Colonne vertébrale uniforme et régulière simplifiant les procédures chirurgicales, taille du canal vertébral, structure et biomécanique de la colonne lombaire et thoracique similaires. Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1. Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2. Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière, le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3. Cas particulier des porcs domestiques Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où le choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet.