Troubles musculosquelettiques
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Inactivation d’une protéine impliquée dans l’atrophie musculaire dans un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces souris porteuses d'une forme de dystrophie musculaire de Duchenne reçoivent une injection intramusculaire puis des mesures de contractilité musculaire sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélèvements. Le porteur décrit des risques d'hypothermie et d'arrêt cardio-respiratoire liés à l'anesthésie et attend "à court terme" une amélioration du phénotype dystrophique, l'usage chez le patient restant renvoyé au long terme. Il affirme le modèle murin "indispensable", les modèles in vitro ne rendant pas compte selon lui de la dégénérescence progressive de la maladie.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, nous envisageons de tester une nouvelle molécule qui possède un réel potentiel thérapeutique en améliorant l’intégrité du muscle dystrophique.
Bénéfices attendus
Nous attendons comme bénéfices à court terme, chez les souris dystrophiques, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec notre molécule. A long terme, nous projetons d’utiliser cette molécule comme traitement utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions: - Injection intra musculaire (10 minutes) (avec analgésie et anesthésie). Les animaux seront soumis à des mesures de contractilité musculaire (40 minutes) (1 fois) (avec analgésie et anesthésie). Euthanasie après les mesures de contractilité musculaire.
Impact sur les animaux
Lors du transport entre les deux laboratoires et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lors de leur transfert dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Au moment des injections intramusculaires et des mesures de force, les animaux subissent un stress lorsqu’ils sont placés dans la cage à induction pour l’anesthésie gazeuse. Suite à l’injection intramusculaire, une gêne et/ou une anomalie au niveau du site d’injection pourrait éventuellement apparaître mais nous administrerons un analgésique avant la procédure et surveillerons les animaux pour réagir au plus vite. Au cours de l’anesthésie profonde, les animaux pourraient être victimes d’hypothermie mais nous veillerons à que leur température reste constante. Enfin, les animaux pourraient être victimes d’arrêt cardio-respiratoire suite à l’administration de l’anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires
Remplacement
Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle dystrophique est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne car il s’agit du modèle le plus approprié car bien caractérisé. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Néanmoins les souris dystrophiques présentent une forte hétérogénéité surtout lorsque nous mesurons des paramètres tels que la force musculaire. En envisageons donc d’utiliser 6 animaux (6 muscles traitées), pour l’analyse des mitochondries et 12 animaux (12 muscles traités) pour les mesures de force. Sachant que l’expérience sera répétée, nous envisageons donc d’utiliser 12 et 24 animaux pour l’analyse des mitochondries et les mesures de force respectivement. Ce nombre d’échantillons permettra d’obtenir une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. Au total, nous prévoyons d'utiliser 60 souris dystrophiques et 60 souris contrôle. La taille des effectifs sera établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l’euthanasie compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet combine l’avantage du modèle murin dystrophique et l’avantage d’avoir les mitochondries marquées, ce qui sera très utilie pour mener à bien notre projet. Nous utiliserons des animaux âgés de 11 semaines en début de procédure et de 21 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux adultes pour ne pas observer de biais dus à la croissance.
Evaluer la biocompatibilité et l’efficacité de biomatériaux implantés in vivo chez le rat dans un défaut généré dans la calvaria
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit la création d'un trou dans l'os du crâne sous anesthésie, le comblement par un biomatériau maintenu vingt semaines, des prélèvements de sang hebdomadaires sur animal vigile et des radiographies répétées. Le porteur relie ce test à l'obtention du marquage CE d'un substitut osseux, prévu par la directive européenne sur les dispositifs médicaux. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage osseux et que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
Les objectifs du présent projet sont : - De caractériser in vivo la biocompatibilité d’un biomatériau (substitut osseux) dans un environnement osseux. - D’évaluer la capacité du biomatériau étudié à induire une formation osseuse suite à la création d’un défaut dans la calvaria (os du crâne)
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux : - Court terme (3 mois): chaque protocole, permettra de générer des informations sur la biocompatibilité du biomatériau étudié telles que l’évolution de l’inflammation des tissus post-chirurgie ainsi que la cicatrisation initiale autour du biomatériau. - Long terme (5 mois) : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modalités de reconstruction osseuse (ex : mesure du taux de calcification, intégration du biomatériau) chez les animaux après implantation du biomatériau.
Procédures
La création d’un défaut osseux est prévue pour chaque animal. Cette procédure durera environ 20 min et se fera sur animal anesthésié. Le biomatériau de comblement sera ensuite appliqué et maintenu en place pendant 20 semaines. Des prélèvements sanguins sont prévus 1x/semaine sur animal vigile pendant toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. Des radiographies sont prévues 2x/mois sur animal anesthésié pendant toute la durée de l’étude. Chaque radio durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours des études d’efficacité préalablement réalisées et appuyées d’une veille bibliographique inhérente au biomatériau. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, difficulté à se déplacer…. Ces effets délétères ont préalablement été anticipés et listés au même titre que leurs actions correctives afférentes. Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’implantation du biomatériau. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une anesthésie, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus. - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus.
Devenir
A l’issue du protocole tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour évaluer la toxicité éventuelle du biomatériau et/ou évaluer les modifications induites par son implantation. Les organes seront également utilisés pour réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.
Remplacement
De manière systématique, les biomatériaux que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des biomatériaux testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer le remodelage osseux. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux biomatériaux testés, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le biomatériau évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents biomatériaux pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un analgésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié.
Choix des espèces
Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère (à l’identique de la souris) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettront de confirmer la biocompatibilité du biomatériau et de faciliter la transposition à l’homme dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux biomatériaux. De plus, une analyse in vivo de la biocompatibilité de biomatériaux est requise par la loi afin de pouvoir être marqué CE au titre de la directive européenne 93/42/CEE. Sous le couvert de la réglementation française (article R. 214-87 du Code rural et de la pêche maritime), le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté en fonction des données préliminaires du client et de l’analyse de la littérature par rapport au biomatériau étudié.
Caractérisation de la fonction musculaire dans un modèle murin de maladie dégénérative neuromusculaire.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
324 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les cohortes expérimentales tuées à l'issue et 50 animaux réutilisés pour l'élevage ou d'autres projets. Elles subissent un prélèvement de l'extrémité de la queue et la pose d'une bague à l'oreille à quinze jours, puis un test de force musculaire sous anesthésie, tout en développant une perte de coordination et une intolérance à l'effort. L'objet est de caractériser la composante musculaire d'une maladie neuromusculaire génétique. Le porteur affirme que la coordination des processus en jeu ne peut être étudiée qu'in vivo, sur un animal vivant.
Objectifs
Ce projet vise à étudier une maladie neuromusculaire d’origine génétique qui se manifeste chez les patients par une perte de coordination des mouvements avec une évolution lente et progressive pouvant être associée à une intolérance à l’exercice, un retard mental faible à modéré et des crises d’épilepsie. L’objectif de ce projet est de comprendre la composante musculaire de cette maladie en étudiant la fonction musculaire de façon non invasive dans un modèle qui possède une perte totale du gène responsable de la maladie et qui développe une forme modérée de la maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet seront, à moyen terme, une meilleure compréhension des anomalies de la fonction musculaire et des anomalies moléculaires et biochimiques dans cette maladie, ce qui permettra de mettre en place des essais pré-cliniques afin de tester l’efficacité d’agents pharmacologiques. A long terme, l’identification de solutions thérapeutiques efficaces permettra le transfert de ces données vers la clinique pour une meilleure prise en charge et prévention de la maladie
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 15 jours, réalisé en même temps que leur identification par la pose d’une bague à l’oreille. La durée du prélèvement sera de quelques secondes et l’identification des animaux par pose d’une bague à l’oreille nécessite moins de 1 minute. Le projet comprend aussi un test de force musculaire non invasif sous anesthésie générale (10-15 min).
Impact sur les animaux
Les souris modèles développent une maladie neuromusculaire progressive avec la perte de la coordination des mouvements et une intolérance à l’effort uniquement décelable grâce aux tests de comportement, ce qui peut induire un léger stress. Ces souris ont une alimentation et une durée de vie normales. Pour l’identification et le génotypage des animaux, le prélèvement de tissu sera réalisé à l’extrémité de la queue et sera inférieure à 1mm afin de limiter les effets indésirables. A l’âge de 15 jours, une biopsie de moins de 1 mm peut être envisagée sans induire d’effets indésirables importants pour l’animal. La pose d’une bague numérotée aux oreilles pour identifier de façon définitive la souris peut entrainer une gêne ou un inconfort dus au poids de la bague.
Devenir
Les animaux reproducteurs seront utilisés pour générer le nombre d’animaux nécessaires pour la procédure expérimentale. Les animaux de génotypes non-utiles seront recyclés pour les croisements ou d’autres utilisateurs, ou mis à mort. Les animaux des cohortes expérimentales sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et biochimiques
Remplacement
Bien que l'analyse de la fonction musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, la coordination des processus biologiques qui la régule et leurs répercussions fonctionnelles ne peuvent être étudiées qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.
Réduction
Les souris étant génétiquement modifiées, un élevage spécifique est mis en place. Les souris surnuméraires et de génotypes utiles sont recyclées pour les croisements ou pour d’autres utilisateurs. L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses expérimentales. L’utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l’établissement des données expérimentales, à l’aide des analyses statistiques effectuées précédemment. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des mesures de force musculaire rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le prélèvement de tissu à l’extrémité de la queue sera réalisé précocement, à l’âge de 15 jours, avant l’ossification de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors du protocole de la mesure de la force musculaire.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines puisque 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. Les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris génétiquement modifiée est liée à l'absence de modèle mammifère naturel correspondant à la maladie humaine. Par ailleurs, nos premières données de l’étude du modèle montrent que ce modèle reproduit la maladie étudiée dans ce projet. Pour l’élevage de la lignée, des souris âgées entre 8-20 semaines seront utilisés pour s’affranchir d’éventuelle baisse de production après 6 mois. L’identification et la biopsie pour le génotypage se font à 15 jours. Pour la procédure expérimentale, deux stades seront étudiés pour les test de force musculaire: 20 et 40 semaines. A 40 semaines, une intolérance à l’effort a déjà été identifiée dans une expérience pilote menée dans une précédente animalerie sur un nombre limité d’animaux en utilisant un protocole de tapis roulant, démontrant des conséquences physiologiques sur la fonction musculaire. Ensuite, les analyses biochimiques montrent des anomalies dès 20 semaines pouvant potentiellement entraîner des conséquences physiologiques sur la fonction musculaire.
Evaluation de l’efficacité d’un traitement contre l’ostéoporose induite par glucocorticothérapie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
570 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous la peau un système diffusant un corticoïde pendant cinq mois, puis des prélèvements de sang et d'urine chaque semaine, des injections sous-cutanées et intramusculaires deux fois par semaine, des gavages quotidiens et des radios, provoquant traumatismes et inflammations aux sites d'implantation. L'objet est d'évaluer un traitement contre la fragilité osseuse induite par les corticoïdes. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" en affirmant qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité du traitement étudié à résorber les atteintes osseuses qui surviennent lors d’une corticothérapie chronique (La corticothérapie est un traitement à base de corticoïdes, des médicaments aux propriétés anti-inflammatoires). En effet, des études de pharmacovigilance ont montré qu’une fragilisation osseuse est induite lors d’une corticothérapie et est caractérisée par une réduction de la minéralisation osseuse, altération de l’architecture et de la densité minérale de l’os. De plus, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques agissant sur le métabolisme osseux, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet afin d’évaluer sur l’animal la capacité d’un traitement à éviter l’apparition d’atteintes osseuses, comme de caractériser les effets indésirables que pourrait entrainer le composé thérapeutique étudié. Cette étude permettra de définir les types de lésions osseuses (ostéoporose) qui sont observées lors de la corticothérapie, de proposer des schémas thérapeutiques d’administration adaptés afin de réduire et/ou abolir ses potentiels effets délétères, et de caractériser la capacité du traitement à stopper le développement des lésions osseuses. .
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesureront à plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra de générer des informations sur la potentielle toxicité osseuse du traitement étudié. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications physiologiques osseuses chez les animaux après application du traitement. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.
Procédures
Une implantation sous-cutanée de système de diffusion continue de corticoïde est prévue pour chaque animal. Cette procédure durera environ 20 min et se fera sur animal anesthésié. Le système de diffusion restera en place pour une période maximum de 5 mois. Des prélèvements sanguins et urinaires sont prévus 1x/semaine sur animal vigile pendant toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. Des injections sous-cutanées sont prévues 2x/semaine sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque injection durera moins de 1 min. Des injections intra-musculaires sont prévues 2x/semaine sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque injection durera moins de 2 min. Des gavages se feront sur animal vigile 1x/jour sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque gavage durera moins de 5 min. Des radios sont prévues 2x/mois sur animal anesthésié. Chaque radio durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’implantation du système de type ALZET (dispositif de diffustion de molécules en continu). Cette procédure étant douloureuse à court terme, une anesthésie, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus. - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’injection du traitement. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus. - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus.
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le traitement et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser le composé et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.
Remplacement
De manière systématique, les composés/principes actifs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs, 12 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique, sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité et de ceux obtenus entre chaque protocole de ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion altérée, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera pris en charge.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents traitements seront utilisés.
Evaluation de stratégies thérapeutiques dans un modèle de myopathie
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections abdominales déclenchant la mutation d'une myopathie génétique, subissent une perte de force et de poids, puis des tests de force et de course répétés pendant douze semaines et des injections d'agents thérapeutiques, avant le prélèvement de leurs muscles. L'objet est d'identifier des candidats médicaments pour une myopathie à cores sans traitement curatif. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal vivant ne permet d'évaluer la force musculaire et son évolution sous traitement.
Objectifs
Les myopathies à cores sont des maladies génétiques rares sans aucun traitement curatif actuellement. Elles sont caractérisées par la présence de zones anormales, appelées "cores", à l’intérieur des fibres musculaires, et sont souvent liées à des mutations génétiques bien identifiées dont une en particulier sur laquelle est basée ce projet. Il en résulte que la fibre musculaire est moins performante car sa structure est modifiée. Chez l'Homme, la diminution de la force musculaire se manifeste dès la naissance pour les cas sévères ou plus tardivement. Les mécanismes conduisant au développement de la pathologie ont été identifiés grâce à des altérations observées sur les cellules musculaires de souris en culture et sur un modèle de souris précédemment développé et reproduisant une grande partie des problèmes musculaires rencontrés chez les patients. Ces mécanismes constituent des pistes thérapeutiques potentielles. Pour la plupart de ces pistes, des modulateurs ont été décrits et présentent donc un intérêt thérapeutique. Pour chacune de ces pistes candidates, nous avons retenu un ou plusieurs agents capables de corriger les altérations observées in vitro. Le présent projet propose d'évaluer leur potentiel in vivo en suivant l'évolution de la force musculaire chez des souris modèle génétique de la myopathie à cores. Ainsi, l'objectif de notre étude est d'identifier des candidats médicaments ayant la capacité de redonner de la force musculaire à des patients atteints de myopathie à cores afin d'améliorer leur espérance et leur qualité de vie.
Bénéfices attendus
L'objectif de notre étude est d'identifier des candidats médicaments ayant la capacité de redonner de la force musculaire à des patients atteints de myopathies.
Procédures
1- injection dans l'abdomen de l'agent chimique permettant l'induction de la mutation: 1 fois par jour pendant 5 jours; durée moins de 30 secondes. 2- test de comportement pour la mesure de la force: entrainement et réalisation du test : 1 fois par semaine, 12 semaines, durée moins de 5 minutes par test. 3- Test de course: entrainement et réalisation du test tous les 15 jours, pendant 12 semaines, durée moins de 30 minutes par test. 4- injection de l'agent thérapeutique par différentes voies, une fois par semaine; durée moins de 30 secondes pour l'injection dans l'abdomen, jusqu'à 5 min anesthésie comprise pour l'injection dans le muscle. Ces injections n’auront pas lieu si le traitement dans l’eau de boisson ou dans les croquettes est possible.
Impact sur les animaux
1- Une souffrance légère liée à la répétition des injections est à envisager ainsi que les risques de formation d’un hématome au site d'injection. 2- La perte de la force musculaire et la perte de poids liées au modèle de la myopathie. 3- l'injection dans le muscle peut engendrer une douleur au site d'injection, elle se réalisera sous anesthésie gazeuse. 4- une perte de poids ou autres effets secondaires actuellement imprévisibles des candidats médicaments
Devenir
Les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever les muscles et réaliser des analyses moléculaires
Remplacement
Afin de limiter le nombre d'agents et donc le nombre d'animaux vivants utilisés, un grand nombre de candidats médicaments seront testés sur des cellules musculaires in vitro. Les candidats médicaments les plus efficaces seront testés chez les animaux. Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation de la force musculaire d'une myopathie génétique et d'en suivre l'évolution au cours d'un traitement thérapeutique.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'agents et donc de réduire le nombre d'animaux vivants utilisés, les candidats médicaments sont auparavant testés sur des cellules musculaires en culture. Seuls les plus efficaces seront testés chez les animaux. Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de répétitions des expériences sont déterminés à l'aide de tests statistiques appropriés tout en optimisant l'interprétation statistique des informations recueillies. Aussi souvent que possible, afin de limiter le nombre d'animaux, un seul groupe controle sera utilisé en parallèle de deux groupes traités simultanément.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du premier février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Les injections dans l'abdomen sont réalisées à l'aide d'aiguilles fines et changées pour chaque animal afin de limiter l'apparition d'hématome suite aux injections répétées, le site d'injection (droit ou gauche) est changé chaque jour. Les injections intra musculaires se réaliseront sous anesthésie. De la nourriture gélifiée et appétente est donnée lors de la perte de poids liée à la fonte musculaire observée chez les animaux modèles de la myopathie. Les tests de comportement sont réalisés après une période d'entrainement permettant de limiter le stress de la nouveauté. Enfin, une grille de cotation adaptée au modèle souris de la myopathie à cores centraux est établie et permet d'identifier et d'utiliser des points limites précoces et adaptés et de définir les critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Le projet utilisera une souche de souris permettant de modéliser les altérations musculaires observées chez des patients atteints de myopathie à cores. Il est nécessaire que le développement musculaire se déroule normalement avant d'induire la mutation dans ce modèle. Ainsi les animaux seront étudiés dès l'âge de 8 semaines, car les fibres musculaires sont matures à partir de ce moment là.
Etude du microenvironnement tumoral et développement thérapeutique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
4 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses ou des implantations chirurgicales de fragments de tumeurs humaines, puis des traitements répétés par voie orale, veineuse ou intrapéritonéale, avant un prélèvement terminal de la tumeur et des organes. L'objet est d'étudier le microenvironnement des tumeurs et d'y tester de nouveaux traitements anticancéreux. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ou ex vivo ne reproduit la complexité de ce microenvironnement et évoque des modèles cellulaires en 3D destinés à réduire, à terme, le nombre d'animaux.
Objectifs
L’hypothèse de travail porte sur l’hétérogénéité tumorale qui corrèle avec l’agressivité́ des tumeurs, leur résistance aux traitements et leur capacité métastatique. Cette hétérogénéité est un paramètre biologique complexe qui inclue une hétérogénéité des cellules tumorales et de leur environnement et peut être impactée par les traitements utilisés. Le microenvironnement tumoral va créer un sanctuaire pour la mise des cellules cancéreuses dans un état de dormance qui deviennent résistantes aux drogues et sont alors responsables de la récurrence de la maladie plusieurs mois ou années après la rémission. Ce sanctuaire est une zone de tolérance immunitaire renforçant la survie et la croissance des cellules tumorales. Le projet portera sur le développement de nouvelles approches thérapeutiques et l’analyse de l’impact des traitements sur l’hétérogénéité tumorale et ses conséquences cliniques. Les approches thérapeutiques testées reposeront sur un ciblage des cellules tumorales (ex. chimiothérapie, inhibiteurs de kinases), un ciblage du microenvironnement tumoral (ex. ciblage des macrophages, inhibiteurs de points de contrôle du cycle cellulaire) en monothérapie ou en bithérapie. Ces approches seront testées in vivo dans des modèles murins xénogéniques (souris immunodéficients) ou syngéniques (souris immunocompétentes). Les pathologies tumorales étudiées seront des sarcomes (osseux ou tissus mous) ou de carcinomes (ex. prostate, colon, poumon). Ce projet a pour objectifs : - de caractériser sur un plan cellulaire et moléculaire le microenvironnement tumorale au cours de l’évolution naturelle de la maladie (impact sur la tumeur primaire et sur le développement métastatique), - de caractériser de manière cinétique l’évolution du microenvironnement tumoral et son impact sur la clonalité des cellules cancéreuses au cours des traitements, - d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, - de développer de nouvelles approches thérapeutiques reposant sur un ciblage du microenvironnement tumora
Bénéfices attendus
Le dialogue établi entre les cellules cancéreuses et leur environnement est considéré comme un point majeur dans la progression tumorale et dans le processus de résistance aux traitements. Cependant, quels que soient les traitements utilisés en oncologie, ceux-ci impactent la biologie des cellules tumorales et également les cellules « saines » du microenvironnement tumoral. Le projet présenté permettra de mieux comprendre les modifications du microenvironnement au décours des traitements, leur impact sur la progression tumorale et le développement de résistances aux drogues. Les bénéfices de ce projet sont multiples à court et long termes. A court terme une meilleure compréhension de l’évolution du microenvironnement permettra : - de cartographier l’impact des traitements sur les tissus, - de comprendre la contribution des éléments du microenvironnement dans le développement tumoral et la réponse aux traitements, - d’identifier et de valider de nouveaux biomarqueurs pronostiques, - d’identifier et de valider de nouvelles cibles thérapeutiques. A long terme, ce projet permettra d’analyser de manière cinétique l’évolution du microenvironnement tumoral, d’identifier de nouveaux biomarqueurs pronostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques en cancérologie. Les résultats obtenus permettront également la mise en place d’essais cliniques chez les êtres humains et les animaux (chiens, chats, etc) atteints de cancer.
Procédures
Le projet prévoit l’induction de tumeurs chez la souris par l’injection de cellules cancéreuses (3440 animaux) ou de fragments tumoraux humains frais (1360 animaux). Fréquence : une seule injection/implantation par animal. L’induction des tumeurs par injection de cellules sera réalisée par injections de cellules en site sous cutanée et en site intramusculaire para-osseux sur animal vigile, ou en site intracardiaque sous anesthésie générale. Des implantations intra-osseux sont prévues sous anesthésie générale. L’induction des tumeurs par implantation de cellules cancéreuses en site intra-osseux, ou de fragments tumoraux en site sous cutanée ou intra-musculaire sera réalisée par une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Durée d’intervention : 10 minutes par souris (site sous cutanées ou intramusculaire), 20 minutes (site intra-osseux) Les traitements par injection en site intra-péritonéal, sous cutanée seront réalisés sur animal vigile. Les traitements par injection en site intra-veineux seront réalisés sur animal sous anesthésie gazeuse (durée de la manipulation: 10 minutes). Les traitements oraux seront réalisés sur animal vigile (durée de manipulation : courts moins de deux minutes/animal). La rythimicité des traitements est dépendante des agents thérapeutiques utilisés et de leur mode d’injection (Fréquences maximales des traitements par animal: intra-veineux (un par semaine), sous-cutanée (1 par jour), intra-péritoneal (1 par jour), gavage (1 par jour) ; Fréquences moyennes des traitements par animal selon l’expérience de l’équipe : intra-veineux (un par semaine), sous-cutanée (1 par jour deux fois par semaine), intra-péritoneal (1 par jour deux fois par semaine), gavage (1 par jour). Les volumes tumoraux seront suivis manuellement à l’aide d’un pied à coulisse deux fois par semaine sur animal vigile (durée de la manipulation : 2 minutes/animal). Les prélèvements de tissus (organes, os, tumeurs) seront réalisés en point final après euthanasie des animaux, et un prélèvement sanguin en site intracardiaque sera réalisé sur animal sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Les procédures présentées dans ce projet peuvent générer des douleurs chez les animaux comme l’injection de cellules ou l’implantation de fragments tumoraux. Une prise en charge de la douleur spécifique à chaque geste technique sera proposée et reposera sur une administration médicamenteuse adaptée et proportionnée à l’évaluation de la douleur. Cette prescription médicamenteuse sera maintenue pendant 24 heures (procédure dite légère) ou avec une fréquence toutes les 12 heures pouvant être accrue toutes les 8 heures (procédure jusqu’à récupération complète et disparition de la douleur liée à la procédure). La suite du protocole ne doit pas générer de douleur, néanmoins, s’il est constaté́ une douleur (mobilité réduite, comportement anormal type prostration, pelage hérissé, etc), la procédure légère de prise en charge de la douleur sera réitérée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés selon la procédure précisée en vue de prélever la tumeur, les sites métastatiques, le sang et les organes afin d’analyser les caractéristiques du microenvironnement tumoral et d’analyser l’impact des molécules thérapeutiques sur celui-ci et leur effet sur les organes des animaux.
Remplacement
Le microenvironnement tumoral est un environnement très complexe composé de divers types cellulaires et de matrice extracellulaire produit par différentes cellules, et qui se développent de manière cinétique en trois dimensions. Toutes ces composantes interagissent entre elles pour établir pour assurer la mise en place d’un environnement propice à la croissance de la tumeur, au processus métastatique et au contrôle de la réponse aux médicaments par les cellules tumorales. Par ailleurs, cette niche tumorale peut être modifiée en fonction du temps par les thérapies utilisées. Ces caractéristiques font qu'il n'existe actuellement aucun système in vitro ou ex vivo permettant de récapituler tous les évènements et les modifications du microenvironnement associées que ce soit pour les sarcomes et les carcinomes. Cependant, parallèlement aux modèles animaux proposés, des essais in vitro "basés sur les tumeurs" (lignées cellulaires, cultures primaires de cellules humaines, modèles de culture 3D) ont débuté au sein de l’équipe pour développer une plateforme de criblage de composés prometteurs et ainsi réduire le nombre d'animaux requis. Ces futurs modèles associeront des systèmes microfluidiques, de la reconstruction en 3D de coupes histologiques humaines, des approches utilisant des données archéologiques (tissu osseux) et de la modélisation informatique.
Réduction
La conception de nos protocoles expérimentaux repose sur notre expérience, les données quantitatives publiées antérieurement suite à différents traitements médicamenteux et les recommandations de notre cellule statistique. En prenant en compte tous ces éléments, le nombre d’animaux par groupe est fixé à 10. Si des différences importantes sont observées lors des premières expérimentations à venir (essai d’une nouvelle génération de molécules), une réduction du nombre d'animaux dans les expériences suivantes sera appliquée après une nouvelle estimation statistique. Toutes les expériences seront « randomisées » : les animaux sont inclus au hasard dans chaque groupe après induction des tumeurs, et groupés de manière à réduire le nombre d'animaux en utilisant, dans la mesure du possible (par exemple : un même groupe de contrôle peut être utilisé pour plusieurs molécules à tester). Des études pilotes reposant sur un nombre d’animaux réduits seront envisagés lorsque cela sera nécessaire (ex : nouvel échantillon de patient) pour définir un temps de croissance tumorale par exemple et ainsi réduire le nombre d’animaux par groupe ultérieurement. Un plan expérimental sera établi avant chaque expérimentation afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus.
Raffinement
Les modèles murins qui seront utilisés dans ce projet sont déjà établis et nous disposons déjà de données dans l'utilisation de ces modèles (ex. croissance tumorale, formation de métastases, réponse à certaines chimiothérapies). Nous avons déjà identifié la chronologie de la croissance de la tumeur primaire pour les modèles reposant sur l’injection de cellules tumorales issues de lignées cellulaires commerciales, de l'initiation des métastases pulmonaires (cas des ostéosarcomes) et de la détection des cellules tumorales circulantes. Ces informations nous permettent d'initier les procédures expérimentales à un moment approprié avec une reproductibilité accrue. Une attention particulière sera donnée sur le suivi des signes de souffrance des animaux. Une surveillance étroite des animaux par des techniciens animaliers et des chercheurs expérimentés sera mise en place et, le cas échéant, une analgésie sera utilisée pour soulager la douleur. Nous continuerons à affiner les études en termes de surveillance/imagerie des tissus et de collecte de données. Dans le cadre des bonnes pratiques de laboratoire, nous rédigerons un protocole [plan d'étude individuel (PIE)] pour chaque expérience, comprenant l'énoncé du ou des objectifs, une description de l'expérience, couvrant des questions telles que les traitements expérimentaux, les détails du matériel expérimental.
Choix des espèces
Nos procédures expérimentales prévoient l’utilisation de souris immunocompétentes et immunodéprimées selon l’origine des cellules ou des tissus tumoraux implantés. Des souris immunodéficientes seront utilisées pour l'injection de lignées cellulaires humaines et pour l'injection de cellules issues de cultures primaires ou d'échantillons de patients. L’utilisation de souris immunocompétentes permettra d’étudier les populations immunitaires associées au développement tumoral suite à l’implantation de cellules d’origine murine. Différentes souches de souris seront utilisées selon l'origine des cellules. La souris est préférentiellement choisie en raison de l’origine des lignées cellulaires disponibles et par le fait que ces animaux de petites tailles nécessitent des quantités de molécules thérapeutiques réduites. Pour les modèles de d’ostéosarcomes et de sarcomes d’Ewing, des souris jeunes seront utilisées afin de mimer au mieux les tumeurs chez les patients (enfant, l’adolescent et le jeune adulte). Réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 semaines). L’âge des souris est déterminé selon l’âge de diagnostic de la pathologie chez l’être humain. Pour les modèles de sarcomes des tissus mous, chondrosarcomes et de carcinomes, des souris âgées de 8 semaines seront utilisées. Réception de souris âgées de 7 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 8 semaines). L’âge des souris est déterminé selon l’âge de diagnostic de la pathologie chez l’être humain.
Preuve de concept de l’efficacité de nos produits d’intérêt myorelaxant, après application topique, dans le traitement des maladies de la contraction musculaire.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
516 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est rasé, reçoit le produit sur la peau ou par injection intramusculaire, puis subit une dizaine de mesures électriques du muscle sous anesthésie et une trentaine de mesures de l'écartement des doigts de la patte. Le projet compare des produits commerciaux, désignés comme "nos produits", aux traitements de référence de la dystonie et de la spasticité. Le porteur indique que la réutilisation des animaux a été tentée sans succès et affirme que les modèles cellulaires restent débattus.
Objectifs
Cette étude a pour objectif de démontrer l’efficacité et les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Dans cette étude, le produit sera administré localement aux rats, sur la peau d’un membre postérieur (application topique au niveau du tibialis cranialis). Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence.
Bénéfices attendus
Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide, et d’autres offrent un effet durable par exemple (le cas du premier Lead FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.
Procédures
Rasage : 1 fois : 30 sec/animal Administration composée : 1 fois : 1min / animal et maintient avec un pansement pendant 2h ; Mesure CMAP (avec anesthesie) : environ 10 fois : 15 min / animal = 150 min /animal (1h30) Mesure DAS : environ 30 fois : 10 sec / animal = 300 sec / animal (5 min)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues ici sont : Partie administration des composés : Stress dû au rasage de la patte des animaux, administration des composés par voie sous-cutanée ou intra-musculaire, légère gêne suite au pansement occlusif sur la patte. Partie observation : Stress dû aux lectures DAS (Digit Abduction Score = score de l'écartement des doigts de la patte) et au différentes anesthésies pour les mesures de CMAP (Coumpound Measurement Activity Potentiel = mesure de l'activité élétrique du muscle).
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. Nous avons testé cette possibilité lors du premier projet, malheureusement sans succès. Il est possible que les animaux ayant subi une série d’expériences (suivi d’une période de repos) se soient accoutumés au test DAS, et répondent différemment des animaux naïfs ; le poids plus important des animaux ré-utilisés peut également impacter négativement la réponse au test DAS.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de co-culture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Les test DAS et CMAP nous permettent au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.
Réduction
Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’administration des composés (ici topique et intra-musculaire.) est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Les administrations de nos composés en topique sous pansement occlusif ne seront réalisées qu’une seule fois sur un temps assez restreint (2h). Pour toutes les mesures de CMAP, les animaux seront anesthésiés environ 10 fois pour chaque animal (aux temps 2h, 4h, 8h, 24h, 48h, J7, 14J, 21J, 28J (et tous les 7 jours jusqu’au retour du signal au signal de départ)
Choix des espèces
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Les tests DAS et CMAP chez le rongeur, déjà éprouvés lors de notre étude princeps, sont au contraire des tests reconnus pour leurs pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles (Bien que faciles à manipuler, nous avons remarqué au cours de l’étude princeps que la prise de poids des animaux ne facilitait pas la stimulation et la lecture du DAS (animal difficile à stimuler, et peu enclin à exhiber un réflexe). Or il est largement admis que les mâles prennent plus de poids que les femelles. De plus, nos molécules ont été administrés en i.m (pour tester leurs efficacités dans notre étude princeps) et que nous n’avons remarqué aucune différence (entre mâles et femelles) de réponse pharmacologique. De plus, pour les molécules testées ici leur pharmacocinétique est connue (soit dans la littérature, soit testé dans notre laboratoire), et aucune différence significative n’est observée entre les deux sexes. Afin de diminuer notre variabilité de mesure, nous sommes donc contraints de nous limiter aux animaux femelles) âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler
Imagerie des altérations structurales vasculaires et de flux sanguins spinaux dans un modèle animal de lésion médullaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
480 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit le retrait chirurgical de vertèbres au-dessus de la moelle épinière puis une séance d'imagerie de moins de deux heures, sans reprise de conscience, dans une étude de biomatériaux censés favoriser la régénération médullaire. Le porteur reconnaît que l'anesthésie prolongée peut affecter les constantes vitales et prévoit une étude histologique sur les tissus prélevés. Il affirme qu'aucune méthode in vitro, ex vivo ou in silico ne permet d'obtenir ces données et que seule l'approche sur l'animal entier est possible.
Objectifs
Les lésions traumatiques et neurodégénératives du cerveau et de la moelle épinière chez l’homme induisent un handicap qui peut être sévère et permanent. Analyser l’évolution des constituants neurobiologiques (cellules neuronales, gliales et vasculaires) de la lésion médullaire et en parallèle, élucider comment les neurones lésés répondent à ces changements constitue un défi important afin de concevoir des stratégies thérapeutiques visant à stimuler la régénération et la réparation du réseau neuronal affecté. Ce projet, qui est une collaboration entre notre laboratoire et ceux de nos collaborateurs) vise à étudier la capacité de biomatériaux développés dans le cadre d’un financement commun à promouvoir la régénération médullaire et la récupération motrice chez le rat seul ou en combinaison avec une stratégie neuroprotectrice. La nature de cette demande (notre part du travail dans ce projet collaboratif) réside en l’anesthésie, la pose d’un cathéter veineux, puis l’imagerie de la moelle épinière de ces animaux, dans une expérience d’imagerie sans réveil qui sera immédiatement suivie de leur euthanasie. Pour ce faire, une semaine avant la séance d’imagerie, les animaux seront transférés dans notre laboratoire (3 ou 7 semaines post-lésion de façon à les étudier à 4 ou 8 semaines, à un moment où ils ont retrouvé spontanément une autonomie vésicale. L’utilisation des rongeurs, et du rat en particulier constitue le modèle animal adapté pour ce projet. La règle des 3R a été considérée tout au long de l'élaboration de ce projet et sera appliquée au quotidien.
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est de déterminer quand et comment, après la lésion de la moelle épinière, la combinaison de l'implantation de biomatériaux avec les traitements cités permettrait une efficacité fonctionnelle chez l’animal. Par ailleurs, notre collaboratrice poursuit un processus de valorisation et d’interaction avec des cliniciens qui a pour but de permettre une perspective clinique de ces travaux chez l’Homme. Leur ambition est d’aboutir à des solutions transposables, réalisables et efficaces en clinique humaine. Grâce aux preuves de concept obtenues au préalable, notre projet de recherche préclinique démontre qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité du système nerveux central (ici la moelle épinière), même dans les conditions les plus toxiques et néfastes de la lésion traumatique de la moelle épinière. Notre motivation dans cette thématique et qu’aujourd’hui aucune solution thérapeutique curative n’est disponible en routine clinique pour favoriser significativement la récupération médullaire chez les patients paralysés. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
- Au début de la séance d’imagerie, les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale ayant pour but de retirer localement les vertèbres au-dessus de la moelle épinière.. Celle-ci durera environ une demi-heure. - Au cours de ces expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. Les acquisitions en imagerie dureront moins d’une heure. - Malgré ce temps court, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront monitorées grâce au suivi des fréquences cardiaques et respiratoires. Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux de perfusion de l’anesthésique afin de maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal). La séance d’imagerie durera en tout moins de deux heures.
Impact sur les animaux
Cette étude d’imagerie sera réalisée sur animal anesthésié. Ils ne seront imagés qu’une seule fois, dans une procédure sans réveil. Bien qu’il n’y ait aucun effet indésirable attendu, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Non seulement nos séances seront courtes (1h30 à 2h d’anesthésie en tout), mais les constantes seront suivies (fréquences cardiaque et respiratoire). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’anesthésique gazeux pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).
Devenir
Une étude histologique étant réalisée ensuite à la fin de ces expériences sur les tissus cérébraux prélevés.
Remplacement
Notre projet porte sur l’étude des remaniements vasculaires dans un modèle de lésion médullaire chez le rat et du potentiel thérapeutique d’un mélange de biomatériaux avec un facteur neurotrophique ou des cellules greffées. Ces mesures seront réalisées sur animal anesthésié. Dans ce contexte, les approches intégratives sur l’animal entier restent incontournables. A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données similaires des mécanismes physiopathologiques et leur réparation. Seule l’approche chez l’animal est possible.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus par groupe expérimental est le plus petit possible, permettant de tenir compte de la variabilité attendue des résultats scientifiques et de la nécessité d’avoir une puissance statistique suffisante pour publier nos résultats. En revanche, nous nous intéressons à l’effet de certains facteurs : - La lésion - L’effet bénéfique d’un agent neuroprotecteur - L’effet bénéfique des cellules greffées - L’effet bénéfique du biomatériau - L’effet bénéfique de la combinaison des trois.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des séances d’imagerie. Un suivi quotidien sera assuré contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture. Les animaux seront hébergés à deux par cage dans le respect des surfaces réglementaires avec enrichissement (tunnel, bois à ronger) et avec des copeaux de bois souples qui préviennent l’émergence d’escarres. Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous avons défini un score décisionnel en fonction des observations quotidiennes permettant de modifier la procédure en cours avec administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou de mettre à mort. Pendant toute la durée des actes sous anesthésie, les constantes vitales seront suivies : température corporelle, l’oxygénation des tissus et fréquences cardiaque et respiratoire. Aucun acte ne sera entreprit avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes.
Choix des espèces
Rat et souris sont les animaux d’expérimentation les plus utilisés dans la recherche sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la physiopathologie et développer des stratégies thérapeutiques adaptées. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces post-traumatiques sont les mêmes. L’induction du traumatisme est très reproductible et standardisée chez le rat et de nombreux tests sensori-moteurs ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion. Chez le mammifère, l’incapacité d’un neurone à régénérer son axone après une lésion mécanique est essentiellement notée à l’âge adulte. Ainsi l’intégralité de ce projet sera réalisé chez le rat adultes âgés de 6 à 7 semaines, soit en moyenne de 250g.
Test de l’efficacité de 4 médicaments sur un modèle souris du syndrome de Barth (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles présentent dès la naissance un déficit de poids et un défaut cardiaque, et reçoivent un gavage deux fois par jour pendant cinq mois ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaux, pour tester le repositionnement de quatre médicaments déjà commercialisés. La moitié est tuée pour prélèvements d'organes, l'autre moitié transférée vers une autre animalerie pour des analyses cardiaques puis tuée également. Le porteur affirme que le modèle cellulaire reste incomplet pour un "organisme tout entier" et conclut à la "nécessité" du modèle animal avant le passage à l'Homme.
Objectifs
Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.
Procédures
Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (2 fois par jour pendant 5 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Si la procédure de gavage pose problème, comme des irritations, il pourrait y avoir éventuellement la pose de mini pompes 1 fois par/mois pendant 4 mois (de l'âge de 2 mois à 6 mois) où chaque intervention n'exéderait pas 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 5 mois. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10-12 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins rétro-orbitaux sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. Le prélèvement se fera dans un oeil différent d'une fois sur l'autre. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal . Les mises au points de gavage 2 fois par jour durant 3 mois lors d'une précédente DAP n'ont pas révélé de nuisances particulières.
Devenir
Euthanasie de 180 animaux (la moitié du nombre total d'animaux) pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet (DAP) précédentes. L'autre moitié (180 animaux) sera transféréé dans une autre animalerie (autre DAP acceptée) pour analyse par echocardiographie et course sur tapis (treadmill) et sera également euthanasiée afin de récupérer les organes pour analyses.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.
Raffinement
Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis la mise en place des conditions optimales pour le bien-être des animaux. Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des animaux modèles de la maladie (KO TAZ) inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance : si on dépasse les 25 pourcents d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure. Pour les animaux KO TAZ, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les animaux contrôles, non malades (WT) seront séparés des KO dans les cages.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage.
Evaluation de l’impact de molécules myorelaxantes sur l’activité et le tonus neuromusculaire chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
1000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à 240 administrations de composés et subir jusqu'à 44 prélèvements sanguins sur 120 jours, avec des mesures d'écartement des doigts et d'influx nerveux sous anesthésie, pour tester des molécules myorelaxantes contre la spasticité. Le porteur résume les bénéfices attendus à l'espoir de "participer à la sélection de nouveaux traitements". Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est disponible pour un phénomène aussi complexe que la myorelaxation.
Objectifs
12 millions de personnes dans le monde souffrent d’un désordre moteur appelé spasticité. Il s’agit de contractions exagérées d’un muscle entraînant des troubles des mouvements et/ou de la posture qui peuvent être chroniques et douloureux. Ainsi, tout mouvement locomoteur devient difficile voire impossible ; les conséquences sont très invalidantes et peuvent aller jusqu’à la mise en danger de la vie des personnes. Sa prise en charge médicale repose sur des traitements dont l’objectif est soit de provoquer la relaxation musculaire, soit d’empêcher la stimulation du muscle par le nerf. Ainsi, les médecins utilisent les myorelaxants mais leur niveau d’efficacité reste faible. Les patients peuvent aussi être pris en charge par l’utilisation de la toxine botulique. Ce traitement est efficace mais n’agit qu’après quelques jours et doit être renouvelé régulièrement. Des recherches sont donc faites pour améliorer l’efficacité, la puissance, la rapidité et la durée d’action de ces traitements. Après une évaluation in vitro des nouvelles molécules, les plus prometteuses sont testées dans ce projet chez la souris, afin de valider leur efficacité.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour la spacticité.
Procédures
Nous évaluerons sur l’ensemble des animaux les écartements entre les doigts et mesurerons l’influx nerveux et musculaire sous anesthésie une fois avant le début du traitement. Une fois les traitements commencés, le premier jour nous évaluerons jusqu’à 6 fois l’écartement des doigts et nous mesurerons jusqu’à 4 fois l’influx nerveux et musculaire et nous pourrions être amener à évaluer jusqu’à 4 fois la répartition du poids de l’animal sur ces pattes. Les deux semaines suivant l’injection, les tests seront effectués un maximum de 4 fois par semaine pour les deux tests puis 2 fois si l’étude dure plus de 2 semaines. Concernant l’écartement des doigts, il pourra être évalué 2 fois par jour les deux premières semaines puis 1 fois par jour au-delà de deux semaines. Ce qui donne un total de 226 tests (140 écartements des doigts, 43 mesures d’influx neuromusculaire et 43 mesures de distribution pondérale). En considérant un début de traitement des animaux en J0, le composé sera donné au maximum 240 administrations per os, sous-cutanés ou intrapéritonéale ou par 120 administrations intra-nasales ou intramusculaires ou encore par 10 injections intra-veineuse. En parallèle des teste des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 44 prélèvements sanguins sur la période de 120j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en terme de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, les molécules testées peuvent induire une myorelaxation, ce qui pourrait gêner les animaux dans leurs activités quotidiennes. De plus, le test mesure de l’influx nerveux et musculaire (EMG) met en œuvre une anesthésie générale qui peut créer un certain inconfort pour l’animal. Les administration répétée ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent également induire des nuisances au niveau des sites d’administration et de prélèvement : comme une douleur passagère, une irritation, une inflammation, une induration. Un stress lié au différentes manipulation et aux tests comportementaux peut également apparaitre.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. « Une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances à long terme.
Remplacement
La myorelaxation étant un phénomène complexe qui met en jeu plusieurs acteurs (muscles, nerfs, …) et différents processus de contrôle, actuellement aucune méthode de remplacement n’est disponible pour étudier la problématique du présent projet. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. Les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 animaux. Si des informations préalables existent pour permettre de tester seulement 8 animaux par groupe, nous le ferons. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Des analyses statistiques seront réalisées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial pendant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment une inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux seront hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres par un enrichissement important du milieu. L’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton accroché à la grille de la cage afin d’en augmenter le volume utile, une maisonnette en carton afin de permettre aux animaux de se cacher et de la frisure pouvant servir de matériel de nidification, de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. De plus dès la première administration les animaux sont pesés tous les jours. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les mesures d’EMG sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane/oxygène) afin d’éviter que l’animal ne bouge. Les mesures de DAS sont autant que possible couplées à la prise du poids afin de ne manipuler les animaux d’une seule fois. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien-Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Etant donné que ces études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures mais que nous n’étudions pas de pathologie liée à l’âge, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines)
Ingénierie Tissulaire : Evaluation d’hydrogels nutritifs favorisant la viabilité et la fonctionnalité des cellules ostéoprogénitrices implantées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
135 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau du dos des hydrogels nutritifs porteurs de cellules souches humaines, avec des séances d'imagerie répétées et, pour une partie, une thoracotomie avec injection d'un agent radio-opaque, pour évaluer la survie de ces cellules en vue de réparer l'os. Le porteur signale des douleurs, des risques d'infection et une gêne liée à la taille des implants. Il conclut qu'aucune méthode in vitro ne reproduit l'environnement complexe suivant l'implantation et qu'un "modèle in vivo" est nécessaire.
Objectifs
Les greffes osseuses autologues (autogreffes) sont largement utilisées en clinique pour des interventions de reconstructions osseuses mais présentent plusieurs limites. L’ingénierie tissulaire osseuse se développe comme une alternative à la greffe osseuse en associant des biomatériaux à des cellules souches, principalement des cellules stromales mésenchymateuses (CSMs) capables de se différencier en ostéoblastes (cellules de l’os) et de promouvoir la revascularisation du site afin de régénérer le tissu osseux. Malgré des résultats encourageants et la preuve de la sécurité de l’utilisation des CSMs chez l’Homme, l’efficacité de ces matériaux cellularisés dans la réparation osseuse reste inférieure à celle de l’autogreffe. La forte mortalité des cellules implantées (90%) observée lors des deux premières semaines post-implantation est un des facteurs clés expliquant ces résultats suboptimaux. Cette mortalité serait due aux conditions ischémiques (manque d’oxygène et de nutriments) rencontrées après implantation. Comme nous avons démontré que les CSMs survivaient in vitro et in vivo à l’absence d’oxygène mais pas à celle de nutriments, nous avons développé, en collaboration avec une autre équipe, un hydrogel nutritif à base de fibrine (couramment utilisée en clinique) capable de libérer du glucose après implantation par digestion d'un polymère de glucose par une enzyme, tous deux contenus dans l’hydrogel. Des expérimentations in vitro ont déjà démontré que ces hydrogels amélioraient significativement la survie et la fonctionnalité des CSMs en conditions ischémiques. Les premiers résultats in vivo ont également été encourageants mais suboptimaux et nous avons donc amélioré la composition de nos hydrogels afin de prolonger la libération du glucose. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer in vivo l’effet bénéfique de ces hydrogels nutritifs optimisés sur la viabilité et la fonctionnalité (potentiels à induire des vaisseaux sanguins et de l’os) des CSMs.
Bénéfices attendus
L’objectif ultime du projet est de développer une alternative à la greffe osseuse pour combler des grandes pertes osseuses chez l’Homme. L'os est en effet le deuxième tissu le plus transplanté après le sang, avec plus de 2,2 millions de greffes osseuses réalisées chaque année dans le monde. Les transplants osseux sont généralement récoltés chez le patient (autogreffes), mais les complications associées au site donneur, ainsi que la faible quantité et/ou qualité de l'os récolté chez les patients âgés, pédiatriques ou cancéreux constituent des limites sérieuses pour cette technique. Les produits d’ingénierie tissulaire osseuse représentent donc un traitement alternatif aux autogreffes prometteur. Toutefois, plusieurs études ont montré que les cellules implantées ne survivent pas assez longtemps pour induire une formation osseuse suffisante pour combler des défauts osseux de grande taille. Le développement d’un hydrogel nutritif améliorant la survie et la fonctionnalité des cellules implantées permettrait donc d’améliorer le potentiel réparateur de ces produits d’ingénierie tissulaire osseuse.
Procédures
Pour tous les animaux (135 souris) : Les animaux vigiles auront une injection sous-cutanée d’analgésique 30 min avant l’injection intra-péritonéale d’anesthésiant. Lorsque l’anesthésie générale est bien établie deux à quatre incisions cutanées seront effectuées dans le dos et les hydrogel mis en place (1x, durée 20-30 min). Les incisions seront suturées. Dans les 24h suivant l’opération, les animaux vigiles auront deux injections sous-cutanées d’analgésique à 12h d’intervalle. Pour les animaux de l'étude 1 (30 souris) : ils subiront une anesthésie générale gazeuse avant injection sous-cutanée d’un réactif bioluminescent puis 40 min après seront à nouveau anesthésiés au gaz pour l’acquisition du signal bioluminescent. La procédure sera répétée 6 fois pendant la période d’implantation (6x, durée 5+5min, sur 4 semaines). Au temps terminal de l’étude les animaux seront anesthésiés au gaz et auront une injection intrapéritonéale d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l'étude 2 (90 souris) : les animaux vigiles auront une injection sous-cutanée d’analgésique 30 min avant l’injection intra-péritonéale d’anesthésiant. Lorsque l’anesthésie générale profonde est bien établie, les animaux auront une thoracotomie suivie d’une infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque (1X, durée 30 min). Pour les animaux de l'étude 3 (15 souris) : au temps terminal de l’étude les animaux seront anesthésiés au gaz et auront une injection intrapéritonéale d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min).
Impact sur les animaux
La chirurgie d’implantation en sous-cutané (135 souris) peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. La douleur sera néanmoins prise en charge par un traitement analgésique approprié. La perte d’un ou plusieurs points de suture en post-opératoire peut-être également observé occasionnellement, mais sans impact sur le bien-être animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée (bien que jamais observée dans notre laboratoire). Enfin, la taille des implants pour 90 souris peut entraîner une gêne de l’animal mais qui disparait dans les 48h post-implantatoire. Les anesthésies gazeuses nécessaires à l’imagerie non invasive en bioluminescence (30 souris) vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil. Enfin, les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence. Celles-ci suivront les bonnes pratiques vétérinaires.
Devenir
Les animaux seront mis à mort aux temps terminaux de chaque étude afin de permettre l’explantation des hydrogels et des analyses post-mortem (radiologiques, histologiques et/ou analyses de l'expression génique).
Remplacement
L’environnement ischémique post-implantatoire est un environnement complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible à ce jour de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses interactions cellulaires (avec les cellules vasculaires ou les cellules de l’inflammation, par exemple) et moléculaires (par l’effet d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions cellules-cellules, ils n’incluent que 2 ou 3 interactions (cellules souches/macrophages, par exemple) et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des CSMs en vue d’une réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux l’étude 1 est une étude de suivi longitudinal, où les mêmes animaux seront imagés au cours du temps (et non un animal/temps). Basé sur les premiers résultats d'un précédent projet nous avons supprimé un temps d’analyse (semaine 1) pour l’étude du potentiel des CSMs à induire des vaisseaux sanguins, une procédure (imagerie rayon X) pour l’étude du potentiel des CSMs à former du tissu osseux, et un groupe contrôle pour ces deux études car les premiers résultats apportent peu de renseignement sur la capacité de nos hydrogels à promouvoir la fonctionnalité des CSM. En se basant sur les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants/groupe afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant. Pour les analyses statistiques, un test non paramétrique sera effectué pour une comparaison globale entre les groupes suivi d’une comparaison des groupes deux à deux.
Raffinement
Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. La souffrance liée à l’implantation sous-cutanée sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant 24h. Un gel nutritif sera ajouté lors des 3 premiers jours post-opératoires, pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation des animaux. Suite à la procédure chirurgicale, des points limites définis au préalable sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques à l’acte chirurgical seront surveillés et scorés et permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si des points limites sont atteints, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié. Une analgésie pré-opératoire appropriée sera administrée aux animaux avant tout geste chirurgical.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est la souris immunodéficiente non consanguine. Le modèle souris est le mieux connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non-invasive, tel que la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L'utilisation de souris immunodéficientes (souris Nude) permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d'origine humaine et ainsi d'évaluer le potentiel de cellules d'origine humaine. Jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30g et dont la croissance et le développement, toujours en cours, permettent d'avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.
Membranes à base d’acide polylactique fonctionalisées : Evaluation de leur potentiel osteogenique dans un modèle de craniotomie chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, deux trous sont percés dans leur crâne pour y tester des membranes censées améliorer la régénération osseuse, avec deux contrôles au microscanner sous anesthésie à deux et quatre semaines. Le porteur compare la contrainte à celle d'une "simple fracture" et rapporte une perte de poids et un arrêt du toilettage de quelques jours. Il présente au conditionnel des dispositifs médicaux innovants et décrit le modèle animal comme un "préalable impératif".
Objectifs
Les traumatismes et les interventions chirurgicales peuvent engendrer des blessures au niveau de l'os qui sont plus ou moins facile à soigner. Actuellement, la greffe osseuse est majoritairement utilisée pour réparer l'os lésé. Cette technique à cependant des limites : la nécessité de procéder à deux opérations (prélèvement puis greffe), la faible quantité d’os disponible et les possibles complications post-opératoires et séquelles pour le patient. La régénération osseuse guidée est une technique chirurgicale qui utilise des membranes. Ces membranes ont un rôle barrière, elles séparent l'os à réparer de la peau ou des muqueuses, ce qui permet d'obtenir une cicatrisation osseuse de qualité. De nombreuses membranes sont actuellement commercialisées. Leurs principales limites sont le risque de contamination lors de la chirurgie et une réparation osseuse insuffisante du à leur manque de rigidité . C’est pourquoi la recherche est active pour développer des membranes avec de meilleures propriétés dans le but d’étendre leurs indications. Ce projet de recherche a pour objectif d’étudier l’efficacité de nouvelles membranes permettant une cicatriation osseuse de meilleure qualité et/ou en plus grande quantité. Les études préliminaires effectués dans notre laboratoire ont permis de sélectionner des membranes qui permettraient de réduire le risque de contamination et un gain osseux plus important. L'absence de toxicité a également été testée. L’utilisation d’un modèle animal est un préalable impératif pour envisager une application chez l'homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pouvant remplacer à ce jour l'expérimentation animale pour l'étude de la régénération osseuse. Le modèle animal choisi consiste à la réalisation de 2 trous circulaires au niveau de la surface externe du crâne. Il s’agit d’un modèle très souvent employé pour valider l'intérêt clinique de nouveaux matériaux utilisés en orthopédie et en dentisterie. Les objectifs de ce projet sont d'évaluer la tolérance de membranes à base de polymères ainsi que leur potentiel de réparation osseuse .
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet d'expérmentation animal chez le rat sont à court terme : 1) la vérification de la bonne tolérance biologique et tissulaire de nos membranes, 2) une cicatrisation osseuse améliorée, 3) une dégradation des membranes implantées permettant l'optention d'une qualité osseuse biologique et mécanique optimale. Les bénéfices attendus à long terme sont de pouvoir proposer aux patients des dispositifs médicaux innovants doués de propriétés cicatrisantes, ossifiantes, antibactériennes et mécaniques améliorées par rapport aux dispositifs médicaux actuellement disponibles. Ces améliorations permettraient d'élargir les indications d'utilisation des membranes actuellement commercialisées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste à réaliser 2 défauts osseux sur le sommet du crâne. La durée de la procédure chirurgicale n'excèdera pas 30 minutes. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera pratiqué. Des examens radiologiques par microscanner seront réalisés à 2 temps intermédiaires (2ème et 4ème semaine) dans le respect des bonnes pratiques en matière de radioprotection. La durée de ces examens d'imagerie médicale dureront au maximum 12 minutes et seront réalisés sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux.
Impact sur les animaux
Les principales nuissances que nous avons préalablement observés sur ce modèle expérimental chez le rat sont une absence de toilettage durant 2 à 3 jours et une rupture des sutures (très rarement observé). Un nettoyage de la plaie à l'aide d'un antiseptique est pratiqué afin de limiter le risque de contamination microbienne. Les effets indésirables mineurs rapportés sont une perte de poids modérée (au maximum de 5% du poids initial de l'animal) durant la première semaine pour la moitié des animaux et une récupération du poids durant la 2ème semaine opératoire puis un gain de poids régulier durant toute le reste de la durée de l'étude. Les effets indésirables graves théoriques sont un saignement abondant suite à un traumatisme non contrôlé des vaisseaux sanguins lors de la chirurgie et la possible survenue d'une crise cardiaque durant l'anesthésie.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront anesthésiés puis à mise à mort afin de pouvoir procéder aux prélèvements tissulaires sans souffrance.
Remplacement
Les études réalisées préalablement dans notre laboratoire sur des cultures de cellules nous ont permis de sélectionner des matériaux non toxiques et susceptibles de favoriser la cicatrisation et la repousse osseuse. Cependant, ces premiers résultats prometteurs doivent être vérifiés par une implantation dans un organisme vivant avant la réalisation des premiers essais chez l'homme. Il n'existe pas à ce jour de modèle informatique permettant de reproduire ou de prédire la réaction d'un organisme vis-à vis d'un matériau implanté avec certitude.
Réduction
Un test statistique adapté a été utilisé pour calculer le nombre nécessaire de rats pour répondre aux objectifs de ce projet. Pour chaque groupe et temps final, un nombre de 10 rats par lot est nécessaire, avec un nombre total maximal de 480 rats demandés.
Raffinement
A leur arrivée à l’animalerie les rats subiront une phase d’acclimatation de 14 jours aux conditions d’hébergement du laboratoire. Les animaux seront hébergés dans des cages plastiques adaptées à la taille des animaux avec un nombre de 2 à 3 animaux par cage afin de maintenir les interactions sociales. La nourriture et l’eau seront mises à disposition en continue. Les litières des animaux sont enrichies d'objets en carton afin qu'ils puissent se constituer un nid. Les cages seront changées toutes les semaines. Durant l'étude, les animaux seront observés au moins 1 fois par jour. Nous avons accumulé une expérience sur ce modèle pour dire que la souffrance des animaux durant la période périopératoire ne devrait pas dépasser un niveau de contrainte équivalente au traitement d'une simple fracture. Le risque d'infection et de douleur postopératoire sera anticipé par la prise d'antibiotique et de medicament antidouleur. Une grille d'évaluation de l'état général de l'animal, son apparence et son comportement, révélateurs du niveau de douleur ressentie sera tenue 2 fois par jour pendant les premiers jours postopératoires, puis 1 fois par jour pendant la deuxième semaine, puis 1 fois par semaine à partir de la 3ème semaine postopératoire. En cas d'altération de l'état général de l'animal ou d'une douleur sévère non contrôlable, la mise à mort de l'animal sera anticipée.
Choix des espèces
Le modèle choisi est considéré comme un modèle de référence pour l'étude des matériaux destinés à la régénération osseuse. De nombreuses espèces animales ont été utilisées dans ce modèle de défauts osseux, notamment chez les rongeurs. Ce modèle est particulièrement bien décrit et validé chez le rat adulte. Le gabarit de l’animal par rapport à la souris permet une technique chirurgicale reproductible. Le choix du rat adulte permettra de cribler différents matériaux ou membranes avant de passer à des animaux plus grands en cas de résultats encourageants. De plus, ce modèle d’expérimentation animale dans cette espèce n’entraine pas de souffrances importantes selon nos expériences antérieures. Plusieurs souches de rats ont été utilisées dans la littérature, notamment les rats Wistar. L’animalerie dispose de l’agrément pour l’espèce et la souche choisie.