Troubles musculosquelettiques

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dix servent à entraîner un geste d'injection, les autres reçoivent un virus porteur d'un gène puis subissent une batterie de huit tests, dont la suspension pour la force musculaire, le tapis roulant et la barre crantée pour la coordination, l'immersion de la queue en bain-marie et la plaque chauffante pour la sensibilité. Le porteur annonce une "preuve de concept thérapeutique" et une "étape essentielle vers les essais cliniques", bénéfices renvoyés à un stade ultérieur, pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Il affirme qu'une étude sur cellules ne "pourrait pas se suffire à elle-même" car les effets sur l'organisme entier et la force musculaire y seraient impossibles à évaluer.

Objectifs

Le but de ce projet est de consolider une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques d’injections de virus adéno-associés, couramment utilisés dans la recherche médicale.

Bénéfices attendus

Le succès de ce projet fournira une première stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert. Ce projet permettra également de déterminer si une myopathie coexiste avec la neuropathie chez les patients.

Procédures

Une partie des animaux (10) sera utilisée pour un entrainement à une technique d’injection. Les autres animaux (320) seront injectés (durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés. 80 animaux seront injectés entre le 3ème et 5ème jour après la naissance et 240 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 9 semaines, les animaux seront soumis à une série de 8 tests comportementaux : - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x20s max en tout), -mesure de réactivité sur plaque chauffante (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse ; et, -mesure des propriétés contractiles musculaires in situ, sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil) pour évaluer la force musculaire développée.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le second modèle utilisé dans cette étude présente des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Le phénotype général des souris n’a pas été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale de même que la mesure de force musculaire in situ.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 ou 9 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage et leur souffrance sera évaluée quotidiennement : capacité à se retourner/à se mouvoir, couleur de la peau. Après le sevrage, les animaux seront hébergés à plusieurs par cage, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson/nourriture. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. La zone d'injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) pendant les 3 jours suivant l'injection afin de prévenir l’apparition d’une infection. Afin de réduire le stress lié à certaines expériences, une session de familiarisation avec le matériel sera effectuée. Pour la mesure d’électromyographie, l’animal aura une anesthésie gazeuse tout au long de la procédure afin de supprimer le stress lié à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale et celle-ci sera contrôlée à l’aide d’une sonde rectale. Un produit sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. De même lors des mesures de force, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, la température de l’animal sera maintenue par une plaque chauffante, sa respiration surveillée et l’animal sera mis à mort avant son réveil pour prélèvement et analyse des tissus. En cas de douleur au cours de l’étude, un analgésique sera administré. En revanche, si l’animal devait réaliser des tests sensitifs, les antidouleurs risquant de perturber les résultats aux tests, il sera mis à mort prématurément.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice, la conduction nerveuse et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous testerons différentes conditions d’une thérapie génique (prévention ubiquitaire, réversion ubiquitaire et réversion tissu-spécifique). Nous étudierons les effets de ces injections à 8 ou 9 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si les différentes modulations sont bénéfiques.

154 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 114 tués à l'issue et 40 reproducteurs maintenus en vie pour l'élevage. Modèles de la myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections intracardiaques ou intramusculaires de cellules souches humaines et un traitement immunosuppresseur, et subissent des prélèvements sanguins, des échographies et des tests musculaires, avant la mise à mort de la plupart pour prélever muscles et organes. Le porteur affirme n'attendre pas d'effets indésirables majeurs de ces injections, en s'appuyant sur des essais antérieurs chez le chien. Il justifie le rat dystrophique par les limites du modèle souris et le coût du modèle chien.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne est la plus fréquente des dystrophies musculaires avec un garçon nouveau-né sur 3500. C’est une maladie génétique caractérisée par une mutation du gène codant une protéine musculaire : la dystrophine et entrainant son absence dans les fibres musculaires. Ceci entraîne une destruction des fibres puis le remplacement du muscle par du tissu fibreux et graisseux. Cliniquement, une réduction de la masse musculaire et une faiblesse musculaire sont observées conduisant au décès des patients vers l’âge de 20-30 ans. Il n’existe aucun traitement de la maladie à ce jour. L’injection de cellules saines fait partie des orientations thérapeutiques prometteuses. L’identification de populations de cellules souches au sein de tissus adultes ces dernières années et la démonstration de leur potentiel myogénique (capacité à régénérer des fibres musculaires, à en former de nouvelles ou des progéniteurs myogéniques de réserve) offrent des perspectives intéressantes. Notre équipe a isolé une population de cellules souches dérivées du muscle squelettique (cellules MuStem) et démontré son efficacité chez le chien malade en montrant des propriétés phénotypiques (propriétés à exprimer un ensemble de marqueurs de lignées cellulaires) et comportementales similaires à celles décrites pour la population canine. L’objectif du projet est de poursuivre la caractérisation des potentialités de la population hMuStem pour renseigner si celle-ci peut être présentée comme un support de biothérapie innovante pour les dystrophies musculaires. Pour cela, nous souhaitons déterminer l’innocuité (absence de caractère nuisible) et l’efficacité de son administration dans la circulation sanguine chez le rat dystrophique (DMDmdx). Ce modèle se révèle être un très bon modèle animal de la DMD pour réaliser les 1ères phases d’évaluation de nouveaux produits thérapeutiques. C’est la raison pour laquelle l’étude de biodistribution (dissémination au sein de l’organisme avec étude du comportement de l’agent à coloniser les tissus musculaires et/ou s’accumuler dans les organes filtres comme le poumon, le foie ou encore le rein) et d’impact de la population hMuStem sur la fonction et la reconstruction du muscle a été définie dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Le projet décrit ici repose sur un ensemble conséquent de résultats in vitro et in vivo (chien, rongeurs, primate-non-humain) acquis progressivement ces 12 dernières années et qui tendent à montrer un potentiel thérapeutique des cellules MuStem dans le cadre de la prise en charge des affections musculaires et en particulier de la DMD. Pour progresser sur la qualification de cet agent dans le but de statuer sur son positionnement ou non comme médicament innovant, des données in vivo sur sa biodistribution et son efficacité de réparation musculaire (fonction et tissu) en contexte dystrophique sont fondamentales à ce stade du programme de recherche et pourraient permettre de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique pour une pathologie musculaire qui reste à ce jour sans traitement curatif.

Procédures

Partie I : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem par injection intracardiaque (IC) unique, sous anesthésie générale et analgésie, plus contrôle échographique. Durée : 2 min. (ii)3 prises de sang en ante mortem, sous anesthésie, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. (iii)4 animaux supplémentaires auront une injection intraveineuse de produit de contraste afin de calibrer le protocole d’administration par voie IC sous contrôle échographique, pendant l’anesthésie générale préalablement au sacrifice. Durée : 1 min. Partie II : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem, en une seule fois, par injection intramusculaire (2 injections sur 3 muscles différents d’un membre), sous anesthésie générale et analgésie. Le même protocole d’injection sera mené sur le membre opposé avec du sérum physiologique. Durée : 10min (ii)3 jours au préalable, un traitement immunosuppresseur sera administré par voie sous-cutanée (SC) sur animaux vigiles ou sous légère tranquillisation, à raison de 4 injections à 10 jours d’intervalle. Durée : 3min (iii)5 prises de sang sur animal tranquillisé, à la veine jugulaire ou sous anesthésie avant sacrifice, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. Partie III A : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem ou du sérum physiologique sous forme de 3 IC espacées de 6 à 9 jours, sous anesthésie générale et analgésie. Durée : 2 min. (ii)un traitement immunosuppresseur identique à la Partie II (iii)prises de sang : n= 6 pour les suivis 2 mois, n=8- pour les suivis 4 mois. (iv) Un électrocardiogramme (ECG) et une échocardiographie en pré- injection, et avant sacrifice. Durée : 2 min (v)Une évaluation musculaire : 2 tests d’exploration fonctionnelle (test d’agrippement et test d’endurance) et un test d’évaluation motrice (test d’actimétrie) seront réalisés sur chaque animal à raison d’une fois au cours de son suivi . Durée : 25 min. Partie IIIB : Même protocole que la partie IIIA, mais avec un suivi des animaux de 7mois post injection. Les interventions seront donc identiques mais en nombre plus élevés : (i) prise de sang : n=11 (ii) 4 ECG et 4 échocardiographies en pré-injection, J60, J120 et J210 (iii) 3 évaluations musculaires (motrices et fonctionnelles) à J60, J120 et J210

Impact sur les animaux

L’administration par voie intra-cardiaque des cellules hMuStem ne devrait pas occasionner d’effets indésirables si on s’en réfère aux résultats que nous avons obtenus précédemment avec ce type cellulaire dans le cadre de protocoles d'injection systémique (intra-artérielle et intraveineux) chez le chien dystrophique. Néanmoins, nous serons attentifs à la formation d’agrégats cellulaires comme cela a été relaté pour d’autres types cellulaires, lesquels peuvent être à l’origine de troubles de la circulation sanguine. L’administration intra-musculaire des cellules hMuStem induira un dommage local avec le passage de l’aiguille. La mise en place du traitement immunosuppressif par voie sous cutanée ne devrait pas non plus occasionner d’effets indésirables majeurs mais un point de vigilance sera porté sur l’apparition d’éventuels dérèglements biochimiques et/ou hématologiques. L’échocardiographie et l’électrocardiogramme, les tests de force et d’endurance et le test d’actimétrie sont des techniques d’abord non invasives pour lesquelles il n’est pas identifié d’effet indésirable.

Devenir

A l'issue des procédures décrites dans ce projet, tous les animaux inclus dans cette étude (n=114 maximum) seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses qui ne peuvent pas se faire du vivant de l'animal. Les prélèvements concerneront certains muscles squelettiques, diaphragme, coeur et organes filtres correspondant au poumon, foie, rein et rate, et comporteront au moins 4 fragments par tissu. Seuls les animaux reproducteurs, au nombre de 40, seront maintenus en vie pour maintenir la production de l'élevage de rats DMDmdx.

Remplacement

Il ne sera pas possible dans cette étude dans la mesure où il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pertinente et robuste pour tester l’effet d’un traitement de médecine régénérative in vivo. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact de cette thérapie dans différents organes et sur le phénotype de l’animal malade.

Réduction

Le nombre d’animaux qui a été fixé par groupe dans les 3 parties du projet repose sur notre expérience précédente dans la mise en place de protocoles de médecine régénérative lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Ainsi, ces nombres, validés par un agent agrégé en biostatistiques, sont minimaux et permettent d’assurer la robustesse (au sens de l’analyse statistique) des résultats sans être excessif en termes d’animaux à inclure. Les jeux de données acquis seront analysés selon des modèles linéaires généralisés qui pourront être complétés par des analyses multivariées type « analyse factorielle multiple - AFM. Par ailleurs, le projet a été structuré en 3 parties séquentielles afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux dans le sens où les parties I (biodistribution) et II (preuve de concept) seront déterminantes pour la suite du projet.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement (3R), le bien-être animal passera par : - de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation avec enrichissement du milieu (tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois et hébergement à deux animaux). - un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement), - l'instauration de points limites pertinents avec mise en place de mesures adaptées (anesthésies, analgésie ou euthanasie), - une réactivité accrue du personnel animalier avec mise en place d’une grille d'évaluation de la douleur par une liste de comportements /constatations à évaluer dès que nécessaire pour détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates - la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions (anesthésie et analgésie).

Choix des espèces

Les modèles animaux de la DMD les plus souvent utilisés sont des modèles rongeurs et plus spécifiquement le modèle de la souris mdx. Ce modèle souffre néanmoins de sérieuses limitations, notamment la mise en place de mécanismes de compensation aboutissant à des lésions musculaires très limitées et une faiblesse musculaire quasiment inexistante. Ces éléments limitent grandement la transposition des résultats obtenus sur ce modèle à l’Homme. Le chien Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD, mais reste un modèle de gros animal coûteux et lourd à manipuler. Ainsi, le choix du modèle de rat DMDmdx s’avère pertinent dans le sens où ce dernier présente un phénotype fonctionnel et tissulaire proche de celui décrit chez le patient DMD, caractérisé par une nécrose des fibres musculaires, une fibrose, une adipose ainsi qu’une faiblesse musculaire et une cardiomyopathie dilatée. Les rats seront inclus à l’âge 2 mois afin de se placer dans un contexte de lésion musculaire suffisamment avancé pour pouvoir détecter un éventuel effet sur la fonction musculaire et/ou le remodelage tissulaire. Par ailleurs, la mortalité des rats DMDmdx étant observée particulièrement à partir de 8 mois d’âge, il était important que l’inclusion des animaux se fasse précocement pour être en mesure d’avoir un suivi de l’impact éventuel sur une période satisfaisante mais aussi de possiblement observer une répercussion sur la durée de vie des animaux traités.

298 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de pose d'une broche puis une découpe du fémur pour simuler une fracture, suivie de radiographies répétées sous anesthésie et d'injections sous-cutanées quotidiennes, avant sa mise à mort pour prélever les os. Le porteur reconnaît que la fracture provoquée est douloureuse à court terme et met en avant l'analgésie mise en place. Il justifie le rat par l'absence de modèle in vitro reproduisant une fracture et par la possibilité d'y poser des broches de chirurgie humaine.

Objectifs

La réparation des fractures a fait l’objet d’études antérieures et certaines molécules ont été développées et approuvées pour traiter les complications osseuses associées aux fractures (retard de consolidation, non consolidation, etc…). Cependant, l’utilisation de ces molécules est associée à de fortes contraintes ou effets secondaires indésirables (implantation locale via un dispositif médical nécessitant une chirurgie correctrice, augmentation localisée de la résorption osseuse, formation osseuse anarchique et anormale et quelques fois un œdème) avec en plus un fort coût économique qui ne semble pas justifié par rapport aux bénéfices apportés aux patients. Aujourd’hui, il n’y a pas de molécule, administrable par injection, permettant de faciliter la réparation des fractures et de réduire le risque de complications et de chirurgies correctrices. La consolidation des fractures osseuses nécessite une activation contrôlée des voies de la formation osseuse. La différentiation des cellules impliquées dans la réparation osseuse est conditionnée par la qualité du matériau osseux sur lequel ces cellules reposent et un changement de dureté/raideur du matériau osseux est suffisant pour activer le programme de différentiation de ces cellules. Cependant, aujourd’hui, aucune donnée sur la qualité du matériau osseux au site de fracture ou adjacent au site de fracture n’est disponible. Récemment, de nouvelles molécules ont été développés et leurs mécanismes d’action suggèrent une augmentation de la résistance osseuse dans les semaines qui suivent l’initiation du traitement. In vitro, ces composés stimulent la formation osseuse et augmente la qualité du matériau osseux déposé, résultant in fine en une meilleure résistance osseuse. Ces composés sont administrables par voie sous-cutanée et l’hypothèse de travail est qu’ils pourraient améliorer la réparation et consolidation des fractures osseuses réduisant ainsi les complications associées. Les objectifs de ce projet sont : (1) de générer un modèle animal de fracture fémorale afin d’évaluer la qualité du matériau osseux au site de fracture et juste à côté ; et (2) d’investiguer si les nouvelles molécules pourraient représenter une solution thérapeutique innovante dans la prévention des complications osseuses associées aux fractures.

Bénéfices attendus

Les principaux bénéfices de ce projet sont une meilleure compréhension de la qualité du matériau osseux afin de comprendre la contribution dans la différentiation cellulaire. Le second bénéfice est représenté par l’évaluation de nouvelles molécules qui a terme peuvent apporter un réel plus dans la prise en charge des patients avec fractures osseuses.

Procédures

Les animaux subiront une procédure chirurgicale afin de réaliser l'implantation d'une broche osseuse pour stabiliser la fracture et une découpe du fémur afin de simuler une fracture osseuse. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale et une administration de médicaments anti-douleur sera réalisée avant incision de la peau. De même, un antibiotique sera administré aux animaux avant la procédure chirurgicale afin de réduire le risque d'infection. Un suivi longitudinal des animaux sera réalisé par radiographie (3 radiographies pour les temps court et 8 radiographies pour le temps long) après anesthésie gazeuse. Des traceurs fluorescents non toxiques seront injectés aux animauxpar voie sous-cutanée afin de standardiser les mesures avant mise à mort. Les nouvelles molécules seront administrées quotidiennement par voie sous-cutanée. Les injections sous cutanée seront réalisées sur animaux vigiles avec une contention adaptée.

Impact sur les animaux

La réalisation chirurgicale de la fracture osseuse et de l’ostéosynthèse pourra être perçue comme une procédure douloureuse à court terme. Cependant, il est à noter ici que la séquence utilisée, pose d’une broche pour stabiliser le fémur avant fracture, a été choisi afin de ne pas engendrer de lésions des tissus entourant le fémur et de ne pas entrainer de mouvements des fragments osseux. Ceci dans un but de réduire la douleur ressentie par les animaux. Afin de réduire la souffrance des animaux, ce geste sera réalisé sous anesthésie générale et des médicaments anti-douleur seront administrés au moment du geste (analgésie péri et post-opératoire immédiate) et maintenu sur une période de 48h. Les animaux recevront également une dose cumulative de rayons x estimé au maximum à 0.020 mSv, équivalente à 60h d’irradiation naturelle. Enfin une grille de points limites adaptés a été mise en place et sera utilisée pour évaluer l’inconfort/souffrance des animaux. Le cas échéant, une administration de médicament anti-douleur pourra être réalisée. Les administrations de traceurs fluorescents et de nouvelles molécules thérapeutiques seront réalisées par voie sous-cutanée.

Devenir

Le but de l'étude étant d'étudier le retentissement d'une fracture osseuse, avec ou sans traitement, sur la qualité de la matrice osseuse, nous devons collecter des pièces osseuses à des temps bien précis. Les animaux de l'ensemble des procédures expérimentales seront mis à mort à la fin des 4 procédures de ce projet.

Remplacement

Malheureusement, à ce jour, aucune donnée de la littérature n’est disponible et ne permet pas de développer un modèle in vitro ou in silico permettant de reproduire les conséquences moléculaires, cellulaires et tissulaires d’une fracture osseuse. Le recours à l’emploi d’un modèle de petit animal est requis pour évaluer ces questions. Le rat est un modèle animal reconnu, peu coûteux et facilement maintenu en captivité. La physiologie de réparation des fractures chez cet animal est également transposable à l’homme. De plus, la taille des os longs et notamment du fémur, rend possible l’utilisation de broches osseuses utilisées en chirurgie osseuse humaine pour la stabilisation des fractures de phalanges.

Réduction

Le modèle de fracture osseuse proposé dans ce programme (stabilisation par broche osseuse et découpe du fémur pour simuler la fracture) est maitrisé dans notre laboratoire. Les investigations osseuses sont également toutes maitrisées. Les données de la littérature permettent d’établir un échec de la procédure (non-récupération de l’anesthésie, infection osseuse, mauvaise pose de la broche osseuse, points limites) d’environ 18%. Nos études antérieures de qualité osseuse dans des modèles animaux précliniques nous ont permis de réaliser un calcul d’échantillonnage (test d’inférence statistique) afin de déterminer le nombre minimum d’animaux à inclure par groupe pour observer une différence significative de la résistance osseuse et donc in fine de la vitesse de réparation osseuse. En tenant compte de l'ensemble des paramètres, un nombre de 13 animaux par groupe devraient nous permettre d’atteindre la significativité des résultats obtenus. Des tests statistiques seront utilisés et une valeur de p

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon les conditions d’hébergements au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages normalisées, dans une pièce ventilée à hygrométrie et température contrôlées. Les animaux auront à leur disposition de l’eau et de la nourriture à volonté. Un cycle automatique jour/nuit – 12h/12h sera respecté. Il sera mis à la disposition des animaux un abri et de la cellulose pour la constitution d’un nid. Des frisottis de cartons et/ou des petits morceaux de bois à ronger seront mis à disposition. La fracture (stabilisation et découpe osseuse) sera réalisée sous anesthésie générale. Des médicaments anti-douleur seront administrés avant ouverture de la peau et renouvelés pendant les premières 48h post-opératoires. Un antibiotique sera injecté avant ouverture de la peau pour réduire les risques d’infection. Une grille de points limites, adaptée au modèle, sera mise en place et comportera les items suivants : expression faciale, activité, posture, respiration, automutilation, aspect des matières fécales et déshydratation. Le cas échéant une palpation de la zone opérée pourra être effectuée afin de s’assurer que celle-ci n’est pas douloureuse et ne présente pas de signe d’infection osseuse.

Choix des espèces

Une étude préliminaire préclinique sur un modèle rongeur est un prérequis des agences de régulation du médicament pour le développement d’une thérapie osseuse. Le rat est un modèle animal reconnu, peu coûteux et facilement maintenu en captivité. La taille des pièces osseuses rend l’utilisation des dispositifs biomédicaux humains possible pour la stabilisation des fractures. La réparation des fractures chez le rat présente également des mécanismes physiopathologiques similaires à ceux observés chez l’homme. De plus, notre équipe a depuis maintenant 10 ans développés et validés des outils d’analyse de la qualité osseuse directement applicable aux modèles de rongeurs. Les animaux seront utilisés à un âge d’environ 10 semaines +/- 1 semaine. Ce stade correspond à l’entrée dans le plateau de croissance des animaux et le tissu osseux est considéré comme significativement mature à partir de cet âge. De plus, cet âge est couramment employé pour ce modèle, ce qui permettra de faire une comparaison des données obtenues avec les données de la littérature obtenus avec d’autres agents thérapeutiques.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une myopathie rare, elles reçoivent dès un à trois jours de vie une injection de vecteur viral sous anesthésie par le froid, puis passent des tests de force musculaire jusqu'à douze fois et une mesure invasive de force sous anesthésie sans réveil à quatre mois, avant d'être tuées pour analyse des muscles. Le porteur indique que ces nouveau-nés peuvent souffrir d'une hypothermie non corrigée ou être rejetés par leur mère, et que la lignée développe une faiblesse musculaire progressive. Il juge "indispensable" de poursuivre chez la souris pour vérifier l'efficacité et la toxicité de la thérapie à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

La Myopathie CentroNucléaire Autosomique Dominante est une maladie rare du muscle. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine impliquée dans les processus d’entrée et de transports de vésicules dans la cellule. L'injection dans le muscle d’un virus thérapeutique exprimant une molécule ciblant la forme mutée de la protéine permet de restaurer la structure et la fonction du muscle dans un modèle murin de la maladie après administration à l’âge d’un mois. Cependant, le traitement est moins efficace chez les souris plus âgées qui présentent une atteinte musculaire plus prononcée. Par ailleurs des essais de traitement de l’ensemble des muscles via une administration par voie sanguine se sont révélés infructueux y compris chez les souris d’1 mois. L’expression d’une molécule thérapeutique dans la cellule par l’intermédiaire d’un vecteur viral de type virus adéno-associé (AAV) est dépendante de son entrée dans la cellule et de son transport jusqu’au noyau par des vésicules. Nos résultats antérieurs montrent que le vecteur est moins bien acheminé chez les souris malades et que ce phénomène s’empire avec l’évolution de la maladie. Ainsi la maladie elle-même, semble compromettre l’administration du traitement. Le but de ce projet est d’intervenir le plus précocement possible dans le développement de la maladie (en période néonatale) afin de s’affranchir de son impact potentiel sur l’acheminent du vecteur thérapeutique et de tester différentes combinaisons de constructions de vecteur viral dans une optique d’amélioration de son administration dans ce contexte pathologique.

Bénéfices attendus

L’aboutissement de ce projet constituera une étape essentielle de l’étude préclinique de notre molécule et est nécessaire au développement de futurs traitements inexistants à ce jour pour les patients atteints de Myopathie Centronucléaire. Il participera également à la compréhension et l’optimisation des voix d’administration de ce type de molécule dans un modèle pathologique présentant une altération de la transduction virale

Procédures

Toutes les souris subiront une injection en intrapéritonéale (IP) ou dans le système sanguin d’un virus vecteur « inactivé » exprimant un gène luminescent ou un shRNA thérapeutique à l’âge de 1 ou 2 jours à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille ultrafine. Une seule injection sera réalisée par souris sous anesthésie. La durée de l’injection est d’environ 15 secondes par souris. La durée totale du geste par souris est d’environ 30 minutes incluant l’anesthésie de quelques minutes, l’injection et le réveil avec ses congénères avant d’être replacé dans la cage avec la mère. Ensuite, un premier lot de souris subira une injection intrapéritonéale (IP) d’un produit permettant de visualiser le gène luminescent à l’âge de 1 mois, 2 mois et 4 mois suivi d’un examen d’imagerie dans un appareil qui permet de lire la bioluminescence. Ce lot de souris sera anesthésié par anesthésie gazeuse au moment de l’examen qui dure quelques minutes. Ces souris seront euthanasiées à l’âge de 4 mois. Résumé des interventions subies par le lot1 : Injection d’AAV IP ou Veine temporale (J1 ou J2) -> (Injection IP de luciférine +Imagerie sous anesthésie gazeuse) *3 -> Euthanasie à 4 mois. Un second lot sera soumis à des tests de force musculaire non invasifs à partir de l’âge d’1mois. Ces évaluations sont la mesure de la force par test d’agrippement sur une grille et de maintien sur la grille après retournement. Ces 2 mesures durent environ 5 minutes par animal et seront répétées toutes les semaines entre 1 et 4 mois (soit 12 fois maximum pour chaque test). Une mesure de traction sur une barre sera réalisée à 2 reprises également pour chaque souris, 3 essais/souris avec 30 secondes entre chaque essai. Une mesure directe de la force du muscle de la patte après stimulation électrique sera réalisée chez ces souris à l’âge de 4 mois sous anesthésie générale gazeuse avec analgésie en procédure sans réveil par le personnel expert. Elle dure environ 20 mn par souris. Résumé des interventions subies par le lot 2 : Injection du vecteur viral en IP ou Veine temporal (J1 ou J2) -> Mesures non invasives de forces musculaire (hebdomadaire entre 1 et 4mois soit environ 12 fois)-> Mesure de Forces invasives sous anesthésie gazeuse puis euthanasie à 4 mois.

Impact sur les animaux

La lignée de souris modèle présente un phénotype dommageable. Les hétérozygotes développent une faiblesse et une atrophie musculaire progressive dont les premiers signes apparaissent à 1 mois et s’amplifient jusqu’à environ 8 mois avec une perte de force musculaire l’ordre de 40% par rapport à des souris sauvages. Ce phénotype est comparable à celui observé dans la myopathie humaine. Ces souris hétérozygotes sont par ailleurs viables et fertiles avec une courbe de poids comparable à des souris sauvage. Les souris homozygotes meurent dans les premières 24h après la naissance mais ne seront pas produite dans ce projet. L’élevage de la lignée pour les projets fait l’objet d’une autorisation spécifique. Les différentes procédures que vont subir les animaux (tests de forces non-invasives, contention pour les injections intrapéritonéale, préhension des animaux pour les anesthésier) entrainent un stress de l’animal. Les animaux pourraient également souffrir d’hypothermie non-reversée suite à l’anesthésie par le froid ou être rejeté par leur mère. L’utilisation des vecteurs viraux de ce projet n’entraîne pas de douleurs et aucune pathologie ni effets indésirables ne sont induits chez les animaux traités avec des ARN interférence ou les AAV. Cependant une inflammation au site d’injection pourrait survenir.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

L’efficacité et l’absence de toxicité de l’approche thérapeutique par ARN interférence allèle spécifique a été démontré au préalable sur des cellules de patients en culture. La validité du modèle de souris de la maladie est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons préalablement démontré l’efficacité et l’innocuité de la stratégie thérapeutique en injection ciblée dans le muscle de souris du modèle de la maladie par l’intermédiaire du vecteur viral utilisé dans le projet. Le but de ce projet est l’optimisation de cette thérapie dans le modèle de souris en testant des modifications du vecteur viral et de son contenu afin d’améliorer l’expression de la molécule thérapeutique. Il nous apparait indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude dans ce modèle. Seule l’administration du traitement dans le système sanguin permettra de vérifier son efficacité et sa potentielle toxicité à l’échelle d’un organisme entier

Réduction

Des études précédentes sur nos différents projets nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés (entre 6 à 8 souris par groupes expérimentaux). Une première étude correspond à une étude pilote sur le sérotype et la voie d’administration systémique afin de réduire le nombre d’animaux utilisé pour la deuxième étude avec le vecteur exprimant la molécule thérapeutique. Les mâles et femelles sauvages et hétérozygotes seront analysés mais les comparaisons seront réalisées entre souris de même genre dans les 2 études. En effet des différences d’efficacité de transduction et de forces sont connues entre mâles et femelles. Ainsi cette étude pourra aussi permettre de révéler ou non des différences de phénotypes ou de réponse au traitement entre les sexes. Nous injecterons le nombre de portées nécessaire à obtenir au moins 8 souris de chaque génotype d’un même sexe pour les 2 études. Des analyses statistiques dédiées à l’analyse sur petit groupe seront utilisées pour une interprétation la plus fiable possible des résultats. Les constructions de la 2ème étude seront testées de manières successives et si une option s’avère parfaitement efficace les autres ne seront pas testées. Aussi, l’ensemble de ces projets nécessite au maximum l’utilisation de 720 souris (sauvages et hétérozygotes) dans les 2 études expérimentales pour les 5 ans du projet.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h/jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés 6 par cage maximum et l'isolement est évité au maximum. Un enrichissement de leur environnement est mis place avec aux choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’entretien des animaux ainsi que les expériences seront réalisés par un personnel titulaire des autorisations et formations nécessaires. Les animaux sont observés quotidiennement par l’animalier en charge de la lignée ou par les personnes en charge des protocoles. L’utilisation de vecteurs viraux de type virus adéno-associé n’entraine a priori pas de douleurs et donc de mise en place de traitement particulier pour y palier mais une surveillance renforcée sera exercée dans les jours suivants l’injection des souris. La procédure d’injection dure moins d’une minute par souris et est réalisée après anesthésie par le froid chez les nouveaux nés. L’imagerie est réalisée après anesthésie gazeuse et les mesures de forces de type Grip, Hanging et string test sont non invasives. Pour les mesures de forces invasives elles sont réalisées sous anesthésie et sans réveil. L’anesthésie gazeuse est réalisée en maintenant la thermorégulation en utilisant une lampe ou un tapis chauffant. Les animaux anesthesiés par le froid dont réchauffés progressivement dans une cage placée sur tapis chauffant. Les nouveaux nés ne sont replacés avec leur mère qu’une fois réchauffés et complètement réveillés (respiration normale et mouvements spontanés). Ils sont également frottés avec la litière de la cage maternelle afin de limiter le risque de rejet et remis tous en même temps dans la cage.Le comportement de la mère envers les petits est ensuite surveillé pendant 15 minutes puis fréquemment pendant les heures suivantes. Pour tous les projets, des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour l’optimisation du traitement, car la molécule testée ici est un outil génétique qui cible spécifiquement la mutation du gène portée par ce modèle. Le modèle de souris utilisé est le plus petit modèle mammifère pour cette myopathie et est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons précédemment démontré l’innocuité et l’efficacité du vecteur viral thérapeutique utilisé dans le muscle de souris de ce modèle. A ce stade il apparait donc indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude chez la souris afin d’en optimiser l’efficacité et vérifier la toxicité à l’échelle de l’organisme entier (injection dans le système sanguin). Les souris développent un phénotype musculaire progressif dont les premiers signes apparaissent à 1 mois et s’amplifient ensuite. Nos études préliminaires montrent que le défaut qui permet le bon acheminement du vecteur thérapeutique apparait entre 1 et 2 mois et s’aggrave avec la progression de la maladie. L’objectif de ce projet thérapeutique étant d’intervenir au plus tôt dans le développement de la maladie, les souris seront injectées en période néonatale entre 1 et 3 jours de vie. Nous nous limiterons à des injections entre J1 et J3 car après la veine temporale n’est plus visible du fait de l’apparition de la pigmentation de la peau et pour l’injection intra-péritonéale il s’agit de la fenêtre permettant une diffusion optimale en systémique (perméabilité maximale). Les souris sont par la suite évaluées à 1, 2, 3 et 4 mois après l’injection 1 c’est-à-dire après le début des symptômes jusqu’à ce que la maladie soit bien développée.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie centronucléaire, elles reçoivent une injection d'un vecteur viral, subissent des mesures de force musculaire sous anesthésie et la pose d'électrodes pouvant enflammer le muscle, avant le prélèvement de leurs organes. L'objectif est de tester une thérapie génique apportant le gène manquant responsable de la maladie musculaire. Le porteur affirme que ces analyses "ne peuvent pas être effectuées" sur cellules en culture, seul l'animal reproduisant l'évolution des symptômes.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point un traitement curatif en apportant le gène manquant responsable de cette maladie à l'aide d'un vecteur viral. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différents domaines de la protéine manquante responsable de la maladie musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine étudiée.

Procédures

Les 140 souris de la cohorte « Injection intraveineuse » seront soumises aux procédures suivantes : - Injections systémiques rétro-orbitales sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. -Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 10min par animal - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 13 semaines d’âge

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement. En revanche lors de la soumission à l’effort ou par stimulation électrique, le phénotype des souris devient observable et quantifiable le temps de l’analyse. A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose sous-cutanée des électrodes et l’injection intra-musculaire peuvent causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures car notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à la procédure expérimentale.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de l’injection par voie rétro-orbitale, du gel ophtalmique sera appliqué au niveau de l’œil de l’animal afin de s’affranchir de la sécheresse oculaire au réveil. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. L’effet du traitement avant l’apparition des symptômes a déjà prouvé son efficacité lors d’une étude précédente au laboratoire, nous traiterons donc ces animaux au stade adulte (8 semaines) pour étudier l’effet du traitement après l’apparition des symptômes.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent des injections intraveineuses et intracrâniennes de molécules, puis passent chaque mois pendant dix-huit mois une batterie de tests locomoteurs (rotarod, grip test, marche sur planche à trous, open field) et une mesure de force musculaire sous anesthésie. L'objectif est de tester la correction de la faiblesse musculaire, aucun traitement n'existant pour cette maladie. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de disposer d'un modèle animal car aucun système cellulaire ne reproduit les troubles de la locomotion à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la correction des altérations locomotrices et de la force musculaire chez des souris modèles d’une maladie humaine musculaire, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA, ou maladie de Charcot), pour laquelle il n’existe pas de traitement. Cette pathologie est due à une anomalie de l’ADN qui entraine une perte des neurone moteurs, aboutissant in fine à un affaiblissement des muscles squelettiques. Ayant précédemment identifié le mécanisme de cette mort neuronale, nous souhaitons désormais développer une approche thérapeutique pour cette maladie. Plus précisément, nous souhaitons injecter en intraveineux différentes molécules thérapeutiques, que nous avons précédemment validées en modèle cellulaire, dans des souris adultes modèle de cette maladie, et ceci afin d’étudier la correction du phénotype neuromusculaire de ces animaux. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de la locomotion et une mesure de la force musculaire de ces animaux chaque mois sur une période d’environ un an. Nous espérons que cette approche nous permettra d’ouvrir une piste thérapeutique pour cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour développer une approche thérapeutique pour la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la correction de la neurodégénérescence, de la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier cette maladie. Enfin, l’analyse de la correction de la faiblesse musculaire dans ce modèle murin a un véritable intérêt pré-clinique pour développer et tester des pistes thérapeutiques pour cette maladie neurodégénérative.

Procédures

1 – Les injections en intrapéritonéale, notamment d’agents anesthésiques, requièrent moins d'une minute. 2 - Les injections en sous cutané, notamment d’agents analgésiques, requièrent moins d'une minute. 3 – Une injection intraveineuse de virus adéno associé (AAV) requiert entre 30 secondes et 1 minute par animal. 4 - Une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique requiert entre 5 et 7 minutes par animal. 5 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 18 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 10 à 15 jours selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 6 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 10 à 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 18 mois. En conclusion, chaque animal recevra à l’âge de deux mois une injection intraveineuse rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse (entre 30 secondes et une minute), puis trois semaines plus tard une injection sous cutanée d’un analgésique et une injection intrapéritonéale d’anesthésiques suivie d’une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique (d’une durée de 5 à 7 minutes). Un mois après cette injection intra-crâniale, le phénotype de cet animal sera suivi par une batterie de tests locomoteurs non invasifs (rotarod, grip test, bar test puis rotarod) répartis sur 10 à 15 jours, puis deux semaines après le dernier test, nous effectuerons une mesure de leur force musculaire sous anesthésie gazeuse en 4 à 8 minutes. Ces tests locomoteurs et mesure de force seront répétées environ chaque mois sur une période de 18 mois.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier une maladie neurodégénérative et neuromusculaire touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal ; nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices et/ou d’une faiblesse musculaire chez ces souris. Il est à noter que les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie. Concernant le nombre d’animaux étudié, des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique. Ainsi, compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et une molécule contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de cette maladie.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir les doses de molécules thérapeutiques à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique et compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et un contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de diminuer le stress et la douleur liées à la mesure de la force musculaire par stimulation électrique et aux injections intraveineuses et intracérébrales ; ces procédures expérimentales se font toutes sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement (akinésie, prostration, paralysie), réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.

Choix des espèces

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. Enfin, nous allons étudier des approches thérapeutiques sur le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet la maladie que nous étudions touche les adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois. Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la maladie étudiée.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante sont dystrophiques et dix sont des témoins, et toutes subissent des injections intraveineuses en contention vigile, des mesures de fonction cardiaque, des électromyogrammes et des mesures de force musculaire sous anesthésie, pour tester une molécule associée à une restauration de la dystrophine dans la myopathie de Duchenne. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable", les modèles in vitro ne rendant pas compte selon lui de la dégénérescence progressive. Les bénéfices pour les patients sont renvoyés au long terme, en complément d'outils de thérapie génique en développement.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénerescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, notre molécule représente un bon candidat car il a déjà été prouvé que ce traitement renforce l'intégrité musculaire. Nous proposons donc une thérapie combinée associant la restauration de dystrophine et notre molécule afin de maintenir un environnement musculaire plus propice à la réexpression de la dystrophine.

Bénéfices attendus

Nous attendons comme bénéfices à court terme, chez les souris dystrophiques, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec la combinaison molécule d’intérêt et restauration de dystrophine comparé au traitement restauration de dystrophine seul. A long terme, nous projetons d’utiliser cette molécule comme traitement utilisable chez le patient atteint dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions: - Injection intra veineuse (1 minute) (sans anesthésie) dans le laboratoire collaborateur. Prélèvements de sang (20 secondes) (1 fois en fin de procédure pour chaque animal) (avec anesthésie). Les animaux seront soumis à des mesures fonctionnelles : -Mesures de composition corporelle (2 minutes) (1 fois) (sans anesthésie). Evaluation de la fonction cardiaque (échocardiographie) (10 minutes) (1 fois) (avec anesthésie). Electromyogrammes (20 minutes) (1 fois) (avec anesthésie et analgésie). Mesures de contractilité musculaire (20 minutes) (1 fois) (avec anesthésie)

Impact sur les animaux

Lors de l’injection en intraveineuse par voie caudale, l’animal vigile placé dans un appareil à contention prévu à cet effet, ressentira un stress et une douleur/inconfort équivalent ou supérieur à l'introduction d'une aiguille. Lors du transport entre les deux laboratoires et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lorsqu'ils seront transférés dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Lors des mesures de composition corporelle, l’animal subit un stress pendant l’immobilisation de 2 minutes dans le cylindre de contention. Au cours des procédures d’évaluation de la fonction cardiaque et des procédures de mesure de force, les animaux subissent un stress au moment de la contention et lors de l’administration de l’anesthésie (gazeuse ou piqure en intrapéritonéal).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle dystrophique est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne car il s’agit du modèle le plus approprié car bien caractérisé. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.

Réduction

Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 10 animaux est le nombre d'échantillons nécessaire pour obtenir une analyse statistique fiable. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. De plus tous les muscles et une majorité des organes de la souris seront prélevés. Au total, nous prévoyons d'utiliser 40 souris dystrophiques et 10 souris contrôle. La taille des effectifs sera été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats

Raffinement

Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l'euthanasie compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet combinent l’avantage du modèle murin dystrophique et l’avantage d’avoir les mitochondries marquées, ce qui sera très utilie pour mener à bien notre projet. Nous utiliserons des animaux âgés de 4 semaines en début de procédure et de 16 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux à un stade précoce de la maladie dès la fin du sevrage. Le démarrage du traitement dès que possible à 4 semaines permettra d’évaluer la capacité de notre molécule à ralentir la progression de la maladie.