Troubles musculosquelettiques

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles naissent avec un déficit de poids et développent des atteintes cardiaques et musculaires, puis sont gavées deux fois par jour, soumises à des échographies et à des courses forcées sur tapis avant la mise à mort. Le porteur teste le repositionnement de médicaments déjà commercialisés pour d'autres maladies. Il présente le passage à l'humain comme rapide en cas de succès, sans traitement curatif existant à ce jour.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Pas de procédures chirurgicales sur animaux vivants (prélèvements terminaux de différents organes sur animaux euthanasiés). Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (2 fois par jour pendant 1 semaine maximum; quelques secondes pour chaque geste) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste).

Impact sur les animaux

Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 5 mois. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10-12 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 2 fois par jour durant 3 mois lors de la DAP précédente n'ont pas révélé de nuisances particulières. Les prélèvements sanguins et l'echocardiographie sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. Le suivi des performances sur tapis de course teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux en fin de cinétique pour prélèvements terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet (DAP) précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Ces mêmes animaux seront également communs entre cette demande d'autorisation de projet (DAP) et une autre DAP. Par ailleurs, si les faibles doses ont un effet positif, les doses supérieures ne seront pas testées, diminuant ainsi le nombre total d'animaux. On passera à la dose supérieure uniquement si aucun effet sur dosages sanguins mais également sur poids, échocardiographies, treadmill et analyses sur organes n'est observé. Les mises au point actuelles montrent qu’un n de 5 est suffisant pour obtenir des statistiques robustes. Le logigramme montre que si l’étape 2 (sacrifice pour prélèvements d’organes et de sang) n’est pas engagée alors on aura des lots de 10 en étape 3 et si l’étape 2 (sacrifice pour prélèvements d’organes et de sang) est engagée alors on aura des lots de 5 en étape 2 et en étape 3. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis la mise en place des conditions optimales pour le bien-être des animaux. Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des animaux inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance : si on dépasse les 20 pourcents d'écart par rapport à l'animal lui-même, alors l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste, développés dans chaque procédure. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir, l'animal sera immédiatement euthanasié. Lors des échocardiographies, la surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux modèle de la maladie, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les animaux contrôles seront séparés des anaimaux modèle de la maladie dans les cages.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront élevés et gavés quotidiennement avec les candidats médicaments dans l'animalerie de production puis envoyés à l'animalerie où se feront les expérimentations de la présente DAP à l'âge de six mois (âge où un défaut en échocardiographie et sur tapis de course a été mis en évidence lors d'une précédente DAP).

6 000 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois avec adjuvant, et des prélèvements de sang pouvant aller jusqu'à quatre par jour, pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic et des médicaments. Hébergés seuls alors que l'espèce est sociale, ils sont tués en fin de protocole, un prélèvement de sang final important rendant leur maintien en vie impossible selon le porteur. Celui-ci reconnaît que la production d'anticorps in vitro existe mais affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques).

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 2 mL répartis sur 4 à 8 sites maximum pour la voie sous-cutanée, 0.5 mL sur 4 sites maximum pour la voie intra-musculaire, 5 mL/kg pour la voie intraveineuse, 2mL sur 40 sites maximum pour la voie intra dermique. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique mais seront au maximum espacés d’un à deux jours sur une durée totale d’un mois. En cas de durée supérieure à un mois, la structure en charge du bien-être animal sera contactée pour évaluer le bénéfice / risque. Concernant les prélèvements, les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de 5 minutes. Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à une anesthésie générale par injection d’un anesthésique par voie intraveineuse ou à une anesthésie locale répétée par application d’une pommade anesthésiante. Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, la contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Il est en effet impossible de : réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre protocole d’immunisation, réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre projet effectué par l’établissement utilisateur. Lors du prélèvement final de la procédure, un volume significatif de sang est récupéré et cela rend incompatible la réutilisation de l’animal.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

Également, à travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les lapins sont hébergés individuellement en gardant un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. De l’enrichissement est mis à leur disposition (balles de cellulose et/ou foin, anneau en plastique, mousqueton…) Un cycle jour nuit est présent en zone d’expérimentation (12h/12h). Les animaux sont observés de manière quotidienne par du personnel formé et compétent et pesés toutes les semaines. Durant cette pesée, un examen approfondi de l’état clinique des lapins est effectué par le technicien (e.g. : vérification des points d’injection, maux de patte éventuels, dentition…). Également, durant ce processus, des caresses aux animaux sont prodiguées. Des points limites intermédiaires associés à des actions spécifiques et des points limites terminaux sont en place. Par exemple, en cas de perte de poids ≥ 20% sur une semaine, une nourriture appétante est proposée à l’animal. Également, en cas d’apparition de certains signes cliniques (exemples : masses sans douleur pour l’animal, abcès sans lésion, fécalome) des protocoles de soins validés par un vétérinaire sont prodigués aux animaux. Certains gestes douloureux (injections intra-dermique) sont réalisés sous anesthésie générale et les injections répétées sont effectuées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Choix des espèces

Le lapin est l'animal le plus utilisé pour la production d’anticorps étant l’espèce animale la plus adaptée pour cela, de par la production de volumes suffisants d'antisérum qualitatif et à titre élevé. Cela permet donc d’utiliser moins d’animaux pour l’objectif scientifique requis. Age minimum des lapins : 10 semaines. A cet âge, les lapins ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections intramusculaires et jusqu'à sept prélèvements de sang, avant mise à mort pour prélever les muscles injectés. Le porteur affirme n'attendre aucun signe clinique et présente ce contrôle d'immunogénicité comme "nécessaire" à son dossier réglementaire avant des essais cliniques sur un candidat myorelaxant. Sur le remplacement, il indique que la pertinence des modèles cellulaires reste débattue et que le système immunitaire ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

Après avoir démontré le bénéfice d’efficacité de notre produit (FTP-501) face aux produits de référence utilisés en clinique lors de projets précédents, ce projet expérimental s’intéresse au potentiel immunogène (développement de réaction pro-inflammatoire) de ces candidats. Cette étude a pour objectif de confirmer la non-présence d’Anticorps Anti-Drug (ADA) (anticorps dirigé contre notre propre molécule) suite aux injections de notre composé. Cette molécule pourrait a priori provoquer une réaction immunitaire suite aux injections, diminuant ainsi l’efficacité du traitement et sa tolérance. Il est donc important de vérifier qu’une telle réaction est limitée ou inexistante. De plus ce test est nécessaire pour l’évaluation de notre dossier règlementaire en vu des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé nos 2 premiers Lead (FTP-501 et FTP-101) quasiment au terme de leur développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Ainsi, ce projet permettra de vérifier qu’aucune réaction immunitaire ne se manifeste suite aux injections du composé FTP-501 et que par conséquent notre produits est très bien toléré après des injections répétées.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 6 injections, durée 30 secondes/injection/animal = 3 min - Pesée des animaux = 10 pesées / animal => 30 secondes / pesée = 5 min / animal - Prélèvements de sang = 7 maximum par animal, durée 2 minutes = 14 minutes / animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans nos études précédentes et la littérature. En effet lors de nos précédents projets, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à une seule injection n’a été observé. Nous n’attendons pas ici de réactions suite aux multiples injections. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection, une douleur liée aux injections i.m. et les multiples prélèvements de sang (7 maximum).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure sont concernés En effet, les muscles injectés seront prélevés pour analyse histologie.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). De plus, nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe (impossible à reproduire dans sa globalité in vitro) et nécessite des expérimentations in vivo.

Réduction

Pour la réduction, la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis) a été déterminé avec le logiciel G-Power. Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 20 animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages en plastique transparent de 1800cm2 au sol et comportant une plateforme. Les cages seront ventilées individuellement, placés dans une pièce sous air conditionné, avec un cycle jour/nuit de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Ils seront maintenus en groupe de 2 ou 3 rats par cage. Ils disposeront de matériel de nidification (litière en chips de cellulose) puis d’enrichissement : les rats ont un tunnel rouge ainsi qu’un bâton de bois à ronger. Les animaux seront surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur entraîné, et via une approche limitant le stress et la douleur, tout en ne dépassant pas les limites de volume prélevables chez un rat.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes interne. Nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe et nécessite des expérimentations in vivo. De plus, nous avons choisi le rat d’une part, par continuité avec nos études précédentes et notre expérience sur ce modèle et d’autre part, car il s’agit d’un modèle de choix pour des études de toxicité de composé. Nous utiliserons des rats Sprague Dawley âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 30 semaines maximum en fin d’expérimentation. Des jeunes adultes sont choisis ici pour le bon fonctionnement de leur système immunitaire

18 rats porteurs d'un modèle de la dystrophie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des enregistrements cardiaques et respiratoires, un test de préhension et une mesure de force musculaire sous anesthésie, puis un prélèvement de sang, avant mise à mort pour analyse des organes. Le porteur teste deux composés combinés censés réguler la dynamique calcique et retarder la maladie, mais renvoie les bénéfices pour les patients au conditionnel et au long terme, après d'éventuels essais sur des animaux plus grands. Sur le remplacement, il affirme que seule la réponse de l'animal vivant avec ses organes en interrelation permet de conclure, et décrit le rat comme un modèle plus fidèle que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très mauvais et les jeunes patients meurent prématurément. L’absence de la protéine dystrophine entraîne un stress oxydatif pour les cellules, avec une anomalie de la dynamique du calcium qui engendre des défauts fonctionnels pour les fibres musculaires. Nous proposons ici de tester l’efficacité thérapeutique de deux composés chimiques innovants, identifiés comme régulateurs de cette dynamique calcique. Ces deux composés sont ici combinés en un seul produit qui a récemment prouvé son efficacité chez le poisson et la souris, modèle partiel de la DMD. Le but de ce projet est d'évaluer l'effet de ce produit dans le modèle pertinent du rat DMD, dont il a été prouvé qu’il récapitule beaucoup plus fidèlement la progression très sévère et fatale de la maladie chez l'humain. Par sa plus grande hétérogénéité génétique, le rat permet de plus d’évaluer la réponse individuelle au traitement, prémices d’une médecine de précision. En cas de succès, ce produit poursuivra son développement vers des essais précliniques chez des animaux de plus grande taille et encore plus hétérogènes au plan génétique avant, en cas de succès, d’entrer en phase d’essai clinique chez les enfants atteints de DMD.

Bénéfices attendus

Nous espérons que les résultats obtenus dans le cadre de cette étude contribueront au développement d'un traitement pharmacologique de la dystrophie musculaire de Duchenne. D'une manière générale, nos résultats permettront d'avancer dans la connaissance plus précise des mécanismes anormaux à l'oeuvre dans cette maladie. La thérapie basée sur le produit testé ici est de nature protectrice et nous espérons que ce traitement retardera l'évolution de cette maladie. Ce produit peut être administré en combinaison avec d'autres thérapies existantes ou en développement. Le produit a déjà démontré son efficacité et sa sécurité lors d'études préliminaires sur des cellules musculaires et cardiaques humaines, ainsi que sur des poissons et des souris. Il est donc attendu un bénéfice sur l'état général des animaux testés ici, ainsi qu'une absence de toxicité.

Procédures

La durée d'un enregistrement ECG, indolore, est de 15 minutes. La durée d'un enregistrement pléthysmographie, indolore, est de 30 minutes. La durée d'une séquence de grip test, indolore, est de 20 minutes. La durée d'un enregistrement de la force musculaire est de 90 minutes jusqu'au réveil, anesthésie comprise (une injection sous cutanée avec une aiguille hypodermique très fine). Les animaux seront également prélevés une fois pour récupérer un millilitre de sang, en vue de quantifier des biomarqueurs de la maladie. Ce prélèvement dure moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

L'absence de toxicité du produit a été démontrée in vitro et in vivo. Aucun effet indésirable supplémentaires à ceux causés par la maladie développée spontanément par les animaux modèles n'a été observé chez les souris traitées avec les composés du produit, sur une durée de 6 mois à la dose de 60 mg/kg/jour. Ici, le traitement sera administré par voie orale dans l'eau de boisson car il s'agit de la forme d'administration la plus pratique et la moins contraignante pour l'animal. Elle a montré une bonne biodisponibilité dans les tissus cibles (muscle, cœur et cerveau) de la souris et du rat.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires à l'évaluation complète du produit testé.

Remplacement

L'efficacité du composé testé a déjà été confirmée in vitro et sur des modèles de souris. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé testé permet-elle de protéger suffisamment les muscles pour que cela confère un bénéfice quantifiable au cœur et aux muscles squelettiques, à l’échelle de leur microstructure et de leur fonction.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats (2 muscles traités indépendamment par rat) permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Pour réaliser cette estimation, nous utilisons des tests statistiques en prenant en compte des paramètres tels que la différence à mettre en évidence entre les différents lots, la puissance et le risque du test. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des logiciels qui permettent de comparer deux groupes ou plusieurs groupes entre eux.

Raffinement

Le phénotype dommageable des animaux consiste en une faiblesse progressive de leur musculature, sans effet indésirable jusqu'à l'âge de 6 mois, au-delà de l'âge atteint par les rats en fin de cette procédure. Les animaux seront donc considérés comme des animaux capables d'une vie normale en espace confiné et seront stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées, monitorées et conformes à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrières. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 6 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 300g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux par l'utilisation d'agents anesthésiques et analgésiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la même classe que l'être humain. À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD dont la valeur demeure inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Nous utiliserons des animaux à l'âge d’un à 4 mois (3 à 15 semaines). Notre étude de caractérisation ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 3 semaines permettra d’évaluer la capacité du composé testé à différer l’installation progressive de la fibrose (traitement préventif) et ses conséquences fonctionnelles sur la musculature striée. Le bon état général des animaux à l'âge maximal de 4 mois justifie notre suggestion de classer cette procédure en procédure modérée.

120 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation sous la peau d'un biomatériau osseux, avant d'être tué pour l'analyse histologique des tissus. Le porteur indique que l'implantation peut provoquer une gêne ou une douleur légère et fixe un seuil d'euthanasie. Il décrit cette étape sur souris comme un préalable à des essais sur os de rat puis chez le "gros animal", et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ensemble formation osseuse, vascularisation et innervation.

Objectifs

En raison des changements de mode de vie et du vieillissement des nations industrialisées, les lésions osseuses traumatiques et les fractures fragiles induites par l'ostéoporose représentent un énorme défi médical et socio-économique. Notre projet vise à créer une nouvelle approche de régénération osseuse, qui combine l'administration de gènes et l'impression 3D pour la création de matériaux personnalisés qui permettraient d'aboutir à une meilleure réparation osseuse par la stimulation conjointe de la réparation des nerfs, des vaisseaux et des os. Ici, il s’agit de réaliser une première évaluation de nos matériaux en les implantant sous la peau de souris, en préalable à des expérimentations sur site osseux chez le rat. Cette évaluation servira deux objectifs : d’une part, évaluer la biocompatibilité (réaction inflammatoire, réaction à corps étranger, …), et d’autre part évaluer la fonctionnalité (formation osseuse, vascularisation, innervation) des produits, pour définir la ou les formulations les plus appropriées pour l’application chez le rat en modèle de réparation osseuse.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences d’implantation de nos matériaux menées sur modèle souris sont un préalable à la poursuite des travaux sur site osseux chez le rat. De mauvais résultats obtenus avec ce biomatériau et/ou l'un des gènes administrés conduiront à l’abandon de l’élément mis en cause. En revanche, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager dans un premier temps les expérimentations en site osseux chez le rat, et dans un deuxième temps le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie d'implantation sous-cutanée (acte chirurgical unique d'une durée de 5 à 10 minutes)

Impact sur les animaux

L'implantation sous-cutanée peut entraîner une gêne voire une douleur légère. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie selon les standards européens. Au-delà d'un certain seuil, l’animal sera euthanasié sans attendre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de leur temps expérimental pour procéder à une analyse histologique des tissus de la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau et pour évaluer le potentiel régénératif de celui-ci. Aucune méthode in vitro actuelle (ex. organoïdes, sphéroïdes,...) n'a démontré la capacité ou ne présente de validation scientifique permettant d'étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l'innervation induites par les biomatériaux tout en tenant compte de la complexité d'un être vivant (système immunitaire, flux sanguin...).

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré in vitro une absence de cytotoxicité, et une seule lignée de souris sera utilisée. Les échantillons explantés à l'issue des temps expérimentaux seront utilisés pour plusieurs types de marquages et détections. Deux implantations seront réalisées par souris, en tenant compte de la taille du matériau et de la taille des animaux. La possibilité d'implanter au moins deux matériaux par animal, de réaliser un suivi longitudinal, d'analyser plusieurs paramètres à partir des mêmes prélèvements sur animaux après euthanasie, permet de collecter un maximum d'informations sur les animaux utilisés.

Raffinement

L’opération est réalisée sous anesthésie générale. Afin de réduire la souffrance des animaux, des analgésiques sont utilisés lors de l’opération, puis de nouveau en cas de douleur après l’opération. En cas de lésion sérieuse ne pouvant être traitée par suture et/ou antiseptique, l’animal est euthanasié. La cage reçoit un surcroît d’enrichissements le jour de la chirurgie de manière à distraire l’animal de la gêne liée à la présence du matériau implanté, et ainsi limiter les risques d’arrachement de l’implant, de rupture des points de suture, et d’infection de la plaie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris présentant une immuno-déficience marquée, adaptée à l'implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Les souris seront implantées à l'âge de 7 à 12 semaines. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´implantation sous-cutanée.

129 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats reçoivent un implant de céramique dans l'os par chirurgie, les souris un implant sous la peau, avec suivi par micro-scanner. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales au site opératoire. Il affirme qu'aucun modèle de formation osseuse in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la cicatrisation, et vise à tester des céramiques comme alternative à l'autogreffe.

Objectifs

La réparation du squelette après perte de substance osseuse demeure un problème lorsque les défauts sont de grande taille. Si le traitement par autogreffe (prélèvement d’os chez le même patient) reste la référence, il a cependant des inconvénients. Les matériaux à base de céramiques en phosphate de calcium (CaP) sont une bonne alternative à l’autogreffe osseuse car supportent bien la repousse osseuse mais, généralement qu’aux abords des berges osseuses limitant leur efficacité à des défauts de faible volume. Une stratégie prometteuse pour améliorer le potentiel régénératif de ces matériaux est de mieux mimer la composition chimique de l’os (partie minérale), qui contient de nombreux oligo-éléments sous formes d’ions (tels carbonates, fluor, magnésium, manganèse…). L’insertion d’ions dans les céramiques de CaP est une approche de plus en plus étudiée permettant de moduler les propriétés physico-chimiques et microstructurales du matériau, et ainsi ses propriétés biologiques. Parmi les éléments ‘traces’ présents naturellement dans l’os, le silicium (principal élément composant le sable) joue un rôle essentiel dans le développement, la croissance et la calcification du tissu osseux (une alimentation déficiente en silicium engendre un retard de croissance accompagné d’un développement crânien anormal chez le rat alors qu’un régime enrichi en silicium améliore leur croissance squelettique). Le silicium est présent dans le corps sous forme d’ions silicates. Des études in vitro démontrent que les ions silicates favorise la différenciation de cellules qui produisent le tissu osseux et inhibe les cellules osseuses qui résorbent l’os. L’incorporation d’ions silicates dans ces matériaux a été déjà étudiée ces dernières années mais en raison de la faible dégradation des céramiques de CaP in vivo, les ions Silicates (qui pourraient influencer les cellules osseuses) ne sont en fait jamais libérés. L’incorporation d’ions carbonates, (ions naturellement présents dans le tissu osseux à 5-8%) dans les céramiques augmente leur dégradation in vivo. Considérant les avantages de chacun, l’incorporation simultanée d’ions silicates et carbonates dans la structure des céramiques rendrait le matériau dégradable, libérant ainsi les ions Silicates bioactifs pour stimuler les cellules osseuses et promouvoir l’ostéogénèse. L’objectif de ce projet est d’évaluer la dégradation des différentes céramiques (+/- ions) in vivo et leur potentiel à réparer un défaut osseux.

Bénéfices attendus

Plusieurs données de la littérature ont montré le bénéfice de céramiques contenant des ions silicates sur la formation osseuse ; mais une controverse persiste dans la communauté scientifique en raison de la faible/absence de dégradation des céramique in vivo, limitant la libération des ions silicates bioactifs. Le co-insertion d’ions carbonates et silicates a pour objectif d’obtenir des matériaux dégradables et donc plus bioactifs. Ce projet permettra de valider (ou invalider) l’intérêt d’insérer des ions silicates dans une biocéramique pour la réparation osseuse. Le bénéfice attendu à plus long terme est l’optimisation de la synthèse et fabrication d’implants en biocéramique pour le comblement de grands défauts osseux en remplacement de l’autogreffe.

Procédures

Pour les souris : 1-Implantation sous cutanées de matrices ( 1X ; durée ~20 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (max 7X; durée 15 min) Pour les rats : 1- Implantation intraosseuse au niveau du condyle (1X, durée 40 min) ; 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (6X; durée 15 min) 3- Injection d'agent fluochromes (2X ; durée 5 min)

Impact sur les animaux

Nuisances attendues causées durant les actes expérimentaux : stress dû à la contention puis lors de la perte de connaissance par le gaz anesthésiant (souris et rats) ; Injection en sous cutané (souris et rats); Injection en intrapéritonéal (souris et rats); Chirurgie en sous-cutané (sous analgésie et anesthésie) (souris) ; Chirurgie en intra-osseux (sous analgésie et anesthésie) (rats). Nuisances attendues engendrés suite aux expérimentations : douleurs post-chirurgie (niveau du site opératoire) (souris et rats)

Devenir

Mise à mort car fin de protocole ; les explants seront récupérés et traités selon l’étude (analyse expression génique, histologie, analyse au scanner à plus haute résolution, mesure de la masse de la céramique restante).

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire ; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

4 ou 2 implants seront implantés par animal pour diminuer le nombre d’animaux utilisé. L’imagerie non-invasive pour petits animaux (suivi de la formation osseuse par micro-scanner) sera utilisée pour suivre les mêmes animaux dans le temps et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisé. Une analyse statistique en préalable a permis de déterminer qu’il nous fallait 10 animaux par groupe testé pour espérer obtenir une différence statistique entre au moins 2 groupes.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée entre l’arrivée des animaux et la chirurgie. Le manipulateur viendra les voir et manipuler au minimum 3 fois avant la chirurgie. En vue d’éviter le stress, les souris et les rats initialement hébergés ensemble (3 animaux/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La souffrance sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire pendant les 3 premiers jours. Après anesthésie et avant chirurgie, un gel sera est appliqué sur chaque œil pour éviter le dessèchement des yeux. Après chirurgie, les animaux seront surveillés en per-opératoire puis régulièrement jusqu'à la fin de l'expérimentation. Pour chaque analyse par micro-scanner, les souris et rats seront anesthésiées par inhalation d’un gaz anesthésiant dont les effets se dissipent 1 à 2 minutes après l’arrêt du contact direct avec le produit. Les points critiques (plaie, démarche..) seront surveillés, notés et reportés sur une feuille de score permettant de quantifier la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures à prendre pour chaque situation clinique (Perte de poids, Comportement général altéré, Apparence extérieure altérée, Site d’implantation infecté) et si les points limites sont atteints, sont listées sur cette feuille de score. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), dômes (pour souris) et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour les implantations sous-cutanées est la souris immunodéprimée Nude (ayant un système immunitaire adaptatif altéré, mais inné non-altéré) car une procédure implique l’association de céramiques avec des de cellules humaines formatrices de tissu osseux; son poids à 8 semaines (~30 g) permet l’implantation de 4 implants par souris ou 2 chambres de diffusion par souris sans problème. Le modèle animal choisi pour les implantations intra-osseux est le rat Wistar. La taille du rat est plus pertinente que la souris pour évaluer la réparation d’un grand défaut osseux. La souche Wistar est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin.

60 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation du tendon du genou leur est provoquée par injection de collagénase, un produit irritant, puis ils subissent des angiographies et une embolisation, et juste avant leur mise à mort des embolisations supplémentaires sont pratiquées sur d'autres organes comme les reins, la prostate ou l'utérus. Le porteur indique que le modèle est "maîtrisé" et qu'aucune nuisance supplémentaire n'est attendue, et signale que le projet sert aussi à former des internes en radiologie interventionnelle. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative reproduisant des conditions proches des cas cliniques.

Objectifs

Les inflammations chroniques des tendons et des articulations sont fréquentes et difficiles à soigner. C'est un problème de santé publique avec un coût médico-économique important et des arrêts de travail prolongés (douleur épaule, coude, poigner, genou) et arrêt de sport. Dans cette pathologie, des nouvelles artères (néovaisseaux) se forment et entretiennent cette inflammation. Une équipe de chercheurs rapporte que le fait de boucher ces néovaisseaux, c'est à dire de réaliser une embolisation, permet d'améliorer les patients souffrant de ces maladies chroniques. L’agent utilisé pour boucher les vaisseaux est un antibiotique, et n’a pas l’autorisation en France pour être utilisé dans les artères. Cette approche doit être validée sur un modèle animal avant de pouvoir faire des tests chez l'Homme notamment pour prouver qu'il n'existe pas de risque à priver de sang les tendons ou les articulations inflammatoires et d’étudier les différents agents d’embolisation possibles. Dans une étude précédente, notre équipe a mis au point un modèle porcin reproductible d’inflammation du tendon du genou qui associe une inflammation du tendon et le développement de vaisseaux pathologiques. Il a été utilisé pour tester l'embolisation avec des microbilles définitives, montrant l’absence de complication sévère chez l’animal. Cependant l’embolisation avec ces petites billes semble avoir des résultats nettement moins bons sur la douleur que les publications utilisant l’antibiotique comme agent d’embolisation. Dès lors, il est nécessaire d’étudier l'efficacité de cet antibiotique sur notre modèle animal, ainsi que celle de nouveau agents d’embolisation pour orienter la prise en charge future de ces patients. L’objectif de ce projet est donc de proposer notre modèle validé, reproductible et maîtrisé par les radiologues interventionnels, à différentes équipes pour tester la sécurité et l'efficacité de leurs matériaux d'embolisation.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’embolisation dans la pathologie tendineuse. Ceci permettra de mieux comprendre les douleurs des patients et ainsi de leur apporter un nouveau traitement antalgique qui permettra de limiter le recours aux médicaments, soins de kinésithérapie, d’accélérer la reprise du travail et la reprise du sport. De plus, ce projet contribuera également à la formation d'internes en radiologie interventionnelle à la réalisation de gestes techniques.

Procédures

Les animaux seront impliqués dans une seule procédure opératoire qui se déroulera en plusieurs étapes : le 1er jour, induction d'une inflammation au niveau du tendon du genou du porc par injection intra-tendineuse d'une produit irritant (collagénase) sous échographie (30 min maximum). Après une semaine, réalisation d'une angiographie (examen d'imagerie d'environ 1 heure) afin de valider la présence de néovaisseaux et embolisation le cas échéant. Après deux semaines, réalisation d'une angiographie pour vérifier la réussite de l’embolisation. Juste avant la mise à mort, d'autres procédures d'embolisations pourront être réalisées sur d'autres organes (reins, prostate, utérus...) avec différents agents embolisants. L'objectif sera d'évaluer la faisabilité en vue de futurs protocoles de recherche sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Ce sont des méthodes mini-invasives non chirurgicales, possibles par l'accès à la carotide qui sera déjà utilisé au cours de la procédure expérimentale, et qui permet d'amener le cathéter jusqu'aux artères alimentant les différents organes (artère rénale, prostatique...). Ainsi aucune autre technique ne sera utilisée pour réaliser ces gestes supplémentaires. L'ensemble de cette dernière phase n'excèdera pas 2 heures.

Impact sur les animaux

L’étude précédente ayant permis la validation de la dose de collagénase n’a montré aucun signe d’apparition d’inconfort ou de douleur, ni de changement de comportement chez les animaux. Ainsi, le modèle étant désormais maîtrisé, aucune nuisance supplémentaire n'est attendue. Concernant les effets indésirables, devant le risque ischémique lié à l’utilisation des agents embolisants testés, il conviendra de s'assurer de l'absence de complication locale visible au niveau des cuisses de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer le prélèvement des tendons.

Remplacement

Il s’agit d’une étude ayant pour objectif de vérifier l'efficacité et la précision d'une technique interventionnelle. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les groupes en cas de comparaison, ou un groupe suffisamment important pour valider un groupe pilote sur un nouvel agent. Dans un souci de Réduction du nombre d’animaux utilisés, nous souhaitons profiter de l’anesthésie générale finale, après l’artériographie et donc juste avant l’euthanasie de l’animal, pour réaliser ces gestes, similaires à ceux réalisés sur les genoux, sur d’autres organes. Cela permettra de valider leur faisabilité technique soit en prévision de projets futurs, soit pour répondre à des questions ponctuelles, sans engendrer de souffrance supplémentaire pour les animaux déjà anesthésiés profondément et mis à mort juste après, et sans nécessité d’écrire un nouveau protocole impliquant un nombre supplémentaire d’individus. Enfin, cette démarche contribuera également à la formation d'internes en radiologie interventionnelle à la réalisation de ces gestes techniques. Aucun étude statistique ne sera prévu sur ces expérimentation (étude de faisabilité).

Raffinement

Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine et tout au long de la procédure. Afin de limiter leur stress, les animaux seront hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Ce modèle ayant été mis au point dans les mêmes conditions, toutes les techniques expérimentales ont été optimisées. Pour la phase d'injection dans le tendon, une anesthésie légère. Les gestes interventionnels (angiographie) seront toujours réalisés sous anesthésie générale afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal, de même que la mise à mort. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un morphinique. La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille.

Choix des espèces

De manière générale, le porc est un bon modèle d'étude proche de la physiologie humaine, notamment au niveau de la vascularisation, ce qui permet de se former sur l'animal avant l'usage chez l'Homme. Nous profiterons également de la mise en place de ce projet pour réaliser des formations aux radiologues interventionnels sur cette nouvelle technique d’embolisation. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 25 et 35 kg, permettant des groupes homogènes) et pour des raisons de coût d'autre part.