Troubles musculosquelettiques

30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose des cathéters dans les veines fémorales sous anesthésie, on administre par voie orale ou intraveineuse un candidat médicament anti-inflammatoire, puis on réalise cinq prélèvements sanguins sur douze heures et un placement en cage à métabolisme pendant vingt-quatre heures. Le projet mesure le devenir de la molécule dans l'organisme en vue d'un futur dossier d'autorisation de mise sur le marché. Le porteur affirme que la pharmacocinétique n'est "pas prévisible" par des études sur cellules et qu'elle doit être fournie in vivo pour ce dossier.

Objectifs

L'IMD-036B est un candidat médicament qui présente des caractéristiques intéressantes pour lutter contre les processus inflmmatoires à l'origine de maladies chroniques inflammatoires comme le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques ou encore l'hyper-inflammation responsable des orages cytokiniques comme dans le cas des formes graves de COVID19. Afin de compléter les données obtenues sur ce candidat médicament avant de pouvoir mener des essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de connaître son devenir dans l'organisme et de déterminer si la molécule est bien absorbée et comment elle est éliminée (élimination rénale ou métabolisme hépatique). Notre projet a donc pour but de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et la clairance rénale de l'IMD-036B après administration par voie orale (la voie préconisée pour l'administration future chez l'Homme) et par voie intraveineuse (la voie de référence permettant de déterminer la biodisponibilité de la molécule).

Bénéfices attendus

Ce projet est une première étape pour pouvoir déposer un dossier d'AMM pour un nouveau candidat médicament. Les premières données obtenues sur ce candidat médicament laissent fortement penser qu'il permettrait de traiter efficacement les processus inflammatoires dans un certains nombres de maladies chez l'Homme qui n'ont pour le moment peu ou pas de traitement (par exemple, sclérose en plaques ou COVID19). Dans un deuxième temps, son utilisation pourrait également bénéficier aux vétérinaires pour le traitement de dermatites atopiques chez le chien par exemple.

Procédures

1. Pose d'un ou deux cathéters au niveau des veines fémorales sous anesthésie générale + analgésie: une seule chirurgie de maximum 30 minutes avec un réveil rapide, 2. Administration par voie orale ou par voie intraveineuse d'IMD-036B: une seule administration de quelques secondes à une minute max à chaque fois, 3. Cinq prélèvements sanguins sur environ 12h (1 de 100 µL et 4 de 250 µL) via cathéter sur animal vigile: quelques secondes à 1 minute max à chaque fois, 4. Placement en cage à métabolisme pour recueil des urines sur 24h, 5. Prélèvement de sang sous anesthésie via cathéter ou par ponction intracardique suivi de la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

La toxicité de cette molécule a déjà été testée sur rongeurs après des administrations répétées et à des doses bien plus importantes que celle utilisée dans notre projet. Aucun effet indésirable n'est attendu lors de l'administration unique par voie orale ou intraveineuse d'IMD-036B à la dose de 10 mg/kg à des rats. Les nuisances qui pourraient être observées sont plutôt inhérentes à la chirurgie effectuée sur les animaux, mais il s'agit d'une procédure largement maitrisée par le personnel en charge du projet et avec une analgésie très efficace.

Devenir

Les animaux ayant subi une chirurgie et l'administration d'une molécule qui n'est pas encore disponible sur la marché dont nous ne pouvons donc pas connaître les effets à long terme seront euthanasiés. Les animaux avec des cathéters non fonctionnels qui n'auraient pas reçu la molécule seront euthanasiés pour obtenir des matrices blanches permettant de réaliser gammes et QC pour le dosage de la molécule dans la plasma.

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet car le devenir d'un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) n'est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale...). De plus, lors du dépôt de dossier d'AMM pour ce nouveau candidat médicament, il sera nécessaire de fournir des données de pharmacocinétique in vivo.

Réduction

Le projet sera découpé en deux parties: une première partie consistant à administrer la molécule à 15 rats par voie intraveineuse, la seconde partie consistant à administrer la molécule à 15 autres rats par voie orale. L'utilisation du second lot de 15 rats pour l'administration par voie orale ne sera faite que si les études menées in vitro sur Caco2, en parallèle de la première partie de notre étude, montrent que la molécule présente un bon passage au niveau intestinal. De plus, grâce à des techniques de modélisation des données, il est possible de réduire le nombre de prélèvements sanguins effectués sur les rats en ne réalisant pas tous les prélèvements sanguins à tous les temps sur tous les rats. Enfin, le fait de poser deux cathéters lors d'une seule chirurgie pour l'administration par voie intraveineuse et la réalisation des prélèvements sériés permet de réduire le nombre d'anesthésies pour ces animaux.

Raffinement

La réalisation du projet en deux parties permet de ne pas utiliser inutilement des animaux pour l'administration par voie orale alors que, si la molécule est mal absorbée, les résultats seront inexploitables. Les rats seront hébergés en groupe dans des milieux enrichis (papier pour faire des nids, rouleaux en carton en guise de tunnels et pour ronger), sauf juste après la pose des cathéters (au moins jusqu'au réveil de l'animal) et lors des 24h en cage à métabolisme. Les cages à métabolisme permettront tout de même aux animaux de se voir et se sentir.

Choix des espèces

Les études précliniques qui doivent être effectuées avant les essais cliniques chez l'Homme doivent l'être sur une espèce de référence comme le rat ou la souris. Le choix du rat a été fait car cette espèce permet, contrairement à la souris, de faire des prélèvements sanguins sériés. Animaux adultes. Dans un premier temps, on évitera les animaux trop jeunes ou senescents qui pourraient avoir un métabolisme différent car nous n'avons pas encore connaissance de la cinétique de la molécule et de la variabilité interindividuelle des concentrations plasmatiques et urinaires.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une maladie musculaire génétique, elles reçoivent des injections de molécules thérapeutiques, dont des injections rétro-orbitaires, puis sont soumises chaque mois pendant un an à des tests de locomotion et de force sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser leurs muscles. Le porteur indique n'étudier que les premières étapes des symptômes et tuer les animaux avant la phase terminale de la maladie. Il juge le modèle animal "indispensable" car aucun modèle cellulaire ne reproduit les troubles de la locomotion et de la force.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la correction des altérations locomotrices et de la force musculaire chez des souris modèles d’une maladie humaine musculaire, la dystrophie myotonique, pour laquelle il n’existe pas de traitement. Cette pathologie est due à une anomalie de l’ADN qui entraine un affaiblissement des muscles squelettiques. Ayant précédemment identifié le mécanisme de cette faiblesse musculaire, nous souhaitons désormais développer une approche thérapeutique pour cette maladie. Plus précisément, nous souhaitons injecter en intraveineux différentes molécules thérapeutiques, que nous avons précédemment validées en modèle cellulaire, dans des souris adultes modèle de la dystrophie myotonique, et ceci afin d’étudier la correction du phénotype locomoteur et de la force musculaire de ces animaux. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de la locomotion et une mesure de la force musculaire de ces animaux chaque mois sur une période d’environ un an. Nous espérons que cette approche nous permettra d’ouvrir une piste thérapeutique pour cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour développer une approche thérapeutique pour la dystrophie myotonique, car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier cette maladie. Enfin, l’analyse de la correction de la faiblesse musculaire dans ce modèle murin a un véritable intérêt pré-clinique pour développer et tester des pistes thérapeutiques pour une maladie humaine musculaire.

Procédures

1 – Les injections en intrapéritonéale, notamment d’agents anesthésiques, requièrent moins d'une minute. 2 – Les injections rétro-orbitaires de virus associés aux adénovirus adénovirales (AAV) ou d’oligonucléotides antisens (ASO), requièrent entre 30 secondes et 1 minute par animal. 3 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 12 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 2 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 4 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 12 mois.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier une maladie musculaire touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal, nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices et de faiblesse musculaire chez ces souris. Toutefois, afin de limiter la douleur induite par les symptômes, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. De plus, les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs muscles squelettiques pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie musculaire causée par une mutation génétique, la dystrophie myotonique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de cette maladie.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents nous ont permis d’établir les doses de molécules thérapeutiques à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera le type de molécule thérapeutique et compte tenu de notre projet d’analyser 7 types et/ou doses de traitements sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 168 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. De plus, afin de limiter d’éventuelles douleur induite par l’apparition de symptômes locomoteurs, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. Toutefois, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Enfin, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience stoppée.

Choix des espèces

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie musculaire causée par une mutation génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. Nous allons étudier des approches thérapeutiques sur le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet la maladie musculaire que nous étudions touche les adultes, donc des souris sevrée et adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 12 mois. Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la maladie étudiée.

200 primates non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit 150 macaques à longue queue, 25 macaques rhésus et 25 singes vervets. Chaque animal reçoit une administration de virus AAV par voie intraveineuse ou intrathécale, suivie de prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, certains protocoles retirant jusqu'à 20 % du volume sanguin, avant une mise à mort pour analyser la répartition du virus dans les organes. Le porteur juge peu probables les effets secondaires des AAV rendus non réplicatifs et signale surtout un stress lié aux contentions et aux gestes. Il affirme que ces études de biodistribution sont "indispensables" et retient le primate pour sa proximité immunitaire avec l'humain, au service du développement de thérapies géniques.

Objectifs

Ce projet porte sur l’analyse de la biodistribution les organes d’un virus AAV (Adeno-Associated Virus) sur un modèle primates non humains. Ce type de virus est utilisé dans le cadre de thérapie génique, afin notamment de faire exprimer aux cellules des patients des protéines manquantes à cause de maladies génétiques. Ce projet porte sur l’analyse de la biodistribution dans les organes d’un virus AAV (Adeno-Associated Virus) sur un modèle primates non humains. Ce type de virus est utilisé dans le cadre de thérapie génique, afin notamment de faire exprimer aux cellules des patients des protéines manquantes à cause de maladies génétiques. Les virus adéno-associés (AAV) sont un vecteur viable de transfert de gènes. Ils peuvent être conçus pour transporter des séquences d’ADN thérapeutiques dans le noyau de différents types de cellules (hépatiques, musculaires, ou nerveuses par exemple). Leur nature réplicative-déficiente et l'inactivation des outils moléculaires liés à l'inclusion de ces virus dans le génome humain leur donnent un profil de sécurité particulièrement intéressant pour leur utilisation clinique chez l'homme. Selon les types d'AAV, naturels ou chimériques, leur tropisme et leur profil d'infection dans divers organes va être complètement différent. Les phases de développement d'un AAV thérapeutiques passent donc par une phase de "screening" de candidats virus, dont le but est d'évaluer la biodistribution de ceux-ci dans diverses structures biologiques d'intérêts. La proximité immunitaire des singes avec l'humain fait de ces espèces un modèle intéressant et prédictif de la biodistribution attendue chez les patients.

Bénéfices attendus

Les AAV sont utilisés en thérapie génique comme "moyen de transport" pour amener du matériel génétique dans les cellules cibles. Cette étude permettra de sélectionner les « constructions » d'AAV pour traiter des maladies spécifiques, grâce à la distribution d'un transgène thérapeutique dans un tissu particulier.

Procédures

Après une période d’acclimatation de 15 jours minimum, les animaux recevront une unique administration de l’AAV par voie intraveineuse ou intrathécale selon les recommandations du donneur d’ordre et en accord avec les procédures de l’entreprise. Les volumes administrés aux animaux seront en accord avec les recommandations éthiques en vigueur selon la voie d’administration utilisée (iv bolus : 5mL/kg maximum et IT bolus : 1mL/animal maximum). Les administrations étant des bolus, elles seront de courte durée (< 5 minutes). Les administrations intraveineuses seront réalisées dans la mesure du possible sur animal vigile, les administrations intrathécales seront réalisées sous anesthésie. Suite à chaque administration, des prélèvements (principalement de sang ou LCR) seront effectués afin d’analyser les biomarqueurs liés à l’infection par l’AAV dans le sang. Les recommandations suivantes seront suivis pour la récolte de sang (7,50 % du VSC suivi d’un repos de 7 jours ; 10% du VSC suivi d’un repos de 2 semaines; 15% du VSC suivi d’un repos de 3 semaines; 20% du VSC suivi d’un repos de 4 semaines ou suivi d'une euthanasie dans les 24h). Les prélèvements de sang sont de courte durée (

Impact sur les animaux

Les AAV injectés étant des espèces non pathogènes, il est peu probable d’avoir des effets secondaires. En effet, les possibles transgènes inclus dans ces virus sont soit des séquences "rapporteuses" permettant l'identification ou la localisation du virus, ou bien des gènes codant pour des protéines humaines. En termes de contamination et multiplication, ces virus sont rendus inoffensifs et n'ont pas la possibilité de se reproduire ou de s'intégrer au génome de l'hôte. Mise à part des réactions locales au niveau des sites d'administrations et éventuellement une réaction systémique de type fièvre peuvent apparaître les jours suivants les administrations. De plus, la procédure d'injection elle-même peut potentiellement induire des effets secondaires en cas de mauvaise manipulation. Les sites d'administration et la température corporelle seront donc suivis les jours suivants les administrations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude dans le but de récolter les organes et analyser la biodistribution des AAV dans les différents tissus.

Remplacement

Les études de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapie. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique.

Réduction

Pour chaque procédure réalisée, il sera veillé à utiliser un nombre minimal et suffisant d'animaux pour que les résultats soient interprétables et transposables. Une sérologie sera réalisée sur plus d'animaux que necessaire à l'étude. Au jour de l'infection, seul le nombre d'animaux necessaire à l'étude seront injectés. Au vu du faible nombre d'animaux par groupe, aucun test statistique ne sera réalisé.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d'enrichissement dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. Une attention particulière sera accordée à l’enrichissement du milieu de vie des animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. L'inclusion de paramètres hématologiques et biochimiques pour le suivi clinique, l'inclusion de prélèvement de fluides pour le suivi du viscérotropisme et du neurotropisme permettent un suivi précis du statut de l'animal. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélèvements. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable. Avant tout acte techniques, les animaux bénéficieront d'entrainements avec récompenses, ce qui permettra de réduire leur stress durant les manipulations (notamment en cas d'utilisation de la chaise à contention pour habituer l'animal à être dans cette chaise avant le jour de l'administration). Pour certains actes (LCR, administration intratécal,...), les animaux seront anesthésiés (ex: kétamine / midazolam) et recevront un analagésique (type buprénorphine) afin de palier toute douleur lié à l'acte. Les points limites décrits dans le projet permettront de décider l'euthanasie anticipé d'un animal en cas de souffrance.

Choix des espèces

Le primate non humain est un modèle de choix dans l'évaluation préclinique pour évaluer le tropisme des virus recombinants, car les AAV sont connus pour infecter largement les primates non humains et les humains (la preuve en est qu'une forte proportion des singes est séropositives pour certains types d'AAV). Nous devons utiliser des animaux qui sont évolutivement plus proches de l'homme et donc plus susceptibles de représenter fidèlement la machinerie cellulaire impliquée dans la transduction et d'autres aspects de la biologie du virus/vecteur et de l'hôte. Il est donc légitime de penser que les résultats observés chez le primate non humain seront très utiles pour prédire les mêmes phénomènes physiologiques et comportementaux chez l’Homme. De juvéniles à adultes matures selon les questionnement scientifique de l'étude.

108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur ouvre le crâne pour y déposer un implant en céramique, puis on répète l'imagerie au micro-scanner et on injecte un agent pour visualiser les vaisseaux, avant la mise à mort pour analyse. Le porteur décrit des douleurs post-chirurgicales et un protocole d'analgésie sur trois jours, pour comparer des géométries d'implants destinés à combler des pertes osseuses. Il écarte les modèles in vitro et in silico, jugés incapables de reproduire la complexité de la réparation osseuse et sa vascularisation.

Objectifs

La réparation du squelette après perte de substance osseuse demeure toujours un problème lorsque les défauts sont de grande taille. Si le traitement par autogreffe (prélèvement osseux du patient sur un autre site) reste la référence, il a cependant des inconvénients (quantité disponible, morbidité..). Les céramiques à base de phosphates de calcium (CaP) sont une bonne alternative à l’autogreffe osseuse car elles possèdent une composition chimique similaire à la phase minérale de l’os, les rendant biocompatibles et ostéoconductrices (favorisant la repousse osseuse à la surface du matériau) . Cependant, la faible vascularisation et pénétration des tissus néoformés dans les céramiques poreuses en CaP n’en font une solution satisfaisante que pour des défauts de petite taille. L'augmentation de leur efficacité clinique implique une amélioration de leurs propriétés angio- et ostéo conductrices (favoriser l’invasion vasculaire et la formation osseuse). Ces propriétés peuvent être obtenues en modulant les caractéristiques chimiques et architecturales de la céramique. L’architecture des céramiques (comprenant la forme, la porosité, la taille des pores, leur interconnectivité et la surface interne) conditionne le transport de nutriments, la migration cellulaire et tissulaire et la distribution des contraintes de cisaillement. Les techniques récentes de fabrication additive associées à celles de conceptions assistées par ordinateur permettent dorénavant de produire des implants avec des formes externes personnalisées (épousant parfaitement le défaut osseux) ainsi qu'une macro-architecture interne optimisée et reproductible. Ce présent projet fait suite à un précédent projet récemment terminé qui a consisté à évaluer le potentiel de réparation de défauts osseux au niveau du crâne de rat avec des implants à base de céramiques de phosphates de calcium et 2 géométries différentes. Nos résultats, obtenus sur des défauts de taille non critique (5 mm de diamètre) ont montré que les paramètres porosité / taille des pores étaient critiques par rapport à la surface interne. Ce projet a pour objectif de valider ces premiers résultats sur un défaut de taille critique (8 mm de diamètre) et de mieux discriminer l’impact des paramètres (i) porosité, (ii) taille de pores et (iii) surface interne sur la cinétique de l’invasion osseuse. Par ailleurs, nous évaluerons la relation entre formation osseuse, vascularisation et impact de la géométrie des implants.

Bénéfices attendus

De nombreux travaux issus de la littérature ont tenté de déterminer l’impact de certains paramètres géométriques d’implants substitut osseux sur l’invasion osseuse, mais la plupart des études ne tiennent compte que d’un seul paramètre (généralement la taille des pores) ; cette étude permettra de discriminer l’impact de la porosité globale, de la taille des pores et de la surface interne sur l’invasion osseuse et l’invasion vasculaire. Le bénéfice attendu à plus long terme est l’optimisation de la fabrication des implants en biocéramique pour le comblement de grands défauts osseux en remplacement de l’autogreffe.

Procédures

1-Craniotomies latérales et dépôt d’un implant ( 1X ; durée ~40 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (Max 7X; durée 15 min) 3- Injection de fluorochromes (2X, durée 5 min) 4- Infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

Nuisances attendues causées durant les actes expérimentaux : stress dû à la contention puis lors de la perte de connaissance par le gaz anesthésiant; Injection en sous cutané ; Injection en intrapéritonéal (sous anesthésié gazeuse) ; Chirurgie au niveau du crâne (sous analgésie et anesthésie) ; thoratocomie. Nuisances attendues engendrés suite aux expérimentations : douleurs post-chirurgie

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet permettant des analyses post-mortem (analyse au scanner à haute résolution de la formation osseuse et du réseau vasculaire pénétré dans le matériau macroporeux + histologie des cranes réparés)

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire ; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (cellules osseuses / cellules immunitaires par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Le suivi de la formation osseuse seront réalisées sur les mêmes animaux par imagerie in vivo. Le suivi de la vascularisation aux temps précoces ne se fera qu’à 2 et 4 semaines et que sur 2 groupes (1 seule géométrie et défaut vide). Ces études nécessiteront 10 animaux par groupe compte tenu des variations de résultats pouvant être observées dans les études in vivo, de cassures de l’implant, et de l’étape de perfusion vasculaire qui, parfois faillit en ne remplissant pas parfaitement le réseau vasculaire, notamment les capillaires. Pour les analyses statistiques, nous effectuerons les tests adéquats après test de normalité.

Raffinement

Les rats initialement hébergés ensemble (3 rats/cage) le resteront du début à la fin du protocole et bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. Un analgésique leur sera administré avant chaque intervention chirurgicale laquelle sera faite sous anesthésie générale. Des injections bi quotidiennes d’analgésique en sous cutanée seront aussi pratiquées pendant les 3 jours post opératoires. Pour chaque analyse en imagerie, les rats seront anesthésiés par voie gazeuse. L’acte terminal nécessitera des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem.

Choix des espèces

Le modèle choisi est le rat male WISTAR (non-syngénique). Le rat est un bon compromis entre la souris (trop petite pour obtenir un défaut de taille suffisante pour l’évaluation d’implants massifs) et le lapin (couteux et trop gros pour permettre un suivi en imagerie micro-scanner in vivo). De plus, le modèle de défaut au niveau de la calvaria est bien décrit dans la littérature et autorise la réalisation de défauts reproductibles et contrôlés. Jeunes adultes (3 mois) car de taille suffisamment importante pour permettre l’implantation en site osseux et leur phase de croissance est terminée.

99 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous la peau et dans le derme de composés myorelaxants candidats, puis sont mis à mort pour l'analyse histologique des sites d'injection. Le porteur qualifie ces injections de "brèves, indolores et peu stressantes" alors qu'il déclare par ailleurs une douleur liée à l'injection et une gêne en cas d'inflammation. Il justifie l'usage du rat par la continuité avec ses études de toxicité antérieures et écarte les modèles cellulaires, jugés inadaptés à son développement.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de déterminer la bonne tolérance de nos composés après injections sous-cutanées ou intradermiques. Dans cette étude, le produit sera injecté localement aux rats, sous la peau (injection sous-cutanée) et dans les couches supérieures du derme (injection intradermique). L'observation est brève, indolore, et peu stressante pour les animaux. Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (molécule la plus active et la plus intéréssante) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes :

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection s.c. / i.d. = 6 injections, durée 1 min / animal. - Pesée des animaux = maximum 5 pesée / animal => 30 secondes / pesée => 2.5 minutes / animal. - Observation des réactions = 1 fois / jour => 30 sec / animal.

Impact sur les animaux

Ces molécules ont déjà été injectées en intramusculaire, sans avoir provoqué le moindre signe clinique (macroscopique ou en analyse histopathologique). Nous n’attendons ainsi pas de signe clinique particulier après injection des molécules ; toutefois, afin de se prémunir de tout imprévu, nous suivrons avec attention tout signe, et avons mis en œuvre les mesures décrites dans le tableau fourni en annexe. De plus, dans cadre de nos procédures, les nuisances attendues sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection ; une douleur liée à l’injection sous-cutanée ou intradermique ; une gêne si inflammation des tissus.

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés car les sites d’injections seront prélevés pour des analyses histopathologiques.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Des modèles in vitro d'irritation locales existent bien mais ne sont pas adaptés dans notre developpement, en effet, la production d'anticorps anti-drug necessite et impliquent le système immunitaire de complet de l’hôte, ainsi aucun modèle in vitro ne peut remplacer ce système.

Réduction

Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis). Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 3 animaux / doses / type d’injection. De plus, les 2 flancs des animaux étant utilisés , ceci nous permet de réduire le nombre d’animaux en maximisant le nombre de site/composé (n=6/dose)

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les injections intradermiques et sous cutanée dans la peau du flanc, sont réalisés sous contention par un expérimentateur entraîné, et les observations sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux.

Choix des espèces

Nos études précédentes (preuve de l’efficacité de nos molécules et étude de toxicité GLP) ont été réalisées chez le rat. Ainsi, par continuité avec ces études, notamment sur les analyses histologiques, il nous semble important de continuer sur ce modèle. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis par continuité avec nos études précédentes fonctionnel et notre étude GLP de toxicité

108 souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique, puis plusieurs prélèvements sanguins sous anesthésie jusqu'à un prélèvement terminal à huit semaines, pour comparer quinze constructions et sélectionner les plus efficaces. Le porteur affirme que l'injection de ces vecteurs est bien tolérée chez le rongeur et ne provoque aucun effet indésirable. Il présente cette étude pilote comme un moyen de réduire le nombre d'animaux d'une seconde étude à venir, affirme qu'aucune méthode ne remplace l'essai in vivo, et euthanasie toutes les souris pour prélever leurs tissus.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD qui code pour une protéine appelée Dystrophine. La Dystrophine est essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité de l'ensemble des muscles de l'organisme (y compris le coeur). L’absence de Dystrophine dans les muscles provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. Aucun traitement n’est disponible à ce jour pour la DMD. La thérapie génique, qui vise à corriger ou remplacer le gène DMD est aujourd’hui une approche prometteuse pour le traitement de cette maladie. Pour réaliser un transfert de gène efficace, il est possible d'utiliser des vecteurs viraux dérivés des Virus Adéno-Associés (AAV). Ils assurent un transfert de gène thérapeutique sûr et efficace dans différents tissus/organes, notamment le muscle et le cœur. Le gène de la dystrophine étant trop grand pour être inséré dans un vecteur AAV, des transgènes miniaturisés de la Dystrophine ont été générés. Ils permettent une récupération partielle de la fonction musculaire dans les modèles animaux de la DMD. Cependant, un rejet immunitaire contre ces produits thérapeutiques est parfois observé, avec une perte de l’effet thérapeutique. L’objectif du présent projet est d’évaluer de nouveaux produits de thérapie génique, qui pourraient permettre de combler le déficit en Dystrophine, tout en évitant ce rejet immunitaire. Ces nouveaux produits pouvant être plus ou moins stables ou plus ou moins fonctionnels dans les cellules musculaires, nous en testerons plusieurs, afin d'évaluer leur efficacité après injection intraveineuse chez la souris mdx, modèle murin de la DMD.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus dans cette étude pilote nous permettront de sélectionner les nouveaux produits de thérapie génique les plus efficaces (en termes d’efficacité du transfert de gène dans différents muscles, de niveau d'expression du produit thérapeutique, et de l’efficacité à corriger la pathologie musculaire des souris mdx au niveau histologique), afin d'ensuite évaluer la ou les meilleures (entre 1 et 3 maximum) pour leur efficacité thérapeutique et leur immunogénicité dans un autre modèle animal de la DMD, présentant un phénotype DMD marqué, et cela avec un nombre d'animaux plus important par groupe expérimental afin d'assurer la robustesse de ces évaluations phénotypiques. Cette seconde étude fera l'objet d'une autre demande d’autorisation de projet. A long terme, les bénéfices attendus de ce projet pilote sont de développer un candidat présentant un fort potentiel thérapeutique pour le traitement de la DMD par thérapie génique AAV. En cas de succès, le produit sera évalué dans une étude de toxicologie réglementaire, afin de pouvoir ensuite prétendre à réaliser un essai clinique chez des patients DMD.

Procédures

(i) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal sous contention, sans anesthésie, mais sous analgésie afin de limiter le stress de l'animal. Durée de l'intervention: maximum 5 min. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine mandibulaire le jour de l'injection, puis à 2 semaines et 4 semaines post-injection (3 prélèvements par animal). Prélèvements effectués sous anesthésie, pour un volume correspondant à 10% maximum du volume sanguin circulant de l'animal. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave, à 8 semaines post-injection. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

(i) Injection intraveineuse: l'injection intraveineuse réalisée dans la veine caudale se fera sous contention et pourra provoquer un stress léger le temps de l'injection (maximum 5 min), et une petite douleur au niveau du site de ponction. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur AAV chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine mandibulaire: les animaux pourraient être stressés par les anesthésies, mais celles-ci seront donc espacées d'au moins 2 semaines, et les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour l’animal, puisque cet examen sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier et sur le long terme (plusieurs semaines après injection). L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs) et sur un tissu pathologique dans toute sa complexité (différents types de lésions). Ce projet, qui vise à évaluer le niveau d'expression et l'efficacité de nouveaux produits thérapeutiques pour notamment réduire les lésions musculaires liées à la pathologie DMD, ne peut donc être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie génique lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses de tolérabilité et d'expression qui seront réalisées ici. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. D'autre part, par l'identification des constructions les plus efficaces, cette étude pilote permettra de réduire le nombre total d'animaux qui seront à inclure dans l'étude qui suivra et qui visera à évaluer l'efficacité thérapeutique des meilleurs de ces nouveaux produits de thérapie génique dans un autre modèle animal de la DMD, présentant un phénotype plus marqué. En effet, tester d'emblée l'efficacité thérapeutique de l'ensemble des 15 constructions différentes dans cet autre modèle animal aurait demandé l'inclusion d'un nombre très important d'animaux, supérieur au nombre qui sera inclus au total via ces 2 études.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (cages équipées de mezzanine et mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

L'objectif de cette étude requiert l'utilisation d'un modèle animal de la DMD, dans lequel l'expression de Dystrophine est absente, et cela afin de pouvoir évaluer l'efficacité de nouveaux produits de thérapie génique. Il existe 3 modèles animaux majeurs de la DMD: la souris mdx, le rat DMD et le chien GRMD. La souris mdx présente des lésions musculaires typiques de la DMD, mais assez peu de symptômes de la maladie. Cette dernière limitation n'aura pas d'impact sur les objectifs de cette étude, puisqu'aucune évaluation phénotypique ne sera réalisée dans cette étude pilote. L'intérêt du modèle de la souris mdx pour cette étude repose par contre sur la facile disponibilité des animaux, ainsi que sur leur petite taille, réduisant les quantités de vecteurs nécessaires pour les injections (les vecteurs étant injectés en dose/kg d'animal). Les animaux seront injectés à l'âge adulte, entre 10 et 12 semaines d'âge. Avant l'âge de 8 à 10 semaines, la souris mdx présente des phénomènes de régénération musculaire qui peuvent avoir un impact négatif sur l'efficacité du transfert de gène à l'aide vecteurs viraux AAV. Les souris devront donc être âgées à minimum de cet âge. L'évolution de la pathologie chez les souris mdx étant ensuite lente, nous nous donnons une fourchette de 3 semaines d'âge de différence pour les animaux à inclure (mini 10 semaines, maxi 12 semaines), afin de simplifier la gestion de l'inclusion des animaux dans l'étude, qui sera adaptée selon la disponibilité des animaux chez l'éleveur, sans que cela n'ait d'impact sur les résultats de l'étude.

20 chiennes porteuses de la myopathie de Duchenne vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, quinze tuées pour prélever leurs tissus dont le cœur et cinq adoptées. Chaque animal subit des prélèvements de sang et d'urine, des biopsies musculaires sous anesthésie et des IRM de deux heures trente sous anesthésie, sur six mois de suivi. Le porteur souligne que ces chiennes ne présentent pas d'atteinte clinique évidente et que le principal risque est une mort subite par trouble du rythme cardiaque. Il décrit le chien GRMD comme un "modèle unique" reproduisant fidèlement la maladie humaine.

Objectifs

La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X, qui touche le muscle chez les jeunes garçons, les contraignant à l'usage du fauteuil roulant vers l'âge de 10 ans, et entraînant un décès précoce d'insuffisance respiratoire ou cardiaque vers l'âge de 30 ans. Les mères et sœurs de ces garçons, porteuses de l'anomalie génétique, ont longtemps été considérées comme "porteuses saines" de la maladie. Cependant, de plus en plus d'études montrent que ces femmes peuvent présenter des atteintes musculaires squelettiques et cardiaques, à des degrés variables. Un suivi cardiologique leur est désormais proposé. La question se pose chez certaines de ces patientes de l’intérêt de mettre en place un traitement médicamenteux tel que des stéroïdes. Il n’est pas clairement établi si les anomalies cliniques de ces femmes sont évolutives ou non. Parmi les modèles animaux de DMD, le chien GRMD (golden retriever muscular dystrophy) occupe une place pré-clinique immédiate dans le développement de thérapies car il reproduit de manière fidèle la maladie humaine, dans un organisme de grande taille, pouvant être suivi sur le long terme. Une étude récente sur des chiennes porteuses de l’anomalie génétique à l’origine de la GRMD, adultes, ne présentant pas de signe clinique évident, a permis d’identifier une fibrose myocardique et des arythmies ventriculaires chez tous les animaux. Ces anomalies suggèrent que ces animaux montrent, comme les femmes porteuses de DMD, une symptomatologie cardiaque et pourraient être inclus dans des études pré-cliniques permettant de répondre aux nombreuses questions posées pour ces patientes. Ce projet a le double objectif de caractériser plus avant le phénotype à la fois musculaire strié squelettique et cardiaque de ces chiennes porteuses de GRMD, à un stade de fibrose myocardique déjà installée (chiennes adultes) et de déterminer si ce phénotype est évolutif et si oui dans quelle mesure. Dans ce but, des chiennes porteuses et non porteuses (témoins) seront suivies durant six mois à l’aide de différentes méthodes d’évaluation non-invasives. Des biopsies musculaires seront également prélevées. Cette étude permettra, par le biais d’une caractérisation approfondie, d’apporter une réponse à la question de l’évolutivité du phénotype chez les porteuses, et de poser les jalons de possibles études thérapeutiques pré-cliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une connaissance plus approfondie de ce modèle unique pour les femmes porteuses de myopathie de Duchenne, pré-requis à l'inclusion de ces animaux dans des études thérapeutiques. Les données obtenues au cours de ce projet pourront être utilisées comme données de référence pour comparer les données obtenues chez des chiennes après un traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents tests d'évaluation fontionnelle non invasifs. Ces tests seront soit réalisés vigiles, après une période d'habituation s'ils nécessitent la coopération du chien, soit sous anesthésie générale s'ils nécessitent une parfaite immobilité du chien ou s'ils peuvent engendrer un stress. Sept prélèvements sanguins (durée=moins de 5 minutes) seront réalisés au cours des six mois de suivi (un prélèvement par mois), et deux prélèvements d'urine (durée = 1 minute, au début et à la fin du suivi). Des biopsies musculaires de deux muscles de la cuisse seront prélevées au début du projet, par voie chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie (durée = 30 minutes). Les examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et dureront 2h30 environ. D'autres examens non invasifs ne requérant pas d'anesthésie générale (non stressants et non invasifs) seront mis en oeuvre pour explorer les fonctions motrice (durée 10 minutes), respiratoire (durée 10 minutes) et cardiaque (électrocardiogramme enregistré sur une nuit).

Impact sur les animaux

Les chiennes porteuses de myopathie de Duchenne ne présentent pas d'atteinte clinique évidente de prime abord, ni d'altération de leur qualité de vie (pas de "handicap" visible). Les anomalies identifiées au cours d'une précédente étude, certes importantes et généralisées à l'ensemble des individus évalués, l'ont été par le biais de méthodes d'investigation plus poussées qu'un examen clinique vétérinaire standard. Le principal risque identifié pour ces animaux suite à cette première caractérisation est celui d'une mort subite en raison de leurs troubles du rythme cardiaque. Néanmoins ces événements ne sont pas classiquement rapportés chez ce type d'animaux jusque là considérés comme porteurs sains. Il n'est a priori pas attendu de nuisances majeures liées au projet sur les animaux, hormis celles liées au stress généré par les procédures mises en oeuvre (anesthésies générales, enregistrements et prélèvements sur animaux vigiles). Nous veillerons particulièrement à établir des conditions permettant de minimiser ce stress. Pour les tests le nécessitant, une habituation préalable et progressive sera prévue. Les animaux seront manipulés avec douceur par des personnes de leur entourage quotidien, et seront récompensés par la voix, des caresses et une friandise lorsque ce sera possible. Des complications post-opératoires des biopsies musculaires effectuées par voie chirurgicale ne peuvent être totalement écartées. Cependant cela est très improbable, et prévenu par le fait que les muscles prélevés sont des muscles superficiels qui ne nécessitent qu'une voie d'abord peu invasive, et que les prélèvements sont effectués dans des conditions d'asepsie conformes aux bonnes pratiques chirugicales. Si malgré les mesures de raffinement mises en oeuvre une complication post-opératoire se présentait (infection, déhiscence des sutures, hématome), les soins vétérinaires appropriés, incluant une gestion de la douleur, seraient mis en place.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par nécessité de prélever des tissus, notamment le coeur.

Remplacement

Les questions posées dans le cadre de ce projet (caractérisation et évolutivité avec l'âge d'un phénotype impliquant les fonctions locomotrice, respiratoire, cardiaque et leurs intéractions) ne peuvent être élucidées qu'in vivo. Par ailleurs, une pathologie cardiaque liée au statut de porteuse de dystrophinopathie n'a à ce jour été identifiée que dans l'espèce canine.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus dans ce projet a été déterminé afin de pouvoir objectiver, si elle existe, une augmentation de 35 % (équivalente à celle d'un chien atteint par la myopathie de Duchenne) d'un marqueur sanguin de stress cardiaque sur les 6 mois de suivi. Les données recueillies au cours de ce projet permettront une évaluation précise du nombre d'animaux à inclure dans de futures études thérapeutiques sur ce modèle, et elles pourront également servir de données de référence pour comparer des données acquises sur des chiens en essai thérapeutique.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, nous aurons recours essentiellement à des méthodes d'évaluation non invasives. Néanmoins, il sera nécessaire de prélever des biopsies musculaires, cela sera réalisé sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. Dès qu'un examen, même non invasif, sera susceptible d'entraîner un stress, ou de requérir une immobilité prolongée, il sera pratiqué sous anesthésie générale. Les examens ou prélèvements réalisés sur chiens vigiles le seront avec douceur, en prévoyant des phases d'habituation si nécessaire et un renforcement positif systématique (voix, caresse, friandises). Des points limites adaptés ont été définis, portant principalement sur les risques liés à l'atteinte cardiaque de ces animaux, mais également sur de possibles, bien que peu probables, complications post-opératoires liées au prélèvement de biopsies musculaires. Sur le plan de l'hébergement, les chiens sont hébergés en petits groupes sociaux compatibles, sur litière, et ont à leur disposition des plateformes, lieux de couchage et jouets. Ils bénéficient de sorties quotidiennes 7j/7 en groupes plus larges et d'interactions quotidiennes avec l'Homme.

Choix des espèces

Actuellement, hormis chez le chien, il n'existe pas de modèle animal pertinent, décrit et utilisable pour les femmes porteuses de myopathie de Duchenne. Ce projet fait suite à une étude précédente menée chez les chiennes porteuses de GRMD, montrant qu'une atteinte cardiaque est présente chez des animaux adultes, et a pour objectif de déterminer si cette atteinte évolue au cours du temps une fois installée. Le chien est le modèle animal qui reproduit le mieux les caractéristiques cliniques et histologiques de la myopathie de Duchenne. Il peut donc être projeté que répondre à la question de l'évolutivité du phénotype chez ces chiennes porteuses permettra une transposition assez robuste des résultats obtenus aux patientes. Pour toutes ces raisons, cette étude sera menée dans l'espèce canine. Les chiennes seront des adultes de plus de 5 ans, afin de disposer d'animaux ayant déjà une atteinte cardiaque installée, et de pouvoir en déterminer la progressivité.