Troubles musculosquelettiques

Deux à quatre injections dans les muscles des pattes arrière, pratiquées sur des rats dont les muscles sont déjà lésés par une dystrophie de Duchenne, avec un antalgique renouvelable toutes les douze heures pendant deux à trois jours. 52 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour analyses génétiques, histologiques et moléculaires. Le porteur écrit pourtant qu'"aucun effet indésirable significatif n'est attendu" et que la méthode n'a montré ni toxicité ni effet secondaire. Le bénéfice visé, renforcer assez la force des bras et des doigts pour manipuler un fauteuil roulant, reste un objectif de long terme conditionné à la confirmation des résultats précliniques.

Objectifs

Les dystrophies musculaires constituent un groupe de maladies génétiques rares et graves pouvant affecter différents tissus, principalement le muscle squelettique. L’une des formes les plus sévères, la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), est causée par des anomalies du gène codant la dystrophine, une protéine essentielle au bon fonctionnement des fibres musculaires. En l’absence de cette protéine, les muscles s’affaiblissent progressivement, entraînant d’abord une perte de la capacité à marcher, puis des complications respiratoires et cardiaques. À ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible, bien que plusieurs pistes thérapeutiques soient activement explorées. Certaines approches visent la réparation ciblée des mutations génétiques, afin de corriger le gène défectueux. Dans ce contexte, le système CRISPR-Cas9, souvent appelé « ciseaux moléculaires », offre une capacité puissante pour modifier l’ADN de manière précise, en supprimant ou insérant des fragments de séquence afin de corriger les mutations responsables. L’une des principales difficultés demeure la délivrance efficace et sûre de cet outil dans les cellules musculaires. Ce projet propose d’évaluer une méthode innovante d’administration du CRISPR-Cas9, reposant sur l’introduction directe et transitoire de la protéine Cas9 – ainsi que d’autres composants d’édition génétique – dans les cellules musculaires, de façon non toxique et sécurisée. L’objectif est de tester l’efficacité de cette approche chez un modèle animal présentant des symptômes et caractéristiques similaires à ceux des patients, afin de déterminer si cette méthode permet de restaurer la production de dystrophine à différents stades de la maladie. Le protocole inclura également l’évaluation de l’impact des administrations successives (deux injections) en comparaison avec une administration unique. Bien que ce type de thérapie ne constitue pas une guérison définitive, il peut être envisagé comme une option complémentaire aux traitements existants. L’objectif à long terme est de développer cette approche comme une thérapie permettant, par exemple, de renforcer la force des bras pour manipuler les fauteuils roulants, ou celle des doigts pour saisir des objets et utiliser les commandes des fauteuils, améliorant ainsi l’autonomie quotidienne et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l’efficacité et la sécurité d’une méthode innovante d’administration des outils d’édition génique directement dans les cellules musculaires, dans un modèle de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’objectif principal est de démontrer que cette approche, appliquée à des muscles spécifiques, permet de restaurer la production de dystrophine et d’induire une amélioration de la force musculaire, contribuant ainsi à renforcer la fonction motrice. Un avantage majeur de cette méthode, selon les données préliminaires, est qu’elle n’active pas le système immunitaire, ce qui permet des administrations répétées pour renforcer l’effet thérapeutique sur un même muscle ou pour traiter différents muscles. De plus, la stratégie sera testée à différents stades de la maladie (précoce et avancé), afin d’évaluer son efficacité tout au long de l’évolution de la dystrophie. Cela ouvre la possibilité d’une application chez des patients d’âges variés, y compris ceux présentant une forme avancée de la maladie. En ciblant des muscles spécifiques plutôt qu’en diffusant le traitement de manière systémique, cette approche se positionne comme un traitement complémentaire, visant à améliorer l’autonomie et la qualité de vie des patients. À long terme, si les résultats précliniques se confirment, cette stratégie pourrait ouvrir la voie à des essais cliniques chez l’humain, avec l’objectif d’aider les patients à renforcer la force des bras pour manipuler les fauteuils roulants, ou celle des doigts pour saisir des objets et utiliser les commandes, facilitant ainsi les activités quotidiennes et l’indépendance. Ainsi, ce projet pourrait poser les bases d’une thérapie innovante et sûre, capable d’améliorer durablement la qualité de vie des patients et de leurs familles.

Procédures

Dans ce projet, le traitement sera administré par injection dans un muscle de chacune des pattes arrière, soit deux injections par animal, ou quatre dans le cas de doses répétées. Toutes les injections seront réalisées sur des animaux préalablement traités avec un médicament contre la douleur. Ce traitement pourra être répété toutes les 12 heures pendant deux à trois jours, uniquement si des signes de douleur sont observés. À la fin de la procédure, un prélèvement sanguin sera effectué sur des animaux complètement endormis (anesthésiés au moyen d’une injection). Ce prélèvement sera réalisé une seule fois pour chaque animal. Chaque injection sera effectuée en moins d’une minute, et le prélèvement sanguin en moins de trois minutes. Au total : - 36 animaux, chacun recevant 2 à 7 injections d’un médicament contre la douleur et 2 injections du traitement, une dans chaque patte. - 16 animaux, avec 3 à 13 injections d’un médicament contre la douleur et 4 injections avec le traitement, deux dans chaque patte.

Impact sur les animaux

Des études antérieures utilisant cette méthode ont montré l’absence d’effets toxiques ou secondaires liés à l’administration du traitement. Par conséquent, aucun effet indésirable significatif n’est attendu chez les animaux dans le cadre de ce projet. L’administration dans le muscle peut toutefois provoquer une légère gêne ou douleur, en particulier chez des animaux présentant déjà des lésions musculaires. Deux types des interventions seront réalisées : 1. L’administration d’un médicament anti-douleur, qui ne devrait pas entraîner de gêne notable. 2. L’administration du traitement dans un muscle de chaque patte arrière. Ces interventions peuvent provoquer une douleur locale transitoire. Ils seront effectués chez des animaux âgés de 4, 12 et 16 semaines, à un stade où les muscles sont peu (4 semaines) ou modérément (12 et 16 semaines) affectés, avec un impact très limité ou plus marqué respectivement, selon l’âge. Les animaux seront suivis jusqu’à un âge compris entre 3 et 6 mois, avant l’apparition des symptômes les plus graves de la maladie (vers 9 mois), afin de limiter autant que possible leur souffrance liée à l’évolution naturelle de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les échantillons nécessaires aux analyses génétiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

La dystrophie musculaire de Duchenne touche plusieurs organes interconnectés (muscle, cœur, cerveau, tube digestif), mais le muscle squelettique est l’un des plus affectés. La méthode thérapeutique proposée est une approche innovante d’administration des outils d’édition génique dans les cellules musculaires, permettant de corriger de manière précise le gène défectueux responsable de cette maladie. Aucun produit n'est testé chez nos animaux sans qu’un mécanisme et un effet biologique robustes aient été préalablement établis. Avant les essais précliniques sur les animaux issus de nos lignées modèles, l’efficacité et la sécurité de cette thérapie ont été testées sur des cultures de cellules musculaires (in vitro), avec des résultats très encourageants : la méthode montre une forte efficacité pour modifier le gène défectueux, sans altérer la santé ni le fonctionnement normal des cellules. De plus, afin d’évaluer l’efficacité et la toxicité dans un organisme entier, cette stratégie a été testée in vivo sur un modèle animal de plus petite taille, confirmant que la méthode permet d’introduire efficacement les outils de réparation dans les fibres musculaires, sans toxicité, sans effets secondaires visibles et sans déclencher de réponse immunitaire chez les animaux traités. Le présent projet cherche à valider cette stratégie (en termes d’efficacité et d’innocuité) chez un organisme mammifère sévèrement atteint par la maladie, plus proche de la réalité humaine, et présentant des signes cliniques similaires à ceux observés chez les patients (perte musculaire, faiblesse et évolution progressive de la maladie), y compris dans la complexité de la réponse de l’organisme à l’administration du traitement.

Réduction

Lors des essais précliniques, le traitement de moins de 10 individus permet généralement d’obtenir des données suffisantes pour confirmer ou infirmer un effet majeur d’un candidat médicament sur l’évolution de la maladie. Des analyses statistiques ont été réalisées, permettant de réduire le nombre moyen d’animaux nécessaires pour répondre aux questions biologiques posées lors des expérimentations. Pour les objectifs de ce projet, nous avons mis en place des procédures pilotes et en cascade, permettant de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire selon la progression du projet. Le nombre d’animaux témoins pour les procédures pilotes a été réduit au minimum, tout en permettant que leurs données soient analysées et intégrées dans notre banque d’échantillons.

Raffinement

Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à des manipulations douces et régulières. Ils sont hébergés par groupes de deux ou plus, dans un environnement enrichi afin de prévenir l’ennui et le stress. Pour anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage, yeux), leur comportement (mobilité) et leur état général (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont mises en place : surveillance renforcée biquotidienne et administration de médicaments visant à atténuer ou supprimer la douleur. Dans le but de prévenir toute souffrance animale, des points limites ont été établis et feront l’objet d’un suivi rigoureux, avec application immédiate de procédures préétablies. Par ailleurs, pour réduire au maximum le stress lié aux manipulations ou aux tests, les animaux sont préhabitués et familiarisés avec l’expérimentateur 2 à 3 jours avant le début des procédures, afin d’éviter toute réaction de peur ou de stress lors des manipulations scientifiques.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère appartenant à la même classe que l’être humain. Cette proximité évolutive en fait un modèle particulièrement apprécié pour la recherche biomédicale. Il partage de nombreux aspects anatomiques et physiologiques avec l’homme, notamment la constitution et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Grâce aux outils génétiques récents, le rat est devenu un modèle de choix pour l’étude des troubles musculaires. Les modèles de rat reproduisent de manière très fidèle ce type de maladies humaines, tout en conservant les avantages des rongeurs : courte durée de gestation, taille raisonnable et longévité compatible avec l’évaluation à long terme des médicaments sur des individus âgés. Le rat constitue ainsi un excellent complément aux autres modèles animaux, permettant de mieux comprendre la physiopathologie et d’évaluer l’efficacité et la sécurité de nouvelles thérapies. Les animaux seront âgés de 1 et 3 mois au moment de la procédure, correspondant aux stades précoce et avancé de la maladie. Ces stades permettent d’explorer les muscles et d’évaluer l’effet de la thérapie à la fois fonctionnellement et morphologiquement, en tenant compte des différents degrés de progression pathologique.

Jusqu'à six injections par animal, des tests de suspension et d'agrippement répétés treize fois sur quatre mois, puis une chirurgie de vingt minutes sans réveil pour mesurer la contractilité du muscle : 1 008 souris porteuses d'une mutation myopathique vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses moléculaires et histologiques des muscles injectés. Le projet vise à optimiser une thérapie génique que l'équipe dit avoir déjà validée dans le muscle, l'administration par voie sanguine ayant échoué lors des essais antérieurs. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de poursuivre dans ce modèle et que seule l'injection dans le sang permettra de vérifier l'effet à l'échelle d'un "organisme entier". La lignée fait l'objet d'une autorisation d'élevage pour phénotype dommageable, alors que le même document décrit des souris au comportement locomoteur, au poids, à la longévité et à la fertilité comparables à ceux des souris non modifiées.

Objectifs

Nous développons des approches thérapeutiques pour une maladie génétique rare du muscle, causée par des mutations dans un gène codant une protéine impliquée l’entrée et le transport de vésicules à l’intérieur de la cellule. Nous avons démontré que l'injection dans le muscle d’un virus thérapeutique exprimant une molécule ciblant la forme mutée de la protéine permet de restaurer la structure et la fonction du muscle dans un modèle murin de la maladie, lorsqu’elle est administrée à l’âge d’un mois. Cependant, le traitement est moins efficace chez les souris plus âgées qui présentent une atteinte musculaire plus prononcée. Par ailleurs, les essais d’administration systémique visant à traiter l’ensemble des muscles via la circulation sanguine se sont révélés inefficaces, même chez les souris âgées d’un mois. L’expression de la molécule thérapeutique dans la cellule par l’intermédiaire d’un vecteur viral est dépendante de son entrée dans la cellule et de son transport jusqu’au noyau. Nos travaux antérieurs ont montré que le vecteur est moins bien acheminé chez les souris malades et que ce phénomène s’empire avec la progression de la maladie. Ainsi la pathologie elle-même, semble compromettre l’efficacité de l’administration du traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer des stratégies thérapeutiques alternatives permettant d’acheminer efficacement la molécule de thérapie génique, notamment à travers l’utilisation de différentes combinaisons de vecteurs viraux ou non viraux.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une maladie neuromusculaire rare et invalidante (prévalence estimée inférieure à 1 pour 100 000 naissances), pour laquelle aucun traitement curatif n’est actuellement disponible. La faiblesse musculaire progressive entraîne une perte d’autonomie, altérant significativement la qualité de vie des patients et nécessitant une prise en charge pluridisciplinaire. La réussite de ce projet représentera une avancée cruciale dans l’évaluation préclinique de notre molécule et permettra d’envisager le développement de traitements qui, à ce jour, n’existent pas pour les patients atteints de cette maladie. Par ailleurs, ce travail enrichira notre compréhension des différentes voies d’administration (virale et non virale) de thérapies géniques dans un contexte où la transduction virale est altérée. Les stratégies optimisées et les données générées pourront être extrapolées à d’autres pathologies caractérisées par des défauts similaires de délivrance du vecteur, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques

Procédures

Toutes les souris participant à cette étude recevront une thérapie via différentes voies d’injections (entre 1 à 6 injections maximum par souris selon le protocole suivi) réparties sur plusieurs semaines. Suivant la voie, les animaux seront vigiles ou anesthésiés. L’acte technique dure 2 minutes maximum et sera répété 6 fois maximum. Afin d’évaluer la force musculaire des animaux et donc l’efficacité des thérapies testées, certains animaux suivront des tests de force non invasifs (capacité à s’agripper ou à se suspendre). Les animaux seront vigiles lors de ces tests, chaque test pourra durer 5 minutes maximum et ils seront répétés 13 fois maximum sur 4 mois. Tous les animaux auront une chirurgie en phase terminale sans réveil afin de tester la contractilité musculaire. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie et durera 20 minutes. Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La lignée de souris présente un phénotype dommageable. Les souris hétérozygotes développent progressivement une atrophie et une faiblesse musculaire (mais sur certain muscle uniquement et après mesure spécifique de la force). Elles n’ont pas d’autre signe clinique, et présentent un comportement locomoteur, un poids, une longévité et une fertilité comparables à ceux des souris non génétiquement altérées. Les manipulations nécessaires aux différentes procédures peuvent provoquer un léger stress chez l’animal. Les différentes injections dureront quelques minutes et sont susceptibles d’occasionner une douleur au moment de l’injection et, secondairement, un saignement et/ou hématome, une inflammation locale et rarement une infection. Les administrations répétées comportent un faible risque de péritonite. L’anesthésie gazeuse utilisée peut entraîner une perturbation de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardio respiratoire. Les tests comportementaux de 5 minutes maximum pourront engendrer de la fatigue musculaire. Enfin, une chirurgie sans réveil sera effectuée sur certains animaux, l'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

L’efficacité et l’absence de toxicité de notre approche thérapeutique ont été démontrées au préalable sur des cellules de patients en culture. La validité du modèle de souris de la maladie est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons préalablement démontré l’efficacité et l’innocuité de l’approche dans le muscle de souris du modèle en utilisant un vecteur de type virus thérapeutique. Le but de ce projet est l’optimisation de cette thérapie dans le modèle de souris en testant différent véhicule pour délivrer le médicament dans tout l’organisme. Il est indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude dans ce modèle. Seule l’administration du traitement dans le système sanguin permettra de vérifier son efficacité et sa potentielle toxicité à l’échelle d’un organisme entier.

Réduction

Le nombre maximal théorique de souris impliquées si toutes les procédures sont réalisées est de 1008. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et nos études précédentes afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. La réalisation des procédures et des étapes à l’intérieur des procédures seront réalisées de manière successive et adaptative, dans un ordre permettant de limiter le nombre d’animaux en fonction des résultats positifs ou négatifs. Les organes et tissus de souris issus de ce projet seront conservés en banque pour d’autres projets de l’équipe, évitant ainsi de nouveau prélèvements. Grâce à ces mesures de réduction, nous limitons au strict nécessaire le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant la validité statistique et scientifique de chaque protocole.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Un enrichissement de leur environnement est mis place avec au moins 2 éléments aux choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’entretien des animaux ainsi que les expériences seront réalisés par un personnel titulaire des autorisations et formations nécessaires. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse pour éviter toute douleur ou gêne, elles durent moins d’une minute par souris. Une analgésie sera pratiquée avant certaines injections pour éviter toute gêne. L’anesthésie gazeuse est réalisée en maintenant la thermorégulation en utilisant un tapis chauffant. Les jours suivants les injections une surveillance renforcée des souris sera exercée par l’animalier en charge de la lignée ou les personnes en charge des protocoles. Les mesures de forces sont non invasives et seront réalisés entre 1 et 13 fois maximum par souris afin de limiter un stress répété. Les mesures de forces en fin de projet seront réalisées sous anesthésie et analgésie et sans réveil. Les animaux ne développent habituellement pas de phénotype conduisant à une diminution de leur locomotion mais le cas échéant, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. La lignée fait l’objet d’une autorisation d’élevage pour phénotype dommageable. Dans toutes les procédures, des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme points limites et critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux concernés.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé est le plus adapté pour développer et tester notre traitement, car la molécule étudiée cible précisément la mutation génétique présente chez ces animaux. Il s’agit du plus petit modèle de mammifère reproduisant cette myopathie, reconnu par les experts du domaine et largement utilisé dans des études publiées et présentées lors de congrès internationaux. Nous avons déjà montré que le vecteur viral thérapeutique que nous utilisons est sûr et efficace dans le muscle de ces souris. Il est donc indispensable, à ce stade du développement préclinique, de poursuivre les tests dans ce modèle afin d’optimiser l’efficacité du traitement et de vérifier l’absence d’effets indésirables sur l’ensemble de l’organisme, après une injection dans le sang. Les souris de ce modèle développent progressivement des symptômes musculaires à partir d’un mois, qui s’aggravent jusqu’à environ huit mois. Cependant, leur déplacement, leur fertilité et leur durée de vie restent normaux. Nos travaux précédents ont montré qu’entre un et deux mois, un défaut apparaît dans le transport du vecteur thérapeutique à l’intérieur des cellules, et que ce défaut s’accentue avec la progression de la maladie. Les procédures seront réalisées sur des souris adultes âgées de 1 à 6,5 mois. Les souris âgées d’un mois serviront à évaluer la capacité de nos approches à améliorer la diffusion du traitement dans tout l’organisme, tandis que celles de trois mois, présentant des signes intermédiaires de la maladie, permettront de mesurer l’efficacité du traitement pour stopper ou inverser son évolution.

À dix semaines de vie, le ménisque médial du genou droit est déstabilisé par une chirurgie d'un quart d'heure pour déclencher une arthrose. À douze semaines suivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, cinq jours de suite, sur 2 004 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'arthrose qui s'installe peut faire souffrir les animaux, les conduire à la prostration, à s'isoler de leurs congénères et à cesser le toilettage social, et les injections de tamoxifène peuvent provoquer une péritonite. Toutes sont ensuite tuées pour prélever le sang, la colonne vertébrale, les pattes, la trachée, les poumons et l'aorte.

Objectifs

L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation correspond à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). A un stade plus avancé de la maladie, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés se met en place, via un mécanisme nommé « angiogenèse ». Cette invasion vasculaire accélère fortement la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Nos premiers résultats indiquent qu’une protéine ligand est spécifiquement produite par les chondrocytes hypertrophiques et que l’interaction avec son récepteur, présent à la surface des cellules endothéliales vasculaire, favorise l’angiogenèse. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le rôle de l’interaction entre cette protéine ligand et son récepteur dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Pour ce faire, nous utiliserons une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant à la fois d’induire une invalidation du gène codant pour le récepteur spécifiquement au niveau des cellules endothéliales vasculaires mais aussi de visualiser cette population cellulaire grâce à une protéine fluorescente. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’invasion vasculaire du cartilage articulaire sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement l’interaction entre la protéine d’intérêt et son récepteur.

Bénéfices attendus

Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle que tiennent les chondrocytes hypertrophiques dans le développement de cette maladie. Ce projet comporte également une partie dédiée à évaluer des modes d’administrations du traitement moins invasif et stressant pour les souris, ce qui permettra, in fine, une amélioration et un raffinement de ce protocole, dans un souci de respecter les 3Rs de l’expérimentation animale. Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représentent des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongés et aux interventions) exercées par l’arthrose sur notre société.

Procédures

A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Les animaux âgés de 12 semaines recevront des injections quotidiennes du composé d’intérêt de quelques secondes sur une période de 5 jours. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal.

Impact sur les animaux

Lors du développement de l’arthrose post-traumatique, de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Dans le cas du modèle chirurgical DMM, une douleur pourrait être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Les injections intrapéritonéales, bien que ne durant que quelques secondes, peuvent entraîner une irritation au niveau du site d’injection. De même, les injections de tamoxifène et plus généralement la technique d’injection intrapéritonéale en elle-même peuvent entrainer des nuisances chez l’animal : stress/anxiété, perte d’appétit, inflammation du péritoine (péritonite), injection mal placée conduisant à l’accumulation du produit au niveau d’un site non ciblé (i.e. organes présents dans le péritoine) avec conséquences multiples.

Devenir

L’ensemble des animaux de ce projet seront utilisés afin de réaliser des prélèvements multi-organes post-mortem. Ces prélèvements sont indispensables pour la validation de notre modèle murin génétiquement modifié et pour mener à bien notre étude visant à déterminer l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques contre le développement de l’arthrose.

Remplacement

Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communications cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Pour ce projet scientifique, les nombres de 9 et 35 animaux de chaque sexe par groupe ont été calculés par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvements multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.

Raffinement

Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Deux semaines post-DMM, les souris seront à nouveau observées quotidiennement le temps des injections puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 10 à 22 semaines. La procédure chirurgicale sera réalisée à 10 semaines de vie, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial

627 rats porteurs d'une myopathie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie de trente minutes pour l'implantation d'une pompe sous la peau, d'autres reçoivent des injections quotidiennes dans le péritoine, d'autres une injection de cardiotoxine directement dans le muscle, avec des prélèvements de sang chaque semaine pendant deux mois. Le porteur indique que les rats seront tués entre quatre et six mois, avant l'apparition des atteintes majeures du phénotype dystrophique qu'il situe après dix mois. Sur le remplacement, il reconnaît que l'inhibition de la ferroptose réduit déjà la mort des fibres musculaires en culture, et conclut que seule l'expérimentation sur "l'animal entier" permet de valider un traitement, en visant à terme un essai chez le chien puis chez l'enfant.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique rare, grave et encore incurable. Elle est causée par des mutations d'un gène responsable de la production d'une protéine appelée dystrophine. Cette protéine est essentielle pour protéger les fibres musculaires pendant l’effort. Son absence rend les muscles fragiles, ce qui provoque leur mort progressive. Cela entraîne une faiblesse musculaire sévère qui touche les muscles squelettiques, mais aussi les muscles respiratoires (comme le diaphragme) et le cœur. Bien que la mort des fibres musculaires (appelée myonécrose) soit une caractéristique bien connue de la DMD, on ne comprend pas encore parfaitement comment elle se déclenche. Récemment, une nouvelle forme de mort cellulaire appelée ferroptose a été découverte. Cette forme de mort est liée à un excès de stress oxydatif dans les cellules, notamment au niveau des graisses qui composent les membranes cellulaires, et à une baisse des défenses naturelles de la cellule. Des travaux récents ont montré que cette ferroptose pourrait jouer un rôle dans la DMD. À l'heure actuelle, il n'existe aucun traitement permettant de s’attaquer directement à la cause de la maladie ou d’arrêter son évolution. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer si bloquer la ferroptose permettrait de protéger les muscles et de ralentir la progression de la DMD. Pour cela, nous testerons trois composés qui ont déjà montré leur efficacité en laboratoire ou dans d'autres modèles de maladie. Ces traitements seront administrés à des rats atteints de DMD entre 2,5 et 4 mois, une période où la dégénérescence musculaire est particulièrement active. Deux méthodes d’administration à court terme seront comparées : une perfusion continue grâce à de petites pompes placées sous la peau, ou des injections quotidiennes. Les effets des traitements seront analysés à travers des biomarqueurs sanguins, des tests fonctionnels, des examens histologiques et moléculaires du muscle. La méthode la plus efficace sera retenue pour une étude plus longue, afin d’évaluer si les bénéfices peuvent durer dans le temps. Par ailleurs, nos premières observations en laboratoire suggèrent que ces traitements pourraient aussi aider les muscles à se réparer. Cette idée sera testée chez des rats sains, dans un modèle de lésion musculaire aiguë, afin d’observer si les médicaments favorisent la régénération des fibres musculaires après une blessure.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : (1) évaluer le potentiel thérapeutique d’un inhibiteur spécifique de cette voie, seul ou en association ; (2) identifier des effets secondaires ou bénéfiques non anticipés, comme une possible stimulation de la régénération musculaire. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques combinées pour la DMD, et, à plus long terme, être transposables à d'autres myopathies impliquant des phénomènes de mort cellulaire régulée. A plus long terme et en cas de résultats encourageant, nous envisageons de pouvoir programmer un essai préclinique chez le chien afin de consolider le dossier préclinique qui serait utile pour un essai clinique chez l'enfant.

Procédures

Dans ce projet, certains animaux subiront une chirurgie légère pour poser une pompe (environ 30 minutes/animal), d’autres seront soumis à des injections quotidiennes dans le péritoine (environ 30 secondes/animal) et enfin certains subiront une injection dans le muscle de cardiotoxine (environ 30 secondes/animal). Des prélèvements de sang seront réalisés de manière hebdomadaire sur une durée de maximum 60 jours. Des tests non invasifs fonctionnels pour évaluer la force musculaire seront réalisés tous les 15 jours sur une durée maximale de 60 jours

Impact sur les animaux

Utilisation de modèles pathologiques : Les animaux dystrophiques utilisés dans ce projet (modèles DMD) présentent un phénotype pathologique progressif. Toutefois, les signes cliniques majeurs n’apparaissent qu’après l’âge de 10 mois. Dans ce protocole, les animaux seront mis à mort au plus tard à 6 mois, avant l’apparition des altérations sévères. Intervention chirurgicale pour l’implantation de pompes : Cette procédure, réalisée sous anesthésie générale, peut induire un stress opératoire, une douleur post-chirurgicale modérée et un inconfort local dû à la présence du dispositif. Ces nuisances seront limitées grâce à un protocole analgésique adapté (pré, per et post-opératoire) et à une surveillance étroite des animaux durant la phase de récupération. Injections répétées : Les injections quotidiennes peuvent engendrer une douleur légère et transitoire ainsi qu’un stress lié à la contention répétée Prélèvements sanguins hebdomadaires : Les prélèvements seront réalisés via des techniques peu invasives entraînant un stress modéré et une douleur légère de courte durée. Tests fonctionnels : Certains tests peuvent provoquer une fatigue musculaire, en particulier chez les animaux myopathes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Il a été démontré, dans des modèles cellulaires, l’activation des voies de mort cellulaire régulée de type ferroptose, ainsi que la capacité de leur inhibition à réduire significativement la mort des myofibres en culture. Ces résultats in vitro soulignent la pertinence de la ferroptose comme cible thérapeutique, mais nécessitent désormais une validation in vivo. En effet, seule l’expérimentation sur l’animal entier, dans un environnement physiologique intégrant l’ensemble des organes et systèmes en interaction, permet d’évaluer de manière complète et fiable l’efficacité et la tolérance d’un traitement. Nous proposons ainsi de tester l’efficacité d’inhibiteurs de la ferroptose dans des modèles de rats DMD, afin de confirmer leur potentiel thérapeutique dans un organisme vivant.

Réduction

De nombreuses données ont été cumulées sur les modèles animaux utilisés dans ce projet. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique et le calcul de puissance statistique nous recommande d'utiliser 8 animaux par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure qu'il était suffisant et approprié pour conclure de façon non ambiguë.

Raffinement

Afin d’assurer leur bien-être, nous utilisons les plus grandes cages disponibles sur le marché, permettant aux rats de marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Ce niveau d’activité spontanée est essentiel pour des rats dont les capacités locomotrices sont évaluées. Le milieu est enrichi par des éléments variés tels que des lanières de papier kraft,des bâtons à ronger, balles, tunnels et carrés de coton compressé. Pour limiter le stress lié aux manipulations et aux tests, les rats sont habitués dès leur jeune âge à être manipulés régulièrement et avec douceur. Le suivi des animaux est assuré par du personnel expérimenté, capable de détecter, évaluer, et atténuer ou éliminer les signes de douleur ou de détresse. Pour la pose de la pompe par chirurgie, une anesthésie chimique est réalisée. Les prélèvements sanguins sont effectués sous une couverture analgésique chimique. La gestion du bien-être et la mise à mort : Dans ce projet, les rats modèles DMD seront mis à mort à l’âge de 4 à 5 mois, avant l’apparition des signes délétères majeurs du phénotype dystrophique, qui surviennent généralement après 10 mois (difficultés à mastiquer, risques de rhabdomyosarcome) ou au-delà de 12,5 mois pour les insuffisances cardiaques fatales. Une grille critériée d’évaluation de la douleur et des seuils limites a été mise en place et affichée. Les animaux sont surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Toute atteinte d’un seuil critique entraîne une action corrective immédiate. En l’absence d’amélioration et en cas de trouble irréversible, une mise à mort compassionnelle est pratiquée afin de prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nos animaux appartiennent à une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, cette espèce est devenue un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Les animaux seront âgés de 2,5 à 4 mois jusqu’à maximum 6 mois, ce qui correspond au stade où la maladie progresse le plus et les muscles sont de plus en plus impactés, fonctionnellement et morphologiquement.

Enfermées quatre jours dans des cages de 330 cm² sans possibilité de se suspendre, des souris reçoivent des chimiothérapies utilisées contre le cancer du sein, par injections espacées d'une à trois semaines. 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent des tests de force et de fonction musculaire ainsi que des tests d'effort maximal de dix à vingt minutes, avant et après le traitement. Le porteur décrit la réduction de l'espace comme une "altération mineure du bien-être animal" à "faible nuisance physiologique", alors que le projet l'organise pour aggraver la fonte musculaire provoquée par la chimiothérapie.

Objectifs

La chimiothérapie utilisée pour traiter le cancer du sein précoce entraîne de nombreux effets secondaires sur le muscle squelettique, affectant à la fois sa quantité et sa qualité. Les patientes traitées présentent diverses altérations musculaires, comme une atrophie, qui contribuent à la diminution des capacités fonctionnelles. Ces altérations, observées après un traitement par chimiothérapie, varient en fonction de la molécule utilisée. Par ailleurs, la réduction de l’activité physique, fréquemment observée chez les patientes, aggrave probablement ces altérations musculaires. En effet, la diminution des contraintes mécaniques et métaboliques exercées sur les muscles entraîne des effets similaires à ceux induits par la chimiothérapie. L'interaction entre ces deux facteurs reste difficile à dissocier chez la patiente, ce qui justifie l’utilisation d’un modèle animal. À l'inverse, l’exercice, qui augmente les stimuli mécaniques et métaboliques, pourrait prévenir ces altérations, bien que ces bénéfices n’aient été observés que chez des sujets sains avec des preuves scientifiques robustes. Cependant, les effets aigus, chroniques et différés de l'exercice dans le contexte de l'atrophie musculaire induite par la chimiothérapie demeurent largement méconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier, dans un modèle murin, l'impact de la modulation de l’activité physique sur l’atrophie musculaire induite par la chimiothérapie. L’étude 1 caractérisera les effets combinés de la réduction de l’activité physique et des chimiothérapies sur les altérations musculaires, tandis que l’étude 2 explorera les effets aigus, chroniques et différés de l’exercice sur ces altérations. MODIFICATION : PLUS PRECISEMENT, LE TURNOVER PROTEIQUE, QUI COMPREND LA SYNTHESE ET LA DEGRADATION PROTEIQUE), SERONT ETUDIES AFIN D’AVOIR DE COMPRENDRE LES MECANISMES QUI REGULENT LA MASSE MUSCULAIRE.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples au niveau fondamental et au niveau de l’application clinique possible. Tout d’abord, la caractérisation de l’interaction entre la réduction du niveau d’activité physique et la chimiothérapie sur les altérations musculaires permettra de proposer un modèle murin plus proche de la réalité clinique. En effet, étant donné que les patientes atteintes d’un cancer du sein ont une réduction de leur niveau d’activité physique après l’administration de chimiothérapie, il est probable que cette réduction, induite dans le modèle murin, exacerbe les effets de la chimiothérapie sur le tissu musculaire. D’autre part, l’étude des effets aigus, chroniques et différés de l’exercice permettra d’un point de vue fondamental de caractériser les voies de signalisation cellulaires sous-jacentes et d’un point de vue clinique d’adapter la prise en charge des patientes. En effet, nous pensons que de manière aigue, l’exercice pourrait prévenir une partie des altérations musculaires. Si nous montrons ces bénéfices, cela aboutira à une preuve de concept et un changement de prise en charge clinique. Il sera alors recommandé de pratiquer de l’exercice juste avant l’administration de chaque dose de chimiothérapie. Enfin, la caractérisation des effets différés de l’exercice et de la chimiothérapie permettra d’indiquer aux patientes si la pratique d’exercice spécifique doit se poursuivre au-delà du traitement.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous allons administrer des traitements de chimiothérapies. Pour l'étude avec administration aigu : une injection sur animal vigile, d'une durée de quelques secondes, sera effectuée sur les animaux. Lorsque les chimiothérapies seront administrées par injection de manière chronique, celles-ci seront espacées de 1 à 3 semaines selon le type de molécule administrée. Pour répondre aux questions scientifiques, les souris de l’étude avec administration aigue seront placées dans des cages individuelles, tandis que celles du groupe "réduction d’activité" seront hébergées dans des cages de dimensions réduites (330 cm², sans possibilité de suspension). la durée de ce maintien cage individuelle avec ou non réduction de la surface au sol disponible sera de 4 jours. Deux tests de force et de fonction musculaire seront réalisés, pour une durée inférieure à 5 minutes. Ces tests seront effectués avant et 4 jours après l’administration de la chimiothérapie dans le cadre des expérimentations aiguës, ou avant et après l’ensemble du traitement par chimiothérapie pour les expérimentations chroniques et différées. Dans le cadre des expérimentations chroniques et différées, des tests d’effort maximaux seront réalisés, d’une durée de 10 à 20 minutes, avant et après l’ensemble du traitement par chimiothérapie. MODIFICATION : POUR L’ENSEMBLE DES EXPERIMENTATIONS, UNE INJECTION D'UNE MOLECULE PERMETTANT DE MESURER LES FLUX DE PROTEINES DE 1 A 2 SECONDES SERA REALISEE SUR ANIMAL VIGILE.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, l'administration des chimiothérapies entraîne une douleur légère à modérée au site d'injection, de courte durée MODIFICATION : ET PEUT ENTRAINER DES PERTES DE POIDS. La répétition des injections, bien qu’alternées entre les côtés injectés et espacées d’au minimum 1 semaine, pourrait induire une légère induration locale et un stress modéré lié à la contention, d’intensité croissante avec le nombre de manipulations. Les manipulations répétées pour les séances d’exercice et les évaluations (force, fonction musculaire et vitesse maximale à l'exercice) induisent un stress modéré, de durée variable selon la fréquence des manipulations. Dans l’étude 1, le placement des animaux dans des cages individuelles pendant une courte durée entraîne une altération mineure du bien-être animal, sans impact significatif sur l’anxiété ou les capacités cognitives. Le placement en cage individuelle sera limité à 4 jours, réduisant ainsi son impact potentiel. Pour le groupe de réduction d’activité, le placement dans des cages de dimensions réduites (330 cm² sans possibilité de suspension) entraîne une réduction des opportunités de mouvement, avec une faible nuisance physiologique et une intensité limitée sur le bien-être, en accord avec les études précédentes.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem nécessaires aux analyses prévues.

Remplacement

Pour comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité physique dans le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, il n’existe pas à ce jour un modèle in vitro permettant de réduire le niveau d’activité physique et les modèles d’électrostimulation utilisés pour mimer l’exercice sont incomplets. De plus, pour comprendre les aspects fonctionnels (force et fonction musculaire), le recours à un modèle in vivo est nécessaire.

Réduction

L'équipe de recherche bénéficie de l’expérience et de l’expertise nécessaire pour permettre la mise en place d’expérimentations de qualité avec un nombre de souris réduit au minimum mais suffisant pour les analyses statistiques. Pour rappel, l’étude 1 vise à caractériser la contribution de la réduction du niveau d’activité physique dans le déconditionnement musculaire induit par une administration de chimiothérapie. Pour calculer mathématiquement le nombre d'animaux par groupe, le critère de jugement principal sest basé sur le degré d’atrophie mesuré au niveau histologique par la surface de section des fibres musculaires encore appelé taille de l'effet. Sur la base de la littérature, la chimiothérapie peut en moyenne induire une atrophie de 17, 9%. Les résultats obtenus seront comparés grâce à des analyses statistiques adaptées permettant de mettre en évidence l'effet de la réduction d'activité physique sur l'atrophie induite par la chimiothérapie.

Raffinement

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont maitrisées. Le bien-être des animaux sera constamment surveillé, et toute modification du comportement, telle que la manifestation de souffrance ou d'angoisse, sera immédiatement rapportée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour mettre en place les mesures correctives nécessaires. En cas de signes de douleurs, un avis au vétérinaire sera demandé.Avant le début des procédures, les animaux seront habitués aux conditions environnementales et manipulés pour les habituer aux expérimentateurs ainsi qu'à la contention nécessaire à la réalisation des injections. Pour enrichir l’environnement des souris, les cages seront équipées de matériaux et d'objets adaptés pour leur permettre de nidifier et ronger. Les souris seront maintenues en groupes sociaux et, pour une des études, individualisées uniquement lorsque cela sera nécessaire pour atteindre les objectifs et la durée du placement en cage individuelle sera de durée très limitée (4j). Nous observerons attentivement la locomotion des souris afin de détecter tout signe de boitement ou de difficulté à se déplacer, ce qui pourrait indiquer des effets secondaires inattendus de la chimiothérapie. En parallèle, nous évaluerons régulièrement l'aspect général des animaux, incluant leur posture, leur tonus musculaire, leur comportement dans la cage, l'état de leur pelage et leur poids corporel via des grilles de scoring pour lesquelles des mesures correctives ainsi que des points limites ont été définies pour interrompre les procédures et limiter la souffrance animale. Pour exemples, en cas de signes de faiblesse musculaire, affectant potentiellement leur capacité à s'alimenter ou à se mouvoir, nous fournirons de la nourriture en gel en complément de leur régime alimentaire standard. Une réhydratation sous-cutanée pourra également être mise en place.

Choix des espèces

L’utilisation de modèles cellulaires est impossible pour comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité dans le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie. Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. La souris présente un intérêt particulier du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l’Homme (99% d’identité de gènes avec l’Homme), tant au niveau histologique et cellulaire qu’au niveau du type de réponses aux traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité physique sur le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie utilisée chez les patientes atteintes d’un cancer du sein. Ainsi, pour se rapprocher de la réalité clinique, nous travaillerons sur des souris adultes (8 mois post natal environ). En effet, dans nos études cliniques, aucune patiente n’était âgée de moins de 26 ans. Conformément aux équivalences entre âge souris/humain, une souris de 8 mois correspond à un humain d’âge moyen.

Produire du cartilage articulaire dans le corps d'un animal avant de le réimplanter sur une articulation abîmée : 10 lapins adultes vont être utilisés pour cette preuve de concept, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une anesthésie par injection dans le muscle, la pose d'un cathéter dans l'oreille et une chirurgie d'une heure trente pour prélever un greffon de périoste et l'associer à un implant placé sous la peau. Pendant les vingt-huit jours suivants, ils sont contenus plusieurs fois par jour pour que l'on mobilise les platines de l'implant, source de stress que le porteur reconnaît, et une grille d'observation fixe les seuils au-delà desquels ils seront mis à mort. Récupérer l'implant demande de rouvrir la cicatrice et les muscles : les lapins seront tués, ce que le porteur présente comme un moyen de leur éviter les séquelles de cette seconde intervention.

Objectifs

L'arthrose est une maladie courante qui affecte les articulations en provoquant une détérioration du cartilage. Cela peut entraîner des douleurs et une réduction de la mobilité, en particulier chez les personnes âgées. La recherche se concentre actuellement sur la régénération du cartilage articulaire en utilisant des greffons de périoste, une membrane fibreuse qui peut être prélevée plus facilement que le cartilage lui-même. Le projet a pour objectif de développer un processus chirurgical de régénération du cartilage chez le lapin, en utilisant un implant chirurgical en biomatériaux associé à un greffon de périoste. L'objectif est de réimplanter le cartilage régénéré sur une perte de substance cartilagineuse articulaire et d'évaluer sa durabilité.

Bénéfices attendus

L'arthrose est une maladie articulaire caractérisée par la détérioration progressive du cartilage qui recouvre les extrémités osseuses dans les articulations. Cette détérioration entraîne des douleurs et une diminution de la mobilité chez les personnes touchées, en particulier dans les populations vieillissantes où la fréquence de la maladie est en augmentation. En conséquence, l'arthrose est considérée comme un problème de santé publique en raison de son impact négatif sur la qualité de vie des individus affectés et des coûts associés aux soins de santé pour traiter cette maladie. L’approche chirurgicale décrite dans ce projet pourrait être utilisée pour traiter l'arthrose en permettant la réimplantation d'un nouveau cartilage sur une zone où il est détérioré, de façon similaire à ce qui est pratiqué en chirurgie humaine lors d'interventions appelées "mosaïcplasties". Il s’agit d’interventions chirurgicales où de petits morceaux de cartilage sain sont prélevés dans une zone de l'articulation non porteuse de poids et réimplantés dans les zones endommagées du cartilage, mais sur des surfaces limitées (1 à 4 cm2), en particulier du fait d’un nombre réduit de sites donneurs. Cette nouvelle technique offrirait l'avantage de pouvoir traiter des zones plus importantes de perte de cartilage, avec un bénéfice non négligeable sur la qualité des patients.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux participeront à une seule procédure expérimentale, comprenant une anesthésie générale par injection intramusculaire (15 min), la pose d'un cathéter intraveineux au niveau de l'oreille (2 min), une intervention chirurgicale (environ 1h30) au cours de laquelle la douleur sera contrôlée par injection médicamenteuse. Au cours du suivi post-opératoire pendant 28 jours, ils seront manipulés quotidiennement pour recueillir des données mais sans geste invasif (pesée, vérification de l'implant...).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, trois types de nuisances ont été identifiées. Le premier est lié à l’intervention chirurgicale, nécessaire pour le prélèvement du greffon de périoste pour laquelle l'anesthésie nécessitera des injections par voie intra-musculaire, puis la pose d'un cathéter intraveineux au niveau de l'oreille. La présence d'une plaie chirurgicale pourra générer de la douleur après le réveil. Le deuxième type de nuisances est lié à l’implant lui-même, situé sous la peau, ce qui pourrait entraîner une gêne. Enfin, les manipulations quotidiennes pour la mobilisation des platines nécessiteront une contention légère des animaux mais répétée plusieurs fois par jour sur toute la durée de l’étude, cela pouvant induire un stress.

Devenir

L'implant devant être récupéré pour réaliser des analyses tissulaires, il sera nécessaire de rouvrir la cicatrice et les muscles. Les animaux seront euthanasiés pour leur éviter toute séquelle liée à ces gestes.

Remplacement

Dans le cadre de la croissance et de la régénération des os et du cartilage, l’ensemble des processus biologiques impliqués est complexe. Plusieurs équipes ont notamment démontré qu’il existe une interaction très active entre le muscle strié et l’os au cours de la réparation osseuse. Cet aspect d’interaction positive entre le muscle et l’os est aussi retrouvée au plan clinique orthopédique où l’importance d’un environnement musculaire de qualité pour la réparation osseuse est constatée quotidiennement. C’est pourquoi l’utilisation d’un environnement tissulaire de type muscle strié squelettique autour du greffon de périoste est nécessaire pour ce projet de développement d’un dispositif innovant. En l’état des connaissances actuelles, Il n’existe pas de système alternatif “in vitro” susceptible de reproduire un environnement aussi riche en faveur d’un processus de construction tissulaire ostéocartilagineuse, d’où la nécessité de passer par un modèle animal.

Réduction

Une étude préalable sur cadavre sera réalisée pour vérifier la faisabilité de l’implantation. S’il s’avérait que des difficultés apparaissent, alors la procédure serait revue avant de débuter les essais sur animaux vivants. De plus il s’agit d’une étude très préliminaire pour « preuve de concept ». L’identification histologique de la production d’un cartilage de qualité spécifiquement articulaire sera l’élément essentiel de validation de la procédure mais ne donnera pas lieu à une étude statistique particulière. Un nombre limité de 10 animaux est donc envisagé dans cette première étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par deux. Après l’intervention, l’animal est transféré dans une cage dédiée, où lui seront proposés de l’eau et de la nourriture dès son réveil afin de permettre une reprise alimentaire rapide. Le fond de cage sera matelassé pour réduire les risques d’hypothermie et éviter que le lapin ne se blesse en faisant un faux mouvement pendant son réveil. Une alèse chirurgicale permettra d’absorber les urines. Les animaux resteront sous surveillance en isolement, mais avec un contact visuel avec leur congénère, pendant les 24 premières heures. Si leur état clinique le permet, ils seront remis en espace libre dès le lendemain de l’intervention. Au cours des étapes suivantes, l’état clinique des animaux sera vérifié quotidiennement et évalué le cas échéant à l'aide d'une grille d'observation permettant d'établir des points limites et les actions à mener (surveillance accrue, administration d'antidouleurs, mise à mort) en fonction du score obtenu.

Choix des espèces

Le lapin est un des modèle animaux très couramment utilisé pour la recherche sur le cartilage articulaire. Des adultes de 3 à 3,5 kg ont été choisis car leur taille est suffisante pour implanter le dispositif médical. De plus, l’équipe initiatrice du projet a déjà une expérience sur cette espèce, dont les travaux précédents avaient montré qu’il serait possible de produire du cartilage articulaire à partir de greffons de périoste, ce qui a donné lieu à ce nouveau projet.