Troubles immunitaires

Une perte de poids supérieure à 20 %, une hyperventilation, une perte de poils, un isolement social ou une baisse d'activité en cage font sortir la souris du protocole. 1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 840 d'entre elles subissent une trachéotomie d'une vingtaine de minutes pour mesurer leur fonction pulmonaire et prélever un lavage broncho-alvéolaire, 320 des prises de sang à la queue ou à la joue, après deux à quatre semaines d'instillations nasales d'extrait d'acarien. Le porteur cherche à décrire le comportement de certaines cellules immunitaires dans le poumon asthmatique et ne situe qu'à long terme d'éventuelles retombées thérapeutiques.

Objectifs

Ce projet se focalise sur le rôle des populations immunitaires localisées aux interfaces épithéliales des bronches en conditions physiologiques et en conditions inflammatoires. L’inflammation asthmatique se caractérise par l’activation et le recrutement (local et périphérique) de cellules immunitaires connues pour provoquer des altérations physiologiques au niveau des parois bronchiques suite à une stimulation par des allergènes inhalés. Afin de comprendre la régulation de la réponse immunitaire médiée par ces cellules dans un contexte inflammatoire, les souris sont mises dans des conditions d’induction d’asthme allergique via une exposition à différents extraits d’allergènes comme la papaïne et l’extrait d’acarien (House Dust Mite, HDM), et des molécules stimulantes (IL-33). Ainsi nous étudierons les modifications à court-terme (induites par la papaïne et IL-33) et à long-terme (induites par le HDM) du comportement des cellules immunitaires. Nous effectuerons plus particulièrement des études sur l’activation, la prolifération, la motilité, et les altérations morphologique de ces cellules immunitaires au cours de l’inflammation. Ces études permettront de déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires orchestrés par ces cellules immunitaires, en plus des modifications physiologiques observées.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au cours de l’inflammation du poumon dans un contexte d’asthme allergique. À court terme, ce projet permettra d’établir les différences de comportement des cellules immunitaires en inflammation dans différentes lignées de souris génétiquement modifiées, engendrées par les différents modèles d’induction d’asthme. Les résultats de ce projet devraient communiquer la nature des mécanismes moléculaires et cellulaires entre certaines protéine et cellules immunitaires dans le poumon asthmatique. Cela permettra de déterminer si ces mécanismes contribuent à la progression vers une pathologie chronique, ou à un rétablissement à l’homéostasie. À long terme, ces résultats pourraient participer à de futures recherches sur des stratégies thérapeutiques ciblées contre ces mécanismes moléculaires, afin de lutter contre l’exacerbation de l’inflammation et d’atténuer les dommages physiologiques, au vu de l’impact important de cette maladie en santé publique.

Procédures

Les interventions prévues sont les suivantes : 320 animaux subiront des prélèvements sanguins venant de la veine caudale latérale ou de la veine submandibulaire. 840 animaux subiront une procédure chirurgicale (maximum 20 minutes) permettant d’accéder à la trachée afin d’effectuer des trachéotomies pour les mesures de fonctions pulmonaires et ensuite prélèvements de lavage broncho-alvéolaires.

Impact sur les animaux

La stimulation par certaines molécules en 3 jours consécutifs peut induire une inflammation des poumons à court-terme. Le modèle d'instillations intranasales d’extrait d’acarien sera appliqué pour une plus longue durée allant à 2 semaines dans certaines expériences pour simuler une inflammation asthmatique aigüe, et à 4 semaines dans d’autres expériences afin d’induire une chronicité. Ces inflammations des voies respiratoires peuvent provoquer les nuisances suivantes : des irritations et constrictions aux niveau des bronches, et possiblement une augmentation du rythme respiratoire. Nous nous attendons donc à ce que les animaux utilisés dans ce projet présentent un rythme respiratoire augmenté à l’œil nu. Mis à part cette nuisance, la littérature ne décrit pas d’autres signe de nuisance apparente, Il n’y aucune difficulté d’alimentation/d’abreuvement, ni de mortalité causée par l’inflammation pulmonaire induite par ces modèles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés à pour un accès à leurs organes et à l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.

Remplacement

La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossibles à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront néanmoins entreprises en culture 2 dimensions afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique d’inflammation car les effets des modèles d’asthme allergique sont déjà décrits dans la littérature. Par exemple, nous savons que les changements de comportement des cellules immunitaires ne sont à tester qu’à partir de 24 heures après la dernière instillation de la molécule testée. Les mécanismes moléculaires et cellulaires, ainsi que leurs modulations ne seront analysés qu’à des points de temps précis où des différences significatives des populations immunitaires sont détectées. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire, ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement après la validation des altérations de mécanismes moléculaires impliqués dans les changements de comportement des cellules immunitaires (prolifération, activation, motilité) chez les souris génétiquement modifiées, une étude du blocage des molécules concernées se fera par l’injection de molécules inhibitrices. Ainsi, nous vérifierons dans les organes cibles si les molécules bloquées avaient un effet favorisant ces changements de comportement. L’application de ces molécules bloquantes uniquement dans le cas d’une prolifération/ activation/ motilité statistiquement significative permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste. Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’analyser les différents organes pour les populations immunitaires.

Raffinement

Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences. Certains seront évalués pour leurs capacités respiratoires et leurs sérologies à des points de temps spécifiques. Une fiche d’observation tout au long des conditions permettra de vérifier leur état (pelage, poids, interactions, mobilité) et des scores seront tenus afin de vérifier que les modèles décrits n’induisent pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis : perte de poids importante (>20%), hyperventilation, modification d’état du pelage/alopécie, isolement social, et diminution de l’activité dans les cages. Le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de diminuer la dose des stimulants et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Dans le cas des anesthésies par voie gazeuse, nous veillerons à chauffer les animaux anesthésiés à l’aide d’un tapis chauffant lors des inoculations intranasales. Nous appliquerons également du gel hydratant sur les yeux des animaux anesthésiés afin d’éviter les dessèchements. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.

Choix des espèces

La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. En outre, il existe un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiés dont l’utilisation permettra la réalisation d’études sur les dynamiques et mécanistiques des cellules immunitaires impliquées dans l’asthme allergique. Le détail du nombre de souris dans chaque procédure est décrit dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte, et la mise en place des modèles d’induction de l’inflammation asthmatique débutera à 6 semaines. Dans une de nos procédures, nous analyserons l’effet de l’inflammation asthmatique à partir de 14 jours (2 semaines). Ces âges ont été retenus comme les plus significatifs pour observer la mise en place et le suivi de l’inflammation allergique des voies respiratoires chez la souris. De plus, comme le modèle HDM se pratique sur 4 semaines dans certaines expériences, les souris doivent être analysées à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après les inoculations intranasales et que l’on ne se situe pas sur l’interprétation d’un facteur de vieillissement.

Immunisés cinq à plus de seize fois par an, puis saignés jusqu'à vingt et une fois par an pour produire du sérum, 1 500 lapins, 1 000 cobayes, 30 chèvres et 30 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués une fois le titre d'anticorps et le volume de sérum jugés suffisants, après un dernier prélèvement plus important. Les anticorps polyclonaux obtenus alimentent des tests de diagnostic vendus dans le monde entier, le porteur mentionnant jusqu'à un test utilisé par seconde et un nombre d'animaux fixé par le "Donneur d'ordre". Il indique que la réaction inflammatoire au point d'injection disparaît en quelques jours et qu'aucune conséquence néfaste n'est observée ensuite, description difficile à tenir pour des animaux immunisés et ponctionnés pendant deux ans avant d'être tués.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l'immunisation des animaux afin d’obtenir des anticorps polyclonaux. Après immunisation et prélèvement du sang, le sérum obtenu contient les anticorps polyclonaux spécifiques de l’antigène utilisé. Après purification, les anticorps servent à produire différents tests par exemple : hémostase, thrombose, infections inflammatoires, détermination des groupes sanguins (utilisés pour les transfusions et les transplantations…). Ces tests de laboratoire permettent de doser les facteurs concernés dont le déficit est responsable des troubles cliniques dans le suivi des patients en thérapie ou en postopératoire. Les tests peuvent aussi permettre de confirmer des résultats sérologiques faibles ou peu clairs avant une transfusion ou une transplantation… Les tests immunologiques produits à l’aide des anticorps polyclonaux purifiés à partir des sérums des animaux hyperimmunisés sont marqués CE, ou enregistrés IVDR pour l’Europe, ou FDA (510(k)) pour les USA, ainsi que dans les systèmes règlementaires de la majorité des pays, afin de pouvoir les utiliser dans les hôpitaux pour le diagnostic et le suivi des pathologies. Le projet est principalement à visée humaine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la production d’anticorps polyclonaux, sont la mise à disposition des laboratoires hospitaliers et cliniques de tests diagnostiques performants et précis, utilisant directement ou indirectement la technologie immunologique. L’utilisation du processus d’immunisation sur animaux permet d’obtenir des anticorps polyclonaux, d’isotype IgG, reconnaissant l’ensemble de la structure de la protéine (utilisée comme antigène), avec une grande affinité, c’est-à-dire une réaction spécifique et très forte avec cette protéine. Cela permet de l’identifier, de la quantifier ou de l’extraire dans un milieu très complexe, comme le sang, tout liquide biologique (ascites, liquide céphalo-rachidien, urines, etc…), ou un lysat cellulaire. Deux applications importantes sont mises en œuvre dans le projet : a) test l’utilisation des anticorps pour la production de tests de diagnostic médical, permettant de quantifier précisément une protéine ou un anticorps dans un liquide provenant du corps humain, à des fins de diagnostic, de pronostic, ou de suivi de traitement thérapeutique. b) Extraction spécifique d’une protéine d’un milieu complexe, comme le plasma humain, afin de produire un plasma déficient en cette protéine. Ce plasma est ensuite utilisé dans des trousses de diagnostic, pour doser l’activité de la protéine concernée, apportée par le plasma à tester. Le bénéfice est très important car une faible quantité de sérum permet de fournir une très grande quantité de tests, ils sont utilisés au niveau mondial à très grande échelle (jusqu’à un test utilisé par seconde dans le monde).

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur une durée de 2 ans maximum : Prélèvements sur animaux vigiles : 1 prélèvement de sang sain. Immunisations sur animaux vigiles : 5 à plus 16 par an. Prélèvements sur animaux vigiles : 1 à plus 21 prélèvements sanguins par an pour la production sérum. Lorsque le titre des anticorps et le volume de sérum seront jugés suffisants, le protocole d’immunisation sera arrêté et les animaux euthanasiés après prélèvement d’un volume sanguin plus important.

Impact sur les animaux

L’expérience acquise avec ces protocoles permet de dire que la principale nuisance sur les animaux concerne la réponse au processus d’immunisation, qui peut induire une réaction inflammatoire au point d’injection. Cette réaction inflammatoire disparait généralement en quelques jours, et aucune conséquence néfaste n’est observée ensuite. Les autres nuisances possibles concernent la contention et l’introduction de l’aiguille sous la peau des animaux pendant le prélèvement, pouvant provoquer de l’inconfort, une sensibilité légère limitée à la durée du prélèvement. L'anesthesie a répétition chez le cobaye. Cette étape n’a pas d’autre conséquence particulière sur les animaux.

Devenir

Tout animal ayant étaient immunisés sera mis à mort car l'immunisation ne permet pas de les utiliser dans d'autre procédures.

Remplacement

A chaque fois que cela est possible, des anticorps monoclonaux produits par culture cellulaire, ou des anticorps recombinants, sont utilisés, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés pour la production d’anticorps polyclonaux. Toutefois, les anticorps polyclonaux présentent des caractéristiques uniques par leur grande affinité vis-à-vis de la protéine utilisée pour leur immunisation, et par la reconnaissance globale des structures de cette protéine. A l’inverse, les anticorps monoclonaux ou recombinants, ne reconnaissent qu’une seule structure de la protéine, et si cette structure est affectée par une mutation génétique, la reconnaissance et perdue, et le variant n’est pas détecté. Les anticorps obtenus par immunisation des animaux permettent ainsi d’obtenir des caractéristiques uniques pour les besoins du laboratoire et la mise à disposition d’outils de diagnostic performants. Le client s'engage à faire la production in vitro lorsque cela est possible et respecte les normes réglementaires de diagnostic.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu résulte de 2 contraintes : a) Utiliser un nombre suffisant d’animaux pour réduire la variabilité inter-animaux de la réponse immunitaire. b) Utiliser le nombre requis pour obtenir la quantité de sérum suffisante pour la quantité d’immunoglobulines IgG purifiées nécessaires pour répondre aux besoins. Le nombre d'animaux utilisés correspond au minimum en fonction des volumes souhaités, définis par le Donneur d'ordre. La ré-immunisation des animaux au long terme permet de limiter le nombre d’animaux utilisés. En moyenne, nous pouvons produire 26 litres de sérum par an avec 6 moutons ou 6 caprins, 130 litres de sérum par an avec 300 lapins et 13 litres de sérum par an avec 200 cobayes.

Raffinement

Les animaux sont tous contrôlés de façon journalière, ils ont à disposition des enrichissements adaptés et variés avec des roulements périodiques si possible (Lapin: bloc de cellulose à ronger, bout de bois.../Ovins, caprins:balai, un gros ballon, sapin perchoir(tronc d'arbre).../Cobayes: petite balle, bloc de cellulose...).- Pour les lapins, les cages disposent de mezzanines et de petits trous sur les parois leurs permettant de voir et de sentir les lapins dans les cages voisines . Les prélèvements se font dans une pièce séparée des hébergements. Après chaque prélèvement les lapins sont placés dans une piscine remplie de copeaux et de balles en plastique le temps du prélèvement d’un autre lapin.- Les ovins et caprins,sont dans une bergerie qui leurs est dédiée avec accès sur 2 hectares de prairie. Ils sont hébergés dans un box recouvert de paille. L'alimentation est composée de foin, pierre à sel, graines d'orge et d'avoine. Les prélèvements se font dans une partie dédiée, séparée de l'enclos. -Les cobayes sont hébergés dans une unité indépendante dans des cages par groupes sociaux harmonieux (2ou 3) avec mise à disposition d'une maison . Après chaque prélèvement ou immunisation ils reçoivent une récompense .Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être provoqué lors des procédures avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Des isolements de quelques minutes seront appliqués le temps des immunisations. Les volumes prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations du Gircor. Un tableau d’évaluation des points limites est mis à disposition pour suivre l’évolution d’un animal qui présente des signes cliniques. (voir arbre décisionnel et critères d'arrêt des souffrances en pièces jointes). Les administrations ou les prélèvements s’arrêteront si un animal atteint un score de 3 sur la grille d’évaluation. Le dernier prélèvement est réalisé sous anesthésie générale , (excepté s' il y a contre-indication scientifique). Dans ce cas, l’animal ne se réveille pas, il est mis à mort dans la foulée du prélèvement .

Choix des espèces

Les lapins, les ovins, caprins et cobayes font partis des espèces les mieux documentées et les plus appropriées pour la production d’anticorps polyclonaux selon les recherches des donneurs d’ordres L'un des facteurs qui influence la production d'anticorps est la nature de l'immunogène utilisé (spécifique à chaque espèce). Le lapin est facile à manipuler et à prélever, il produit des volumes suffisants d'antisérum à titre élevé et à forte affinité. Les ovins et caprins ont une longue durée de vie, sont facile à manipuler et le prélèvement sanguin est facile à réaliser (veine jugulaire). La grande taille des animaux apporte un volume important d'immunsérum et réduit par la même occasion le nombre d'animaux. Les lapins ont au minimum deux mois et demi à la première immunisation et 5 mois aux premiers prélèvements. Les ovins et caprins ont au minimum trois mois à la première immunisation et 5 mois et demi aux premiers prélèvements. Les cobayes ont au minimum trois mois à la première immunisation et de 4 mois et demi aux premiers prélèvements. Cet âge à l’avantage de permettre une bonne acceptation des administrations par les animaux avec le développement d’une réaction immunitaire correcte et de permettre prélever une quantité intéressante de sang.

Le nerf vague est sectionné au niveau du cou, d'un seul côté, sur des souris ensuite nourries d'un régime riche en lipides pendant quatre à vingt-quatre semaines. 4 608 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les prélèvements de tissus. Chacune subit un gavage de glucose ou une injection d'insuline ou de toxine diphtérique, cinq prélèvements de sang successifs sur deux heures, une contention en tube et un séjour seule en cage de calorimétrie, une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort. Le porteur écrit que les souris récupèrent rapidement et complètement après la section du nerf, sans signe significatif de douleur ni de détresse, et que le régime gras ne devrait causer aucune douleur perceptible.

Objectifs

La stéatose hépatique non-alcoolique (NASH) est une maladie du foie caractérisée par une accumulation excessive de graisse dans les cellules hépatiques, accompagnée d'une inflammation et d'une lésion hépatique. Actuellement, il n'existe pas de traitement pharmacologique efficace et validé pour cette maladie. Cependant, des recherches antérieures ont mis en évidence le rôle clé de l'inflammation dans le développement de la NASH. Précédemment, nous avons montré que l’inflammation pathogène était un acteur important dans le développement de la NASH. Une découverte intéressante a montré une relation entre l'innervation vagale et le métabolisme hépatique. Le nerf vague, qui est une composante du système nerveux autonome, semble jouer un rôle dans la régulation du métabolisme du foie. Des études ont montré que la stimulation du nerf vague pouvait avoir des effets positifs sur la fonction hépatique. De plus, des recherches ont indiqué que la vagotomie cervicale unilatérale (section du nerf vague du côté gauche du cou) était associée à une augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Cela suggère que la modulation de l'activité vagale pourrait influencer la mobilisation des cellules immunitaires, notamment les monocytes, à partir de la moelle osseuse et de la rate. Cependant, les mécanismes précis de ces interactions restent encore mal compris. Pour mieux saisir ces interactions complexes, nous proposons une approche chirurgicale consistant à réaliser une vagotomie cervicale unilatérale chez des souris, qui seront soumises à un régime riche en lipides pour induire une NASH. L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la NASH. Cette recherche pourrait fournir des informations cruciales pour mieux comprendre les liens entre le système nerveux autonome, l'inflammation et la pathogenèse de la NASH, ouvrant potentiellement de nouvelles voies pour le développement de traitements futurs.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH). La NASH représente la forme la plus prévalente de maladie hépatique et est étroitement liée à la progression de l’obésité. A ce jour, les patients souffrant de NASH ne disposent pas de traitements approuvés, et le nombre de patients nécessitant une transplantation hépatique est en constante augmentation. Par conséquent, une compréhension plus approfondie des mécanismes sous-jacents ouvre la voie à de nouvelles approches et stratégies thérapeutiques anti-inflammatoires dont les patients atteints de NASH pourront bénéficier.

Procédures

Les souris seront soumises à des interventions chirurgicales consistant en une section du nerf vague au niveau cervical côté gauche (vagotomie) ou des chirurgies contrôles sans section du nerf vague (Sham). Chaque souris subira une seule opération, qui durera environ 10 minutes et sera réalisée sous anesthésie et analgésie. Une période de récupération de 3 semaines suivra l’intervention. Ces procédures chirurgicales sont décrites en détail dans la littérature scientifique. Les observations indiquent que les souris récupèrent rapidement et complètement après la chirurgie, sans présenter de signes significatifs de douleur ou de détresse. Par la suite, les souris seront soumises à des régimes alimentaires, soit une diète standard, soit une diète riche en lipides induisant la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH). Ces régimes alimentaires ne sont pas associés à une détresse particulière. Nous examinerons l’impact de ce régime à 4 moments différents : une période courte de 4 semaines, une période intermédiaire de 8 semaines, une période de 16 semaines marquée par une inflammation avancée, et enfin, une période de 24 semaines caractérisée par une fibrose avancée. Des explorations dites métaboliques seront réalisées en fin de procédure impliquant un gavage des animaux avec du sucre (glucose) ou une injection d’insuline puis des prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile (5 petits prélèvements successifs sur une période de 2 heures). La durée des actes techniques de prélèvements de sang est de 5 à 7 minutes par souris, et de gavage est de 2 à 5 minute par souris. En toute fin de procédure, les souris seront placées dans un tube pendant 2 minutes avec une certaine restriction de mouvement pour mesurer leur quantité de graisse. Elles seront ensuite placées seules dans des cages de dimension réglementaire permettant des mesures de leur métabolisme, leur activité et de leur consommation d’eau et de nourriture. Avant l’euthanasie, un prélèvement sous-mandibulaire de sang sera réalisé d’une durée d’environ 30 secondes puis l’animal sera euthanasié conformément aux directives éthiques. Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Les éventuels effets indésirables chez les animaux sont principalement liés à la chirurgie (douleur physique passagère, hypothermie éventuelle durant l’anesthésie). Les observations montrent que les souris récupèrent rapidement et complètement après la chirurgie, sans présenter de signes de douleur ou de détresse significative. Dans le cadre de ce projet, certaines souris seront soumises à un régime gras (Western-type). Ce régime alimentaire ne devrait pas causer de douleur ou de détresse perceptible chez les souris, mais plutôt entraîner une prise de poids, qui sera étroitement surveillée tout au long de l’étude. Toutefois, en cas d’infection et non cicatrisation de la plaie, l’animal sera sorti de l’étude. Pour les explorations métaboliques, certaines procédures telles que la mise à jeun des animaux pendant 4 heures, le gavage de glucose, l’injection intra-péritonéale d’insuline ou de toxine diphtérique (une seule piqure abdominale) avec contention douce de l’animal et la microcoupure de la queue pour les prélèvements sanguins peuvent entraîner des périodes de stress et d’inconfort temporaires et de courtes durées pour les animaux. De plus, l’isolement nécessaire de la souris de ses congénères en cage de mesure calorimétrie peut également provoquer un stress de l’animal.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins est nécessaire pour explorer la maladie dans un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.

Réduction

Nous aurons besoin de 12 souris par groupe. Nous visons à minimiser le nombre d’animaux nécessaires tout en maintenant la robustesse des résultats. Pour assurer la solidité statistique de nos résultats, il sera nécessaire de reproduire les expériences sur deux lots de souris. Le nombre total d’animaux prévu est de 4608 souris. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins (réduction jusqu’à 25 pourcents).

Raffinement

Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long de la durée du projet, en minimisant la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft, maisons en carton, tunnels en carton ou carrés de coton compacté). Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris sera effectuée en ouvrant chaque cage. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. L’identification des animaux génétiquement modifié sera réalisée par le personnel qualifié et formé de l’animalerie. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée et entraînera un isolement si nécessaire. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne devraient pas être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal, conformément aux directives éthiques. En ce qui concerne les chirurgies, les animaux seront soumis à une anesthésie générale par injection intrapéritonéale. Une dose préventive d’antalgique sera administrée avant la chirurgie, puis renouvelée toutes les 8-12 heures pendant 48 heures. Un gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter le dessèchement de la cornée pendant l’anesthésie. Lors de la chirurgie, réalisée sur un tapis chauffant pour maintenir la température de l’animal, une attention particulière sera portée sur sa fréquence respiratoire. Un rétablissement complet sans douleur ni détresse notable devra être observé après la chirurgie. Une grille de suivi sera mise en place avec pesée hebdomadaire des animaux. Une perte de poids de 20 pourcents dans les jours suivant la chirurgie sera considérée comme point limite et entrainera l'euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH) chez la souris. La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement de la NASH. Plus particulièrement, elle est capable d’intégrer les réponses immunitaires observées chez les êtres humains. En outre, la souris est un modèle bien établi pour l’étude de la NASH et des effets de la vagotomie. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines à leur entrée dans la procédure expérimentale. Nos études requièrent que les animaux aient un métabolisme, un système immunitaire et vasculaire mature. Les souris entreront en procédure à 8 semaines et en ressortiront à 15, 19, 27 et 35 semaines. L’âge des animaux est suivi par rapport à leur date de naissance qui sera sur les étiquettes des cages ainsi que dans le logiciel de gestion des animaux.

Quarante-deux jours d'administration quotidienne par gavage ou par injection, et une colite entretenue par un produit chimique ajouté à l'eau de boisson sur des cycles de cinq jours espacés de neuf : 1 200 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Le produit altère le côlon, provoque des diarrhées et une perte de poids d'environ 10 % malgré une alimentation normale. La molécule testée a déjà passé un essai de phase 2 chez des patients atteints de rectocolite hémorragique et se trouve en phase 3, et il s'agit ici de tester son association avec d'autres composés en vue d'une autorisation de mise sur le marché. Le porteur retient des souris de neuf semaines, âge qu'il décrit comme optimal pour une colite ni trop importante ni trop mineure.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (rectocolite hémorragique et maladie de Crohn) touchent plus de 0,3% de la population mondiale et sont de plus en plus fréquentes avec l'industrialisation des pays. Les traitements existants ne sont parfois pas efficaces ou non-suffisamment efficaces avec une très grande variabilité au sein des malades. Ainsi, la proposition de nouvelles thérapies est nécessaire. Notre molécule a montré une efficacité anti-inflammatoire dans le modèle murin de colite et chez le patient atteint de rectocolite hémorragique lors d'un essai clinique de phase 2 et est actuellement évaluée dans un essai de phase 3. Dans l’objectif d’une autorisation de mise sur le marché de cette molécule en tant que médicament, nous voulons étudier la possibilité de l’associer avec d’autres composés déjà sur le marché ou en développement, pour améliorer la réponse des patients au traitements.

Bénéfices attendus

La démonstration de l’intérêt d’une association de notre molécule avec d’autres thérapies existantes, permettra d’offrir de nouvelles possibilités aux malades qui ne répondent pas aux traitements actuels des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

Procédures

Les animaux seront exposés à l'ingestion d'un produit chimique ajouté à l'eau de boisson sur des périodes de 5 jours entrecoupées de 9 jours. Ils recevront un traitement par voie orale ou par injection (intrapéritonéale ou intraveineuse) de façon quotidienne sur une durée de 42 jours maximum. Cette procédure est non douloureuse et réalisée avec une contrainte faible en environ 10 secondes. Une prise de sang sera réalisée à la fin du protocole afin d'analyser différents paramètres biologiques. Cette procédure est réalisée sous anesthésie et est réalisée en maximum 30 secondes. Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus chez les animaux résultent de l’administration d’un composé chimique qui mime une inflammation du colon chez l’homme. Ce produit chimique induit une altération du colon provoquant une inflammation suivie par une perte de poids de l’ordre de 10% chez les souris, malgré une alimentation et une hydratation normale, et des diarrhées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus et évaluer l’efficacité du traitement.

Remplacement

Nous voulons étudier le traitement d’une inflammation du colon et pour cela seule l’utilisation d’un modèle murin est adaptée car il permet d’étudier les effets sur un organisme vivant dans son intégralité étant donné que ce traitement a vocation d’être ensuite utilisé chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats solides garantis par des analyses statistiques. Le nombre de souris pour chaque groupe est fixé à partir des résultats précédemment obtenus dans un modèle d’inflammation murine du colon et les données recueillies dans la littérature.

Raffinement

La surveillance des animaux se fera régulièrement avec une évaluation du stress et de la douleur grâce à l'utilisation d'une grille de score, permettant d'évaluer l'atteinte des points limites. L'administration répétée des composés par voie orale ou injection sera réalisée par du personnel entrainé à un geste précis et rapide, ceci afin de limiter le stress de l'animal. L'hébergement des souris sera enrichi par l'ajout dans les cages de cabane en carton et de cotons, favorisant par exemple la construction de nids. Un fond musical est également assuré dans les locaux afin de diminuer le stress des animaux. Lors des périodes de récupération des animaux, de la pâtée alimentaire sera également distribuée dans les cages pour favoriser leur hydratation.

Choix des espèces

Le modèle murin d’inflammation du colon est très documenté et permet de reproduire les symptômes et les mécanismes immunitaires de la rectocolite hémorragique chez l'homme. C’est un modèle très utilisé car sa mise en place est rapide et non invasive (ajout d’un composé chimique dans l’eau de boisson) tout en offrant une bonne reproductibilité des résultats, évitant ainsi la répétition des études et limitant l’utilisation d’animaux. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 9 semaines car c’est l’âge optimal pour une induction de la colite qui ne soit ni trop importante ni trop mineure pour observer des effets des composés thérapeutiques.

Toutes tuées pour analyser l'infiltration inflammatoire de leur muscle cardiaque, 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 45 reçoivent des cellules tumorales implantées dans le pancréas au cours d'une intervention de vingt minutes, 45 autres des cellules de tumeur pulmonaire sous la peau du flanc, et 60 portent quinze jours une mini-pompe osmotique sous-cutanée qui diffuse l'hormone testée. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale gêne les déplacements dans les derniers stades et réduit la prise alimentaire. Il justifie le recours à la souris par sa reproduction rapide et son nombre de naissances, et fixe les effectifs sur une bibliographie qui, écrit-il, suggère dix à quinze souris par procédure.

Objectifs

L'obestatine est une petite hormone produite principalement dans le tube digestif et distribuée dans divers organes et tissus. Cette hormone a des effets très bénéfiques sur le muscle squelettique, dont elle favorise la régénération. Cependant, le rôle de cette hormone dans le tissu musculaire cardiaque pathologique demeure peu clair de nos jours. Par conséquent, l'objectif principal de la présente étude est d'explorer la capacité de l'hormone en tant que traitement possible de la pathologie cardiaque associée à la perte musculaire consécutive au cancer. L'atrophie et la fonte musculaire sont des complications extrêmement graves du cancer et constituent la principale cause de décès chez de nombreux patients. L'atrophie et le dysfonctionnement du muscle cardiaque sont communs à pratiquement tous les types de tumeurs, réduisant la qualité de vie des patients. Au cours des dernières décennies, la réponse immunitaire s'est imposée comme une composante majeure de la pathologie cardiovasculaire et du muscle cardiaque. Pour cette raison, il nous semble intéressant de réaliser cette étude dans laquelle nous établirons : - Le profil des cellules inflammatoires qui atteignent le cœur en présence de différentes tumeurs. - Le rôle de l'hormone sur ces populations inflammatoires atteignant le cœur.

Bénéfices attendus

- Identification de nouvelles voies thérapeutiques ou de traitements liés aux cellules inflammatoires infiltrant le cœur. - Établissement de la petite hormone obestatine comme agent thérapeutique anti-inflammatoire potentiel.

Procédures

Au cours du développement de ce projet, les souris seront soumises à 4 interventions différentes : 1.- Echographie du cœur: Cette intervention sera réalisée sur toutes les souris du projet. L'acquisition a une durée de 10 minutes. Toutes les souris seront soumises à cette ntervention. 2.- Anesthésie : une anesthésie sera pratiquée pendant les échographies, pendant l'implantation des cellules tumorales et lors de la pose de mini-pompes osmotiques. La durée de l'anesthésie pendant l'échographie sera de 10 minutes. La durée de l'anesthésie pendant l'implantation des cellules tumorales sera de 20 minutes (pancréas) et 5 min (sous-cutanée). La durée de l'anesthésie pendant la pose de mini-pompes osmotiques sera de 10 minutes. Toutes les souris seront soumises à cette intervention. 3.- Induction de tumeur pancréatique: Des cellules tumorales pancréatiques seront implantées dans le pancréas sain de souris. Le développement de la tumeur dure trois semaines. A effectuer sur 45 souris. Intervention d'une durée de 20 minutes 4.- Induction tumorale sous-cutanée: Des cellules tumorales du pulmon seront implantées sur le flanc de la souris. Le développement de la tumeur dure quatre semaines. A effectuer sur 45 souris. Intervention d'une durée de 5 minutes 5.- Pose de mini-pompes osmotiques sous cutanées et infusion continue de l’hormone: les mini-pompes resteront implantées pendant 15 jours. A effectuer sur 60 souris. Intervention d'une durée de 10 minutes

Impact sur les animaux

- L'utilisation de l'anesthésie pour procéder à l'immobilisation de l'animal peut entraîner une baisse de la température de l'animal. - L'implantation de cellules tumorales dans le pancréas expose les animaux à un risque de blessure et peut provoquer une douleur modérée au niveau de l'incision. Les souris peuvent avoir une mobilité réduite. L'implantation de cellules tumorales sous-cutanées implique une petite piqûre, sans irritation observable. Les animaux peuvent simplement présenter des symptômes de stress. - Le développement de la tumeur dans les deux modèles peut entraîner une gêne pour les animaux, en particulier en ce qui concerne la mobilité dans les derniers stades du développement de la tumeur. Dans les deux modèles, les souris peuvent présenter une réduction de l'ingestion. - La mise en place de mini-pompes expose les animaux à un risque de blessure et stress.

Devenir

A l'issue de chacune des procédure les animaux seront mis à mort afin que l'infiltration inflammatoire du muscle cardiaque puisse être analysée.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux pour l'étude des pathologies est standardisée et largement utilisée. Cette étude serait irréalisable chez l'homme, et bien qu'il existe des modèles animaux peut-être plus proches de l'homme, des éléments tels que leur acceptation par la communauté scientifique, leur coût/bénéfice, et leur disponibilité (stabulation, protocoles expérimentaux, nombre d'animaux, etc.), explique l’utilisation de modèles murins, adaptés à ce type d'étude. Les modèles in vivo sont une étape essentielle dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des complications cardiaques. Il n'existe actuellement aucun modèle cellulaire ni aucune approche computationnelle permettant de visualiser le problème de l'acquexia.

Réduction

La bibliographie examinée suggère l'utilisation d'un nombre compris entre 10 et 15 souris pour les procedures signalées ci-avant. Ce nombre est décrit comme le plus approprié pour obtenir des données fiables et une analyse statistique robuste. On essaiera d'obtenir le maximum d'informations à partir d'un seul animal afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés

Raffinement

Les animaux seront logés dans des cages avec un maximum de 5 animaux par cage. L'air, l'humidité et la température doivent être contrôlés dans l'animalerie. Les animaux doivent avoir accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Afin de réduire les comportements nuisibles ou anormaux, les animaux doivent bénéficier de techniques d'enrichissement appropriées. Toutes ces techniques d'enrichissement permettent aux animaux de développer des capacités d'adaptation telles que la recherche de nourriture, la manipulation et les activités d'exploration. La surveillance des animaux s'effectue selon une grille de score de points limites.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. Grâce à ces modèles de souris, nous pouvons obtenir très rapidement des résultats pour la recherche, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce dont la reproduction serait beaucoup plus longue et dont le nombre de naissances serait beaucoup plus faible. Les animaux adultes ont été choisis pour le projet car ils ont une réponse inflammatoire suffisamment élevée pour être surveillée.

Des souriceaux nouveau-nés, des souris juvéniles sevrées et des femelles gestantes sont commandés selon la demande d'utilisateurs académiques et industriels. 5 120 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, irradiées 218 secondes ou traitées chimiquement, puis greffées par injection de cellules souches humaines sous anesthésie. Environ 80 % passent le contrôle qualité et sont expédiées vivantes aux utilisateurs finaux qui poursuivront les expériences, les autres sont tuées dans les jours qui suivent puisqu'elles ne sont plus utilisables. Le porteur présente cette production de souris humanisées comme un "service" et la range dans la règle des 3R, au motif que ces animaux réduiraient le nombre d'individus utilisés plus tard.

Objectifs

Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Bénéfices attendus

Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).

Procédures

Procédure 1: Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques puis, immédiatement traité avec un antibiotique pendant 2 semaines, dans le but de prévenir toute infection. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris. Procédure 2: Afin de rendre les souriceaux permissifs à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux seront irradiés 1 seule fois (durée irradiation dépendante de la souche de la souris) afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection de cellules souches humaines dans le foie. Un prélèvement de phalange sera réalisé afin de permettre leur identification ainsi que leur génotypage. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera à l’aide de prélèvement sanguin à entre 9 et 12 semaines après l’humanisation.

Impact sur les animaux

Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.

Devenir

Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >20% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux (utilisation continue chez l'utilisateur final). Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).

Remplacement

Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.

Réduction

Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet, l’ajout de coton…

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. L’âge des animaux au moment de leur inclusion dans le présent projet dépendra de la demande et de l’objectif scientifique de l’utilisateur final. Le projet pourra donc utiliser aussi bien des souriceaux nouveaux nés que des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines). Les doses, volumes et voies d’administration seront adaptés au stade de développement des animaux utilisés. Dans le cas de la procédure 1 nous pourrons : recevoir directement des souris sevrées avant envoie (juvénile) ; ou recevoir des femelles gestantes et réaliser la procédure sur les nouveau-nés une fois l’âge de 4 à 5 semaines atteint.

Des injections quotidiennes d'immunoglobulines prélevées chez des patients, pendant sept à dix-sept jours, provoquent chez la souris une myopathie nécrosante avec perte de force musculaire. 154 souris, dont une partie immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les muscles gastrocnémiens. Elles subissent en plus deux à quatre microprélèvements sanguins sous anesthésie, jusqu'à cinq tests d'agrippement et une mesure de force in situ de dix minutes. Le porteur affirme que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance, tout en décrivant une échelle qui va de la queue traînante à la paralysie du train arrière et un protocole arrêté au score 2.

Objectifs

Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante nécrose des fibres musculaires sans infiltrat inflammatoire. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) ; dont l'aAc anti SRPP (anti-3-Hydroxy-3-MethylGlutaryl-Coenzyme A Réductase) avec une corrélation du titre avec la myolyse. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris d'immunoglobulines G purifiées issues de patients porteurs cet d’aA anti-HMGCR. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’IgG et de molécules du sytéme du complément à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc et suggérant un rôle cytotoxique exclusif du complément. Nous avons déja démontré l'efficacité préventive d'un inhibiteur spécifique du complément. L'objectif général de notre programme est d'évaluer l'efficacité thérapeutique d'un nouvel inhibiteur spécifique du complément humain dans notre modèle murin de MNAI par transfert d'anticorps de malades et de la comparer à celle d'un autre inhibiteur commercialisé mais de spécificté différente et de la molécule antagoniste. Pour ne pas avoir de réponse xénogénique lors de la procédure évaluant le rôle curatif de cette molécule, nous aurons recours à des souris immunodéficientes. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.

Bénéfices attendus

Lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal, nous avons pu démontré l'efficacité de molécules thérapeutiques dans (i) l'apparition et (ii) le traitement de la myopathie. Cela s'est traduit par respectivement (i) une absence d'atteinte histologique et de diminution de la force musculaire et (ii) par une réduction significative de l'atteinte histologique et une restauration de la force musculaire. Avec ce nouvel inhibiteur du fragment C2 du complément nous pouvons nous attendre à une restauration partielle ou complète de la fonction musculaire de l'animal ouvrant ainsi la porte à un essai clinique chez les patients atteints de MNAI.

Procédures

Les animaux seront soumis à des microprélèvements de sang (2 à 4 en fonctions des groupes d'animaux) de 75 microlitres, prélèvement sur souris anesthésiée, durée de l'acte 20 secondes. Les souris seront injectées quotidiennement avec du complément, par voie intra péritonéale (IP), durant 7 à 17 jours selon les groupes, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection des immunoglobulines G en IP, de 2 à 5 fois par souris selon les groupes, sur respectivement une période de 7 à 17 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Une mesure de la force musculaire par test d'agrippement (grip test) sera réalisée pour chacune des souris, durée moins de 10 secondes, jusqu'à 5 tests sur le temps de suivi des souris. Mesure de la force musculaire in situ-sur souris anesthésiée, 1 seule mesure par souris, en fin de procédure, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal dans l'évaluation de molécules thérapeutiques a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercussion visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids.

Devenir

Le prélèvement des gastrocnémiens pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de moléculesinhibitrices du complément dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisée que chez l'animal.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autre protocoles expériementaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'auto-anticorps chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique excat des effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologique obervées lors de ces protocoles.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de celllose et des fibres de coton. De plus, en raison de leur sensibilité aux infections, les animaux seront maintenues en portoir ventilé. Les prélèvements sanguins, la mesure de la force musculaire et la mise à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie gazeuse grâce à un matériel dédié. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Cette échelle est définie de la façon suivante: Score 0 : condition physiologique (pas de signe clinique) ; Score 1 : faiblesse du train arrière, queue trainante ; Score 2 : diminution de l’activité locomotrice des pattes arrières, courbure du dos significative ; Score 3 : paralysie du train arrière. Elle permettra également d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. En effet, les animaux seront observés quotidiennement et l'apparition de signes cliniques, poils hirsutes, perte de poids visible (sans pesée) ou prostration, ou lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes seront atteints entraineront la mise en place de dispositions pour réduire la douleur. Un traitement préventif quotidien de la douleur sera mis en place lors de la première injection des anticorps pour les animaux de tous les lots. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. Un analgésique sera administré en sous cutané 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement par un des tests adaptés.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.

Un agent cancérigène dans l'eau de boisson pendant seize semaines, ou une injection de cellules cancéreuses dans la bouche suivie d'une tumeur buccale qui gêne l'alimentation. 1 500 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tumeurs et des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet déclaré est de comprendre comment un composant de la matrice extracellulaire bloque les cellules immunitaires autour des cancers de la tête et du cou. Les atteintes décrites se limitent à l'anxiété et à la douleur transitoire des injections buccales, sans que soit précisé ce que quatre mois d'ingestion d'un cancérigène font subir aux 419 souris du modèle chimique.

Objectifs

Les cancers de la tête et du cou (ORL) représentent la 6ème cause de cancer humain avec une espérance de vie à 5 ans de 50%. On distingue ceux liés à une infection virale préalable et ceux provoqués par une exposition aux agents cancérigènes (tabac/alcool). La défense immunitaire permet de lutter contre le développement du cancer. Comprendre l’impact de l’environnement immédiat de ces cancers sur la défaillance immunitaire est donc cruciale. La Matrice Extra Cellulaire (MEC) structurant les tissus cancéreux a une constitution et une organisation spécifique qui favorise la progression cancéreuse. Nous avons identifié qu’un composant de la MEC des cancers ORL impacte la position des cellules immunitaires et la sévérité du cancer humain et d’un cancer ORL murin. Lorsque ce même modèle de cancer ORL se développe chez des souris qui n’expriment ce composant structurant, le cancer est moins grave et les cellules immunitaires ne sont pas séquestrées dans l’environnement de la tumeur. Notre objectif est de comprendre la nature des relations de contact entre les cellules immunitaires et ce composant au cours du développement du cancer et de déterminer quand et comment ce composant modifie les performances immunitaires. Ceci permettra d’améliorer nos connaissances sur les relations de proximité au sein des cancers ORL et sera important pour la recherche préclinique en identifiant de nouveaux traitements pour stimuler la défense immunitaire. Sur cinq ans, nous développerons trois modèles de cancers mimant les cancers ORL humains chez la souris normale, sans ce composant structurant ou sans un type immunitaire pour dévoiler les relations entre la défense immunitaire et notre composant structurant au cours de la croissance tumorale: Le premier modèle consiste en l’administration pendant 16 semaines d’un dérivé de la nicotine dans la boisson des souris pour mimer le cancer lié au tabac. Les tumeurs collectées en fin de procédure permettront d’identifier les défaillances de la défense immunitaire à différents stades du cancer; Deux modèles de greffe tumorale buccale par injection de cellules cancéreuses indépendantes d’une infection virale ou dépendante d’une infection virale. Ils permettront de comparer les mécanismes de défense immunitaire dans les cancers dépendant ou non d’une infection virale et leur défaillance. Ces modèles courts seront utiles pour déterminer le rôle de cellules particulières de la défense immunitaire et pour l’évaluation de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’identifier les relations microscopiques entre la défense immunitaire et un composant structurant et les conséquences de ces interactions sur la nature, la fonction des cellules immunitaires, la croissance cancéreuse et la structure du tissu malade. A terme, ces travaux permettront d’identifier des pistes nouvelles de stimulation du système immunitaire dans les cancers ORL afin de stimuler la défense immunitaire. Les modèles murins de développement de cancer ORL que nous proposons de développer et caractériser représente un outil indispensable pour déterminer les relations complexes et temporelles en place au sein des tumeurs. Ces études chez la souris poseront les bases d'une étude translationnelle chez l'Homme. Les résultats de cette étude serviront aussi au developpement de modèles in vitro pertinents.

Procédures

1 Modèle chimique: Administration d'un agent cancérigène dans l'eau de boisson pendant 16 semaines n'ayant pas d'impact direct sur l’alimentation (16 semaines par souris, 419 souris maximum). 2 Modèles de greffe buccale: 1 injection de cellules cancéreuses dans la bouche et une injection dans l'abdomen pour l'anesthésie pour contrôler la douleur et l’anxiété due à l'injection des cellules cancéreuses dans la bouche (2 injections totales par souris, 780 souris maximum). Elimination d'une population de la défense immunitaire pour évaluer son rôle dans la croissance cancéreuse par injection dans l'abdomen d'une drogue: 8 injections dans l'abdomen par souris (modèle chimique) sur 80 souris maximum et 2 injections dans l'abdomen par souris (modèles de greffe tumorale) sur 160 souris maximum.

Impact sur les animaux

les injections de cellules cancéreuses dans la bouche peuvent générer de l'anxiété et une douleur transitoire correspondant à une nuisance modérée. Lla croissance des tumeurs buccales peut avoir un impact sur l'alimentation correspondant à une nuisance modérée

Devenir

TOUS mis à mort en fin d'expérimentation afin de réaliser des gestes post-mortem (prélèvementsde tumeurs et d'organes pour analyses biologiques)

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre les relations complexes des cellules immunitaires avec l'environnement immédiat du cancer. Ce type d'étude est difficilement envisageable chez l'Homme car les prélèvements de cancer accessibles pour la recherche sont de très petites tailles et la rareté de nos cellules nous oblige à travailler sur du matériel biologique suffisamment important. Par ailleurs, nous ne pouvons pas étudier l’effet de traitements innovants visant soit à éliminer ou bloquer l’infiltration des tumeurs par certaines cellules dans des modèles in vitro. Or ce type d'analyse est un pré-requis pour pouvoir valider de nouvelles cibles d'immunothérapie chez l'homme. Ces travaux permettront également de mieux comprendre les relations complexes responsables de la croissance cancéreuse, ce qui permettra dans le futur de développer des modèles alternatifs in vitro découlant de nos résultats par ingenierie du tissu.

Réduction

Nous avons déterminé les effectifs de nos groupes de manière à obtenir une forte validité statistique (avec puissance de 0.8) avec un minimum d’individus et notre projet a été conçu pour optimiser la quantité d’informations analysables. Le nombre total d'animaux requis est de 1500 pour l'ensemble et la durée totale du projet. Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux, nous procéderons à une analyse séquentielle. Une première série d’expériences permettra de développer les modèles murins et de définir les conditions optimales d'expérimentation (n: 260 souris/an sur deux ans). Nous utiliserons ensuite trois modèles tumoraux optimisés dans des souris sans composant structurant et leur contrôle. Le schéma d'accouplement de ces souris a été optimisé pour obtenir 50% de souris avec et sans composant structurant par couplage et les males et les femelles seront utilisés pour réduire le nombre d'animaux inutiles (n: 150 souris par an pendant 4 ans). De plus, nous utiliserons également des souris males et femelles dans laquelle une population immunitaire est éliminée et leur contrôle dans les trois modèles tumoraux (n: 480 souris maximum). Nous réduirons ce nombre de 160 souris si nos résultats antérieurs démontrent que le modèle chimique et un modèle de greffe ont des caractéristiques similaires. Dans ce cas les expériences ne seront menées que sur deux des trois modèles tumoraux.

Raffinement

Afin d’améliorer les conditions d’hébergement réglementaires des animaux (porteurs ventilés, 5 animaux par cage, objets déplacés régulièrement pour stimuler la curiosité) dans le contexte de cette pathologie buccale, du gel nutritif est ajouté dans la cage afin de faciliter l’alimentation après les injections de cellules cancéreuses. Les injections de cellules cancéreuses sont réalisées sous anesthésie en présence d'un médicament anti-douleur afin de contrôler l'anxiété et la douleur liée à l'injection. Les signes de l'évolution du cancer, le suivi des animaux seront effectués conformément à une grille d’évaluation permettant de définir un niveau de douleur/souffrance à partir duquel les animaux concernés seront mis à mort. Plus particulièrement, il est à noter que les modèles cancéreux seront établis de façon à limiter la croissance tumorale a un volume de 20% en deça du point limite éthique afin d’éviter une souffrance liée à un problème nutritionnel et le suivi quotidien du comportement et une pesée bi-hebdomadaire des animaux permettra de détecter les signes précoces de souffrance. Enfin les souris dans lesquelles notre population immunitaire d'intérêt peut être éliminée par injection d'une drogue ont un phénotype attendu non dommageable mais le bien-être des souris (poids, posture et mobilité) sera documenté hebdomadairement dès le début de l'expérimentation afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Les modèles murins de tumeurs ORL que nous proposons de développer et d'utiliser permettront de caractériser un environnement complexe qui mime les tumeurs humaines. Ce type d’analyse détaillée est un pré-requis pour pouvoir identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et identifier de nouvelles approches d’immunothérapie chez l’homme. Les souris seront mises en expérimentation à un âge de 8 semaines, âge auquel le système immunitaire est mature.