Troubles immunitaires

Quatre injections dans le péritoine, une injection dans la veine rétro-orbitale, une injection directement dans le foie, cinq anesthésies gazeuses suivies de séances d'imagerie et deux anesthésies générales profondes: 2 138 souris génétiquement immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris reçoivent des cellules souches ou des progéniteurs sanguins humains, corrigés ou non, pour vérifier que ces cellules se développent dans un organisme vivant. Le porteur indique que cette étape est exigée par l'Agence nationale de sécurité du médicament avant toute demande d'essai clinique chez l'être humain. L'effectif de 2 138 animaux n'est adossé à aucun calcul de puissance statistique, il a été dimensionné "en fonction de notre expérience du modèle" et de la variabilité observée lors de projets antérieurs.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester in vivo dans un modèle murin l’innocuité et l’efficacité de nouveaux protocoles thérapeutiques pour des déficits immunitaires sévères. Ces déficits sont des pathologies très graves qui touchent les cellules sanguines et immunitaires, indispensables à la lutte contre les agents infectieux. Ils sont dûs, soit à une mutation dans un gène indispensable au développement ou à la fonction des cellules sanguines, soit à des traitements contre le cancer du sang, dans le cas de leucémie par exemple. Pour toutes ces pathologies, la greffe de moelle osseuse provenant d’un donneur sain est une option thérapeutique largement utilisée, mais la survie après greffe est très hétérogène et peut être inférieure à 30%. De nouvelles approches thérapeutiques doivent donc être absolument développées pour augmenter la survie de patients greffés. Notre objectif est d’explorer l’efficacité de trois nouveaux traitements de thérapie cellulaire (injection de progéniteurs des cellules sanguines), et de thérapie génique (injection de progéniteurs des cellules sanguines ou cellules souches, génétiquement modifiés). L’efficacité de ces approches innovantes doit absolument être validée dans un modèle animal car cette étape est exigée par l’Agence Nationale de la Santé et du Médicament avant tout essai clinique chez l’homme. Il existe un modèle de souris génétiquement modifiée pour être atteinte de déficience immunitaire et qui peut recevoir des cellules sanguines humaines pour qu'elles se développent sans effet délétère. Selon l’âge des souris receveuses, les cellules humaines seront injectées en intraveineuse ou en intrahépatique et la reconstitution immunitaire sera suivie par des prélèvements d’organes lymphoïdes après la mise à mort.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place de nouvelles thérapies dans le cas de déficits immunitaires sévères. Plus spécifiquement, les différentes études sur les progéniteurs de cellules sanguines nous permettront de choisir le protocole de production le plus optimisé pour leur capacité à se développer dans le corps. Par ailleurs, les protocoles impliquant la modification génétique des progéniteurs ou cellules souches visent à évaluer l’efficacité de telles stratégies de remplacement de gènes défectueux et notamment en vérifiant la bonne évolution des cellules génétiquement corrigées chez la souris, et ce durant leur développement. A terme, l’ensemble de ce projet permettra la mise au point jusqu’au stade clinique de protocoles thérapeutiques personnalisés avec une survie améliorée pour tous les patients atteints de déficits immunitaires.

Procédures

Les animaux subiront selon leur utilisation, soit 1 ou 2 : Injection intrapéritonéale (4X), 10s par intervention. Injection intraveineuse rétro-orbitale (1X), 30s par intervention. Anesthésie générale profonde (2X), 2min par intervention. Injection intrapéritonéale (1X), 10s par intervention. Injection intrahépatique (1X), 10s par intervention. Anesthésie gazeuse (5X), 10min à 30min. Imagerie optique (5X), 10min à 30min par intervention. Anesthésie générale profonde (1X), 2min par intervention.

Impact sur les animaux

Les altérations génétiques des animaux provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. A la dose utilisée, l'agent de conditionnement n'induit pas d'effet indésirable majeur mais une douleur transitoire durant les heures post-injectio. L’anesthésie légère gazeuse ou profonde générale par injection de produits anesthésiants peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. Les cellules souches et progéniteurs lymphoïdes ne provoquent pas d'effets indésirables et sont très bien tolérés chez les animaux. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée légère et un stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.

Remplacement

La mise en place d’essais précliniques sur modèles animaux, quand ceux-ci existent, est exigée par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés sur les cellules seront testés chez l’animal. Notre protocole de production de progéniteurs de cellules sanguines est déjà une méthode de remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches pour produire et expandre des cellules qui normalement se différencient en plusieurs mois dans la moelle osseuse. Nous utilisons un système de culture cellulaire, en évitant la maturation des cellules humaines chez la souris sur plusieurs stades. De même, la modification génétique des cellules sera faite dans la culture puis validée (efficacité de l’incorporation du gène sain, expression protéique du gène sain…) avant l’injection chez les animaux. En outre, la capacité des progéniteurs ou cellules souches, corrigées ou non, à se développer correctement, notamment en certains sous-type de cellules sanguines, sera également évaluée dans une culture cellulaire grâce à des tests déjà validés dans la littérature. Ils serviront à statuer sur la fonctionnalité potentielle des cellules avant leur injection chez les souris. Les expériences chez l’animal interviendront au terme d’un long développement et d’une caractérisation des produits cellulaires qui seront utilisés afin de ne traiter les animaux qu’avec les cellules dont les résultats sur les cellules seront suffisamment satisfaisants pour poursuivre chez l’animal. Ces expérimentations s’inscrivent dans le cadre d’une validation de la capacité de ces cellules, dans un organisme complet, à se développer. En effet, les expériences sur les cellules ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, la capacité à migrer et la persistance de nos cellules therapeutique.

Réduction

Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé en fonction de notre expérience du modèle en question, en prenant en compte la variabilité observée lors de précédents projets du laboratoire. De par la faible taille de nos groupes, nous nous attendons à ne pas pouvoir valider une distribution gaussienne de nos données et donc à privilégier des tests non paramétriques. Cependant, nous raisonnerons de manière méthodique en testant la possibilité d’une répartition en loi normale de nos jeux de données. Un premier test sera utilisé pour évaluer la répartition gaussienne de chaque groupe, suivi d'un test pour comparer les variances. Pour la comparaison entre deux groupes, si les données suivent une distribution gaussienne, nous aurons recours aux tests paramétriques. En cas de répartition non gaussienne, un test non paramétrique sera utilisé. Pour les comparaisons entre plus de 2 groupes, nous utiliserons soit un test d'analyse de la variance pour les données normales avec comparaisons multiples ou son équivalent non paramétrique en cas de répartition non gaussienne. Par ailleurs, afin de réduire au maximum la production de notre élevage de souris immunodéficientes, nous aurons recours à la synchronisation des trios en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.

Raffinement

Les animaux immunodéficients seront hébergés au sein d'un établissement dont le statut sanitaire apporte un niveau de stérilité permettant d’éviter toute souffrance dues à leur phénotype immunodéficient. Les souris seront hébergées à raison de 5 par cage sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson à leur volonté, la nourriture et l’eau sont stériles. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnels de polycarbonate rouge translucide (pour les activités journalières) destiné à diminuer le stress et stimuler leur activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Des gels riches en nutriments pourront être ajoutés dans la cage si le besoin s'en fait sentir (animal chétif ou faible). La souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score définissant des points limites spécifiques. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Chaque procédure invasive sera précédée d’une anesthésie générale profonde accompagnée d’une analgésie. Lors des anesthésies gazeuses, les animaux seront placés sur un plateau thermostaté permettant de maintenir leur température corporelle. La mise à mort de l'animal sera faite sous anesthésie générale afin de réduire leur stress.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente que nous avons choisie constitue le modèle de référence pour tester l’efficacité de nouvelles approches de thérapie cellulaire et génique des déficits immunitaires. En effet, ces souris immunodéficientes sont capables de soutenir le développement des différentes cellules sanguines humaines à partir de cellules souches. Nous utiliserons soit des souris femelles ou mâles de 4 à 8 semaines soit des souris nouveau-nés (moins de 4 jours). Les souris de 4 à 8 semaines supportent bien le traitement permettant de les “vider” de leur globules blanc les 2 jours précédant la greffe. Ce traitement à la dose choisie est sans toxicité majeure et permet d’une part de mimer la situation clinique de greffe, et d’autre part de « vider » la moelle des animaux afin de faire de la place pour les cellules humaines et faciliter leur différenciation dans toutes les lignées sanguines. La prise de greffe des cellules humaines est bonne chez les animaux âgés de 4 à 8 semaines. Les souris nouveau-nées (

Une anesthésie tous les deux jours pendant deux semaines, chacune précédée d'une injection intrapéritonéale: 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes. Elles reçoivent des cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, développent des tumeurs pulmonaires ou péritonéales, et certaines déclarent une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et perte de poils. L'objet est de tester deux modifications génétiques de cellules immunitaires humaines, censées mieux attaquer les tumeurs solides. Le porteur décrit les cocultures en deux et trois dimensions déjà menées au laboratoire, puis conclut que le modèle animal reste "indispensable" avant toute application clinique.

Objectifs

Le développement des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) a révolutionné l'immunothérapie du cancer pour certains types de cancer. Ce nouveau type de traitement par immunothérapie consiste à prélever les cellules immunitaires du patient, de les modifier génétiquement en laboratoire pour qu’elles expriment le CAR, puis elles sont réinjectées au patient afin qu’elles reconnaissent et combattent les cellules cancéreuses. Cependant, des améliorations des thérapies CAR restent nécessaires afin de cibler d'autres types de tumeurs et d'assurer une fonction antitumorale durable des cellules modifiées. Nous proposons ici deux nouvelles stratégies de modification génique ciblant chacune des cellules immunitaires différentes, les lymphocytes T et les macrophages, dans le but d'amplifier leurs fonctions antitumorales. Ces cellules sont des leucocytes (globules blancs) qui ont pour but de détruire d’autres cellules : les lymphocytes T détruisent les cellules reconnues comme étrangères (immunité cellulaire) ; et les macrophages phagocytes « mangent » les cellules étrangères ou leurs débris et participent à la présentation des antigènes et à la libération de cytokines. Dans la première stratégie, nous augmenterons la fonction antitumorale des cellules CAR issues de lymphocytes T, augmentant leur production d'interféron (cytokine/protéine produite par les cellules immunitaires afin d’activer la réponse immunitaire chez d’autres cellules impliquées dans la réponse inflammatoire) grâce à de nouveaux mécanismes que nous avons récemment découverts. Dans la deuxième stratégie, nous améliorerons la survie des CAR issus de macrophages, en les dotant d'une protection anti-apoptotique (=mécanisme de mort cellulaire). Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous utiliserons des approches expérimentales similaires dans les deux stratégies, pour établir la preuve de concept d'une activité antitumorale accrue in vivo. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie cellulaire par récepteurs antigéniques chimériques (CAR) permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler les tumeurs solides, ii) elle rencontre des rechutes et des résistances chez près de 50% des patients répondeurs à deux ans. Nous proposons donc deux stratégies pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, le tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires. La première stratégie permet l’amélioration de la fonction antitumorale des CAR-T (lymphocytes T modifier génétiquement). Cela est assuré par le contrôle de la production d’interféron par les cellules T. La forte production d’interféron induite par ces manipulations a permis l’augmentation de la capacité de destruction des cellules tumorales. La deuxième stratégie tend à améliorer la persistance et la survie des CAR-MAC (macrophages modifier génétiquement). Ces cellules sont prometteuses pour la thérapie cellulaire contre les tumeurs solides par leur capacité à se diriger vers la tumeur et leur capacité de phagocytose des cellules tumorales. La solution apportée pour améliorer leur survie a permis d’obtenir des effets thérapeutiques plus importants. De plus, elle a l’avantage de reposer sur une ingénierie génétique stable. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer » du système immunitaire (sous-catégorie de lymphocytes, proches des lymphocytes T, qui ont un rôle cytotoxique). Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.

Procédures

Dans les trois procédures, nous visons à évaluer l’effet d’un traitement cellulaire sur la progression tumorale, par différentes étapes : A. Plusieurs lots (un par lignée tumorale) d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de comparer la cinétique de progression des différentes lignées tumorales. B. D’autres lots d’animaux vigiles recevront les cellules thérapeutiques par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer la localisation et la persistance des cellules. C. D’autres lots d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après les animaux vigiles recevront un traitement par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer l’efficacité de notre traitement sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires humaines transplantées attaquent le corps de l'hôte, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux développeront des tumeurs pulmonaires ou dans le péritoine, en fonction de la voie d’injection. Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.

Remplacement

Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet, avec des lymphocytes T et monocytes modifiés, ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroïdes qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.

Réduction

En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera expriment la luciférase, ce qui permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence qui sera faite deux fois par semaine. Une corrélation entre le niveau de bioluminescence pour chaque lignée cellulaire utilisée et l’état général des souris (évalués à l’aide de la grille de score jointe) sera faite, afin de s’assurer que les tumeurs ne dépassent pas un niveau maximal de bioluminescence et éviter le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en recherche de thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 et 10 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique.

Les souris utilisées développent spontanément un diabète, perdent du poids et s'affaiblissent jusqu'à la mort en trois semaines environ. 802 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent six injections dans la peau du dos sous anesthésie en trois semaines, jusqu'à six administrations intranasales d'insuline modifiée, une injection rétro-orbitaire et un prélèvement de sang, pour mettre au point une allergie cutanée à l'insuline que le porteur décrit comme jamais décrite dans la littérature. L'apparition du diabète, d'érythèmes sévères ou d'un état général affaibli déclenche la mise à mort anticipée.

Objectifs

L'allergie à l'insuline est une complication rare mais qui pose de sérieux problèmes pour la prise en charge des patients diabétiques. Les manifestations allergiques incluent urticaire, éruption cutanée, hypotension, essouflement. Dans des cas extrêmes, ces réactions intenses et rapides sont susceptibles de provoquer la mort. Elles sont induites par des anticorps IgE dirigés contre l'insuline injectée. Les traitements actuels consistent en l’utilisation d’agents anti-histaminiques, de corticoïdes, mais également la sélection de préparations d’insuline moins allergènes et des pompes à insuline intrapéritonéale plus invasives. Cependant, aucun traitement de référence n’existe ciblant les causes immunologiques de cette maladie. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une nouvelle stratégie visant à diminuer les réponses allergiques, et induire ainsi une désensibilisation vis-à-vis de l’insuline. Nous utiliserons de l’insuline modifiée qui sera administrée par voie intranasale, ayant comme objectif d’être le moins invasif possible pour à terme facifiter le transfert à la clinique de cette stratégie. Ce choix a été motivé par un intérêt clinique grandissant pour cette voie d'administration pour délivrer des anticorps, combattre l'inflammation et bénéficier des mécanismes de tolérance immunitaire associés aux muqueuses. Dans ce projet, nous travaillerons dans un modèle de souris qui développe un diabète. Tout d'abord, nous mettrons au point un modèle de réaction allergique cutanée induite par sensibilisation d'insuline (mimant ainsi ce qui se passe chez les patients diabétiques), modèle qui n'a jamais été décrit dans la littérature. Nous testerons ensuite notre approche thérapeutique avec l'insuline modifiée administrée par voie intranasale et nous analyserons les mécanismes immuntaires induits.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’apporter la preuve de concept des effets thérapeutiques de notre insuline administrée par voie intranasale dans le contexte de l’allergie à l’insuline. Ainsi, en cas de succès, ces recherches pourraient aboutir rapidement à des essais cliniques chez les patients diabétiques présentant une allergie à l’insuline, pour laquelle il n’existe aucun traitement de référence à l’heure actuelle. Des résultats positifs sur les manifestations allergiques pourraient à plus long terme permettre d’envisager une application de la thérapie intranasale par insuline dans d’autres indications, en particulier le diabète de type 1 qui touche principalement les enfants et adolescents. En effet, des efforts sont développés pour la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prévenir cette maladie. Les thérapies envisagées doivent montrer une grande spécificité d’action et l’utilisation d’une voie d’administration non invasive pour être attractives pour une application clinique. Notre insuline intranasale remplit ces exigences.

Procédures

Injection intradermiques (au niveau de la peau du dos) sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois, 2 fois par semaines pendant 3 semaines. Administration intranasale sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois maximum (1/jour). Injection intraveineuse (rétro-orbitaire) sous anesthésie généralependant 5 minutes, effectuée seule 1 fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectué 1 seule fois.

Impact sur les animaux

Les souris femelles que nous utilisons développent un diabète (hyperglycémie). Elles perdent alors du poids et s’affaiblissent jusqu’au décès en environ 3 semaines. L'allergie cutanée à l'insuline, développée par le protocole mis en place, peut se manifester par des démangeaisons locales modérées et de courte durée (quelques minutes) ou des irritations légères de la peau. Enfin, les souris peuvent subir un léger stress lié aux injections intradermiques ou à l’anesthésie.

Devenir

Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des tests in vitro appropriés seront utilisés pour répondre à des questions mécanistiques précises visant à analyser l’impact de notre protéine sur les réponses immunitaires. Cependant l’expérimentation animale est indispensable pour évaluer in vivo l’efficacité thérapeutique de la stratégie proposée pour le traitement de l’allergie à l’insuline et comprendre les mécanismes immunitaires responsables de la pathologie et de l’effet thérapeutique observé. Les espérimentations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro, qui par ailleurs ne peuvent reproduire les différents stades de la réponse allergique.

Réduction

Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris allergique, plusieurs organes seront prélevés, incluant le tissue nasal, poumons, rate, ganglions, et peau pour de multiples analyses afin d’obtenir le maximum d’information biologiques et mécanistiques. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé nous ferons un premier élevage très restreint des souris afin de définir quelle est la lignée la plus adaptée pour l'induction de l'allergie à l'insuline avant de lancer un plus grand élevage pour les expériences d'immunothérapie avec l'insuline intranasale.

Raffinement

La réponse allergique cutanée sera induite par injections intradermiques d’insuline sur la peau rasée des souris. Afin de réduire au minimum la douleur et le stress des animaux, cet acte se fera sous anesthésie générale. Les souris sont sujettes à une surveillance accrue pendant les 20 minutes suivant l’anesthésie avec un réveil complet et une récupération de la mobilité. Aussi l’endroit de l’injection sera surveillé plusieurs fois par semaine afin de s’assurer qu’il n’y a pas d’irritation majeure de la peau suite à l’injection. De plus, travaillant sur un modèle de souris susceptible au diabète, des tests de glucosurie (concentration du glucose dans les urines) seront réalisés une fois par semaine afin de suivre l’évolution de la maladie. Enfin, de manière générale, la consommation d’eau, de nourriture, la motricité et le comportement de l’animal seront surveillés de manière hebdomadaire par les soigneurs et les expérimentateurs. La survenue du diabète (hyperglycémie), d’érythèmes sévères ou l’observation d’un état général affaibli entraineront la mise à mort anticipée de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans les études de l’allergie cutanée étant donné la bibliographie existente sur le sujet et la caractérisation des réponses allergiques chez cette espèce, et leur similitude avec les observations chez l'homme. Nos expériences seront réalisées chez des souris adultes (entre 8 et 15 semaines d’âge) avec un système immunitaire mature..

Rendues malades d'une colite hémorragique par un produit administré une semaine durant, ou d'un lupus par une injection de pristane dans la membrane entourant l'intestin, 1 080 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le lupus se déclare huit semaines après l'injection, et des prélèvements sanguins sont réalisés chaque mois sous anesthésie, pour évaluer deux molécules mises au point par l'équipe. Le porteur décrit une injection qui "n'induit peu d'inconfort et de douleur", puis annonce que certaines souris développeront des atteintes pulmonaires sévères et seront tuées en détresse. Il conclut que l'essai préclinique sur des souris récapitulant les manifestations humaines est "indispensable" avant tout essai chez les patients.

Objectifs

La Rectocolite hémorragique (RCH) est une maladie inflammatoire digestive sévère dont les causes sont mal comprises. De plus, cette pathologie peut être caractérisée par une résistance du traitement. Le lupus érythémateux systémique (LES) est une maladie auto-immune pouvant engendrer des atteintes cutanées, rénales, articulaire et vasculaire dont les cause ne sont pas encore bien comprise. De plus, les traitements actuellement disponibles ne permettent que de partiellement contrôler la pathologie. C'est pour ces raisons que le développement de nouveaux outils thérapeutiques tant pour le LES que pour la RCH est nécessaire pour une meilleure prise en charge des patients. De nouveaux mécanismes pathologiques communes à ces deux pathologies ont récemment été décrit et nous avons développé de nouvelles molécules afin de réguler ces mécanismes pathogéniques et de diminuer les atteintes d'organes. Les objectifs de ce travail seront donc d'évaluer le pouvoir thérapeutique des deux molécules développées par notre équipe et de les comparer aux traitements de référence ou en combinaison avec ces derniers pour amplifier leurs effets. Ces thérapeutiques étant nouvelles, et nécessitent une validation préclinique avant le passage éventuel chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les thérapeutiques actuellement disponibles pour les patients atteints de recto-colite hémorragique (RCH) ainsi que celles disponibles pour le lupus érythémateux systémique (LES) sont imparfait. En effet certains patients peuvent être résistant au traitement, de plus ces derniers peuvent aussi engendrer de lourds effets indésirables. En partant de ce constat, notre équipe essaye de développer de nouveaux outils thérapeutiques en rapport avec les derniers avancés sur la compréhension de la physiopathologie de ces deux maladies. Avant tout, essaie sur les patients l'essai pré-clinique sur des modèles murins permettant de récapituler les manifestations cliniques humaines est indispensable. Le bénéfice attendu à long terme est donc la génération de nouvelles molécules thérapeutiques pour traiter la RCH et le LES.

Procédures

Le modèle de colite induit en 1 semaines est utilisé pour cette étude est largement validé et utilisé dans la littérature engendrant de l'irritation et inflammation au niveau intestinal. La sensibilité des animaux a la maladie peut varier selon les individus et la détérioration de l’état général peut être plus rapide chez certains. Le poids et l’état général seront donc surveillés quotidiennement pendant la durée du traitement. Il est admis que si l’animal perd plus de 20% du poids du corps, il doit être euthanasié plus rapidement que prévu. Pour les prélèvements sanguins, les souris seront anesthésiées pendant 2 minutes le temps du prélèvement pour limiter leur inconfort. Le modèle murin de lupus est induit par une injection rapide durant moins de 30 secondes au niveau de la membrane entourant l'intestin, ce type d'injection est classique et n'induit peu d'inconfort et de douleur. La maladie lupique est induite a partir de 8 semaines après l'injection.

Impact sur les animaux

Le modèle de colite utilisé pour cette étude est largement validé et utilisé dans la littérature engendrant de l'irritation et inflammation au niveau intestinal. La sensibilité des animaux a la maladie peut varier selon les individus et la détérioration de l’état général peut être plus rapide chez certains. Le poids et l’état général seront donc surveillés quotidiennement pendant la durée du traitement. Il est admis que si l’animal perd plus de 20 % du poids du corps, il doit être euthanasié plus rapidement que prévu. Le modèle murin de lupus induit par le pristane est un modèle validé, certains animaux peuvent développer dans les premières semaines des atteintes pulmonaires sévères, mais ces souris vont rapidement être reconnu comme étant en détresse et seront rapidement euthanasié afin de limiter le plus possible la durée de leur detresse. Les animaux qui n'auront pas développé d'atteinte pulmonaire vont progressivement avoir une légère détérioration de leur fonction rénale.

Devenir

Tous les animaux utilisé seront euthanasié conformément à l'annexe IV de la directive 2010/63/CE. Cette mise a mort des animaux est neccesaire afin d'évaluer les paramétres immunologiques et l'évolution de la pathologie en fonction des différents traitements.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l’homme peut apporter la preuve de l’intérêt d’un traitement ciblant GPX4 ou le s- CD95L dans la RCH et le LES. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé statistiquement comme étant le nombre minimum d'animaux pour réaliser des tests statistiques robustes et permettant de conclure quant à l'efficacité thérapeuque de nos molécules.

Raffinement

1. Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance, perte de poids trop importante. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: certaines souris auront un prélévement sanguin une fois par mois et afin de limiter leurs stress, incomfort et douleurs ce geste sera fait sous anésthésie générale.

Choix des espèces

Souris C57Bl/6 : nous utiliserons ces souris car elles ont largement été utilisées dans la littérature avec le modèle DSS ou pristane et y sont sensibles.

59 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour le volet mené dans le premier des deux établissements de ce projet. Une chirurgie de 45 minutes ouvre un orifice d'un millimètre dans le crâne pour injecter dans le cervelet un vecteur produisant une molécule inflammatoire, puis cinq injections abdominales suppriment les cellules régulatrices de l'immunité. Le porteur indique un stress modéré lié aux manipulations répétées, une douleur post-opératoire possible sur la zone suturée et une perte de poids qui pourrait atteindre le point limite en cas de toxicité de la molécule. Il justifie le projet par la rareté des échantillons de patientes et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet de satisfaire le remplacement.

Objectifs

La pathologie qui fait l’objet de cette étude est caractérisée par une dégénérescence des neurones du cervelet. Les symptômes associés sont des troubles de l’équilibre et de la coordination conduisant à un handicap sévère en quelques mois. Elle touche principalement des femmes atteintes d’un cancer gynécologique (ovaire, sein). Chez ces patientes, le système immunitaire normalement responsable de détruire la tumeur, s’attaque également aux neurones du cervelet et les détruisent. Le diagnostic est confirmé par la détection d’anticorps présents dans le sang et dans le cerveau dont la caractéristique est de reconnaître les neurones du cervelet ainsi que la tumeur des patientes. La théorie en vigueur suppose que la tumeur est responsable de l’activation du système immunitaire et par des mécanismes encore mal compris, le système immunitaire va également s’activer dans le cerveau et détruire les neurones du cervelet. Afin d’étudier les mécanismes à l’origine de la pathologie, le recours à un modèle animal est indispensable à cause de la rareté des échantillons disponibles auprès des patients. Ce modèle permettra des analyses plus approfondies depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. L’objectif est donc de développer un modèle de la maladie chez la souris qui soit au plus proche de la maladie humaine. A ce stade l’objet de cette demande d’autorisation est d’évaluer et valider 2 méthodologies qui seront employées pour modéliser la maladie chez la souris. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Grâce à la modélisation de la maladie chez la souris, l’identification des mécanismes qui conduisent à l’activation des défenses immunitaires contre les neurones du cervelet permettra à terme de développer une thérapie efficace pour guérir les femmes atteintes par la maladie.

Procédures

Interventions réalisées à l’EU1 : -En début de protocole une chirurgie d’environ 45 minutes est réalisée sous anesthésie et analgésie pour l’injection dans le cervelet, à travers un orifice minime d’un millimètre dans l’os cranien, d’un vecteur capable de faire sécréter une molécule inflammatoire localement par les cellules immunitaires. -Un prélèvement de sang est effectué en quelques secondes sur animal anesthésié avant mise à mort. -Cinq injections d’une molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité seront faites par voie abdominale sur 2 semaines à 3 jours d’intervalle. Intervention réalisée à l’EU2 : une injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral est réalisée sous analgésie et anesthésie profonde sans réveil.

Impact sur les animaux

-Stress modéré induit par la manipulation répétée des animaux et leur contention -Une perte de poids engageant le point limite pourrait survenir dans le cas d’une toxicité de la molécule employée pour induire la suppression des cellules régulatrices de l’immunité. -stress lié à la contention pour réaliser le prélèvement de sang au niveau du sinus de l’oeil -douleur causée par les actes invasifs lors de la chirurgie sous anesthésie -Stress post-opératoire (physique, thermique, nutritionnel) et douleur potentielle sur la zone cutanée après suture. -Un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient être induits si l’inflammation est trop disséminée dans le cerveau. Elle devrait néanmoins rester localisée car l’injection est faite localement dans le cervelet et pas en intra-veineuse. -douleur causée par les actes invasifs nécessaires à l’injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral sous anesthésie profonde sans réveil

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Procédure N°1 : Les animaux seront mis à mort pour contrôler et analyser l’efficacité et la durée de la suppression des lymphocytes régulateurs de l’immunité. Procédure N°2 : Les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse du cervelet afin de valider la production intra-cérébelleuse d’une molécule pro-inflammatoire.

Remplacement

La maladie neurologique qui nous intéresse est caractérisée par la perte des neurones du cervelet et reste encore mal comprise. Les analyses possibles à partir des biopsies des patients sont très réduites de par la rareté de la maladie et concernent essentiellement les liquides biologiques (sérum, liquide céphalorachidien), et les tumeurs. Les biopsies de cerveau n’ont fourni que des informations sur la phase terminale de la maladie. Seul l’impact des anticorps sur le fonctionnement des neurones a pu être étudié sur coupe fraîche de cervelet de rat, mais l’effet observé n’est pas confirmé à l’échelle de l’animal. L’objectif de notre modèle est d’accéder aux mécanismes de la réponse immunitaire qui est dirigée initialement contre la tumeur pour en comprendre le rôle dans l’inflammation du système nerveux central. Aucun modèle cellulaire actuel ne permet de récapituler ces éléments de manière concomitante in vitro. Un modèle animal est donc indispensable pour atteindre nos objectifs et permettra une analyse complète depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance.

Réduction

Notre protocole vise à évaluer la fonctionnalité biologique de nos méthodologies et à déceler d’éventuels effets indésirables sur les capacités motrices de nos souris. En préambule, la qualité de 2 lots de molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité sera évaluée grâce à un effectif réduit à 6 animaux contrôles sans consommer inutilement l’effectif total prévu aux tests en cas de toxicité d’un lot. Pour assurer la significativité des résultats obtenus aux tests de motricité, un effectif minimum de 16 animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique de puissance pour chacune des 2 méthodologies. Avant la réalisation des tests de motricité, 3 ou 4 animaux supplémentaires devront être mis à mort à 3 moments clés pour réaliser les analyses biologiques et évaluer la fonctionnalité de la méthodologie employée. Ces moments clés ont été choisis sur la base des études publiées sur nos méthodologies et réduites au minimum sans compromettre le but visé en sus. De plus, les animaux employés aux tests de motricité serviront à un 4ème et dernier point d’analyse qui viendra compléter en terminal les 3 points d’analyse précédents. Ainsi aux 16 animaux précédemment mentionnés, s’ajoutent 12 animaux pour la 1ère méthodologie et 9 animaux pour la 2ème. Ainsi sont nécessaires au projet un total de 34 (6+16+12) et 25 (16+9) animaux, soit 59 animaux.

Raffinement

-Pour limiter le stress des animaux, les souris sont habituées quotidiennement à l’expérimentateur pendant une semaine avant le début de l’expérimentation (5 min par animal. -Une surveillance accrue du bien-être de l’animal grâce à un système de scorage permettra d‘anticiper la perte de poids, de la mobilité et du toilettage pour anticiper au maximum la survenue des points limites. -Une phase d’habituation aux tests de motricité est réalisée sur 4 jours. Une récompense type céréale est donnée en fin de test. Une cage refuge permet de réduire le stress de la traversée sur barre. Les appareils sont nettoyés pour éviter un stress lié à l’odeur des animaux précédents. - des animaux morts n’ayant subi aucune procédure expérimentale seront utilisés pour la mise au point des protocoles d’analyse avec des prélèvements effectués en post-mortem, et pour l’entrainement aux gestes de la chirurgie -Le prélèvement de sang dans le sinus de l'oeil est réalisé avant la mise à mort sous anesthésie gazeuse pour réduire le stress et la souffrance de l’animal. La chirurgie est réalisée sous analgésie sur animaux anesthésiés. Après induction de l’anesthésie, les griffes des animaux sont écourtées pour éviter les infections par grattage de la zone suturée en post-opératoire. Des soins post-opératoires sont appliqués : l’animal est placé dans une enceinte chauffée à une température de 36-38°C pour un réveil optimal en cage individuelle pendant 24h avec mise à disposition facilitée de nourriture (pâté de croquettes humidifiées) et de boisson (en gelée) renouvelées les 2 jours suivants, et avec du matériel de nidification neuf pour contrôler le maintien d’un comportement stéréotypé. L’injection d’analgésique sera répétée les jours suivant. Une surveillance du bien-être sera effectuée les heures suivant le réveil et quotidiennement les jours suivants grâce à une grille de scorage jusqu’à la cicatrisation, puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. Selon l’évolution de la cicatrisation, on appliquera de la crème cicatryl ou dermaflon sur la zone suturée pendant 3 jours. En point final, tous les prélèvements seront effectués après la mise à mort.

Choix des espèces

La souris sera utilisée en raison de l’abondance de littérature sur ce modèle couramment utilisé pour l’étude des pathologies neurologiques. En effet, il s’agit d’une espèce dont l’architecture cérébrale est proche de l’architecture du cerveau humain. La souris est également un bon modèle car il existe un répertoire important de cellules cultivées au laboratoire capables de former une tumeur chez la souris. Il existe aussi de nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées, comme celle que nous utilisons pour manipuler le système immunitaire qui nous aidera à comprendre les mécanismes pathologiques responsables de la maladie. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 à 8 semaines car elles sont sexuellement matures et ont presque atteint leur taille définitive.

Opérées du crâne pendant 45 minutes pour recevoir dans le cervelet un vecteur qui y fait sécréter une molécule inflammatoire, 59 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent cinq injections abdominales d'une molécule supprimant les cellules régulatrices de l'immunité, un prélèvement de sang dans le sinus de l'œil, puis une injection cardiaque de fixateur sous anesthésie profonde sans réveil. Le porteur indique qu'une perte de poids atteignant le point limite pourrait survenir si cette molécule se révèle toxique, et qu'un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient apparaître si l'inflammation se disséminait dans le cerveau. Les tests de motricité sont précisés, avec traversée sur barre, cage refuge et récompense en fin de test, et le porteur conclut qu'un modèle animal est "indispensable" faute d'échantillons de patientes en nombre suffisant.

Objectifs

La pathologie qui fait l’objet de cette étude est caractérisée par une dégénérescence des neurones du cervelet. Les symptômes associés sont des troubles de l’équilibre et de la coordination conduisant à un handicap sévère en quelques mois. Elle touche principalement des femmes atteintes d’un cancer gynécologique (ovaire, sein). Chez ces patientes, le système immunitaire normalement responsable de détruire la tumeur, s’attaque également aux neurones du cervelet et les détruisent. Le diagnostic est confirmé par la détection d’anticorps présents dans le sang et dans le cerveau dont la caractéristique est de reconnaître les neurones du cervelet ainsi que la tumeur des patientes. La théorie en vigueur suppose que la tumeur est responsable de l’activation du système immunitaire et par des mécanismes encore mal compris, le système immunitaire va également s’activer dans le cerveau et détruire les neurones du cervelet. Afin d’étudier les mécanismes à l’origine de la pathologie, le recours à un modèle animal est indispensable à cause de la rareté des échantillons disponibles auprès des patients. Ce modèle permettra des analyses plus approfondies depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. L’objectif est donc de développer un modèle de la maladie chez la souris qui soit au plus proche de la maladie humaine. A ce stade l’objet de cette demande d’autorisation est d’évaluer et valider 2 méthodologies qui seront employées pour modéliser la maladie chez la souris. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Grâce à la modélisation de la maladie chez la souris, l’identification des mécanismes qui conduisent à l’activation des défenses immunitaires contre les neurones du cervelet permettra à terme de développer une thérapie efficace pour guérir les femmes atteintes par la maladie.

Procédures

Interventions réalisées à l’EU1 : -En début de protocole une chirurgie d’environ 45 minutes est réalisée sous anesthésie et analgésie pour l’injection dans le cervelet, à travers un orifice minime d’un millimètre dans l’os cranien, d’un vecteur capable de faire sécréter une molécule inflammatoire localement par les cellules immunitaires. -Un prélèvement de sang est effectué en quelques secondes sur animal anesthésié avant mise à mort. -Cinq injections d’une molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité seront faites par voie abdominale sur 2 semaines à 3 jours d’intervalle. Intervention réalisée à l’EU2 : une injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral est réalisée sous analgésie et anesthésie profonde sans réveil.

Impact sur les animaux

-Stress modéré induit par la manipulation répétée des animaux et leur contention -Une perte de poids engageant le point limite pourrait survenir dans le cas d’une toxicité de la molécule employée pour induire la suppression des cellules régulatrices de l’immunité. -stress lié à la contention pour réaliser le prélèvement de sang au niveau du sinus de l’oeil -douleur causée par les actes invasifs lors de la chirurgie sous anesthésie -Stress post-opératoire (physique, thermique, nutritionnel) et douleur potentielle sur la zone cutanée après suture. -Un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient être induits si l’inflammation est trop disséminée dans le cerveau. Elle devrait néanmoins rester localisée car l’injection est faite localement dans le cervelet et pas en intra-veineuse. -douleur causée par les actes invasifs nécessaires à l’injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral sous anesthésie profonde sans réveil

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Procédure N°1 : Les animaux seront mis à mort pour contrôler et analyser l’efficacité et la durée de la suppression des lymphocytes régulateurs de l’immunité. Procédure N°2 : Les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse du cervelet afin de valider la production intra-cérébelleuse d’une molécule pro-inflammatoire.

Remplacement

La maladie neurologique qui nous intéresse est caractérisée par la perte des neurones du cervelet et reste encore mal comprise. Les analyses possibles à partir des biopsies des patients sont très réduites de par la rareté de la maladie et concernent essentiellement les liquides biologiques (sérum, liquide céphalorachidien), et les tumeurs. Les biopsies de cerveau n’ont fourni que des informations sur la phase terminale de la maladie. Seul l’impact des anticorps sur le fonctionnement des neurones a pu être étudié sur coupe fraîche de cervelet de rat, mais l’effet observé n’est pas confirmé à l’échelle de l’animal. L’objectif de notre modèle est d’accéder aux mécanismes de la réponse immunitaire qui est dirigée initialement contre la tumeur pour en comprendre le rôle dans l’inflammation du système nerveux central. Aucun modèle cellulaire actuel ne permet de récapituler ces éléments de manière concomitante in vitro. Un modèle animal est donc indispensable pour atteindre nos objectifs et permettra une analyse complète depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance.

Réduction

Notre protocole vise à évaluer la fonctionnalité biologique de nos méthodologies et à déceler d’éventuels effets indésirables sur les capacités motrices de nos souris. En préambule, la qualité de 2 lots de molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité sera évaluée grâce à un effectif réduit à 6 animaux contrôles sans consommer inutilement l’effectif total prévu aux tests en cas de toxicité d’un lot. Pour assurer la significativité des résultats obtenus aux tests de motricité, un effectif minimum de 16 animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique de puissance pour chacune des 2 méthodologies. Avant la réalisation des tests de motricité, 3 ou 4 animaux supplémentaires devront être mis à mort à 3 moments clés pour réaliser les analyses biologiques et évaluer la fonctionnalité de la méthodologie employée. Ces moments clés ont été choisis sur la base des études publiées sur nos méthodologies et réduites au minimum sans compromettre le but visé en sus. De plus, les animaux employés aux tests de motricité serviront à un 4ème et dernier point d’analyse qui viendra compléter en terminal les 3 points d’analyse précédents. Ainsi aux 16 animaux précédemment mentionnés, s’ajoutent 12 animaux pour la 1ère méthodologie et 9 animaux pour la 2ème. Ainsi sont nécessaires au projet un total de 34 (6+16+12) et 25 (16+9) animaux, soit 59 animaux.

Raffinement

-Pour limiter le stress des animaux, les souris sont habituées quotidiennement à l’expérimentateur pendant une semaine avant le début de l’expérimentation (5 min par animal. -Une surveillance accrue du bien-être de l’animal grâce à un système de scorage permettra d‘anticiper la perte de poids, de la mobilité et du toilettage pour anticiper au maximum la survenue des points limites. -Une phase d’habituation aux tests de motricité est réalisée sur 4 jours. Une récompense type céréale est donnée en fin de test. Une cage refuge permet de réduire le stress de la traversée sur barre. Les appareils sont nettoyés pour éviter un stress lié à l’odeur des animaux précédents. - des animaux morts n’ayant subi aucune procédure expérimentale seront utilisés pour la mise au point des protocoles d’analyse avec des prélèvements effectués en post-mortem, et pour l’entrainement aux gestes de la chirurgie -Le prélèvement de sang dans le sinus de l'oeil est réalisé avant la mise à mort sous anesthésie gazeuse pour réduire le stress et la souffrance de l’animal. La chirurgie est réalisée sous analgésie sur animaux anesthésiés. Après induction de l’anesthésie, les griffes des animaux sont écourtées pour éviter les infections par grattage de la zone suturée en post-opératoire. Des soins post-opératoires sont appliqués : l’animal est placé dans une enceinte chauffée à une température de 36-38°C pour un réveil optimal en cage individuelle pendant 24h avec mise à disposition facilitée de nourriture (pâté de croquettes humidifiées) et de boisson (en gelée) renouvelées les 2 jours suivants, et avec du matériel de nidification neuf pour contrôler le maintien d’un comportement stéréotypé. L’injection d’analgésique sera répétée les jours suivant. Une surveillance du bien-être sera effectuée les heures suivant le réveil et quotidiennement les jours suivants grâce à une grille de scorage jusqu’à la cicatrisation, puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. Selon l’évolution de la cicatrisation, on appliquera de la crème cicatryl ou dermaflon sur la zone suturée pendant 3 jours. En point final, tous les prélèvements seront effectués après la mise à mort.

Choix des espèces

La souris sera utilisée en raison de l’abondance de littérature sur ce modèle couramment utilisé pour l’étude des pathologies neurologiques. En effet, il s’agit d’une espèce dont l’architecture cérébrale est proche de l’architecture du cerveau humain. La souris est également un bon modèle car il existe un répertoire important de cellules cultivées au laboratoire capables de former une tumeur chez la souris. Il existe aussi de nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées, comme celle que nous utilisons pour manipuler le système immunitaire qui nous aidera à comprendre les mécanismes pathologiques responsables de la maladie. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 à 8 semaines car elles sont sexuellement matures et ont presque atteint leur taille définitive.

16 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées pour prélever leurs organes, à l'exception de celles dont la tumeur régresse complètement et qui pourront être inoculées une seconde fois. Elles reçoivent des cellules cancéreuses humaines par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique ou intra-mammaire, puis des injections de composés jusqu'à quotidiennes, sur des protocoles pouvant durer cent jours. Le porteur indique que la greffe de cellules immunitaires humaines peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte, et qu'un surdosage peut provoquer un orage cytokinique avec atteintes du pelage, plaies et perte de poids. Il qualifie d'"indispensables" les données produites pour faire progresser des candidats médicaments vers les dossiers réglementaires, à raison d'une cinquantaine d'études par an.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre en place les études et modèles permettant d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés modulant le développement et la fonction du système immunitaire dans différents modèles de pathologies sur le rongeur. Les informations générées seront indispensables pour permettre la progression du médicament au travers des futures étapes de développement et inclus l’identification des doses minimales produisant une efficacité, détermination de la pharmacocinétique et pharmacodynamie essentielle pour mettre en place les schémas de traitement appropriés et enfin les études d’efficacités. Ces données pré-cliniques sont un préalable aux essais cliniques et à l’enregistrement de molécules candidates et figureront dans les différents dossiers réglementaires. Le projet se décompose en plusieurs programmes de recherche chacun ciblant un aspect de la fonction du système immunitaire associé à une pathologie donnée pour atteindre un but clinique. 3 grands axes sont utilisés dans ce projet : 1- Evaluation de la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’une molécule modulant la réponse immunitaire (environ 15 études par an) 2- Evaluation de l’efficacité d’une molécule sur la réponse immunitaire humaine chez le rongeur pour le contrôle de croissance de tumeur humaine (xénogreffe) (environ 20 études par an) 3- Vaccination visant à la mise en place d’une réponse immunitaire protectrice anti-tumorale (environ 15 études par an).

Bénéfices attendus

En recherche préclinique, les études de pharmacocinétique et de pharmacodynamie (PK/PD) permettent de démontrer le lien direct entre la présence de la molécule d’intérêt dans le tissu et son activité in situ. Le but est de s’assurer qu’après traitement, les expositions de la molécule d’intérêt dans un ou plusieurs compartiments (sang, organes) sont associées à une activité du composé sur sa cible. De plus, certains de ces paramètres de pharmacodynamie mesurés chez l’animal peuvent devenir des biomarqueurs d’activité en clinique chez les patients. Ces modèles sont reconnus comme étant très prédictifs de l’efficacité de composés et permettent de rapidement écarter et abandonner des composés avant de mettre en œuvre un nombre important d’études d’efficacité nécessitant beaucoup d’animaux. Les immunothérapies sont de plus en plus nombreuses en cliniques et leur qualité est de plus en plus raffinées. Les composés développés aujourd’hui visent de plus en plus à être spécifique de protéines humaines et n’interagissant pas avec les protéines de souris. De plus, certains mécanismes immunologiques ne sont pas reproductibles de la souris à l’homme et inversement. Le développement de souris présentant un système immunitaire partiellement humain permet une évaluation pré-clinique plus précise des composés et une meilleure anticipation de possible effets secondaires dû à une sur activation du système immunitaire (orage cytokinique). L’évaluation de l’immunogénicité sur animaux est l’une des méthodes décrites pour démontrer l’efficacité préclinique des candidats vaccins avant d’envisager des études cliniques chez l’homme. Ces tests d’immunogénicité sont également très utiles pour mettre en place des tests libératoires des lots de vaccins pour leur utilisation en clinique humaine (libération des lots et suivi de la stabilité au cours du temps). Les essais d’immunogénicité permettent d’évaluer le bénéfice de différentes préparations vaccinales, d’identifier les composés nécessaires à la formulation vaccinale, d’évaluer les nouvelles voies d’administration, de nouvelles molécules adjuvantes ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin. Enfin, les mécanismes d’action et la caractérisation de la réponse immunitaire doivent être évalués pour comprendre la réponse immunitaire, voire, l’améliorer.

Procédures

Les gestes techniques concernant tous les animaux : • Tatouage (1 fois, 1min) sur animal vigile • Rasage (1 fois, 2min) sur animal vigile • Injection des cellules cancéreuses (1 fois) intra-péritonéale (20s) sur animal vigile ou par voie sous-cutanée (30s), intra-dermique(30s), intra-mammaire (30s), intra-veineuse au niveau de la veine caudale (30s), sur animal anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux • Injection de composés, unique ou répétées plusieurs fois (de quotidienne à 1 fois par semaine) sur animaux vigile par voie intra-péritonéale (10s), intra-musculaire (30s) ou Per Os (30s) ou intra-veineuse (30s) à la veine caudale. L’inoculation peut être faite sur animaux anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux par voie intra-veineuse à la veine caudale (30s), sous-cutanée (30s) ou intra-dermique (30s). • Pesée (3 fois par semaines) sur animal vigile (1min) • Mesure de la croissance tumorale sur animal vigile (3 fois par semaine) (2min) • Prise de sang (unique à hebdomadaire) à la veine sub-mendibulaire ou la veine caudale sur animaux anesthésie par anesthésie gazeuse (30s). Au total, la procédure 1 dure maximum 72h ;la procédure 2 dure maximum 100 jours. la procédure 3 :8 semaines à 6 mois selon les protocoles.

Impact sur les animaux

L’injection de composés modulant le système immunitaire peut conduire, si utilisé à des doses trop fortes à des effets secondaires indésirables tels qu’une activation excessive des cellules immunitaires conduisant à la libération de cytokines pro-inflammatoires trop forte. Ceci se traduira par des signes cliniques chez la souris tels que atteintes du pelage, perte de poids, apparition de plaies sur la peau. Afin de palier à ces effets, les animaux seront observés tous les jours et monitorés tous les 2 à 3 jours. Tout signe indiquant une atteinte de points limites anticipés préalablement définis conduira au sacrifice de l’animal. L’injection de cellules immunitaires humaines dans une souris peut conduire au développement d’une maladie du greffon contre l’hôte qui peut apparaitre dans les 70 à 100 jours après la greffe. Celle-ci se manifeste par des signes cliniques tels que la perte de poids, une apathie, une inattention au pelage. Les animaux seront observés tous les jours et monitorés tous les 2 à 3 jours. Tout signe indiquant une atteinte de points limites anticipés préalablement définis conduira au sacrifice de l’animal.. Une réponse immunitaire forte contre une protéine antigénique nécessite que l’antigène soit injecté de façon concomitante avec des adjuvants ; l'adjuvant est par définition une substance qui permet d'augmenter l'immunogénicité d'une protéine qui lui est associée ; les adjuvants choisis sont approuvés en clinique humaine pour leurs effets mineurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …). Seuls les animaux qui présenteraient une régression complète de la tumeur pourraient être inoculés de nouveau avec la même lignée de cellules tumorale ou une lignée différente dans le cadre d’une utilisation continue pour évaluer la réponse immunitaire mémoire.

Remplacement

Des essais in vitro sur cellules animales et humaines permettent de réaliser une pré-sélection de composés candidats mais ne sont à ce jour pas suffisants pour comprendre leurs mécanismes d’actions. Les tests in vivo sont donc nécessaires et vont également permettre d’évaluer l’efficacité des composés sur l’élimination des cellules tumorales et cellules infectés. De plus, nombres de pathologies comme les cancers impliquent de nombreux tissus et organes dont les voies biologiques sous-jacentes sont encore très peu connues et ne peuvent donc être mimées de façon fiable dans les modèles in vitro. Seul un modèle chez l’animal peut reproduire les interactions entre les différents systèmes biologiques complexes lors de l’évaluation de l’efficacité de composés à tester.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera basé sur des études similaires rapportées par la littérature. Des analyses de puissance statistique seront utilisées sur les données préliminaires pour déterminer si le nombre d’animaux par groupe puisse encore être réduit

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires. Ils seront groupés dans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse de courte durée. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de l’étude. Des consignes seront mises en place pour définir les procédures à suivre en cas de complications. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous autorité du vétérinaire ou euthanasiés selon les critères définis dans la consigne.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. Des données sur les modèles de tumeurs chez la souris (présentant un système immunitaire murin ou humain) existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car son système immunitaire est bien caractérisé. Les études peuvent être réalisées sur des souris immunocompétente avec système immunitaire murin, ou système immunitaire humains et les résultats peuvent être comparés à de souris immunodéficientes permettant de bien comprendre le rôle du système immunitaire. La souris est aussi un modèle pour lequel il existe de nombreux outils adaptés (cytokine, marqueurs cellulaires…). Les souris sont utilisées au stade adulte pour pour avoir un systémè immunitaire développé.

Pour étudier le rôle d'une cytokine dans le vitiligo, 400 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements. Elles reçoivent sous la peau du flanc des cellules de mélanome qui déclenchent une réaction auto-immune, puis des injections d'anticorps neutralisants, une résection chirurgicale de la greffe au douzième jour, et des séances répétées d'anesthésie gazeuse pour être pesées, mesurées et photographiées pendant plusieurs mois. Le porteur écrit que le protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris, chiffre supérieur aux 400 déclarées dans les gravités attendues. Sur le remplacement, il indique que les cibles ont été identifiées par des travaux in vitro et in silico, et affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend "nécessaire" le recours aux expériences in vivo.

Objectifs

Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 2 mois, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 4 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.

Procédures

400 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 6min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 15min). Puis, 2 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée 6x 3min). Entre 1 et 4 mois, le suivi sera uniquement visuel, sans anesthésie. Après 3 mois, selon le développement des taches blanches, des photos seront prises sous anesthésie gazeuse (durée = 4x3min). La durée totale de la procédure par souris est de 68 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites, ni de gène dans les mouvements des animaux. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. La résection de la greffe se fera sous anesthésie générale profonde. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.

Remplacement

Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse.