Troubles immunitaires
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Développement de nouvelles immunothérapies cellulaires pour le traitement des tumeurs solides
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées porte des modifications qui les font développer spontanément des tumeurs : mélanomes chez 25 à 60 % d'entre elles à partir de deux mois, tumeurs de l'ensemble des glandes mammaires après une latence moyenne de 92 jours. 4 372 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la quasi-totalité, 54 étant tuées sans réveil. Elles reçoivent quatre à six injections sous anesthésie, trois à six injections intrapéritonéales vigiles, des prélèvements de sang à la queue ou en rétro-mandibulaire, et une irradiation de 2 grays ou une injection de busulfan, avec nécrose, ulcération et saignements des tumeurs annoncés. L'élevage croise des femelles sauvages avec des mâles qui ne développent leurs tumeurs mammaires qu'après leur période de reproduction, ce que le porteur compte au titre du raffinement.
Objectifs
L’immunothérapie connaît un grand essor depuis ces dernières années et est de plus en plus utilisée pour traiter différents cancers. Cette thérapie consiste à réactiver le système immunitaire du patient afin qu’il puisse lui-même reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Malgré de nombreux succès cliniques, l’efficacité des immunothérapies est encore limitée à un sous-ensemble de patients répondeurs. Une des principales limites réside dans l’infiltration de la tumeur par les cellules immunitaires. En effet, un faible effet thérapeutique corrèle avec une tumeur dite « froide », c’est-à-dire peu infiltrée et pauvre en cellules immunitaires. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes permettant l’infiltration des cellules immunitaires au sein de ces tumeurs et de développer des stratégies pour manipuler ce processus afin de contourner la résistance thérapeutique aux points de contrôle immunitaire (ICB). Ce projet a pour but de développer de nouvelles thérapies capables de remodeler le microenvironnement tumoral afin de rendre répondante une tumeur qui ne l’est pas initialement. Utiliser ces nouvelles thérapies en combinaison avec les immunothérapies déjà existantes pourrait ainsi permettre de surmonter la résistance primaire observée chez de nombreux patients. Ce projet nécessite la modélisation du contexte immunitaire dans des modèles vivants. Au fur et à mesure de l’avancement du projet, des modèles pré-cliniques (tumeurs endogènes et souris humanisées) seront utilisés afin d’imiter au mieux les effets présents chez l’Homme. Ainsi les modèles précliniques permettent de sélectionner les stratégies immuno-thérapeutiques les plus efficaces à tester dans le cadre d'essais cliniques et par conséquent réduire les risques associés aux essais cliniques infructueux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif fondamental d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents à l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs solides. En parallèle, il cherche à développer des thérapies innovantes capables de réguler et de maîtriser ce processus complexe. En réalisant cette double démarche, nous espérons ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la lutte contre les tumeurs solides, en exploitant ces connaissances pour élaborer des approches thérapeutiques plus efficaces et ciblées. Ces traitements seront conçus pour surmonter la résistance initiale souvent observée vis-à-vis des immunothérapies. Ils agiront en transformant une tumeur qui, au départ, ne répondait pas favorablement envers ces traitements en une tumeur réceptive, permettant ainsi une meilleure efficacité des immunothérapies. Cette approche novatrice vise à contourner les obstacles initiaux et à ouvrir la voie à des réponses positives là où elles étaient auparavant limitées, potentiellement révolutionnant ainsi le traitement des tumeurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à ces types d’interventions : - 4 à 6 injections en intraveineuse/sous-cutanée/intra-tumoral, sur animaux anesthésiés. Cet acte ne dure que quelques secondes. - 3 à 6 injections en intra-péritonéal, sur animaux vigiles. Cet acte ne dure que quelques secondes. - 1 à 3 prélèvements sanguins au niveau de leur queue, sur animaux vigiles. Cet acte dure quelques minutes. - 1 à 3 prélèvements sanguins en rétro-mandibulaire, sur animaux anesthésiés. Cet acte dure quelques minutes. - 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital ou rétro-mandibulaire, sur animaux anesthésiés. Cet acte dure quelques minutes et est sans réveil. - 1 injection intra-péritonéale de buprénorphine. Cet acte dure quelques secondes. - 1 à 3 injections intra-péritonéales d’un anesthésique. Cet acte dure quelques secondes. - 1 anesthésie locale par injection sous cutanée d'une solution d’anesthésique. Cet acte dure quelques secondes. - 1 irradiation (générateur X, dose 2 Gy) ou 1 injection de busulfan dilué en solution saline. Cet acte dure quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont particulièrement liés à la croissance tumorale. En effet, l’ensemble des traitements utilisés sur les animaux ont été déjà publiés dans la littérature comme étant bien tolérés par les animaux dans les lignées de souris que nous utilisons. Ainsi, hormis les nuisances sporadiques parfois observées sur les animaux saints, l’initiation des possibles nuisances se fera à partir du début des expériences et pourra donc être promptement suivie. Certaines souris sont viables et fertiles, mais 25 % à 60 % ou plus développeront spontanément des mélanomes avec un début à l'âge de 2 à 12 mois. L'application topique d’une molécule entraîne le développement de lésions cutanées pigmentées en 21 à 28 jours, qui évoluent en mélanomes. D’autres souris développant des tumeurs mammaires spontanément, les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et poursuivre les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les souris femelles d’un certain génotype développent des tumeurs au niveau de toutes les glandes mammaires (m1 à m10) avec un temps de latence moyen de 92 jours. Les tumeurs apparaissent progressivement à partir de 15 semaines jusqu’à un point limite vers 25 semaines. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales en sous-cutanées (cancer du sein, mélanome) sont : nécrose, uclération et saignements de la tumeur, gène à la locomotion et baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie, perte de poids. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales du cancer du poumon sont : perte de poids, difficultés respiratoires, baisse de la tonicité dans les derniers stades de la maladie. Les nuisances liées aux injections des thérapies et aux prélèvements sont égales à la douleur causée par l’insertion d’une aiguille. Cet inconfort est léger et passager. Les traitements utilisés n’induisent pas de réaction adverse chez la souris. Une autre lignée (phénotype dommageable) sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection, dans une cage individuelle sur portoir ventilé, la litière sera autoclavée, l’eau et les aliments irradiés, le matériel en contact avec les animaux sera au préalable autoclavé ou décontaminé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront porteurs de tumeurs. De plus les animaux “contrôles”, non porteurs de tumeur, devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentent dans les organes et nous devons absolument mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.
Remplacement
Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une approche in vitro, comme la culture cellulaire ou la création d'organoïdes en 3D, nous opterons pour cette solution, comme nous l'avons déjà fait par le passé. Les diverses thérapies cellulaires seront systématiquement soumises à une validation in vitro avant toute autre étape. Cependant, il est important de noter que ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne permettent actuellement d'étudier de manière exhaustive l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs ainsi que les réponses immunitaires anti-tumorales qu'elles déclenchent. Par conséquent, le modèle murin demeure un élément incontournable de ce projet, puisqu'il est le seul à permettre l'étude approfondie de l'infiltration immunitaire au sein des tumeurs et des réponses anti-tumorales qu'elle engendre. L'utilisation de souris s'avère essentielle pour tester de nouvelles thérapies anti-cancéreuses qui réactivent le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des avancées significatives dans le domaine de la lutte contre le cancer.
Réduction
Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animaux. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées avec 7 animaux en accord avec les calculs de puissance statistiques. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques ou l’analyse de la variance . En outre, nous utiliserons des animaux mâles et femelles pour réduire le nombre d’animaux respirant non impliqués dans des expérimentations dans les lignées de souris génétiquement modifiées.
Raffinement
Une lignée de souris étudiée développe des tumeurs mammaires très progressivement sur 5 mois. La stratégie d’élevage participe au raffinement du projet, elle repose sur le croisement de femelles sauvages avec des mâles hétérozygotes qui développent tardivement des tumeurs mammaires (donc sans phénotype dommageable pendant la période d’utilisation comme reproducteurs. Les expérimentations avec une lignée de souris seront réalisées avant que les tumeurs se développent spontanément (à partir de 2 à 12 mois). Dans ce cadre nous utiliserons les souris mâles et femelles pour l'expérimentation. Les animaux seront régulièrement surveillés, et en cas d'apparition inattendue de tumeurs, ils serviront à standardiser
Choix des espèces
La souris se révèle être le modèle privilégié pour les expérimentations dans le domaine de l'onco-immunologie et de la thérapeutique du cancer. Ceci est principalement dû à la connaissance approfondie du génome murin, ce qui permet de tirer parti de nombreux outils soigneusement caractérisés. Parmi ceux-ci figurent les souris génétiquement modifiées pour exprimer des protéines spécifiques d'intérêt, ainsi qu'une variété étendue de modèles de tumeurs transplantées. La souris présente des avantages pratiques significatifs. Elle est aisément manipulable, dispose d'une courte période de gestation et peut donner naissance à plusieurs individus par portée, ce qui crée des conditions d'élevage optimales pour les expériences. Grâce à sa grande similitude génétique avec l'Homme, il est envisageable de transférer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Cette corrélation renforce la pertinence des découvertes réalisées avec les souris, ouvrant la voie à des avancées cliniques prometteuses dans la lutte contre le cancer. Les animaux seront mis en expérimentation entre 8 et 14 semaines après leur naissance, car c’est l’âge à partir duquel ils auront atteint le stade « adulte » et que leur système immunitaire sera pleinement développé.
Validation de l’effet de la molécule Ma sur la production d’anticorps après immunisation par un antigène modèle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, quatre-vingts d'entre elles subissant jusqu'à neuf prélèvements sanguins et deux injections sous la peau au cours d'une expérience de soixante-dix jours. Le traitement testé est ajouté à l'eau de boisson, ce qui peut en dégrader le goût au point que les souris boivent moins, et modifier leur transit. L'objet immédiat reste modeste : vérifier qu'une molécule freine la production d'anticorps après une vaccination à l'ovalbumine, modèle retenu comme moins invasif qu'une greffe. Le bénéfice avancé pour les patients transplantés, la prévention des rejets tardifs, est renvoyé au moyen et au long terme, après d'autres expériences sur des animaux non-humains greffés.
Objectifs
Les transplantations d’organes améliorent et sauvent la vie de nombreux patients. La survie des greffons est possible grâce à des traitements qui bloquent la réponse immunitaire responsable des rejets. Les traitements actuels sont souvent bien tolérés et efficaces, notamment pour le contrôle des rejets aigus. Cependant, les rejets tardifs sont responsables de perte de greffons que les traitements actuels ne parviennent pas à juguler. Le mécanisme responsable de ces rejets tardifs implique la production par le système immunitaire d’anticorps qui attaquent les greffons. C’est cette réponse anticorps qui est imparfaitement contenue par les traitements immunosuppresseurs actuels. Il existe donc un besoin de nouveaux traitements pour prévenir les rejets tardifs par un contrôle de la production d’anticorps anti-greffons. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet d’une nouvelle molécule sur la réponse anticorps dans un modèle de souris. Ces études sont des préalables obligatoires avant d’envisager un passage en clinique de nouveaux traitements. La preuve de concept de l’efficacité de la molécule sera étudiée dans ce projet avec un modèle moins invasif que la transplantation, à savoir un modèle de vaccination faisant intervenir les mêmes réactions immunitaires. Les souris seront vaccinées avec une molécule modèle et seront traitées via l’eau de boisson par la molécule candidate pour évaluer la réponse immunitaire vaccinale en présence ou non de cette molécule. Différents dosages sanguins seront réalisés au cours des expériences pour suivre la réponse immunitaire. Ce projet sera découpé en 3 étapes :1) s’assurer que l’ajout de la molécule n’affecte pas l’appétence des animaux pour leur eau de boisson ; 2) valider la dose dans l’eau de boisson pour obtenir une concentration sanguine efficace et 3) valider l’effet de cette molécule sur la réponse anticorps suite à une immunisation par un antigène modèle. Au total, ce projet nécessite 190 souris sur une durée de 3 ans.
Bénéfices attendus
A court terme, cette étude nous permettra de valider in vivo l’efficacité de la molécule candidate sur un modèle de vaccination (protéine vaccinale modèle Ovalbumine) A moyen terme, l’étude de l’effet thérapeutique de la molécule candidate permettrait de valider son utilisation pour réduire le risque de rejet de greffe associé aux anticorps dans des modèles vivo de greffe pour in fine, à long terme, etre utilisée en clinique chez les patients.
Procédures
Toutes les souris subiront un changement d’eau de boisson (+/- sucre) et +/- molécule dans des biberons opaques tous les 2 ou 3 jours maximum Elles seront pesées tous les 3 jours à toutes les semaines selon l'étape du projet. Pour 30 souris : elles subiront maximum 3 prélèvements sanguins (sous anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (pour la récolte sang + organes). Experience de maximum 14 jours Pour 80 souris : elles subiront maximum 5 prélèvements sanguins (anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (récolte sang + organes). Experience de maximum 21 jours Pour 80 souris : elles subiront maximum 2 Injections sous la peau (vaccination) sous anesthésie gazeuse et au maximum 9 prélèvements sanguins (avec anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (récolte sang + organes). Experience de maximum 70 jours
Impact sur les animaux
Les injections sous la peau (vaccination) et les prélèvements de sang sont susceptibles d’entrainer un stress et une douleur. L’ajout de la molécule dans l’eau de boisson des souris peut entraîner une perte d’appétence pour l’eau et donc une diminution de la prise hydrique. L’ajout de la molécule dans l’eau peut également entraîner des modifications du transit des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des protocoles afin de prélever le sang et collecter les tissus pour réaliser les analyses et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires nécessaire pour étudier les réponses vaccinales ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs avec des analyses statistiques définies selon les paralètres étudiés. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 190 souris (mus musculus).
Raffinement
Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement, aspect général) . Différents traitements seront administrés : - anesthésie générale avant le prélèvement final - Analgésie locale pour les prélèvements sanguins - Anésthésie gazeuse avant l’injection du vaccin sous la peau. Le suivi se fait 2 à 3 fois par semaine et la fréquence est augmentée selon l’apparition des signes cliniques précoces et anticipés qui ont été définis pour éviter toute souffrance animale. Une semaine d’habituation à l’eau est prévue avant tout début de procédure. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature. Age maximum 12 mois en fin de projet (les animaux plus agés ne seront pas utilisés pour éviter une variabilité trop important due à l’age entre les souris jeunes et > 12 mois).
Elevage de lignées de souris immunodéficientes et prélèvements pour génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
79 950 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune pour une biopsie d'oreille au poinçon de deux millimètres ou une prise de sang, contention comprise, en une trentaine de secondes. Aucun anesthésique ni analgésique n'est prévu, le porteur estimant la douleur aiguë mais limitée à deux secondes environ. Ces prélèvements servent au génotypage de lignées de souris immunodéficientes élevées en vue d'être utilisées dans d'autres projets, et le porteur indique qu'une méthode non invasive sur poils ou salive sera privilégiée quand elle sera au point. Une partie des souris est gardée vivante selon les génotypes recherchés et les besoins de reproduction, les autres sont tuées faute de génotype utile, en fin de reproduction, ou parce qu'aucune procédure ne les attend.
Objectifs
Il concerne donc toutes les méthodes de prélèvements invasives d’échantillons en vue des génotypages (biopsies oreilles ou prélèvements sanguins) ainsi que l’hébergement de souris immunodéficientes. Le génotypage des animaux est indispensable afin de définir le génotype de chaque individu, ce qui permettra par la suite d’identifier les animaux qui seront utilisés en reproduction ou à des fins scientifiques dans le cadre de projets/procédures de recherche autorisés. A terme, lorsque la technique de génotypage sur échantillon de poils ou salivaire sera mise au point et que cela sera possible techniquement, une méthode non-invasive sera privilégiée.
Bénéfices attendus
Pouvoir fournir des animaux d’intérêts de lignées de souris génétiquement altérées qui seront utilisés dans les différentes procédures expérimentales des projets autorisés. De manière à atteindre les objectifs scientifiques dans les domaines de l’inflammation, du cancer et de l’infectiologie.
Procédures
Biopsies oreilles : animaux vigiles, prélèvement unique, durée de l’intervention moins de 20 secondes (30 secondes avec la pose de la bague) Prélèvements de sang : animaux vigiles, prélèvement unique, durée de l’intervention moins de 20 secondes (30 secondes avec la pose de la bague)
Impact sur les animaux
Les nuisances pouvant être causées aux animaux sont : - le stress lié à la contention (environ 30 secondes) - la douleur, aigue mais de très courte durée, ressentie lors du poinçonnage de l’oreille (environ 2 secondes) ou au point de ponction pour le prélèvement sanguin (environ 2 secondes)
Devenir
Les animaux sont gardés en vie, en fonction des procédures expérimentales en cours, des génotypes d’intérêts ainsi que des besoins en reproduction. Les animaux mis à mort concernent les animaux ayant un génotype ne présentant pas d’intérêt, arrivant en fin de reproduction, n’étant pas inclus dans une procédure expérimentale.
Remplacement
L’utilisation du modèle animal est incontournable dans certains projets des équipes de l'institut. En effet, la nature des travaux qui sont menés imposent le choix du modèle murin, dans la mesure où les processus développementaux étudiés ne peuvent être abordés dans leur complexité physiopathologique dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro.
Réduction
Une gestion raisonnée des accouplements est mise en place au sein du service de zootechnie. Nous adaptons au mieux le schéma de reproduction en fonction de la spécificité de chaque lignée et/ou des besoins expérimentaux. Cela ayant pour objectif de limiter au maximum la production d’animaux.
Raffinement
Les procédures expérimentales ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Le personnel étant formé et sensible au bien-être animal et les animaux habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. De plus, toutes les mesures sont prises lors des gestes techniques afin de minimiser au maximum les dommages causés aux animaux. Le matériel est adapté à l’espèce et la taille ou le volume de prélèvement est minimisé (poinçon de 2 mm pour la biopsie d’oreilles et volume de 50µl pour le sang). Tous ces éléments font qu’il n’est pas prévu d’utiliser d’anesthésiques volatils, d’analgésique et/ou anesthésique local.
Choix des espèces
Le modèle murin offre plusieurs avantages : 1) sa génétique est bien connue ce qui permet une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques et développementales fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu et est à maints égards semblable au système immunitaire humain. Les animaux seront prélevés au sevrage soit entre 21 et 27 jours pour les biopsies d’oreilles et à partir de 28 jours pour les prélèvements sanguins.
Développement et évaluation de l’efficacité accrue de lymphocytes T génétiquement modifiées ciblant des antigènes tumoraux connues et des néo-antigènes, dans un contexte d’hémopathies malignes et de tumeurs solides induits par dissémination métastatique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
Des cellules tumorales humaines sont injectées dans la veine ou dans le péritoine de souris immunodéficientes, qui développent des tumeurs du péritoine, du foie, des ovaires ou des poumons, avec ascite, difficultés respiratoires, prostration et apathie. 7 186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 190 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 6 996 un niveau modéré. Chacune passe deux séances d'imagerie par semaine pendant huit à douze semaines, sous anesthésie à chaque fois. Le porteur écrit que le raffinement de ces modèles "ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché", en s'appuyant sur les recommandations européennes en cancérologie expérimentale, et fait reposer la limitation de la souffrance sur des points d'arrêt anticipés grâce au niveau de bioluminescence.
Objectifs
Au cours de la dernière décennie, les immunothérapies ont révolutionné la façon dont nous traitons le cancer. En particulier, l’immunothérapie cellulaire permet d’éliminer les cellules cancéreuses, entraînant des rémissions durables dans certains cancers du sang et de ses précurseurs. Cette technologie repose sur l’utilisation de cellules immunitaires (lymphocyte) faisant suite à une modification génétique lui permettant de reconnaitre spécifiquement des marqueurs présents à la surface des cellules cancéreuses. Ces cellules (CAR-T) sont modifiées en laboratoire et réinjectées ensuite aux patients pour cibler et détruire la tumeur. Les avantages des cellules CAR T sont nombreux, notamment la possibilité d'un traitement plus court, d'une durabilité prolongée et d'une réduction des effets secondaires. Cependant, les avantages cliniques sont encore limités pour les tumeurs solides et même dans le domaine des cancers du sang, les patients qui répondent aux thérapies par des cellules CAR T restent exposés au risque de rechute en raison de plusieurs facteurs, notamment l'absence de réponse durable après le transfert chez le patient. Au laboratoire, on a récemment démontré que le ciblage de notre gène d’intérêt renforce la protection à long terme induite par les cellules CAR T contre les rechutes tumorales. Malheureusement, le manque de durabilité n'est pas la seule limitation des thérapies cellulaires. En effet, un autre facteur qui compromet l’utilisation des cellules CAR T pour le traitement de certains cancers est la difficulté à trouver des marqueurs spécifiques (ou associés) aux tumeurs. La plupart des marqueurs tumoraux identifiés sont des protéines mutées ou surexprimées, mais ces antigènes sont parfois aussi exprimés par des cellules saines. En plus, plusieurs cancers n’expriment pas ces antigènes. Dans ce contexte, nous avons récemment découvert des nouveaux antigènes (appelés par la suite néo-antigènes) spécifiques de tumeurs, ce qui élargit la gamme des cancers pouvant être traités par la thérapie cellulaire. L’objectif général de ce projet est d’utiliser nos cellules CAR T plus durables dans plusieurs modèles de cancers d’origine très diverse et exprimant des néo-antigènes, en plus des antigènes spécifiques connus.
Bénéfices attendus
L'immunothérapie cellulaire représente une avancée importante dans le domaine de l'oncologie et de la médecine personnalisée. Toutefois, cette thérapie pose des problèmes tels que les rechutes ainsi qu’une activité limitée sur les tumeurs solides. Ce projet a pour but de surmonter ces deux obstacles à travers : I. L'optimisation du processus de fabrication des cellules CAR T par des approches d'ingénierie en laboratoire, en particulier en produisant des cellules CAR T déficientes pour notre gène d’intérêt. Ceci devrait renforcer leur persistance in vivo et donc la capacité à éliminer les tumeurs de façon maintenue dans le temps. II. L’identification d’antigènes spécifiques aux tumeurs qui garantissent une élimination sûre et efficace des cellules cancéreuses par les cellules CAR T, avec un risque réduit de cibler des tissus sains. À long terme, notre projet a le potentiel clinique d’augmenter l'efficacité des cellules CAR T actuellement disponibles, en plus d'élargir les types de cancers qui pourront être traités. Cela augmenterait considérablement le nombre de patients pouvant bénéficier de cette technologie révolutionnaire.
Procédures
Dans une première procédure des celulles tumorales seront injectées aux animaux vigiles (une seule injection de cellules tumorales au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 20 sec). Puis 3-4 jours après l’injection des cellules, les souris seront imagées. Pour l’imagerie, les souris vigiles recevront une injection (durée du geste inférieure à 10 sec), 12 à 15 minutes plus tard, les souris seront anesthésiées pour être imagées (durée de l’anesthésie : 15 min). Deux séances d’imagerie seront effectuées par semaine pendant 8-12 semaines. Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (une injection de cellules tumorales au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 20 sec). Les souris seront ensuite traitées par une seule injection unique (durée du geste inférieure à 20 sec). Puis, 3-4 jours après l’injection du traitement, les souris seront imagées. Pour l’imagerie, les souris vigiles recevront une injection (durée du geste inférieure à 10 sec), 12 à 15 minutes plus tard, les souris seront anesthésiées pour être imagées (durée de l’anesthésie : 15 min). Une à deux séances d’imagerie seront effectuées par semaine.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront potentiellement des tumeurs au niveau du péritoine, du foie, des ovaires ou des poumons Les effets indésirables subies par les animaux seront les suivantes : prise ou perte de poids excessive par rapport au poids de départ, difficultés respiratoires, ascite, troubles du comportement (difficulté́ de locomotion, absence de toilettage, prostration, apathie). Les nuisances attendues lors de l’administration des produits non irritants et non toxiques seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée)
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Jusqu'à présent, aucun modèle n'a été décrit pouvant remplacer les fonctions complexes d'un système vivant, respirant, multi-organe avec des structures pulmonaires et circulatoires comme celles de l'homme. L'efficacité des cellules CAR T sera préalablement évaluée dans des modèles in vitro (2D et 3D) en utilisant les mêmes lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera pour l’établissement des modèles in vivo. Néanmoins, bien qu'il existe des modèles de tumeurs in vitro, aucun ne permet de reproduire la physiopathologie du cancer aussi bien que les modèles murins. Les cultures cellulaires en 2D ou 3D ne permettent pas de modéliser toutes les interactions physiques et mécaniques entre la cellule tumorale et son environnement. De plus, la thérapie cellulaire est administrée par voie intraveineuse et, malheureusement, la complexité de la vascularisation est aujourd'hui impossible à reproduire, même avec des modèles complexes tels que les organoïdes tumoraux générés par la culture tridimensionnelle de cellules tumorales issues de biopsies de patients. Pour qu'une cellule CAR-T atteigne la tumeur, elle doit passer d’abord par le sang, franchir la barrière imposée par l'endothélium vasculaire par diapédèse, pénétrer le stroma (tissu non-tumoral présent dans tous les types de cancers invasifs) pour enfin exercer son activité antitumorale. Avant d'envisager de passer à l'homme, le recours à la souris reste donc inévitable.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, l'efficacité des cellules CAR T sera préalablement évaluée dans des modèles in vitro (2D et 3D) en utilisant les mêmes lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera pour l’établissement des modèles in vivo. Nous avons également décidé d'utiliser des modèles de tumeurs par injection intraveineuse et intrapéritonéale. Ces modèles nous permettent (i) de mimer différents processus physiopathologiques du cancer. (ii) d'induire des tumeurs de manière très homogène. Pour chaque lignée cellulaire utilisée dans ce projet, l'homogénéité de leur croissance chez les souris NSG sera vérifiée par imagerie de bioluminescence longitudinale. Leur localisation et leur cinétique de croissance seront vérifiées deux fois par semaine. Les lignées tumorales qui mettent longtemps à établir des foyers métastatiques (plus de 21 jours) ou qui présentent une cinétique de croissance ou une localisation hétérogène ne seront pas utilisés dans la suite du projet. Le nombre de souris porteuses de tumeurs et traitées par des cellules CAR-T sera de 8 par condition, afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Ce nombre d’animaux tient compte de la nécessité d'utiliser le moins de souris possible et de pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés.
Raffinement
Afin d’éviter le recours à la chirurgie (et les nuisances associées : douleurs, risques d’infection) pour l’implantation des tumeurs, l'utilisation de modèles de tumeurs solides induites par dissémination métastatique a été privilégiée dans ce projet (injection intraveineuse et intrapéritonéale de la cellule tumorale). En effet, ce type de modèle nous permet de limiter les infections associées à la chirurgie, tout en permettant de mimer des processus physiopathologiques du cancer. Ceci est particulièrement important, puisqu’afin d'éviter le rejet de cellules d'origine humaine, l'ensemble du projet nécessitera l'utilisation de souris immunodéficientes qui présentent un risque d’infection très élevé. Une injection intraveineuse ou intrapéritonéale permettra aux cellules tumorales de se loger dans différents organes. Pour évaluer le lieu exact où les cellules tumorales se développent, nous utiliserons l'imagerie par bioluminescence. Cette technique, réalisée sous anesthésie, extrêmement sensible (seules quelques dizaines de cellules tumorales peuvent être détectées) nous permettra de savoir très précisément et très précocement où les tumeurs vont former des foyers métastatiques. Cette technologie, non invasive, permet donc de suivre un même animal au cours du temps. Des corrélations entre l’état de la souris et le niveau de bioluminescence qui seront établies dans une étude pilote vont nous permettre d’anticiper dans les expériences d’efficacité l’atteinte des points limites ce qui évitera la souffrance de l’animal. En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Un contrôle fréquent du site de croissance de la tumeur, ainsi que la mise en place d’une grille de score adaptée prenant en compte l'ensemble des symptômes associés à la douleur chez la souris nous permettront de limiter au maximum la souffrance. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie anti-cancéreuse, car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées En particulier pour notre projet, la disponibilité de souches murines parfaitement définies et hautement immunodéficientes sera clé. En effet, ces souches favorisent le développement de cellules tumorales humaines, ainsi que le traitement ultérieur par de la thérapie cellulaire, également d'origine humaine. Autrement, le système immunitaire de la souris rejetterait facilement les cellules humaines greffées. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés par des modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales.
Evaluation de la pathogénicité des anticorps anti HMGCR et anti SRP dans un modèle murin de myopathies nécrosantes auto-immunes
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
55 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant sept jours des injections quotidiennes d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de patients atteints de myopathie nécrosante, subissent trois microprélèvements de sang et deux tests de force par traction, avant le prélèvement de leurs muscles gastrocnémiens. L'objet du projet est de vérifier si les anticorps de quatre nouveaux malades déclenchent bien la maladie chez la souris, pour disposer d'un modèle où tester des médicaments. Le porteur écrit que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance ou de perte de poids, tout en prévoyant une gêne de la mobilité du train arrière et un traitement antidouleur quotidien pour tous les lots.
Objectifs
Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante nécrose des fibres musculaires sans infiltrat inflammatoire. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) anti-Signal Recognition Particle (SRP) ou, plus récemment, d'aAc anti-3-hydroxy-3-méthylglutaryl- Coenzyme A réductase (HMGCR) et la corrélation de leur titre avec le myolyse. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris C57BL/6J d'IgG purifiées issues de patients porteurs d’aAc anti- HMGCR ou anit-SRP. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’IgG et de C5b-9 (ensemble de protéines formant un pore dans la membrane) à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc et suggérant un rôle cytotoxique exclusif du complément. Ce modèle nous a permis récemment de tester de nouvelles thérapies avec succès. Cependant, les aAcs de certains malades n'induisent pas de myopathies chez la souris pour des raisons inexpliquées. Les IgG anti-HMGCR et anti-SRP sont purifiées à partir de plasmaphérèse de patient qui sont extrêment rares à obtenir. En relation avec différents hôpitaux en France, nous avons réussi à obtenir des plasmaphérèses de 4 nouveaux malades. L'objectif général de notre programme est d'évaluer la pathogénicité des anticorps de ces nouveaux patients dans le but de les utiliser en cas de résultat positif dans des protocoles d'évluation de l'efficacité de nouveaux médicaments. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.
Bénéfices attendus
Lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal , nous avons pu démontré l'efficacité de molécules thérapeutiques dans (i) l'apparition et (ii) le traitement de la myopathie. Cela s'est traduit par respectivement (i) une absence d'atteinte histologique et de diminution de la force musculaire et (ii) par une réduction significative de l'atteinte histologique et une restauration de la force musculaire. Les plasmaphères de pateints sont rares et épuisables. La possibilité de disposer de nouvelles sources d'anticorps de malades permettra de tester de nouvelles molécules thérapeutiques qui ne peuvent pas être testées dans les modèles in vitro que nous développons parallèlement.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à 3 microprélèvements de sang, d'une durée de moins de 5 secondes chacun. Les souris seront injectées quotidiennement en IP durant 7 jours soit 7 injections d'une durée de moins de 10 secondes chacun. 2 grip test seront réalisés pour chacune des souris à 8 jours d'intervalle, durée moins de 10 secondes. Les gastrocnémiens de tous les animaux seront prélevés sur les souris euthanasiées en fin de protocole.
Impact sur les animaux
L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux autorisés avec ce modèle animal a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercution visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids. Lors des injections IP les souris pouront ressentir un peu de stress du à la contention et l'injection en elle même, mais qui sera de très courte durée. Pour les souris de l'étude qui développeront une myopathie consécutive à l'action pathogéne des anticorps testés une gêne dans la mobilité du train arrière pourra être observée.
Devenir
Le prélèvement des gastrocnémiens pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.
Remplacement
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de la pathogénicité des anticorps de malades dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisée que chez l'animal.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autre protocoles expériementauxautorisés utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'aAcs chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique excat des effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologique obervées lors de ces protocoles.
Raffinement
L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de celllose et des fibres de coton. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Elle permettra également d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. En effet, les animaux seront observés quotidiennement et l'apparition de signes cliniques, poils hirsutes, perte de poids visible (sans pesée) ou prostration ou lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes seront atteints entraineront la mise en place de des dispositions pour réduire la douleur (conférer paragraphe suivant). Un traitement préventif quotidien (par voie orale) de la douleur sera mis en place pour les animaux de tous les lots. En cas de douleur, un traitement en sous cutané (s.c) sera administré. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. Un analgésique sera administré 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ (injection en s.c).
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.
Vaccination ARNm : Etude des mécanismes d’adjuvantation et optimisation de nouvelles formulations vaccinales chez la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 150
1 440 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, chaque animal recevant trois injections de vaccin à ARN messager espacées de quinze jours et cinq prises de sang, toutes sous anesthésie générale. Les effets attendus reproduisent ceux de la vaccination humaine : rougeur, induration et douleur au toucher au point d'injection, fièvre, perte d'appétit et poils hérissés pendant un à deux jours. Tous sont tués pour prélever des tissus. Le projet vise à établir des corrélations entre modèles cellulaires et réponse du rongeur, le porteur annonçant que ces modèles pourraient à terme remplacer ou réduire fortement l'utilisation d'animaux non-humains, ce qui suppose d'en utiliser 1 590 pour le démontrer.
Objectifs
La vaccination basée sur l’utilisation d’ARN messager complexé dans des particules lipidiques s’est imposée comme une technique efficace lors de la pandémie de Covid-19. Les vaccins ARNm sont basés sur l’utilisation d’un ARN messager, molécule naturellement présente dans les cellules qui est traduit en protéine par la machinerie cellulaire. Néanmoins, la vaccination par ARNm entraîne chez l’homme des effets secondaires indésirables liés au déclenchement d’une réponse immunitaire excessive. Cette réaction immunitaire se traduit par l’apparition de douleur et/ou rougeur et gonflement localisés au site d’injection mais également de fièvre. Elles sont la conséquence de l’activation du système immunitaire. Notre projet a pour but de trouver de nouveaux vaccins ARNm qui ne déclencheraient pas toutes ces réactions secondaires tout en permettant d’obtenir une réponse immunitaire optimale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but premier d’établir des corrélations entre les réponses obtenues sur nos modèles cellulaires et la réponse immunitaire chez le rongeur après vaccination par ARNm. Ceci permettra de ainsi mieux comprendre les voies de l’immunité innée nécessaires à activer (ou bloquer) pour obtenir la réponse immunitaire optimale tout en limitant les effets secondaires. Il est essentiel de mieux comprendre la composante adjuvante de la vaccination ARNm, afin de pouvoir la moduler pour obtenir la réponse immunitaire la plus adéquate. Si des corrélations claires sont mises en évidence sur ce modèle, alors nos modèles cellulaires pourront être utilisés par la communauté scientifique pour optimiser les vaccins ARNm en cours de développement. La validation de nos modèles cellulaires pour prédire notamment les effets secondaires des candidats vaccins pourra donc conduire à améliorer la sécurité des vaccins pour l’homme, mais aussi réduire le nombre d’animaux utilisé pour mettre au point ces candidats vaccins.
Procédures
Les animaux anesthésiés auront 3 injections de vaccins espacés de 15 jours sur une durée de 60 jours. Cinq prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal et sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Concrètement, le modèle utilisé repose sur l’injection chez le rongeur de vaccins ARNm. Les effets indésirables prévus sont ceux attendus après une vaccination : Une rougeur locale au site d’injection, un petit gonflement, une induration, et une douleur au toucher pourront être observés, leur intensité est légère à modérée sur une durée de quelques heures à 1 jour. De la fièvre, une perte d’appétit et des poils hérissés peuvent également apparaître et persister en théorie de 1 à 2 jours, entraînant une nuisance modérée.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever des tissus dans le but d’étudier au mieux la réponse vaccinale.
Remplacement
Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’immunogénicité et les effets secondaires de nos formulations vaccinales. Le recours à des animaux semble donc inévitable à ce jour. L’un des buts de ce projet est aussi de démontrer l’intérêt de nos modèles cellulaires pour remplacer ou fortement diminuer à terme l’utilisation des animaux. Mais, pour obtenir cet objectif, nous devons comparer les réponses entre modèles cellulaire et modèles animaux, d’où la nécessité de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.
Réduction
Chaque expérimentation chez la souris est réalisée avec un maximum de 48 souris, soit au maximum 8 groupes de 6 souris. Ceci dans le but de ne pas engendrer de différences artéfactuelles liées à la difficulté de réaliser une expérience avec un trop grand nombre d’animaux au total. Le nombre de 6 animaux par groupe a été déterminé à partir des publications de vaccination. D’après notre expérience, il est suffisant pour permettre à l’expérimentation de mettre en évidence des différences significatives sur le titre anticorps entre les groupes, notre critère majeur. Ces expériences chez la souris permettront de déterminera un ou 2 vaccins ARNm optimisés qui seront ensuite testé chez le rat. Les expérimentations chez le rat sont réalisées sur un maximum de 15 rats, à savoir 3 groupes de 5 rats. Ce nombre restreint permet de pouvoir gérer techniquement l’expérimentation tout en gardant suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives.
Raffinement
Les animaux sont anesthésiés avant chaque injection ou prélèvement pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les animaux immunisés ne sont pas censés avoir de troubles de leur santé suite à l’injection des candidats vaccins. Néanmoins, une réaction locale au niveau du site d’injection ou généralisé à tout le corps (fièvre) peut cependant être induite par la réponse immunitaire innée de l’animal vis-à-vis du vaccin. Pour détecter l’apparition éventuelle de cette réactogenicité, Une surveillance particulière avec examen clinique individuel 4h et 24h après injection sera réalisée en plus de la surveillance quotidienne. Nous avons établi une grille de « scoring » permettant de mettre en place un traitement pour palier à la douleur que pourrait ressentir l’animal. La grille de « scoring » prend en compte 1) l’état général comprenant l’apparence, la posture, la mobilité, le comportement de l’animal dans la cage, 2) l’inspection de l’aspect au niveau des sites d’injection et 3) le suivi de poids de l’animal. Grace à cette grille de scoring, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés, et un traitement d’analgésique locaux ou injectable est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de de douleur non maitrisée par ces traitements, les animaux sont immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les espèces animales sélectionnées, souris et rats, sont les espèces couramment utilisées pour les premiers tests de vaccination : la souris est utilisée dans un premier temps car notre modèle d’étude (cible vaccinale Ovalbumine) est le modèle immunologique de référence chez la souris, tous les réactifs et les outils d’étude sont donc disponibles. Dans un second temps, le rat est utilisé comme second modèle car sa taille plus importante permet d’avoir une première idée de l’extrapolation des doses injectables à un plus gros animal. Ces expériences seront réalisées sur des souris ou rats adultes matures âgées de 8 à 12 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.
Etude de l’activation des cellules myéloïdes dans les maladies d’inflammation vasculaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris dont la douleur ne cède pas au traitement analgésique sont tuées, l'atteinte d'un point limite entraînant l'arrêt du protocole. 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs organes. Les modèles de vascularite rénale et pulmonaire qui leur sont imposés peuvent provoquer une insuffisance rénale, une gêne respiratoire, un affaiblissement général et une perte de poids, et chaque souris subit selon le protocole des injections dans le péritoine à l'état vigile, trois injections derrière l'œil sous anesthésie, une instillation dans le nez et jusqu'à huit heures en cage métabolique. Les retombées annoncées tiennent à des molécules ciblant deux récepteurs, déjà en développement pour d'autres maladies, dont le porteur écrit qu'elles pourraient ouvrir des perspectives dans les vascularites.
Objectifs
Les vascularites, maladies inflammatoires des vaisseaux sanguins, représentent un groupe hétérogène de maladies systémiques avec des mécanismes physiopathologiques distincts et des stratégies thérapeutiques distinctes. Les vascularites sont classées selon la taille des vaisseaux affectés et peuvent conduire à l’altération d’autres organes tels que les poumons et les reins. Ces pathologies se caractérisent par la présence d’un infiltrat inflammatoire, composé particulièrement de cellules immunitaires, qui viennent envahir la paroi aortique, entraînant un remodelage de cette dernière pouvant aller jusqu’à l‘occlusion du vaisseau. Une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans la régulation des cellules inflammatoires et aortiques est indispensable. Les objectifs du projet est d’étudier le rôle de deux récepteurs présents à la surface des cellules immunitaires, les monocytes/macrophages, et leur modulation au cours des maladies inflammatoires. Les modèles murins de maladies inflammatoires étudiés seront des modèles de vascularites rénales, pulmonaires et des gros vaisseaux, et un modèle de réponse inflammatoire systémique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence l’implication potentielle de deux récepteurs membranaires présents à la surface des monocytes/macrophages dans la physiopathologie de maladies inflammatoires, notamment les vascularites affectant les vaisseaux de gros et petit calibre, entraînant l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Des molécules venant cibler ces récepteurs sont en cours de développement dans d’autres pathologies, et les travaux réalisés pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans les vascularites.
Procédures
Prélèvement à la queue (1fois 30sec) sur souris vigile, une injection intra-péritonéale (10 secondes, nombre d'injections variant selon le protocole), une injection rétro-orbotaire sous anesthésie (15 secondes, 3fois), une instillation intranasale sous anesthésie (1fois), une injection intraveineuse (45sec, nombre d'injections variable selon le protocole), un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie (45 sec). Cages métaboliques : inférieur à 8h avec accès à l'eau.
Impact sur les animaux
Les différents modèles peuvent induire un affaiblissement général de l’animal, asthénie, perte de poids, insuffisance rénale (modèle de glomérulonéphrite et vascularite rénal), gène pulmonaire (modèle de vascularite pulmonaire). L’ensemble des modèles peut induire des douleurs de courtes durées et peu intenses liées aux injections. Enfin, un stress chez les animaux peut survenir subissant des contentions et manipulations répétées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever le sang et les organes pour y réaliser des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les vascularites et maladies systémiques impliquent des réponses immunitaires complexes au sein de divers organes. Actuellement, les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire finement l’environnement physiopathologique dans lequel la réponse immunitaire est mise en jeu. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de la physiopathologie de ces maladies observées chez l’Homme. Les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitment, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre d’animaux restreint au maximum, de sorte à obtenir des résultats permettant d'obtenir la puissance statistique nécessaire pour y ttirer des conclusions biologiquement pertinentes. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Les méthodes d'imagerie étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours temps et les paramètres étudiés seront mesurés à chaque passage pour chaque animal. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.
Raffinement
Les injections intra-péritonéales seront réalisées sur animal vigile tandis que les injections rétro-orbitaires et pulmonaires seront réalisées sur animal anesthésié et posé sur un tapis chauffant pour le confort de l’animal. Pour les injections répétées nous alternerons les points d’injections afin de maintenir le confort de l’animal. Une évaluation générale de l’animal, basée sur son apparence physique et comportemental, sera faite grâce à l'établissement de points limites. Le poids corporel sera relevé tous les 3 jours pour les traitements inférieurs à 10 jours et 1 fois par semaine pour ceux supérieurs à 10 jours. Les animaux seront élevés dans des cages enrichies et regroupés en groupe sociaux pour éviter tout isolement. Le personnel qualifié assure un suivi quotidien et tout comportement anormal sera reporté au responsable du projet. L’atteinte d’un point limite établi entrainera une mise à mort anticipée de l’animal et l'arrêt du protocole. Nous aurons recours à de l’imagerie non invasive afin de monitorer les lésions inflammatoires dans le cas d’apparition de vascularites spontanées, et de pouvoir suivre l’évolution de ces modèles de la manière la moins invasive possible. Pour toutes les analyses d'imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie au centre du projet sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste ou fluorescent. Les animaux seront surveillés tout au long de l’expérience afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les manipulations seront arrêtées et les animaux mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle animal nous permet de réaliser des expériences de physiopathologie d’inflammation vasculaire et systémique (induit ou spontané) de mammifère en prenant en compte l’ensemble des paramètres physiologiques existant in vivo. Les analyses in vitro ou in sillico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l’inflammation vasculaire et systémique car trop de paramètres physiologiques entrent en jeu. Les pathologies induites décrites précédemment font l’objet de protocoles publiés.
Reconstitution de rats immunodeficients par des cellules hématopoïétiques humaines
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Tous tués pour prélever leur sang, leur rate, leurs ganglions, leur moelle osseuse, leur foie, leurs intestins et leur thymus, 150 rats immunodéficients sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. À l'âge de deux à quatre jours, les ratons sont séparés de leur mère et irradiés quatre minutes, avec un risque qu'elle les rejette ensuite, puis reçoivent une injection de cellules humaines directement dans le foie. Trois prélèvements de sang derrière l'œil suivent, à douze, dix-huit et vingt-quatre semaines, en alternant œil droit et œil gauche. Le porteur présente ce rat "humanisé" comme une alternative aux souris humanisées, plus grande et plus proche de l'être humain, pour éprouver des médicaments agissant sur le système immunitaire.
Objectifs
A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Les résultats in vitro seuls ne peuvent présumés du potentiel réel et efficace d'une molécule. Afin de pouvoir répondre à ce type de problème, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" (souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre mais on y trouve la présence de cellules humaines) permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Principalement due à la taille du modèle, permettant de réaliser des modèles de greffes vasculaires mais également dû à la différence de pourcentage au niveau des cellules humaines. Ce projet expose donc la procédure utilisée afin de produire des rats dits humanisés à partir de rats immunodéficients (qui sont des animaux ne possédant pas de cellules au niveau du système immunitaire).
Bénéfices attendus
Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation des rats humanisés immunodéficientes reconstitués avec un système immunitaire humain.
Procédures
Les différentes interventions sur les animaux sont : l'irradiation de ratons mâles et femelles âgés de 2 à 4 jours qui se déroule en seule fois et cela pendant 4 min, une seule injection intrahépatiques de cellules humaines sera effectuées sur des animaux anesthésiés (anesthésie rapide avec une durée de procédure n'éxcédant pas 5 min) ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendues sont: le stress du à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales ( l'injection intrahépatique, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux ...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude.
Devenir
A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux.
Remplacement
Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Ce modèle d'étude du mécanisme d'action d'anticorps et/ou médicaments chez le rat ayant un système immunitaire humain permettra de reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme. Ces expérimentations in vivo sont les seules à pouvoir répondre à nos questions, le modèle des rats humanisées étant le seul à pouvoir juger dans des conditions physiologiques du rôle des molécules X et Y sur l'efficacité de la réponse immunitaire. Des résultats positifs in vitro seraient insuffisants pour être convaincu de la pertinence physiologique des observations et leur transposition à la clinique seraient freinés.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été déterminée de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur le mécanisme d'action sur les T régulateurs.
Raffinement
Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter la souffrance. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Au moment des injections du traitement, une application au préalable de Lidocaïne sous forme de gel sera effectuée comme analgésie . Afin de limiter au minimum l’impact de la séparation maternelle, celui-ci est réduit grâce à l'imprégnation des gants de l’expérimentateur et d’une boite de Petri (qui sera mise dans la cage d’irradiation) avec la sciure de la cage maternelle Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). Lors du prélèvement de sang par des sinus rétro orbitaire (effectuée totes les 6 semaines avec alternance œil droit/gauche) sur des rats anesthésiés, l'utilisation de tétracaïne 1% en collyre permettra une anesthésie locale. Nous procédons à l’euthanasie des rats en cas d’atteinte des points de limite préétablis.
Choix des espèces
Le choix du rat repose essentiellement sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris et que les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés Nous utiliserons des ratons âgés de 2 à 4 jours afin de faciliter la reconstitution du système immunitaire par des cellules humaines.
Rôle et régulation de la thrombopoïèse pulmonaire lors d’une infection virale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une partie des souris est génétiquement modifiée pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2, ce qui les rend infectables par les variants humains du virus. 5 040 souris vont être utilisées, 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 240 opérées sous anesthésie sans réveil. Sept jours après inoculation, le porteur décrit chez ces souris une température corporelle tombée à 25 degrés et une perte de poids supérieure à 20 %, et prévoit par ailleurs des chirurgies pulmonaires de quatre à cinq heures, des interventions sur les os du crâne, jusqu'à cinq prélèvements de sang sous la mâchoire et des injections derrière l'œil. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, rate et moelle osseuse, ce cumul de prélèvements sur un même animal étant présenté comme une mesure de réduction.
Objectifs
Les mégacaryocytes sont des cellules qui se développent dans la moelle osseuse et qui permettent la formation de plaquettes dans le sang, nécessaire notamment à la coagulation sanguine. Récemment, nous avons démontré que cette formation de plaquettes n’est pas restreinte à la moelle osseuse mais qu’elle peut aussi avoir lieu dans les poumons. Des études récentes et nos données préliminaires suggèrent que cette formation de plaquettes dans les poumons pourrait jouer un rôle clef lors d'une infection virale pulmonaire. Chez l’homme au cours des infections à Sars-CoV-2 une augmentation très importante de ces mégacaryocytes pulmonaires a été reportée chez les patients atteints de COVID-19 en comparaison à d’autres patients atteints d’autres causes de détresse respiratoire. Nous pensons que la formation de plaquettes au niveau des poumons augmente au cours des infections pulmonaires, et cette augmentation semble liée à une aggravation de la détresse respiratoire et à une inflammation aigüe. Les mécanismes y conduisant ne sont pas connus et ce sont donc ces mécanismes que nous proposons d’identifier en utilisant des modèles d’infections pulmonaires chez la souris et des techniques de microscopie intravitale. L’identification de ces mécanismes devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques non seulement pour les infections pulmonaires comme la COVID-19 mais aussi pour d’autres pathologies inflammatoires pulmonaires comme l’asthme ou les fibroses pulmonaires où l'activation des plaquettes contribue au développement de la pathologie
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) déterminer l’implication bénéfique ou délétère de la production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales ; (ii) étudier la cinétique de production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales pulmonaires et de l’inflammation pulmonaire ; (iii) caractériser et identifier de nouveaux mécanismes de la biologie plaquettaire (production, modifications, rôles) ; (iv) identifier potentiellement des nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies pulmonaires dans lesquelles les plaquettes sont impliquées.
Procédures
Dans ce projet, - Les souris sous anesthésie générale subiront une injection de virus. L’injection ne dépasse pas 1 minute. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront entre un et cinq prélèvement sanguin. Les prélèvements ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques jours plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques heures ou minutes plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une injection de molécules puis une chirugie quelques heures ou quelques minutes plus tard. Les souris anesthésiées subiront une procédure de chirurgie sur les os du crane. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris anesthésiées subiront une injection de virus, puis quelques jours plus tard une injection de cellules, et quelques heures après ils seront mis à mort par anesthésie. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie generale subiront une injection de virus. Puis quelques jours plus tard une injection de cellules sous anesthésie generale et locale. Les injections ne dépassent pas 2 min.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous utiliserons un variant du SARS-CoV-2 adapté pour infecter les souris qui induit des pertes de poids inférieures à 10% sur toute la durée de l’infection ainsi qu’une faible baisse de la température corporelle
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront mises à mort pour des prélevements de tissus et de sang.
Remplacement
Notre projet a pour but de mieux comprendre la production de plaquettes sanguines au cours des infections virales pulmonaires. Afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire suffisamment proche de l’homme. Il est impossible de ne travailler sur des modèles in vitro strictement cellulaires car il n'est pas possible pour l'instant d'obtenir en dehors d'un organisme vivant la production de plaquettes pleinement fonctionnelles. En effet cette production est dépendante du flux sanguin et de nombreuses interactions cellulaires. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier, le plus adapté étant la souris.
Réduction
Des expériences préliminaires ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les analyses statistiques seront réalisées sur un logiciel d’analyse en combinant les résultats de n=4 expériences indépendantes avec 5 souris par lot (soit 20 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus lors de certaines étapes clés de notre projet, nous poursuivrons ou arrêterons certaines expériences. Après mise à mort de l’animal, des prélèvements seront réalisés, afin d’obtenir le plus d’informations possibles sans avoir à utiliser d’autres animaux. Nous prélèverons par exemple à la fois le sang, les poumons, la rate et la moelle osseuse, ce qui nous permettra de réaliser plusieurs tests à partir d'un seul animal.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux. Les injections sont réalisées sous anesthésie générale. Pour la chirurgie qui est une procédure sans réveil nous utilisons aussi une anesthésie générale, combinés à des anesthésiques locaux et un analgésiant. La température corporelle et l’hydratation des animaux sont maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. Un gel est appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement. Les souris infectées seront surveillées quotidiennement jusqu’à l’arrêt des procédures. La température, le poids, l’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Pour notre projet visant à explorer la biologie des plaquettes sanguines dans les infections par des virus, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques ii) de l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà présentes dans l’équipe permettant de suivre les plaquettes et les mégacaryocytes, et iii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité et de la biologie plaquettaire chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, notre projet est basé sur l’étude de la dynamique de production de plaquettes par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez la souris. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes majoritairement âgées entre 8 et 12 semaines, mais également certaines de plus de 40 semaines afin d’étudier notre modèle à différents âges chez la souris. A ces stades de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Evaluation thérapeutique de l’électrostimulation du nerf splénique sur des modèles inflammatoires expérimentaux de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 480 reçoivent une endotoxine bactérienne quatre jours de suite pour déclencher une neuroinflammation et détruire une partie de leurs neurones dopaminergiques, 288 se font implanter une électrode sur le nerf de la rate avec des connecteurs fixés au crâne, et 384 traversent une piste les pattes encrées pour mesurer leur longueur de foulée. Reliée trente-six jours par un fil à un stimulateur électrique, chaque souris opérée est séparée de ses congénères, et le bénéfice annoncé pour les personnes atteintes de Parkinson reste une piste thérapeutique à explorer. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'un tel travail ne peut être mené que sur des "organismes entiers" préservant les interactions entre système nerveux et système immunitaire.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer sur des modèles murins l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique de la maladie de Parkinson. Ce modèle de Parkinson est caractérisé par une réponse pathogénique neuroinflammatoire médiée par le système immunitaire. Il a pour finalité éventuelle d'appliquer ce traitement par électrostimulation en clinique. La maladie de Parkinson est une maladie du cerveau qui entraîne de la neuroinflammation, des problèmes moteurs, des troubles de la santé mentale et du sommeil, ainsi que des douleurs et d’autres problèmes de santé. L'efficacité des traitements actuels est malheureusement inconstante, et épuisable obligeant à changer souvent de molécule. Il n’y a pas de traitements curatifs. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante et pourrait apporter une nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Nous avons ainsi récemment démontré que la stimulation du nerf de la rate (splénique) réduisait significativement la neuroinflammation dans un modèle murin de la sclérose en plaque. On sait que la stimulation de certains nerfs périphériques agit également directement sur les cellules du système immunitaire en inhibant leur activité inflammatoire. Toutefois, l’impact d’une stimulation chronique du nerf splénique sur l’évolution de la maladie de Parkinson n’a jamais été évalué. Le projet consiste à : 1- implanter chez une souris une électrode de stimulation au niveau du nerf de la rate (nerf splénique); 2- puis induire la maladie de Parkinson (modèle par injection intra-péritonéale d’une endotoxine bactérienne ; 3- puis réaliser ou non des sessions d'électrostimulation du nerf de la rate. La comparaison des scores cliniques entre les animaux ayant subi une électrostimulation du nerf splénique et ceux n'ayant pas subit cette électrostimulation nous permettra de déterminer l'effet de l'électrostimulation sur le développement de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante, présentant une toxicité potentielle moindre comparée aux molécules de type stéroïdien par exemple. Déterminer si l’électrostimulation inhibe les principales cellules immunitaires pathogéniques impliquées dans la sclérose en plaque pourrait conforter l’utilisation de cette nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
Induction de la maladie de Parkinson : 480 animaux Les animaux subiront une anesthésie générale gazeuse et recevront une injection d'endotoxine bactérienne tous les jours pendant 4 jours consécutifs afin d’activer le système immunitaire (durée de l'intervention: 10 minutes). Implantation électrode : 288 animaux. Les animaux recevront un analgésique 20 minutes avant l’opération puis subiront une anesthésie générale pendant 20 minutes. Une électrode sera implantée au niveau du nerf splénique et les connecteurs seront fixés au niveau du crâne. La durée prévue de l’opération est de 20 minutes. Le lendemain de l'opération, les animaux opérés recevront un traitement anti-inflammatoire maintenu pendant les 3 jours suivants. Mesure de la longueur de foulé : 384 animaux. Les longueurs de foulée sont mesurées sur une piste plein champ contenant une bande de papier et disposée pour déboucher sur de la nourriture. Les pattes antérieures et postérieures de la souris sont humidifiées au préalable avec de l'encre avant d'être relâchées pour traverser la piste éclairée. Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
1- Nuisances associés à l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'endotoxine bactérienne : Dans ce modèle, la maladie de Parkinson est induite par injections d'une endotoxine bactérienne. Ces injections provoquent chez l’animal une réaction immunitaire induisant de la neuroinflammation et à terme la perte partielle de neurones dopaminergiques dès le 5ième jour. A partir du 19ème jour après la première injection , un déficit moteur modéré apparaît qui se traduit par une diminution maximale de la longueur de foulé de l’ordre de 8%. Le pic de la pathologie est atteint aux alentours du jour 19 post induction puis les symptômes associés à la maladie vont décroitre progressivement jusqu’à la fin de l’expérimentation (jours 36). 2- Nuisances associées à l’électrostimulation : Il n’y a pas de douleurs associées à l’électrostimulation du nerf splénique car ce nerf n’est pas constitué de fibres nerveuses sensitives. La procédure d'implantation d'une électrode sur le nerf de la rate et l'électrostimulation chronique de ce nerf est réalisée de manière récurrente au sein de notre équipe. Une douleur d’une durée estimée à 48 heures est par contre engendrée par la procédure chirurgicale permettant l’implantation de l’électrode de stimulation sur le nerf splenique du fait de l’incision de la peau et du péritoine. Lors de l'électrostimulation les animaux seront séparés les uns des autres car la stimulation électrique requiert une connexion à un stimulateur électrique externe par un fil incompatible avec une stabulation en groupe pendant 36 jours (risques de rognage de fils).
Devenir
Afin de limiter au maximum les souffrances potentielles associées à l'évolution de la pathologie, l'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure
Remplacement
Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique.
Réduction
Les estimations du nombre d'animaux par condition expérimentale a été determiné par une approche statistique afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulé de l’expérimentation et donc de limiter le nombre d’animaux
Raffinement
Des mesures de raffinements seront mises en place afin de limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux dans le contexte de cette étude : les interventions chirurgicales seront menées suivant un protocole d’anesthésie et d’analgésie en prenant soin de maintenir la température corporelle des animaux en les plaçant sur une couverture chauffante. Le suivi postopératoire inclura un traitement antalgique et une grille d’observation préétablie prévoyant des mesures correctives et la mise en oeuvre le cas échéant de points limites précoces et adaptés.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi car c’est l’espèce animale de référence en Immunologie chez laquelle l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'une endotoxine bactérienne a été bien caractérisée. Le projet portera sur des souris mâles C57Bl/6 âgées de 12 semaines permettant une chirurgie aisée (poids entre 20 et 25 gr).
Etude pilote pour l’évaluation de l’efficacité d’induction d’un gène de mort et de la destruction de lymphocytes T humains greffés chez la souris femelle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Dépourvues de lymphocytes T et B fonctionnels, avec des cellules Natural Killer affaiblies pour qu'elles ne rejettent pas la greffe, 100 souris femelles de sept à huit semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des lymphocytes T humains porteurs d'un gène de mort, puis le médicament censé déclencher ce gène, en deux injections au plus sous anesthésie et analgésie, avec trois pesées en dix jours et un prélèvement de sang pour douze d'entre elles. Cette étude pilote vise à montrer qu'on peut détruire à volonté des cellules thérapeutiques devenues dangereuses chez un patient, la preuve ayant déjà été obtenue in vitro puis chez la souris avec un gène rapporteur fluorescent. Toutes sont tuées pour que leurs tissus et organes soient prélevés.
Objectifs
Les lymphocytes T (LT) font partie d’une catégorie de globules blancs qui jouent un rôle très important pour les défenses de l’organisme. Ces cellules sont responsables de la réponse immunitaire cellulaire visant à détruire les agents pathogènes, aussi bien les bactéries que les cellules cancéreuses. L’idée d’utiliser ces LT pour le traitement de maladies est en plein développement. Le principe de ces thérapies consiste à prélever les LT des patients pour les modifier génétiquement et les lui réinjecter dans le but de reconnaître puis d'éliminer les cellules cancéreuses. Leur efficacité est contrebalancée par de fréquents effets secondaires indésirables tels que la production massive de cytokines suivie par des neurotoxicités. Dans ce projet nous souhaitons démontrer la possibilité de pouvoir éliminer de façon contrôlée les cellules T génétiquement modifiées si des effets adverses apparaissaient. Pour contrôler ces cellules en clinique chez l’homme, elles peuvent être équipées de gènes « dit suicide » qui sont activables par des médicaments cliniquement approuvées. L’activation du gène suicide par le médicament va déclencher la mort du LT. Nous avons validé le concept in vitro en substituant le gène suicide par un gène rapporteur fluorescent et montré que notre médicament permettait d’activer ce gène rapporteur en activant un signal fluorescent dans la cellule. Puis, in vivo, chez la souris nous avons confirmé que ce médicament est capable d'induire l'expression de ce gène rapporteur. L’objectif de ce projet est de déterminer l'efficacité de notre médicament à induire la mort de LT humains équipés, cette fois-ci, d'un gène suicide après une greffe chez la souris .
Bénéfices attendus
Le bénéfice de cette étude pilote préclinique est la validation de systèmes de sécurité, inductibles et contrôlés, permettant d'éliminer des cellules T greffées chez un patient en cas d’effets secondaires graves pour le traitement de pathologies. Cette sécurité vise à perfectionner considérablement les protocoles actuels de cellules T et favorisera leurs utilisations en première intention améliorant ainsi la prise en charge des cancers et le traitement de certaines pathologies auto-immunes.
Procédures
Les souris seront soumises à 3 pesées d'une durée de moins de 30 secondes (réalisées sur animal vigile) à J0, J5 et J10. Deux injections maximum sur animal anesthésié et analgésié, d'une durée de moins de 30 secondes, seront réalisées. Un prélèvement de sang sur animal anesthésié sera réalisé sur 12 animaux.
Impact sur les animaux
Un stress, de courte durée de moins de 30 secondes, pourra être généré au moment des contentions des souris et lors des pesées hebdomadaires. Du stress sera également généré lors des anesthésies d'une durée de 5 à 10 minutes maximum. Les injections pour l'inoculation des lymphocytes et du médicament ainsi que le prélèvement de sang pourront également générer une douleur d'intensité légère de courte durée (10 à 15 secondes).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus et d'organes pour des analyses tissulaires.
Remplacement
Des tests in vitro réalisés ont montré que le médicament utilisé est capable d'activer le signal de mort dans des lymphocytes T humains modifiés. Nous souhaitons maintenant valider le concept in vivo aussi l'utilisation du modèle souris est indispensable.
Réduction
Il s'agit d'une étude pilote répartie en deux étapes comportant un effectif de 100 animaux au total. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, les groupes comporteront 10 animaux maximum tout en permettant une analyse à l'aide d’outils statistiques appropriés sur les prélèvements analysés.
Raffinement
Les souris seront acclimatées au moins 7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Les pesées seront réalisées sur animal vigile par contre tous les autres gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié/analgésié afin de diminuer le stress et l'inconfort de l'animal. Durant les 10 jours de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins adaptée.
Choix des espèces
Afin de pouvoir greffer des lymphocytes T humains, une immunodéficience est nécessaire. Nous utiliserons comme modèle une souris immunodéprimée caractérisée par une absence des cellules T fonctionnelles et des lymphocytes B, une diminution des activités des cellules présentatrices d’antigènes, des cellules myéloïdes et des cellules Natural Killer. Ces caractéristiques évitent le rejet des lymphocytes T humains. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 15-20 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules humaines.
Utilisation du modèle de la poche d’air pour évaluer de nouveaux traitements anti-inflammatoires et pour évaluer la bio-compatibilité de produits en développement.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 1000
2 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, une partie parce qu'ils ont reçu des substances dont les effets à long terme sont inconnus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées qui forment une poche d'air sous la peau de leur dos, poche ensuite regonflée, et chaque animal peut recevoir jusqu'à 224 administrations et subir jusqu'à 72 prélèvements sanguins sur cinquante-six jours. Le modèle sert à tester des anti-inflammatoires et la biocompatibilité de biomatériaux, de nanoparticules ou d'implants, y compris des molécules déjà commercialisées, pour des industriels. Le porteur écrit qu'il lui est "malheureusement impossible" de remplacer ce modèle par une approche in vitro ou in silico, les réponses globales de l'organisme étant selon lui difficiles à simuler.
Objectifs
L’inflammation est un processus complexe en réponse à diverses agressions du corps. Cette réaction qui vise à éliminer l'agent agresseur, à réparer les tissus endommagés et à favoriser la guérison, se caractérise par des symptômes tels que le gonflement, la douleur et la rougeur au niveau des zones touchées. La crise inflammatoire est un mécanisme de défense vital qui aide à éliminer l'agresseur et à limiter les dommages. Cependant lorsque l'inflammation devient excessive ou persiste pendant de longues périodes, elle peut conduire à une inflammation chronique pathologique. Il est alors essentiel de disposer de traitements anti-inflammatoires pour éviter les complications à long terme. Actuellement il existe plusieurs médicaments anti-inflammatoires qui sont couramment utilisés pour contrôler l'inflammation et atténuer les symptômes de la crise inflammatoire. Cependant, ils présentent des effets secondaires parfois importants, ce qui limitent leur utilisation, et dans certains cas, l’inflammation résiste à ces traitements. Pour ces deux raisons le développement de nouvelles molécules reste un défi important. L’inflammation peut aussi avoir pour origine l’utilisation de biomatériaux, de nanoparticules ou d’implant dans le traitement de pathologies. Dans ce cadre il est important de tester la biocompatibilité des produits utilisés afin de sélectionner ceux qui seront le mieux tolérés par le corps.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements anti-inflammatoires et au développement de produits biocompatibles lorsque l’utilisation de biomatériaux est nécessaire. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique dans ce modèle, nous participons à une meilleure connaissance de sa prédictivité.
Procédures
Les animaux de ce projet seront tous amenés à subir la formation d’une poche air. Les animaux auront un maximum de 224 administrations et un maximum de 72 prélèvements sanguins sur la période de maximum 56j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 secondes. En cas injection intraveineuse, durée est d’environ 5 min. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Chacune des étapes de la formation de la poche prend moins de 3 min avec le temps de l’anesthésie et le temps l’injection. Le prélèvement du liquide de la poche prend moins de 5 min en tenant compte du temps d’anesthésie.
Impact sur les animaux
Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. Les procédures mises en œuvre peuvent induire des douleurs chez l’animal notamment lors de la création de la poche, lors de l’inflammation induite ou si le produit testé induit une inflammation.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux seront utilisées pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes anti- et pro-inflammatoires in vitro, les réponses globales à court et moyen terme sont difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer nos modèles in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Néanmoins, les molécules et produits testés dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, plusieurs types de prélèvements seront associés. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous testons plusieurs molécules ou produits en parallèle afin de ne pas multiplier les groupes contrôles. Comme aucune inflammation n’est attendue en l’absence d’injection de molécule immunostimulante dans la poche, le groupe sans injection de molécules immunostimulantes ne sera, en général, pas mis en œuvre. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 animaux. Des analyses statistiques finales seront réalisées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, il comporte du Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, il comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Pour les rats, il comporte un tunnel en carton pour leur permettre de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. La douleur induite par les étapes de création de la poche et de regonflage est prise en charge par un traitement anti-douleur. Les prélèvements de sang en cours d’expérience se font sous anesthésie et tous les autres prélèvements (ponction de la poche, prélèvement sanguin terminal) se font en phase terminale, sous anesthésie sans réveil. De plus nous avons établi des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA (Structure du Bien Être Animal) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat dans les études utilisant le modèle de la poche d’air. De plus ce modèle répond favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permet aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Les besoins d’anti-inflammatoire et de matériaux biocompatibles peuvent apparaitre à tout âge, cependant comme beaucoup de ces phénomènes impliquent également le système immunitaire, l’utilisation de jeunes adultes au système immunitaire mature nous parait pertinent. De plus chez la souris il nous faut également des animaux pas trop petits pour des questions techniques de place dans le dos pour former une poche exploitable. Nous utiliserons donc des souris d’environ 12 semaines et rats d’environ 10 semaines au début de l’expérience.