Troubles sensoriels

14 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des tirs de laser femtoseconde dans le cristallin sous anesthésie générale et locale, un motif dans l'œil droit pouvant selon le porteur diminuer "de manière très modérée" l'acuité visuelle, avant d'être tués pour l'analyse histologique des tissus oculaires. Le porteur affirme que le traitement "reste sans douleur" et s'appuie sur une étude antérieure menée sur neuf lapins. Il indique qu'il n'existe aucun modèle in vitro ou ex vivo du cristallin permettant un suivi sur plusieurs semaines, le projet servant une startup à établir une preuve de concept contre la presbytie.

Objectifs

La presbytie, qui survient systématiquement après 45 ans, concerne 1,8 milliard de personnes, dont 826 millions ne sont pas ou sont mal corrigés. Il est documenté qu'elle est causée par une rigidification du noyau du cristallin empêchant les muscles accrochés à sa périphérie de modifier l’épaisseur et la courbure nécessaires à l'accommodation. Le cristallin est composé de cellules contenant des protéines appelées cristallines, qui sont solubles et le rendent transparent en homogénéisant son indice de réfraction. En vieillissant, les agrégats de cristallines (création de ponts disulfures principalement), deviennent insolubles et rigidifie le noyau. L’hypothèse principale est qu’il est nécessaire de « ramollir » le noyau du cristallin en désagrégeant les protéines cristallines. Une des techniques les plus appropriées pourrait être le laser femtoseconde. Ce dernier permet d’envoyer de très courte impulsion d’énergie photonique avec précision dans le tissu sans dégagement d’énergie thermique. Après une étude de safety menée en 2021 sur 9 lapins ayant montré que la création de patterns (= motifs 2D ou 3D) au laser femtoseconde dans le cristallin d'un lapin n'entraine pas d'effets délétères à court, moyen et long terme sur les tissus opthamologiques de l'animal ; la startup a effectué de nombreux tests ex vivo sur cristallin de cochon. Ces tests avaient pour objectif d'effectuer une gamme de marquage au laser femtoseconde (distance entre les points de tir laser, puissance...) afin d'en étudier les interactions laser-matière. Ils ont alors pu observer des paramètres permettant d'obtenir des tirs lasers qui restaient transparents dans le cristallin. 1/ confirmer ou infirmer IN VIVO la correspondance entre les paramètres laser et types d’interaction laser matière observés en EX VIVO (bulles de coalescence, bulle de cavitation, marquage sans apparition de bulles, pas de marquage apparent) 2/ confirmer ou infirmer l’évolution des différents types d’interactions sur plusieurs semaines (résorption des bulles, atténuation ou disparition totale des marquages…) 3/ identifier les paramètres qui permettent d’obtenir un marquage maintenant la transparence ou permettant de la récupérer en IN VIVO afin d’en évaluer les effets biomécaniques (assouplissement), dioptriques ou autres. Données d’entrée à des études ultérieures. 4/Caractériser In situ les impacts laser des différentes interactions lasers (tissulaires et protéiques) 3 semaines après le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à la stratup d'obtenir des connaissances sur l'interaction laser-matière sur le long terme (impossible à obtenir en ex-vivo ou in-vitro) confirmant ou infirmant les résultats qu'ils obtenus en ex vivo et leur permettant ensuite d'aller plus en avant sur des études d'efficacités de leur traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tirs de laser femtoseconde dans le cristallin. 6 lapins auront 2 phases de tirs lasers. et 4 lapins n'en auront qu'un seul. Les animaux seront sous anesthésie générale et locale. Rapellons que ce traitement laser très focalisé reste sans douleur pour l'animal et que des tests précédents ont montrés qu'à cette puissance, il n'y a pas d'effets délétères pour la cornée et la rétine des animaux.

Impact sur les animaux

Les nuanciers créés dans l'oeil gauche de l'animal sont de très petite taille (environ 2mm²) et ne devraient pas avoir d'impact sur la vision de l'animal. Le pattern qui sera créé dans l'oeil droit de l'animal pourrait diminuer l'acuité visuelle de manière très modérée. Les puissances lasers qui seront utilisées durant cette étude sont inférieures à celles utilisées durant l'étude de 2021, par conséquent aucun effet délétère pour la cornée ou la rétine n'est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car nous devons analyser en histologie les tissus oculaires de ces animaux afin de pouvoir conclure.

Remplacement

A ce jour, il n'existe aucun modèle in vitro ou ex vivo de conservation du cristallin satisfaisant et permettant un suivi de l'organe sur plusieurs semaines. De plus, il n'existe aucun modèle de cristallin permettant de simuler l'interaction avec le système immunitaire pour ce genre d'intervention chirurgicale.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type d'intervention chirurgicale pour la première phase et de 4 lapins par groupe pour la deuxième phase afin de pouvoir effectuer toutes las analyses histologiques dont certaines nécessite un globe oculaire entier.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (sédation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Une précédente étude menée par notre laboratoire a démontrer qu'à cette fluence de laser le tir laser dans le cristallin n'induit aucun dommage à la rétine et la cornée du lapin. Cette précédente étude a par ailleurs permis de tester et d'optimiser le système de tir laser et son docking. Ce dernier sera d'autant plus optimisé puisqu'il sera testé sur des têtes de lapins de boucheries et des yeux de lapins énucléés ex vivo et modifié au besoin courant la fin de l'année 2023 et le début 2024. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking.

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire (cristallin et cornée) proche de l'homme. Pour que le traitement du cristallin soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgésd’environ 3 mois (12 semaines).

125 chiens, cochons, chèvres et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des prélèvements sanguins réguliers puis une ou deux chirurgies, dont la création d'une lésion et l'implantation d'un dispositif ORL, avant une euthanasie destinée aux analyses nécropsiques et histologiques. Les bénéfices annoncés pour les patients, implants plus durables et récupération plus rapide, restent renvoyés à l'application future du dispositif. Le porteur affirme que l'expérimentation sur "organisme entier" est "incontournable" et relève d'une "obligation règlementaire" pour valider les dispositifs implantables.

Objectifs

La sphère ORL (pour oto-rhino-laryngologie) est une zone anatomique complexe qui regroupe un large ensemble de structures comme entre autres les oreilles, le nez, les sinus et la gorge (y compris la bouche, la langue, le larynx et la trachée). Elle peut être le siège de différentes pathologies, acquises ou congénitales comme par exemple les cancers des voies aérodigestives supérieures (VADS) qui se situent au 5ème rang des cancers les plus fréquents en France, et dont la chirurgie par voie mini-invasive constitue l’un des traitements de première intention et représente la modalité de référence pour les tumeurs de la cavité buccale et à la suite de laquelle une reconstruction est souvent nécessaire; ou encore des anomalies du développement comme certaines sténoses dont la correction peut nécessiter l'emploi de stents par exemple. Le développement des techniques et des méthodes d’imagerie et de chirurgie interventionnelles, l’essor de la thérapie génique et cellulaire ou la découverte et l’amélioration des connaissances vis-à-vis d'entités pathologiques comme les cancers ont permis ou permettent d’envisager le développement de nouvelles techniques chirurgicales et/ou dispositifs permettant d’améliorer la santé des patients. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. L'évaluation et le développement de nouveaux dispositifs, méthodes et techniques pour le diagnostic et/ou le traitement des affections ORL par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase de recherche et de développement. Durant ce projet le recours à l’animal vivant est indispensable pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire visés par les applications chez les patients et qui ne peuvent être obtenus par des méthodes alternatives. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'évaluation de dispositif en O.R.L avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'évaluation de dispositif O.R.L associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 24 heures pour les ovins/caprins et 6 à 8 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif O.R.L, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type anastomose, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroidiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs doivent être testés sur une anatomie semblable à celle de l’Homme (de l’enfant à l’adulte de grande taille), cela impose l’expérimentation sur des gros animaux. Les différences interspécifiques tissulaires, anatomiques et fonctionnelles nécessitent différentes espèces pour optimiser l’expérimentation. L’évaluation des différents dispositifs du projet se fera uniquement sur le modèle animal préalablement identifié comme le plus pertinent : Les ovins et les caprins pour l'évalution de la durabilité des stratégies opératoires des dispositifs testés. Leurs intérêts principaux sont leur croissance limitée à l'âge adulte et leur robustesse. Les porcins pour l'évaluation de la durabilité de l’ancrage des dispositifs. Les canins lorsqu’ils sont les seuls à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle recherchée. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, on leur pratique deux incisions dorsales pour insérer des membranes synthétiques sous la peau, seules ou avec des cellules, afin d'évaluer si ces implants favorisent la croissance de vaisseaux sanguins en vue d'une future greffe rétinienne. Le porteur indique des douleurs possibles après incision et un risque d'infection ou d'inflammation au site d'implantation. Il décrit des travaux préalables in vitro et affirme qu'aucun système ex vivo n'intègre les phénomènes de vascularisation d'un greffon, rendant les expériences in vivo "nécessaires".

Objectifs

La barrière hémato-rétinienne externe (BHRE) est la barrière la plus externe de l'oeil, protégeant ce dernier, notamment des infections. Dans de nombreuses pathologies de la rétine, comme la dégénérescence maculaire ou rétinopathie diabétique, la BHRE est endommagée conduisant à une perte irrémédiable des cellules la constituant, menant à terme à une perte de la vision. Plusieurs thérapies ont été envisagées, notamment une thérapie cellulaire visant à implanter de nouvelles cellules rétiniennes saines afin de reconstituer le tissu malade. Cependant, ces stratégies n'incluaient pas, au sein de l'implant, de pré-vascularisation. Cette dernière consiste en la formation in vitro de portions de vaisseaux sanguins, au sein d'un implant, qui peuvent ensuite être reliées par le corps humain pour former des vaisseaux fonctionnels. Des études ont récemment montré que la pré-vascularisation est nécessaire pour une bonne intégration et une bonne irrigation sanguine du greffon ainsi qu'à une survie optimale des cellules implantées. L'objectif global de notre projet est donc de proposer un nouveau greffon incluant à la fois les cellules rétiniennes et une pré-vascularisation. Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des membranes en polysaccharides qui sont des molécules naturelles organisées en de longues chaînes constituées à partir de différents types de sucres. L'objectif de cette étude in vivo est d'analyser si ces membranes sont propices à la croissance de vaisseaux sanguins dans le greffon pour garantir son irrigation et si la présence d'une pré-vascularisation des membranes grâce à l'ajout de cellules du système vasculaire permet une meilleure et plus rapide vascularisation de l'implant.

Bénéfices attendus

A travers ce projet, une nouvelle stratégie de thérapie cellulaire pourra être évaluée, en analysant le bénéfice de la pré-vascularisation de l'implant sur l'intégration du greffon chez l'hôte. Cette étude permettra d'évaluer la condition de pré-vascularisation optimale afin de conduire plus tard des implantations dans la rétine. A long terme, ce projet pourra permettre de proposer une nouvelle stratégie de thérapie cellulaire pour de nombreuses rétinopathies aujourd'hui sans traitement efficace.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique procédure menée sous anesthésie générale avec administration d'anti-douleur. Elle consiste à deux incisions cutanées au niveau dorsal, de chaque côté du dos, afin de créer deux poches sous-cutanées dans lesquelles seront placées les implants. Selon les conditions, les implants seront implantés seuls ou en présence de cellules. La procédure dure environ 10 minutes par animal (5-6 minutes pour l'épilation et 3-4 min pour l'implantation).

Impact sur les animaux

L'anésthésie réalisée pour les implantations sera faire par injection, pouvant induire un stress pour l'animal ainsi qu'une douleur au moment de la piqûre. Des douleurs peuvent être ressenties suite à l'incision et à l'implantation du greffon. De plus, même si les implants sont stérilisés puis conservés en milieu stérile et que les souris ont de bonnes capacités de cicatrisation de la peau, une infection pourrait être possible au niveau de l'incision. Enfin, une réaction inflammatoire est possible au niveau de l'incision au cours de la phase de cicatrisation, ainsi qu'au sein de l'implant, en réaction à l'implantation des cellules endothéliales et des péricytes.

Devenir

Pour les analyses prévues, nous avons donc besoin d'euthanasier les animaux à la fin de l'expérience. L'euthanasie sera effectué après anesthésie de l'animal. Le greffon sera alors explanté avec le tissu avoisinant (peau au-dessus et autour de l'implant).

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont été menées afin de montrer la possibilité de céllulariser les membranes. De plus, la cytotoxicité de la membrane a été évaluée in vitro et les résultats ont montré que les cellules ensemencées survivent durant plusieurs semaines sur les membranes. Afin d'évaluer la capacité de vascularisation de ces membranes, il n'existe cependant pas de système ex vivo permettant d'intégrer l'ensemble des phénomènes complexes à l'oeuvre dans les processus de vascularisation d'un greffon. Des expériences in vivo sont donc nécessaires.

Réduction

Des études in vitro ont permis d'optimiser la composition et la structure de la membrane ainsi que les protocoles utilisés afin d'ajouter les cellules dans la membrane afin de limiter le nombre de groupes à étudier chez l'animal, et donc de limiter le nombre d'animaux à utiliser. De plus, dans chaque animal, deux membranes seront implantées, de part et d'autre de la ligne médiane dorsale, afin de limiter le nombre d'animaux. En prenant en compte cet élément, le nombre minimum d’animaux à utiliser a été déterminé d’après le logiciel Invivostat: un nombre de 12 échantillons et donc de 6 animaux par groupe et par temps d'analyse est nécessaire pour assurer des résultats statistiquement pertinents.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un hébergement avec environnement enrichi et en groupe social, et seront surveillés quotidiennement par le personnel technique pour vérifier leur état de bien-être, avant et après la procédure. Pour réaliser la procédure, l'anesthésie se fera avec analgésie (buprénorphine) pour réduire la douleur durant la procédure et en post-opératoire. Après la procédure, les animaux seront surveillés tous les deux jours au cours des deux premières semaines par du personnel compétent grâce à une grille d'évaluation et la mise en place de points limites afin de surveiller la présence de potentiels effets secondaires potentiels de la procédure et de réduire les douleurs éventuelles.

Choix des espèces

Nous souhaitons conduire des implantations en sous-cutané chez la souris, modèle sélectionné grâce à l'importante vascularisation de la peau et aux bonnes capacités de re-cellularisation en sous-cutané, d'après des études reportées dans la littérature. De plus, nous souhaitons utiliser des souris immunodéficientes, c'est à dire qui possèdent un système immunitaire déficient, voire une absence de système immunitaire, afin de limiter la réaction inflammatoire après implantation. Nous utiliserons des souris adultes (environ 8 semaines) afin de maximiser les capacités de vascularisation.

24 souris Hairless vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois formulations à principe actif leur sont appliquées quotidiennement sur le dos pendant 14 jours, ce qui "pourrait induire avec le temps le développement de rougeur (érythème) ou de gonflement (œdème)". La peau est prélevée après mise à mort pour évaluer la tolérance cutanée et la biodistribution. Le porteur affirme que le remplacement "n'est pas envisageable", aucun modèle cellulaire ne reproduisant selon lui le microenvironnement cutané sur un temps prolongé.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer chez la souris la tolérance cutanée et la biodistribution dans la peau de 3 formulations différentes appliquées quotidiennement sur le dos des souris pendant 14 jours consécutifs. Chacune des 3 formulations à évaluer possédera un pricincipe actif différent mais avec les mêmes composants permettant une meilleure diffusion et distribution dans le tissu cutané. Pour effectuer l’évaluation de la tolérance de ces 3 formulations, en comparaison avec une formulation neutre dépourvue de principe actif, une observation quotidienne de la zone traitée sera effectuée avec un scorage de différents paramètres. Un suivi pondéral régulier des souris et une observation de leur comportement seront effectués au cours des 14 jours de traitement. A l’issue des 14 jours de traitement, un prélèvement cutané au niveau de la zone d’application des différentes formulations sera effectué afin de réaliser un ensemble d'analyses qui permettront de caractériser la tolérance, par le tissu cutané, des traitements effectués, et la biodistribution dans la peau des produits appliqués. Cette étude permettra ainsi de sélectionner la formulation ayant la meilleure tolérance cutanée et la meilleure biodistribution au niveau du tissu cutané pour la réalisation d’une étude d’efficacité sur un modèle de lésion précancéreuse de la peau (kératose actinique).

Bénéfices attendus

La kératose actinique est une lésion cutanée développée à partir de cellules constituant 90 % de la couche superficielle de la peau (épiderme), est dont les deux facteurs de risque principaux sont l’exposition solaire avec les rayonnements ultraviolets, ainsi qu’une peau sensible, personnes ayant une peau et des yeux clairs. En France, il s’agit d’une des premières causes de consultation chez le Dermatologue et son incidence double tous les 10 ans proportionnellement au vieillissement de la population. Une kératose actinique se traduit par un épaississement de la surface de la peau aux endroits du corps exposés au soleil pendant une période prolongée. Elle est considérée comme précancéreuse et peut évoluer de différentes manières : elle peut se résorber spontanément, persister ou augmenter de volume plus ou moins rapidement. Dans 16 à 20 % des cas, elle peut évoluer vers un cancer cutané. Différents traitements locaux sont possibles en fonction de la localisation, des caractéristiques du patient et de celles de la kératose actinique. Cependant les effets indésirables varient en fonction du type de kératose actinique et de la durée des traitements nécessaires. Il est donc important et nécessaire de développer de nouvelles thérapies permettant de traiter ces lésions précancéreuses avant qu’elles ne se transforment en lésions cancéreuses, avec la meilleure tolérance possible, par des approches simples et sur des modèles expérimentaux représentatifs de la pathologie humaine. Ces nouvelles thérapies pourront ainsi être évaluées par la suite chez l’Homme et elles permettront d’améliorer la prise en charge de personnes atteintes de kératose actinique.

Procédures

Les 24 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront soumises à une application cutanée quotidienne sur le dos pendant 14 jours d’une formulation neutre ou d’1 des 3 formulations contenant chacune un principe actif différent. Ces applications cutanées effectuées sur animal vigile seront effectuées en 1 minute environ chaque jour. Pour chaque souris, la zone d’application des formulations sera observée quotidiennement tout au long de l’expérimentation afin de suivre la tolérance cutanée au cours du temps. Ces observations seront effectuées sur animal vigile, en 1 à 2 minutes environ chaque jour.

Impact sur les animaux

Les applications cutanées quotidiennes des formulations effectuées sur animaux vigiles pourront engendrer un léger stress mais qui devrait s’estomper progressivement au cours des 14 jours de traitement, celles-ci étant réalisées en moins d’une minute par du personnel expérimenté et en limitant le nombre de personnes manipulant les animaux et réalisant les traitements. Ces applications cutanées répétées des formulations à évaluer pourraient induire avec le temps le développement de rougeur sur la peau (érythème) ou de gonflement de la peau (œdème) mais avec une douleur induite très limitée du fait des propriétés anti-inflammatoires des principes actifs qui la composent. Les observations quotidiennes effectuées avant chaque traitement n’engendreront pas de douleur et seront réalisées en un temps très court (1 à 2 minutes environ). Un suivi quotidien du comportement des animaux et régulier de leur évolution pondérale sera effectué tout au long de l’étude mais aucune modification comportementale notoire et aucune perte de poids significative ne sont attendues.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 24 souris seront toutes euthanasiées après les 14 jours de traitement cutané. Un prélèvement de peau sera effectué au niveau de la zone traitée pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser la tolérance cutanée et la biodistribution des 3 formulations évaluées.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles cellulaires permettant de caractériser sur un temps prolongé la tolérance cutanée et la biodistribution de formulations (influence du microenvironnement cutané et processus immunitaire), et ses effets éventuels sur le comportement. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. L’utilisation de souris mâles et femelles permettra d’obtenir suffisamment de données et d’échantillons pour la réalisation des analyses envisagées. S’agissant d’une étude observationnelle et le nombre d’animaux étant limité, aucune analyse statistique ne sera effectuée.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à la réalisation des traitements quotidiens. Les animaux et la région d’application des formulations à évaluer seront observés chaque jour tout au long de l’expérimentation. Le poids sera relevé 3 fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 10% entre 2 pesées ou 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’intolérance cutanée (érythème ou œdème important, ulcération de la peau) ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, prostration, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Les souris seront placées par 3 dans des cages de 18.9x29.6x12.8 cm dans une animalerie dédiée au souris immunocompétentes. Elles seront maintenues en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), des morceaux de papier absorbants étant placés dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être, remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris et plus particulièrement la souris Hairless, dépourvue de poils, est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet. Elle est très utilisée pour les études dans le domaine de la Dermatologie notamment pour les études de tolérance cutanée et d’efficacité sur différents modèles de pathologies dont la kératose actinique. C’est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce projet afin d’évaluer la tolérance cutanée et la biodistribution de nouvelles formulations. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris classiquement décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de tolérance cutanée et de biodistribution (généralement 6 à 8 semaines).

1962 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil et, pour 606 d'entre elles, quatre lésions au laser de la rétine sur un œil, avant récupération des yeux après mise à mort. Le porteur classe l'injection intravitréenne en gravité modérée par précaution et affirme que les lésions laser sont indolores et compensées par le cerveau en moins d'une semaine. Il conclut qu'aucune alternative in silico ou in vitro ne donne accès aux "grandes fonctions physiologiques des mammifères", et prévoit d'arrêter si un vecteur atteint 80 % de neutralisation du VEGF.

Objectifs

Les maladies de la rétine sont des troubles neurologiques majeurs pour lesquels aucun traitement efficace n’existe, et ce malgré les découvertes mettant à jour certains mécanismes liés à leur progression. Pour la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age (DMLA) seuls existent des traitements palliatifs visant à réduire la prolifération de nouveaux vaisseaux immatures dans la rétine avec des anticorps administrés en Injection Intravitréenne (IVT) et qui sont dirigés contre un facteur de croissance des vaisseaux sangins : le VEGF. Ces nouveaux vaisseaux immatures ne sont pas étanches et laissent passer un liquide qui crée un œdème rétinien responsable de la perte de la vision. Ces traitements ne sont que palliatifs et ne ciblent en aucun cas les mécanismes à l’origine du développement de la pathologie. L’approche visant à bloquer en amont la fabrication du VEGF (avant sa synthèse) via des petits bouts d’ARN interférents (siARN) prend donc tout son sens. En effet dans la cellule, des petits bouts d’ARN quittent le noyau (ARN messagers) pour initier la fabrication du VEGF. Les siARN dirigés contre le VEGF entrent dans les cellules et viennent neutraliser les ARN messagers bloquant ainsi la fabrication du VEGF. Depuis plusieurs années notre société et ses partenaires ont mis en place un consortium permettant le développement de vecteurs (V) améliorant la délivrance de siARN dans le Système Nerveux Central (SNC) dont la rétine. Ces vecteurs se présentent sous la forme d’anticorps modifiés et ciblent les récepteurs impliqués dans le transport au travers des barrières biologiques, par exemple pour passer du sang vers le cerveau ou la rétine, ou pour rentrer directement dans les cellules. A ces vecteurs nous venons y accrocher des molécules thérapeutiques comme des siARN dirigés contre le VEGF. Issus du savoir-faire de notre société, nos candidats médicaments sont couplés à nos vecteurs (V-siARN) et transformés dans le but d’améliorer le transport vers la rétine pour augmenter le pouvoir d’action du traitement.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de ce projet est donc de combattre plus efficacement les rétinopathies à prolifération vasculaire (la DMLA mais aussi la rétinopathie diabétique) au moyen de vecteurs combinées à des brins d’ARN interférents pour bloquer les messagers cellulaires responsable de la synthèse du VEGF et donc lutter contre la pousse de nouveaux vaisseaux dans la rétine. La valeur ajoutée consiste à tester de nombreux de siARN dirigés contre le VEGF et à améliorer leur délivrance grâce à notre technologie (nos Vecteurs). Cette première phase expérimentale nous permettra de sélectionner les meilleurs couples siARN-Vecteurs pour passer, dans une deuxième étape, aux tests d'efficacité sur des modèles animaux pathologiques. Les bénéfices attendus pour de futures applications chez l'homme sont multiples par rapport à l'utilisation d'anticorps actuellement administrés en IVT. En effet notre technologie autorise nos vecteurs à se lier qu’à un seul type de récepteur sur les membranes des cellules de la rétine, ce qui nous permet de cibler précisément les cellules à l'origine de la surproduction pathologique de VEGF. D'autre part, il est connu que l'utilisation de siARN permet de rallonger significativement l'efficacité d'un traitement dans le temps par rapport aux simple anticorps classiques dirigés contre le VEGF, ce qui en théorie permettrai aux patients d'espacer la fréquence (mensuelle) des injections qu'ils reçoivent ; administration IVT qui reste un geste chirurgical particulièrement anxiogène et porteur de potentielles complications.

Procédures

Les animaux anesthésiés seront soumis à des administrations dans l’œil (IVT) (1440 animaux, durée de l’acte : 5 min par œil) et à 4 lésions laser de la rétine sur un seul œil (606 animaux, durée 30 min environ). Ils seront ensuite hébergés de 4 jours jusqu'à 3 mois maximum (4, 7, 14 jours, 1 et 3 mois pour un petit sous-groupe seulement) avant leur mise à mort pour récupération des yeux. Dans la partie concernant la mise en place du modèle pathologique de pousse de nouveaux vaisseaux immatures induit par lésion laser un groupe restreint d'animaux (30) subira 4 contrôles en imagerie rétinienne des lésions (le jour de la lésion, puis à, 4, 7 et 14 jours, durée 30 min) sous anesthésie générale. Lors de ces contrôles les animaux recevront à chaque fois une injection d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min) pour la visualisation des vaisseaux rétiniens. En point final tous les animaux seront mis à mort dans nos expériences.

Impact sur les animaux

La procédure d'administration IVT est considérée comme légère chez l'homme mais pour plus de sureté nous la classons en modérée. Seule une désinfection du pourtour de l’œil est requise avant de commencer. Pour éviter de stresser les animaux, cette procédure sera effectuée sous anesthésie générale avec des antidouleurs. Avec une très faible fréquence, les nuisances pouvant être rencontrées dans ce type d’administration seront surveillées attentivement tous les jours (infections notamment). Pour éviter ce type de complication une pommade antibiotique sera systématiquement déposée sur la cornée. Concernant nos composés, nos données issues de projets précédents avec les mêmes molécules ne montrent pas de réaction du système immunitaire, ni de toxicité apparente. L'autre aspect susceptible d'affecter les animaux concerne les lésions rétiniennes par laser. Ces dernières, indolores, aboutissent à des déficits visuels qui correspondent à des tâches noires dans le champs visuel (< 15° d'angle visuel, ce qui correspond à peu près à des cercles de 10 cm de diamètre à un mètre de distance de l’œil). Au nombre de 4 par animal (en haut, en bas, à gauche et à droite), ces lésions couvrent au total moins de 10% du champ visuel des animaux et ceci sur un seul œil. De plus il est connu que des mécanismes corticaux au niveau des aires visuelles du cerveau compensent une partie de cette perte en moins d'une semaine (la lésion dans la rétine est toujours présente mais l’animal ne voit plus ces tâches sombres : mécanisme de remplissage perceptif). De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux mais nous nous contenterons d'effectuer ces lésions sur un seul œil pour plus de sureté.

Devenir

Dans la procédure 1, un groupe de 720 animaux est inclus pour étudier le potentiel de nos vecteurs couplés au siARN. Si les analyses montrent qu'un couple de nos Vecteur/si ARN atteint plus de 80% de neutralisation des ARN messagers du VEGF-A alors le reste des animaux ne sera pas utilisé. Sinon le reste des animaux inclus sera mis à mort car il est nécessaire pour les analyses de les perfuser pour enlever le sang et nous récupérons les deux yeux pour analyse. Etant donné que nous commandons les animaux pour chaque expérience individuellement, les animaux inclus dans le projet et non utilisés ne seront pas à replacer. Dans la procédure 2 tous les animaux seront mis à mort car ils doivent être perfusés avant récupération des yeux pour analyse.

Remplacement

Toutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifToutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.ères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux nous avons opté pour des injections IVT bilatérales chez l’animal sain pour la sélection des différents siARN couplés à nos vecteurs car le geste, bien que classifié ici comme modéré, est à considérer comme une procédure légère sans composante douloureuse, ni impact au niveau de la vision. Le fait d'injecter les deux yeux dans cette phase de sélection nous permet donc de réduire le nombre d’animaux de moitié. Le nombre total d'animaux dans cette procédure fait l'hypothèse de l’échec des précédents V-siRNA testés. Si un des composés atteint plus de 80% de neutralisation du VEGF (observation systématiquement quantifiée dans chaque expérience) alors notre objectif sera atteint et le reste des animaux inclus dans le projet ne sera pas utilisé.

Raffinement

Les animaux seront soumis à un protocole anesthésique et analgésique rigoureux. Dans ce projet nous avons remplacé notre précèdent anesthésique par un de nouvelle génération car il permet un réveil plus rapide des animaux et n'entraine pas d'augmentation de la pression intra-oculaire (problématique pour l'IVT). Une couverture analgésique générale et locale permet d'éviter toute souffrance pendant l'expérimentation. Etant donné le court laps de temps d’exposition de nos V-siRNA dans l’œil (en moyenne 14 j et jusqu'à 3 mois pour un petit sous-groupe), ce type d’action n’est pas à même d’entrainer l’apparition de problèmes dommageables chez les animaux (observation effectuée dans nos précédentes études). Pour des questions de raffinement et de bien-être animal les groupes de lésions rétiniennes au laser passeront de 4 à 8 individus : en effet un seul œil sera lésé pour affecter le moins possible leur vision. De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux. Enfin Le fait de choisir une administration IVT pour combattre les pathologies rétiniennes permet d’utiliser des doses largement revues à la baisse par rapport à une injection intra-veineuse avec une diminution des risques toxiques et immunitaires associés ainsi qu'une distribution dans tout le corps qui n’est pas voulue. Pour éviter toute souffrance animale, nous avons mis en place une grille d'évaluation de la condition des animaux avec toute une série de points limites et les actions y étant associées. Enfin les souris seront hébergées par 4 sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C (portoirs ventilés) et dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglas et dômes en papier, accompagné de nids en coton, de la frisure de papier craft et nous mettrons également à l’intérieur des cages quelques croquettes).

Choix des espèces

Dans ce projet nous avons choisi des souris saines adultes et pigmentées pour 3 raisons : En ophtalmologie il est indispensable d’utiliser des espèces pigmentées (non albinos) car elles ne sont pas dépourvues d’un type de photorécepteur dans la rétine. De plus leur utilisation est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler la version « souris » du récepteur auquel ils se lient. Certains de nos Vecteurs ciblent également la version humaine de ce même récepteur d'où le choix d'une deuxième espèce, des souris adultes, pigmentées et humanisées pour le récepteur ciblé par nos vecteurs et ceci pour évaluer le potentiel de transfert de nos avancées chez l'homme. Enfin nous utiliserons ici uniquement des souris mâles et adultes car il a été prouvé que le modèle de lésion de la rétine que nous allons utiliser est beaucoup plus variable chez les jeunes individus et chez les femelles.

2 400 animaux non-humains vont être utilisés, 960 souris et 1 440 rats, en majorité tués et pour partie réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés sont placés en atmosphère enrichie en oxygène pour provoquer une atteinte des vaisseaux de la rétine, puis reçoivent des gouttes ou des injections répétées, avec anesthésies et examens d'imagerie jusqu'à leur mise à mort. Le porteur teste des traitements contre les rétinopathies vasculaires et indique réutiliser les mères gestantes dans d'autres procédures après avis vétérinaire. Sur le remplacement, il affirme avoir besoin d'un œil perfusé en développement, que seul l'animal vivant fournirait.

Objectifs

Les pathologies de la rétine ou rétinopathies sont liées en grande partie à des anomalies de la vascularisation rétinienne. Parmi elles, on retrouve la rétinopathie du prématuré. Cette maladie liée à un mauvais développement du système vasculaire qui touche 30% des prématurés de moins de 31 semaines est la principale cause de cécité infantile dans le monde avec 30000 cas de malvoyance. Le but de ce projet est de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques et de trouver de nouveaux traitements en utilisant un modèle qui va mimer cette atteinte vasculaire chez le rongeur après une exposition à une atmosphère enrichie en oxygène. Plus généralement, lorsque le flux sanguin est altéré et que les vaisseaux perdent leur intégrité fonctionnelle, un mécanisme compensateur de réparation se met en place, avec la formation de nouveaux capillaires à partir des vaisseaux préexistants. Ce phénomène est appelé néovascularisation. Ces nouveaux capillaires sont souvent perméables et se développent de façon anarchique. Ils ne peuvent alors plus assurer correctement le transport du sang et aggravent de ce fait les dommages causés à la rétine. C’est le cas de nombreuses maladies comme la forme humide de dégénérescence maculaire liée à l’âge, première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans et la rétinopathie diabétique, première cause de cécité acquise dans les pays occidentaux chez l’adulte entre l’âge de 25 et 74 ans. Ce projet s’inscrit donc avec ce modèle de rétinopathie, développé dans les années 1950, dans un cadre plus large que la seule rétinopathie du prématuré. Il est largement utilisé depuis pour l’étude de l’angiogenèse et de la néovascularisation pathologique au niveau de la rétine. Il permet de ce fait de tester l’efficacité de thérapies luttant contre la grande famille des rétinopathies vasculaires. Sur la durée du projet, 10 études par espèce sont prévues en plus des études de formation du personnel aux bons gestes techniques, avec à chaque fois au moins un nouveau traitement ou une nouvelle formulation à tester. Chaque étude nécessite un nombre d’animaux minimum afin de pouvoir comparer les différentes conditions expérimentales et évaluer de l’efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l’identification et la sélection de nouveaux traitements pouvant améliorer la prise en charge de la rétinopathie du prématuré bien sûr mais aussi toutes les maladies incluant une composante vasculaire telles que dégénérescence maculaire liée à l’âge ou rétinopathie diabétique par exemple.

Procédures

Dès la naissance (rats) ou 7 jours après (souris), les animaux seront placés dans des chambres permettant le contrôle du taux d’oxygène durant une durée définie (14 jours pour les rats, 5 jours pour les souris). La durée des traitements variera en fonction de la formulation et du mode d’administration. Les administrations de gouttes se font généralement quotidiennement à raison de 2 à 3 administrations par jour, tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 17 ou 20 jours après le début de l’étude suivant l’espèce. Pour les administrations systémiques, le schéma d’administration est proche de celui de l’administration de gouttes. Généralement, le nombre d’administrations quotidiennes est un peu plus faible avec 1 ou 2 injections par jour tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 17 ou 20 jours après le début de l’étude suivant l’espèce. Pour les autres voies d’administration qui nécessitent une anesthésie de l’animal, les traitements ne sont plus quotidiens mais hebdomadaires avec seulement 1 à 2 injections par semaine pendant les 17 ou 20 jours de l’étude. La manipulation des animaux durant ces administrations ne durera que quelques secondes. Les examens (observation à la lampe à fente, angiographie, tomographie…) seront généralement hebdomadaires et de dureront pas plus de 5 minutes. Des anesthésies seront pratiquées autant que nécessaire afin de permettre si besoin l’administration ou l’examen des animaux. Tous les examens réalisés ces procédures sont des examens pratiqués chez l’homme en ambulatoire, en cabinet d’ophtalmologie ou chez l'animal en clinique vétérinaire. Chez l’homme, toutes les procédures qui ont nécessité une anesthésie générale, se font la plupart du temps sous anesthésie locale. Les autres examens (lampe à fente…) sont totalement indolores ou sous anesthésie locale et ne durent que cinq minutes tout au plus. Chez l’animal, l’anesthésie générale est réalisée afin d’immobiliser l’animal, de faciliter la procédure et de réduire un stress éventuel.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel liés aux conditions expérimentales d’hébergement, à leur manipulation et à l’administration des produits. La pathologie recherchée - néovascularisation et perméabilité vasculaire rétinienne - n'induit pas de douleur chez l'animal. La croissance des nouveau-nés et des mères exposés à l'hyperoxie (ou alternance de cycles hypoxie/normoxie) n’est que faiblement impactée. Les travaux publiés ne montrent pas d'effet de la modification du taux d'oxygène sur le comportement des animaux. La manipulation des nourrissons peut introduire du stress chez les petits comme chez la mère. Les risques sont qu'un animal soit rejeté de la portée par la mère, ne soit plus alimenté ou mangé par la mère. Pour ne pas induire de stress chez les mères déclenchant ces comportements, les manipulations des animaux seront donc limitées au maximum et seront réalisées par un personnel formé. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de nécroses, de saignements au site d'injection. Les animaux présentant les symptômes, ou exclus volontairement par la mère avec un risque pour leur survie, et si une adoption par une autre femelle n’est pas possible, ils seront sortis de l’étude.

Devenir

A l'issue de chaque étude, les animaux qui auront participé à l’ensemble de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de permettre l'analyse des tissus. Pour les études concernant l'évaluation de l’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure, à savoir les mères gestantes pourront être réutilisées dans d’autres procédures expérimentales compatibles après l’avis du vétérinaire si nécessaire.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Dans le cadre de notre projet, nous avons besoin d’un œil perfusé en cours de développement. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement et du nombre de naissances par portée. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Les animaux, une femelle par cage avec ses nourrissons, sont maintenus dans un environnement enrichi, (bouts de bois, coton pour le nid sur toute la période de l’étude) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des portées tout comme le suivi sanitaire quotidien pour minimiser au maximum le stress de la mère afin qu'elle subvienne aux besoins de ses nourrissons. Les examens qui nécessitent un immobilisme complet de l'animal pour la prise de photo, sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. Il en ira de même pour les procédures plus invasives afin de supprimer la douleur provoquée pendant et après l’intervention. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Le modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques, depuis les années cinquantes pour étudier le développement de la vascularisation de la rétine et ses pathologies. Les espèces choisies sont le rat et la souris. Ce sont les espèces références pour ce modèle. Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Le principe du modèle est d'agir sur le développement vasculaire de la rétine de nouveau-nés. Les animaux seront donc inclus dans l'étude quelques jours après leur naissance, avec leur mère pour subvenir à leurs besoins.