Troubles sensoriels

30 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vingt-huit reçoivent le dépôt d'un produit test dans les deux yeux, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever les structures oculaires, deux lapins de réserve pouvant être replacés s'ils ne servent pas. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable du produit, de la classe infectiologie, et prévoit une surveillance des yeux pour repérer rougeurs et gonflements. Il conclut qu'aucune méthode ne reproduit la diffusion d'un produit dans le sang et qu'il est donc "nécessaire de recourir à l'animal dans son ensemble".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'un produit test aprés une simple administration oculaire dans les deux yeux chez le lapin et de mesurer la tolérance, l'impact de ce produit au niveau structural.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres PK de la formulation test et de démontrer la bonne tolérance de cette formulation au niveau des structures oculaires. Cela sera bénéfique pour l'homme dans le cadre des infections au niveau de l'oeil.

Procédures

Les animaux seront contentionnés pour réaliser l'administration oculaire. L'administration consiste à un simple dépôt (50 µL dans chaque oeil en utilisant une micropipette et cônes adaptés). Durée estimée de l'ordre de quelques minutes. Puis les animaux seront anesthésiés durant le temps du prélèvement sanguin. De l'ordre de quelques minutes également. Les animaux seront euthanasiés pour pouvoir collecter les structures oculaires par administration d'un euthanasique. Durée de l'injection de l'euthanasique: de l'ordre de la minute.

Impact sur les animaux

Le produit test fait partie de la classe thérapeutique infectiologie. Il n'y a pas d'effets indésirables attendus. Un suivi quotidien (et plusieurs fois par jour le jour des administrations) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général) plus particulièrement observation des mouvements de tête. Observation au niveau des yeux comme rougeurs, gonflements, présence au non de larmes....

Devenir

Dans ce projet 30 animaux seront inclus. 28 animaux seront administrés et 2 animaux seront des animaux de réserves. Si les animaux de réserve ne sont pas utilisés ils pourront être replacés. Les 28 animaux administrés seront mis à mort pour récupérer un échantillon de sang et les structures oculaires pour être analysés.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang et aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'impact de la formulation à testée au niveau oculaire sur du tissus vivant il est donc nécessiare de recourir à l'animal dans son ensemble.

Réduction

30 animaux seront inclus dans ce projet. 28 animaux seront administrés et 2 animaux de réserve sont prévus. Les animaux seront réparti en 7 groupes de 4 animaux. 4 animaux par groupe est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats significatifs par rapport aux paramètres pharmacocinétiques et par rapport aux éventuelles modifications tissulaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en boxes collectifs dés l'arrivée jusqu'à la fin de la phase animale. 6 boxes de 5 animaux. Cet hébergement collectif est nécessaire durant l'étude pour un contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, milieu enrichi adapté à l'espèce (copeaux, cachette, buchette à ronger ..) Toutes les manipulations sur les animaux seront faites par un personnel formé, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront observés pendant la phase de réveil. Un suivi quotidien (et plusieurs fois par jour le jour des administrations) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général) plus particulièrement observation des mouvements de tête. Observation au niveau des yeux comme rougeurs, gonflements, présence au nom de larmes.... L'animal sera préalablement anesthésié avant la réalisation du prélèvement sanguin et avant de ce fait avant d'être euthanasié. Les points limites stricts et spécifiques de ce projet seront appliqués à savoir: - Douleurs ( animal prosté, oreilles en arrières, grattage au niveau de la gueule, oeil mi-clos) - Rougeurs, gonflements, grattage au niveau des yeux - Ecoulement oculaire important - Oeil complètement fermé - Lésions tissulaire oculaire

Choix des espèces

Le lapin est une espèce fréquemment utilisée en recheche pre-clinique pour le développement de médicaments destinés à l'homme et la taille de cet animal permet de le manipuler assez facilement. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes afin de ne pas avoir de pathologies liées au vieillissement au niveau des structures oculaires.

77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées à une lumière intense de 20 000 lux pendant une heure et demie pour provoquer une dégénérescence de la rétine, elles reçoivent un composé par gavage et subissent un électrorétinogramme sous anesthésie, avant le prélèvement des yeux. Le porteur décrit les dommages rétiniens attendus, la perte de l'intégrité et de l'activité des photorécepteurs. Il présente ces essais comme "indispensables" pour prouver l'efficacité du composé sur un organisme complet, une preuve de concept d'un traitement préventif.

Objectifs

Il s’agit de faire la preuve de concept d’un traitement préventif de la perte de fonction visuelle par un nouveau principe actif avec une nouvelle formulation par voie orale dans une situation de dégénérescence rétinienne chez la souris modèle de la Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age (DMLA). Il permet également d'évaluer l'impact de la formulation sur l'amélioration potentiel de l'efficacité du composé à protéger de la perte de la fonction visuelle en comparant des souris traitées avec la formulation vs sans formulation.

Bénéfices attendus

La rétinopathie regroupe plusieurs pathologies de la rétine qui sont soit génétiques, comme la rétinite pigmentaire et la dystrophie maculaire de Stargardt, qui touchent respectivement la périphérie et le centre (macula) de la rétine, soit multifactorielles, comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Nous voulons apporter à ces patients un traitement préventif contre la progression de ces maladies. Ce projet est donc à profil santé publique avec une échéance à moyen terme applicable à l'échelle clinique.

Procédures

Gavage voie orale : durée : 30 secondes Exposition à la lumière à 20 000lux : 1h 30 Mise à l’obscurité : 5 jours ERG (éléctrorétinogramme) : 10min par souris

Impact sur les animaux

La nuisance attendue sur les souris est l’exposition lumineuse. les souris sont placées dans l’obscurité 24 h avant l’exposition à la lumière pour minimiser le temps et l’intensité lumineuse. Les dommages rétiniens engendrés sont la perte de l’intégrité et de l’activité des photorécepteurs minimiser le temps et l’intensité lumineuse. Les dommages rétiniens engendrés sont la perte de l’intégrité et de l’activité des photorécepteurs

Devenir

A l'issue de cette procédure, les souris seront euthanasiées. Une analyse histologique et/ou biochimique pourra être effectuée après la mort après prélèvement des yeux.

Remplacement

Toutes les approches in cellulo ne peuvent pas se substituer aux essais chez l’animal qui restent plus proche du patient. L'approche animale est la suite logique des résultats précédemment obtenus sur cellules rétinienne qui nous ont permis de prouver l'efficacité du composé. Ces études précliniques sont indispensables pour prouver l'efficacité sur un organisme complet.

Réduction

Cette quantité d’animaux a été réduite le plus possible sans compromettre les résultats expérimentaux et les études statistiques Comme ces 77 souris se répartissent en 11 lots de 7 souris, en cas d’atteinte de la significativité avant l’utilisation de tous les lots, les souris restantes pourront être réutilisées.

Raffinement

A l’arrivée dans le laboratoire, les animaux sont hébergés au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation d'une semaine. Celle-ci leur permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter aux nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période qu’ils pourront être inclus dans cette étude. L’hébergement des souris se fait obligatoirement en groupe d’étude dans des cages de stabulation sous une lumière (90 lux) faible qui n’affecte pas la réponse rétinienne. Comme de nombreuses souches de souris construisent des nids, la présence de matériaux de nidification est un impératif dans les cages. La nidification permet aux souris de réguler leur température et de gérer leur exposition à la lumière. Dans le déroulement de cette étude, on administre aux animaux un produit dont on souhaite connaître les effets. On en connaît déjà les caractéristiques physico-chimiques ainsi que l’activité sur des extraits biologiques et des cellules (études in vitro), ce qui permet d’éviter d’administrer aux animaux des substances non biocompatibles. L’examen spécialisé (électrorétinographie) nécessite une anesthésie. Celle-ci est réalisée en conformité avec les pratiques vétérinaires et par des personnes formées.

Choix des espèces

La souris de laboratoire (Mus musculus) représente 60% du total des animaux utilisés en recherche. Ce rongeur est devenu le modèle expérimental de prédilection des scientifiques. Sur le plan génétique, la souris est très similaire à l’homme : 99 % de ses gènes présentent un gène homologue chez l'humain. De plus, elle possède tous les atouts pour l’élevage en laboratoire : une descendance nombreuse, un développement rapide et une taille réduite. L'utilisation de souris non génétiquement modifiées allège l'aspect réglementaire qui est très bien respecté par le fournisseur agréé. La souris est une lignée consanguine albinos couramment utilisée dans la recherche biomédicale. En ophtalmologie, elle est très sensible à la lumière fluorescente blanche, ce qui constitue un trait intéressant pour mimer la rétinopathie à évolution rapide. Stade adulte jeune (2-3 mois). La rétine est bien développée à ce stade et la réponse rétienne à la lumière est optimale

1170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire est provoquée par mutation génétique ou par instillation quotidienne d'un conservateur allergène, puis des tests de douleur et des échographies sont menés, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur indique qu'aucun analgésique ne peut soulager cette douleur oculaire, c'est le paramètre évalué. Il présente les résultats obtenus chez le rat comme "très encourageants" et défend une molécule sous brevet.

Objectifs

La sècheresse oculaire (Dry Eye Disease ou DED) est l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez des sujets âgés de plus de 50 ans. Cette pathologie du segment antérieur de l’oeil est caractérisée par des sensations de douleur variables en intensité, allant du simple inconfort à une douleur oculaire prononcée. Les douleurs oculaires sont très difficiles à traiter et leurs mécanismes physiopathologiques demeurent peu connus. Nous avons récemment conçu une molécule qui induit la sécrétion d’eau à partir des glandes lacrymales. Une simple goutte de cette molécule dans les yeux de rats augmente la production de larmes pendant 24h au moins. Notre projet a pour but d’apporter la preuve de concept nécessaire pour proposer cette molécule comme thérapie de la sécheresse oculaire en recherchant 1) si la composition des larmes induites est équilibrée et stable au cours du temps et 2) si, en induisant cette sécrétion naturelle, la molécule prévient l’inflammation et réduit l’activation des nocicepteurs responsables de la douleur oculaire. Nous utiliserons deux modèles de souris complémentaires, validés pour l’étude du DED : l’un, pharmacologique, permettant d’étudier la mise en place et la progression du syndrome, et l’autre, génétique, présentant une anomalie des glandes lacrymales pouvant mimer une sécheresse oculaire modérée. Les effets de la molécule d’intérêt (sous brevet) seront analysés dans chaque modèle in vivo en utilisant différents tests (nociception, volume des larmes et aspect de la cornée) et post mortem par des techniques de biologie cellulaire et histologie. Cette étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d'un traitement du DED par notre molécule. Au total ce projet utilisera au maximum 1170 animaux dans le respect de la règle des 3R. Grâce à nos études préalables in vitro, nous avons déjà caractérisé le mode d'action de la molécule et ses effets (remplacement). Le recours aux séances d'habituation et à l'anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des animaux (raffinement). Enfin, les prévisions obtenues avec l'utilisation de logiciels statistiques nous permet d'anticiper le nombre optimal d'animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles et nous réduirons en cours de projet ce nombre dès lors que nos résultats nous indiqueront que nos données sont suffisamment robustes (réduction).

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. La molécule que nous avons caractérisée représente donc une stratégie thérapeutique prometteuse: en effet, une expérience pilote menée sur le rat a montré clairement que l'administration de cette molécule permet de restaurer une production de larmes équivalente à celle des rats contrôles, ce qui nous permet d'envisager que cette molécule soulagera efficacement la sécheresse oculaire. Le protocole mené chez la souris sera similaire à celui utilisé chez le rat, à la simple différence que rats et souris sont caractérisés par des seuils de sensibilité légèrement différents mais très bien caractérisés que nous prendrons en compte. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire et un premier pas vers la création du médicament et l'industrialisation de ce traitement.

Procédures

Un phénotype de sécheresse oculaire modérée sera induit chez les animaux soit génétiquement soit pharmacologiquement par administration quotidienne dans l'oeil pendant 7 jours d'un produit conservateur allergène. Chaque procédure dure 5 à 6 semaines. Le test d'évaluation de la gêne/douleur associée à la sécheresse oculaire dure environ 1h. Les tests de mesure du volume et de la stabilité des larmes et l'échographie Dopler seront réalisés sous anesthésie légère (15-20 minutes). Les groupes d'animaux étudiés subiront entre 1 et 4 fois fois la série de tests (avec une semaine d'intervalle entre chaque série de tests).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera induite soit par le BAC (conservateur traditionnellement utilisé dans les gouttes pour les yeux et le nez chez l'homme et décrit pour induire une sensibilisation) soit par la mutation Tabby qui induit une réduction de la taille des glandes lacrymales et donc une réduction de la production de larmes. Ces deux modèles murins présentent donc une sécheresse oculaire d'intensité modérée. Cette sécheresse oculaire engendre potentiellement un inconfort voire une douleur (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Nos résultats pilotes obtenus sur le rat indiquent clairement que notre molécule soulage efficacement cet inconfort et nous laissent envisager des résultats très positifs pour ce projet puisque nous utiliserons le même protocole. Nous compenserons et limiterons l'inconfort et les nuisances infligées aux animaux par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Les effets du traitement seront évalués sur 28 jours puis les animaux seront mis à mort. Les animaux auront 3 mois lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances et effets indésirables auxquels ils seront exposés sera donc de 6 semaines maximum pour les souris BAC (habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, 1 semaine d'établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests) et de 4,5 mois pour les souris Tabby (à l'âge de 3 mois, habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

Nos études préalables ont permis de caractériser et de breveter la molécule d'intérêt, de déterminer sa structure et son mode d'action dans différentes cultures cellulaires sur le transport de chlore. De plus, nous avons établi une première collaboration qui nous a permis de montrer que l'administration de cette molécule dans l'oeil de rat wild-type induit la sécrétion naturelle de larmes et qu'elle restaure un volume normal de larmes dans un modèle de rats atteints de sécheresse oculaire. Ces résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet et sa prématuration pour développer et industrialiser la molécule comme stratégie thérapeutique novatrice. Cette phase de prématuration du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément et quantifier les effets de la molécule in vivo. Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nous mènerons en parallèle des analyses protéomiques sur des cultures immortalisées de cellules de l'oeil.

Réduction

Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs. Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires. Les rares médicaments utilisés pour réduire la sécheresse oculaire sont peu efficaces et nécessitent des administrations quotidiennes répétées (3 à 6 fois), ce qui représente un inconvénient majeur pour les patients. Nous avons donc décidé d'administrer notre molécule 1 ou 2 fois par jour maximum, et d'évaluer son effet après 1 ou 2 applications. Cependant, l'effet après 1 application sera évalué en 1ere intention, l'effet après 2 applications étant évalué seulement si les résultats avec 1 application montrent une efficacité partielle. Si l'étude après 1 seule application donne les résultats escomptés, nous ne procèderons pas à l'analyse de 2 applications et le nombre d'animaux sera donc réduit de moitié. Au total, nous utiliserons 1170 animaux maximum.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront hébergés et manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests dans laquelle nous pouvons moduler l'intensité lumineuse et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d'habituation en amont de chaque test et nous réaliserons certains de ces tests sous anesthésie gazeuse légère. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant de mettre en oeuvre des points limites précoces et un arbre décisionnel: utilisation de solutions analgésiques oculaires en fonction de l'aspect de l'oeil (oeil fermé, sécrétions) et du comportement de l'animal (démangeaisons...) ou mise à mort en cas de souffrance. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l'utilisation de l'imagerie par échographie-Dopler représente un avantage dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d'animaux mais de diminuer leur manipulation car c'est une technique non invasive et rapide sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les deux modèles murins reproduisant le syndrome de l’œil sec (DED, Dry Eye Disease) sont des modèles validés et classiquement utilisés dans la littérature. Des animaux âgés de 3 à 5 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l'efficacité de notre molécule sur la physiologie oculaire en nous affranchissant de biais potentiels liés au vieillissement.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire leur est provoquée par instillation quotidienne de chlorure de benzalkonium pendant sept jours, puis leur douleur est mesurée en appliquant une pression croissante près de l'œil jusqu'au clignement, une gêne que le porteur indique ne pas pouvoir soulager par analgésiques "puisque c'est ce paramètre que nous évaluerons". L'étude porte sur le rôle de canaux ioniques dans la douleur oculaire. Le porteur affirme que ce syndrome multifactoriel "ne peut être remplacé" par des modèles in vitro et exige un organisme entier.

Objectifs

La sécheresse oculaire est l'un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez les sujets de plus de 50 ans. La pathologie peut se déclarer chez des sujets plus jeunes en cas de maladie auto-immune, de pollution environnementale, de prise médicamenteuse répétée, après une chirurgie de la cornée ou suite à l'usage intensif des écrans. En conséquence, la prévalence de la sécheresse oculaire est grandissante. Les symptômes regroupent des troubles visuels et des douleurs d’intensité variable qui peuvent devenir chroniques. Les patients se plaignent également d’une sensibilité accrue à la lumière. La sécheresse oculaire est difficile à traiter et ses mécanismes physiopathologiques sont peu connus. Ce constat impose un approfondissement de nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la douleur oculaire. Des mutations dans les gènes codant des transporteurs de potassium appelés K2P sont à l'origine de douleur chez les patients humains et chez les rongeurs (exemple: migraine). Leur fonction dans l'oeil n'a pas encore été caractérisée. Nous disposons 1) de différents modèles de souris dans lesquels les K2P sont absents, et 2) de molécules analgésiques mises au point pour moduler l'activité des K2P. Nous souhaitons combiner ces outils pour caractériser le phénotype oculaire de ces animaux et déterminer l'effet thérapeutique de ces molécules dans la physiopathologie de l'oeil. L'étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d'un traitement de la pathologie oculaire. Ce projet utilisera au maximum 1080 souris. Grâce à nos études préalables in vitro, nous connaissons le mode d'action de ces transporteurs (remplacement). Le recours aux séances d'habituation et à l'anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des souris (raffinement). Les prévisions obtenues avec les logiciels statistiques nous permettent d'anticiper le nombre maximal de souris pour obtenir des résultats significatifs et nous réduirons ce nombre en cours de projet dès que nos données seront suffisamment robustes (réduction).

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. Le projet que nous souhaitons développer permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette pathologie et éventuellement de proposer une stratégie thérapeutique nouvelle si ce projet donne les résultats escomptés. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire.

Procédures

La procédure 1 dure 2X 1 semaine maximum (à 3 mois et à 12 mois environ), la procédure 2 dure 2 semaines maximum. Dans chaque procédure, la mesure du volume des larmes dure 5 minutes (coton au coin de l’œil); la mesure de la stabilité des larmes dure 10 minutes (anesthésie à l’isoflurane, puis administration d’une goutte de fluorescéine). La mesure de la douleur oculaire par un test qui consiste à appliquer une pression croissante sur la zone péri-orbitale et à mesurer la pression (en grammes) induisant le clignement des paupières et le retrait volontaire de la face par la souris, dure 1h. La séance d'imagerie DOLPLER dure 15 minutes (sous anesthésie légère). Dans la procédure 1, chaque animal subira ces 3 tests 1 fois dans sa vie, et 2 fois dans la procédure 2 (avant et après administration de la molécule régulatrice des K2P). Le modèle de la procédure 2 consiste en une injection quotidienne de BAC (chlorure de benzalkonium) pendant 7 jours. Les molécules régulatrices des K2P ou la solution saline contrôle seront administrées en IP, en 1 injection.

Impact sur les animaux

Chez l'homme, la sécheresse oculaire peut occasionner un ressenti très variable selon les individus allant d'une simple gêne soulagée momentanément par des larmes artificielles à une douleur pouvant être plus inconfortable chez certains patients. Il est vraisemblable que cette variabilité entre individus existe également chez la souris. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera d'intensité modérée. Elle engendre potentiellement un inconfort voire éventuellement une gêne chronique (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Les animaux auront 3 et 12 mois environ lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances auxquelles ils seront exposés sera donc de 5 jours pour les souris mutantes pour les transporteurs étudiés: habituation aux tests pendant 2 jours et 3 jours de tests (c'est-à-dire 2 fois 2h de tests à 36h d'intervalle: 1 série de tests pendant la journée, 1 seconde série pendant la nuit). La durée des nuisances sera de 6 semaines maximum pour les souris dans lesquelles nous aurons induit la sécheresse oculaire (habituation aux tests, 7 jours d'établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement avec une série de tests par semaine). Les effets des traitements seront évalués sur 7, 14 et 28 jours maximum puis les animaux seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort selon la législation en vigueur afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nos études préalables et celles de nos collègues ont permis de caractériser in vitro (neurones en culture) et in vivo (rongeurs) les effets des molécules d'intérêt et de déterminer leur mode d'action sur les K2P. Cette phase du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément in vivo sur l'oeil et quantifier le phénotype oculaire des animaux déficients pour les gènes codant les canaux K2P d'intérêt et les effets thérapeutiques des molécules que nous avons testées.

Réduction

Le nombre d‘animaux (1080) correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution et en considérant mâles et femelles séparément, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests, dans laquelle nous pouvons moduler l'intensité lumineuse pour limiter la photoallodynie et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d'habituation en amont de chaque test, et nous réaliserons la plupart de ces tests sous anesthésie légère à l'isoflurane (15-20 minutes). En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l'utilisation de l'imagerie par échographie-Dopler représente un avantage conséquent dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d'animaux mais de diminuer leur manipulation car c'est une technique non invasive et rapide sous anesthésie réalisée par l'expérimentateur principal formé à l'utilisation de l'appareil.

Choix des espèces

Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murin reproduisant la sécheresse oculaire est un modèle validé et classiquement utilisé dans la littérature. Deux âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux.

840 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des bruits de deux à huit heures par jour pendant jusqu'à 180 jours, exposition pouvant provoquer un stress chronique et des dommages de l'oreille, une partie subissant aussi la pose chirurgicale d'implants cardiaques ou neuronaux. Le porteur étudie les effets du bruit sur les circuits auditifs et choisit la gerbille pour son audition proche de celle de l'humain. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de simuler un système auditif entier de millions de neurones.

Objectifs

On distingue la surdité qui est un terme générique désignant la diminution de l’acuité auditive. La grande majorité des surdités sont neurosensorielles et ont essentiellement pour origine l'oreille interne et la transduction mécano-électrique de la vibration sonore en activité neurale. Actuellement, en l’absence de traitement curatif, la surdité neurosensorielle nécessite d’être compensée par une prothèse auditive. L’exposition à un bruit excessif est la première cause environnementale de surdité neurosensorielle. Une exposition supérieure à 105 dB d’une heure provoque ainsi des dommages irréversibles. Les dommages dépendent à la fois du niveau de l’intensité sonore et de la durée de l’exposition. La législation du travail a fixé des seuils de tolérance, en prenant comme base un niveau d’exposition moyen sur 8h : • Au-delà de 80 dB SPL (sound pressure level), des dispositifs de réduction du bruit doivent être proposés (casques par exemple). • Au-delà de 85 dB SPL, ces dispositifs doivent être utilisés et contrôlés. • Au-delà de 87 dB SPL (casques inclus), le bruit doit être réduit. La surexposition sonore dans les mégalopoles, constitue une menace grandissante pour l’audition à l’échelle planétaire. Les conséquences au niveau central des surexpositions au bruit sont peu étudiées. Les conséquences du bruit sur la santé des individus et leurs interactions sociales restent également un sujet de recherche actif. Il existe une grande variabilité individuelle dans la sensibilité aux atteintes auditives déclenchées par le bruit. L’objectif majeur de notre projet de recherche est le suivant : Etudier les conséquences sur les réseaux neuronaux auditifs et la santé des individus d’un son d’intensité moyenne/forte dans la durée. Nous caractériserons la façon une exposition sonore continue impacte les circuits auditifs centraux chez un modèle animal, la gerbille, dont les gammes de fréquences sont plus similaires à celles entendues par l’Homme que la souris habituellement utilisée. Cette analyse se fera à plusieurs échelles : i) modifications anatomiques, ii) modifications fonctionnelles des réseaux, iii) modifications comportementales et iv) modifications physiologiques. Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets globaux du bruit sur la santé en reliant pour la première fois les atteintes physiologiques, cérébrales et comportementales.

Bénéfices attendus

Le suivi des animaux pendant et après l’exposition sonore, du point de vue de l’activité neurale, des modifications anatomiques et de l’évolution des performances comportementales, permettra de mieux appréhender les effets physiologiques et cognitifs du bruit auquel sont confrontés les humains quotidiennement. La plupart des études précédentes ont étudié chaque variable séparément, mais c’est bien dans la relation entre ces différents effets que l’on développera une vision d’ensemble scientifiquement pertinente. Un point crucial est que faire plusieurs mesures sur un même animal est donc non seulement scientifiquement utile mais est éthiquement intéressant puisque cela permet de réduire drastiquement l’usage d’animaux. Certaines questions importantes mais peu étudiées comme l’adaptation des performances du cerveau à la présence durable de bruit environnemental quotidien seront ainsi résolues.

Procédures

Tous les groupes d’animaux subiront des expositions sonores de 2h à 8h par jour pendant au maximum 180 jours. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. En parallèle de ces expositions sonores, deux groupes d’animaux sont soumis à trois interventions. Dans la première intervention, des chirurgies ponctuelles à poser des implants physiologiques (activité cardiaque, premier groupe), neuronaux (deuxième groupe) et une puce d’identification (les deux groupes) sont susceptible d’entrainer des douleurs post opératoires minorées par des antalgiques. La pose d’implants et la mesure préalable de l’audition des animaux nécessitent leur anesthésie pendant environ 4h. Si la procédure se déroule bien, les animaux récupèrent de ces chirurgies en quelques jours. La deuxième intervention est une phase d’habituation puis d’enregistrement de l’activité neurale ou cardiaque, elle est réalisée sur l’animal en liberté ou tête fixée, elle s’étale sur plusieurs jours, environ 1 à 2h par jours, sans douleur pour l’animal. La troisième intervention est un suivi comportemental de l’animal, il ne comporte aucune privation hydrique ou alimentaire ni douleur. L’animal est ensuite mis à mort. Pour un troisième groupe d’animaux, l’enregistrement neuronal est fait durant l’anesthésie, celle-ci dure 8h à 9h mais l’animal est ensuite mis à mort. Ces animaux ne subissent donc qu’une intervention.

Impact sur les animaux

Les gerbilles seront exposées à des bruits pendant 2h à 8h par jour. Ces expositions peuvent potentiellement induire un stress chronique et possiblement des dommages de l’oreille. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit, au moins à l’échelle de quelques semaines, chez les rongeurs. Des chirurgies ponctuelles visant à enregistrer l’activité cérébrale, à poser des implants physiologiques (activité cardiaque) ou neuronaux seront effectuées. Les animaux récupèrent de ces chirurgies généralement en quelques jours. Les nuisances associées sont des douleurs post-opératoires minorées par des antalgiques.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans les procédures expérimentales seront mis à mort à la fin de chaque ou plusieurs procédures car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soit des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant.

Raffinement

Les animaux seront regroupés pour réduire le stress d’isolement social et des jouets d’enrichissement seront disposés dans la cage. Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. S’il apparaissait un état général de l’animal anormal (notamment suite aux chirurgies) en considérant tous les critères généraux de bonne santé d’un animal de laboratoire (poids - pesée tous les 1 à 2 jours la 1ère semaine de stimulation ou après chirurgie - stress, comportement, pelage), celui-ci sera mis à mort immédiatement. En particulier les points suivants entraineront une mise à mort immédiate : - Chirurgies ou implantation de puces : douleur au niveau des interventions (prurit sévère, saignement infection), absence de prise alimentaire et d’hydratation spontanée. - Stimulation sonore : prostration, douleur au niveau de la tête et des oreilles

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux gerbilles, modèle de laboratoire dont le système auditif et les performances auditives sont très similaires à l’homme. En particulier, les gerbilles, contrairement aux souris ou rats sont capables d’entendre et traiter des sons basse fréquence correspondant aux signaux de parole chez l’homme. D’autre part, sa relative petite taille (deux à trois fois le poids d’une souris) rend la plupart des équipements existants pour la souris compatibles avec la gerbille. C’est donc un modèle animal très bien adapté à l’étude de l’audition au niveau central. Enfin, l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble. Le projet impliquera principalement des animaux adultes prioritairement ET/OU âgés d’au moins P90 (90 jours d’âge) afin de pouvoir étudier les effets du bruit sur le système auditif. Dans le cas d’expérimentations visant à établir l’effet des expositions bruyantes sur le développement du cortex auditif, les gerbilles seront éventuellement exposées (via des enceintes acoustiques) en portée avec leur mère avant le sevrage.

2660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles subissent sous anesthésie une injection chirurgicale dans l'oreille interne pour tester des thérapies géniques contre la surdité d'origine génétique. Le porteur renvoie les bénéfices au long terme, un éventuel passage en clinique après démonstration d'efficacité sur les modèles cellulaires et animaux. Il décrit le recours à l'animal comme "nécessaire", faute selon lui de méthode alternative validée pour prédire l'efficacité in vivo.

Objectifs

La surdité est le déficit sensoriel le plus fréquent ; il touche 1 enfant sur 1000 à la naissance, un enfant sur 700 avant l’âge adulte et un pourcentage important de la population adulte. On estime actuellement à 80 % les origines génétiques des surdités de l’enfant. La part génétique des surdités apparaissant à l’âge adulte reste à déterminer mais sera probablement importante. Plus de 100 formes génétiques différentes sont actuellement identifiées dans les surdités isolées. Les thérapies actuelles pour les pertes d’audition sont pour l’essentiel des dispositifs médicaux, qui amplifient le son ou stimulent directement les neurones de la cochlée. Ces deux approches présentent des limites en termes d’efficacité particulièrement pour la perception du son dans un environnement bruyant, car tous les sons vont être amplifiés de façon quasi identique. Les thérapies géniques, sont des solutions pour restaurer la fonction auditive perdue ou altérée, dans le cas de surdité d’origine génétique. Une des difficultés de la thérapie génique est de trouver une solution pour atteindre la cochlée. Il y a plusieurs obstacles à franchir pour atteindre cette cible en raison des particularités anatomiques et physiologiques de l’oreille interne. Ce projet a pour but de proposer un modèle vivo qui permettra de valider l’efficacité de thérapies géniques afin de traiter les pertes auditives.

Bénéfices attendus

A court terme, valider ou non la poursuite d’un programme de développement de thérapie génique pour traiter les troubles de l’audition. A long terme, permettre le passage en phase clinique de thérapies géniques qui auront démontré une efficacité dans les modèles cellulaires et vivo des troubles de l’audition.

Procédures

L’injection unique par chirurgie d’une durée de 30 minutes, dans l’oreille interne des nouveau-nés est réalisée sous anesthésie générale. Aucun prélèvement ne sera effectué sur l’animal vivant. Les tissus de l’oreille pour des analyses histologiques, seront prélevés post mortem.

Impact sur les animaux

Une anesthésie et une injection avec un abord chirurgical, chez le nouveau-né, pour l’administration des substances d’essais directement au niveau de la cochlée. Ceci pouvant engendrer une douleur et/ou inflammation/suppuration post-opératoire. Une euthanasie en fin d’étude pour collecter les tissus frais de l’oreille pour des analyses histologiques.

Devenir

Tous les animaux des procédures 1, 2 et 3 sont euthanasiés en fin d’étude. L’ immunohistologie est nécessaire pour confirmer l’efficacité des produits, et ne peut se faire que post mortem.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas, à ce jour, de méthodes alternatives validées pour prédire l’efficacité in vivo les thérapies géniques en développement. Les atteintes des cellules ne peuvent pas être étudiées uniquement via la culture cellulaire ou les modèles informatiques car nous ne pouvons pas reproduire la complexité des mécanismes conduisant aux troubles de l’audition. Les candidats médicaments qui sont testés auront, lorsque c’est possible, préalablement démontré une activité sur des modèles vitro ou ex vivo afin de poursuivre les projets in vivo avec les candidats les plus prometteurs.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon les résultats de la bibliographie. Entre 6 et 10 nouveau-nés sont nécessaires pour tester chaque vecteur (AAV).

Raffinement

Dans nos études, les impératifs éthiques associés tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique, la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal seront intégrées. Les animaux disposent d’éléments participant à l’enrichissement de leur environnement et à l’améliorer des conditions d’hébergement. Apres administration intracochleaire, les nouveau-nés réveillés sont replacés avec les autres nouveau-nés de la portée. Des points limites spécifiques et adaptés sont mis en place afin de prévenir toute dégradation de l’état de santé des animaux. Un raffinement des techniques d’anesthésie est prévu dans la procédure N°1 afin d’obtenir la meilleure couverture anesthésique possibile.

Choix des espèces

La souris est l’espèce phylogénétiquement inférieure et est un modèle établi dans la littérature pour les études auditives. Les modèles de thérapie génique cochléaire sont développés chez le nouveau-né. Ceci en raison de l’abord chirurgicale qui est simplifié et d’autre part les nouveaux nés ne développent pas de pertes d’audition après l’acte chirurgical contrairement aux animaux adultes. C’est pourquoi ce stade de développement est le plus pertinent pour ce type de modèle. Les modèles de thérapie génique cochléaire sont développés chez le nouveau-né. Ceci en raison de l’abord chirurgical qui est simplifié et d’autre part les nouveau-nés ne développent pas de pertes d’audition après l’acte chirurgical contrairement aux animaux adultes. C’est pourquoi ce stade de développement est le plus pertinent pour ce type de modèle.