Toxicologie (hors obligations réglementaires)

Exposées jusqu'à 22 heures par jour aux ondes de la 5G à partir du septième jour de gestation, 76 rates sont hébergées seules pendant onze à dix-huit jours d'affilée, puis réunies avec leur portée. Les ratons naissent sous exposition et la subissent jusqu'à leur 80e jour de vie. Du premier au vingt-et-unième jour ils passent des tests sensori-moteurs, puis des tests de sociabilité, de cognition et de coordination locomotrice pouvant durer une heure par jour, avec des animaux stimulus non exposés. Le porteur indique que l'exposition pourrait provoquer des malformations, des retards de croissance et des signes comportementaux anormaux. Au total 1 198 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à des temps précis de leur développement pour des analyses ex vivo.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact d’expositions aux champs électromagnétiques radiofréquences liés aux télécommunications, notamment à la fréquence de la 5ème génération de téléphone portable, sur le développement précoce, la sociabilité et la cognition chez le rat. L’étude portera sur des animaux exposés durant la gestation jusqu’à l’âge adulte, et évalués du début de leur vie postnatale jusqu’à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à apporter des éléments de réponse aux questions scientifiques et aux préoccupations sociétales relatives aux effets potentiels des expositions précoces aux champs électromagnétiques radiofréquences sur le développement du système nerveux.

Procédures

Observations cliniques et pesées (5 min) : au moins tous les 2 jours, au maximum tous les jours. Hébergement individuel des 76 femelles gestantes : dès leur réception, environ 3e et 10ᵉ jour de gestation jusqu’à la mise bas (11 et 18 jours en continu) pour respectivement les procédures 1 er 2. Exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences (jusqu’à 22h/jour) : tous les jours durant au maximum 3 mois, du 7ème jour de gestation à 80 jours après la naissance ; placement des cages d’hébergement dans la chambre d’exposition et exposition. Observation de la croissance physique et tests sensori-moteurs (5 min) : du 1er au 21ème (sevrage) jour de vie postnatal ; manipulation des animaux pour les observer et les positionner pour les tests. Test de sociabilité, et évaluation des fonctions cognitives et de la coordination locomotrice (jusqu’à 1h/jour) : 1 fois/âge/test d’intérêt ; manipulation des animaux pour les positionner pour les tests.

Impact sur les animaux

De manière générale, la manipulation des animaux lors des examens cliniques et des tests comportementaux peut provoquer un certain niveau de stress, susceptible d’influencer leurs réactions à la préhension ainsi que leur activité. La manipulation des ratons, l’ajustement des portées et les éventuelles adoptions impliqueront un stress pour les mères pouvant impacter le développement de leur descendance. Par ailleurs, l’exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences pourrait entraîner des effets systémiques pouvant occasionner de la souffrance. Des malformations, des retards de croissance et des signes cliniques anormaux, notamment comportementaux, pourront alors être observés.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort à des temps précis de leur développement pour réaliser des analyses ex vivo et conclure sur le niveau de risque de l’exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences pour leur santé.

Remplacement

Pour ce qui est du remplacement, les approches cliniques, in vitro et in silico, par leurs limitations éthiques et techniques, ne peuvent pas répondre seules au questionnement concernant l’impact des expositions aux champs électromagnétiques radiofréquences sur le développement sensoriel et moteur précoce, la sociabilité, et la maturation des fonctions cognitives et locomotrices, nécessitant de fait le recours aux études in vivo.

Réduction

Au plan de la réduction, plusieurs paramètres biologiques seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés. Les échantillons collectés après la mort seront exploités pour l’analyse de plusieurs marqueurs biologiques d’intérêt fortement questionnés dans le cadre de l’étude des effets des champs électromagnétiques radiofréquences. Le nombre d’animaux qui sera utilisé a été déterminé sur la base de l’effectif minimum nécessaire pour mettre au point les protocoles de test adaptés à l’évaluation de paramètres développementaux chez le rat et de les appliquer à l’étude des effets de l’exposition précoce à des champs électromagnétiques radiofréquences. Il a été établi à partir des données bibliographiques disponibles sur des études antérieures d’intérêt réalisées chez l’animal qui permettront une analyse statistique robuste et une extrapolation pertinente des résultats à l’homme. Des tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution seront utilisés pour les comparer et ainsi évaluer les effets de l’exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement des conditions expérimentales, chaque animal fera l’objet d’une observation quotidienne et sera pesé au minimum tous les deux jours. Les conditions d’hébergement seront enrichies afin de favoriser le bien-être et l’expression des comportements naturels. Les femelles gestantes seront hébergées individuellement, puis avec leur portée après la naissance. À partir du sevrage, les jeunes seront hébergés par sexe et par groupe, afin de favoriser leur socialisation. Un fond sonore musical sera diffusé en journée pour les habituer progressivement aux bruits associés aux manipulations et ainsi réduire le stress lié aux interventions expérimentales. Du matériau leur permettant de nidifier et des bâtons en bois à ronger seront disposés dans les cages d’hébergement, pour contribuer au comportement maternel, à l’enrichissement cognitif et au bien-être général des animaux. Des mesures complémentaires de raffinement concerneront la stabulation et la manipulation. Des points limites ont été définis pour détecter précocement tout signe de douleur ou de détresse. Pour chacun de ces critères, des actions correctives adaptées ont été prévues, en cohérence avec les paramètres étudiés, afin d’assurer le suivi attentif et le bien-être optimal des animaux.

Choix des espèces

Le rat est un animal de référence pour les études de toxicologie. En particulier, ses systèmes neurobiologiques et physiologiques ont été largement étudiés en laboratoire. Il existe une documentation très complète dans le domaine, dans la littérature et les ouvrages spécialisés. Ces recherches ont été effectuées majoritairement chez le rat. Dans un souci de comparer les données de ce projet avec les résultats obtenus précédemment concernant les effets des champs électromagnétiques radiofréquences sur les fonctions cérébrales, nous avons choisi d’utiliser la même espèce. Dans un 1er temps, des femelles avec leur portée, et des juvéniles et des adolescents seront exposés à des champs électromagnétiques radiofréquences et testés au plan comportemental pour mettre au point les conditions d’essai pertinentes à tester. Dans un 2ème temps, des femelles seront exposées aux champs électromagnétiques radiofréquences d’intérêt définis, durant la gestation jusqu’au sevrage, et leurs descendants du sevrage jusqu’à l’âge adulte. Ceux-ci seront évalués à quatre stades clés de leur développement : néonatal, juvénile, adolescent et adulte, au plan de leur croissance physique, développement neuromoteur, sociabilité et maturation des fonctions cognitives. Pour réaliser les tests de sociabilité aux stades juvénile et adolescent, des animaux stimuli, non exposés, seront utilisés en complément.

Déjà capturés et manipulés jusqu'à huit fois au cours de leur vie pour certains, les cincles plongeurs de cette population de rivière sont repris chaque année depuis une dizaine d'années. 2 300 oiseaux adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous relâchés sur leur site de capture. Pris au filet, ils attendent jusqu'à deux heures dans un pochon, puis sont bagués, mesurés, soumis à une mesure du rythme cardiaque et d'un comportement de lutte, avant une prise de sang, un prélèvement de plumes et un prélèvement de sécrétions de la glande uropygienne. Le porteur reconnaît que le cumul de ces gestes peut peser sur l'oiseau et que le stress s'accumule sur toute une vie, tout en indiquant qu'aucun effet négatif majeur n'a été mis en évidence jusqu'ici.

Objectifs

En populations naturelles, les individus sont soumis à des variations des conditions environnementales qui peuvent être d'origine naturelle ou anthropique. Parmi ces dernières, la présence de polluants de natures diverses, liée aux activités industrielles, agricoles et/ou à l'urbanisation, peut fortement impacter le fonctionnement des organismes et des populations. Les actions de restauration des milieux au travers de mesures de dépollution restent pourtant souvent d'une efficacité limitée en raison du manque d'informations sur les concentrations de multiples polluants à une échelle spatiale fine ainsi que de leur impact biologique réel sur l'écosystème concerné. Le projet a pour objectif de fournir une cartographie détaillée des concentrations de différents types de polluants (métaux lourds, polluants organiques persistants, microplastiques) et de caractériser leur impact de façon conjointe (« effets cocktail » potentiels) sur une population d'un petit passereau considéré comme un bioindicateur du milieu des rivières courantes de basse et moyenne montagne, le cincle plongeur. Les rivières sont des milieux particulièrement sensibles à la pollution du fait de la concentration des polluants dans l'environnement alentour via le ruissellement. Sur la zone d'étude, des échantillons biologiques (plumes, sang, sécrétions) sont prélevés sur les oiseaux de façon faiblement invasive et compatible avec le suivi à long terme de la population. Ils permettent de mesurer (1) d'une part les concentrations de différents types de polluants très présents dans cette zone fortement exploitée par l'homme et anthropisée depuis des siècles, et (2) d'autre part des paramètres physiologiques, mais aussi comportementaux et d'histoire de vie (reproduction, survie) des individus. L'étude des liens entre ces concentrations mesurées de polluants auxquels les individus sont effectivement exposés (et donc présents dans leur organisme) et du fonctionnement physiologique (marqueurs des processus immunitaires, hormonaux, métaboliques...) permettra de mieux comprendre l'impact biologique réel des polluants au niveau individuel, et les implications au niveau de la population. Cette cartographie et ces résultats seront donc mis à disposition des acteurs locaux de la société civile, permettant de cibler les zones les plus impactées afin d’optimiser les actions de gestion et de restauration de la biodiversité des écosystèmes rivulaires dans la zone d'étude.

Bénéfices attendus

Nos analyses permettront de comprendre de façon fondamentale l'action des polluants sur les organismes en conditions naturelles et qui sont donc soumis à différentes sources de stress en même temps ; elles permettront également de façon plus appliquée. d’établir une cartographie détaillée à l'échelle locale des niveaux d'exposition aux polluants et de leurs effets sur le fonctionnement des organismes, qui sera mise à disposition des acteurs locaux associatifs et institutionnels comme outil de sensibilisation du public et pour cibler les zones les plus impactées afin d’optimiser les actions de gestion, restauration et préservation de la qualité de l'eau des rivières et de leur biodiversité sur ce territoire. Le manque d'informations sur les variations dans l’espace et le temps des concentrations de différents polluants à une échelle spatiale fine et surtout sur leurs effets biologiques conjoints sur les individus et les populations limite en effet souvent fortement la possibilité de mettre en oeuvre des actions efficaces de ce type face à diverses sources de pollution. Dans un contexte de "santé globale", l'enjeu est à la fois environnemental mais aussi sanitaire, car les activités humaines liées à l'eau sont nombreuses dans la zone d'étude (pêche, sports d'eau , baignade...). Pour atteindre ce but, le suivi exhaustif de la population étudiée permet d'accéder à l'ensemble des paramètres biologiques d'intérêt, chez une espèce qui intègre les mesures de polluants et de leurs effets le long de la chaîne trophique. Le transfert des résultats et connaissances concernant la pollution par différentes substances, sa dynamique au cours du temps et ses conséquences sur l'écosystème des rivières vers différents partenaires de la société civile est aussi un objectif du présent projet.

Procédures

Les oiseaux sont capturés grâce à des filets spéciaux et soumis à une série de manipulations, mesures et de prélèvements une fois par an (lors de leur première capture uniquement, dans le cas où ils seraient recapturés plus tard la même année). Une fois sortis du filet, ils sont placés en attente dans des pochons dédiés, au calme, le temps de la capture de l'ensemble des individus présents sur la zone (maximum 2h). Au moment des manipulations, réalisées sur site, ils sont d'abord identifiés individuellement par baguage, puis mesurés : masse, longueur du tarse, du crâne et du bec, de l'aile, de la queue. Une série de mesures comportementales et physiologiques est ensuite réalisée : mesure du rythme respiratoire et du rythme cardiaque, comportement de lutte. Différents prélèvements sont alors réalisés : (1) prise de sang ; (2) prélèvement de plumes (plumes de couverture du corps à différents endroits et une plume de la queue) ; (3) sécrétions de la glande uropygienne. Enfin, diverses informations sont notées : le sexe et l'âge des oiseaux, l'état des plumes et la présence de mue, la présence d'une plaque incubatrice (pour les femelles reproductrices), la présence de blessures éventuelles, liées à la capture ou antérieures. L'ensemble de ces opérations de mesures et prélèvements dure environ 20 à 30 minutes. Une fois l'ensemble des manipulations effectuées, l'oiseau est relâché directement sur le site de capture (entre 30 min et 2h30 après la capture selon le temps d'attente au départ).

Impact sur les animaux

Le coeur du projet est de pouvoir explorer les liens entre concentrations de différents polluants et leurs effets biologiques sur les individus à différents niveaux, y compris physiologique. Ceci implique de disposer des mesures des polluants et des mesures physiologiques simultanément, sur les mêmes individus, et donc de récolter l'ensemble des échantillons nécessaires sur chaque oiseau. Au cours d'une capture, chaque oiseau sera donc soumis à l'ensemble des gestes d'échantillonnages : (1) prise de sang, (2) prélèvement de plumes, (3) prélèvement de sécrétions de la glande uropygiale, en plus (4) des opérations d'identification (baguage) et des mesures morphologiques. Les effets individuels de chacun de ces prélèvements ou manipulations restent limités, mais le cumul de ces effets pourrait avoir une résultante impactant l'oiseau, parce qu'ils impliquent un temps de manipulation plus long, et/ou parce qu'ils occasionnent des stress et douleurs prolongés / multiples. Le principal effet indésirable attendu est donc un niveau de stress potentielement élevé de l'oiseau durant la capure et les manipulations. Par ailleurs, afin d'étudier la dynamique éventuelle des effets des polluants au cours de la vie des individus (et en particulier les processus de vieillissement), les oiseaux seront échantillonnés et mesurés chaque année. Ainsi un oiseau sera manipulé à chaque première capture de l'année au cours de sa vie, avec un effet potentiellement cumulatif du stress engendré sur l'ensemble de la vie. Une fraction importante des oiseaux subira donc les prélèvements et manipulations plusieurs fois (entre 2 et 8 fois jusqu'ici, la durée de vie moyenne de cette espèce étant d'environ 2 à 3 ans).

Devenir

L'objectif du projet étant de comprendre les effets à long terme des polluants sur des oiseaux en conditions naturelles, les mesures et échantillonnages réalisés visent à impacter le moins possible le devenir des oiseaux (survie, comportement, reproduction futurs) et donc à être compatibles avec le suivi à long terme de la population. Une fois les manipulations effectuées sur les oiseaux, ils sont donc tous relâchés dans leur milieu naturel, au site de capture.

Remplacement

L'objectif étant de comprendre les effets des polluants sur des animaux en conditions naturelles à long terme, l'utilisation d'expériences in vitro ou in silico n'est pas envisageable et seuls les prélèvements et mesures sur oiseaux vivants en population naturelle est possible.

Réduction

Le nombre d'oiseaux impliqués dans le projet correspond à la taille de la population reproductrice suivie (environ 460 adultes maximum par an), soit 2300 oiseaux adultes manipulés au maximum durant tout le projet) ; ceci permettra d'utiliser les modèles statistiques complexes appropriés pour quantifier l'effet des polluants sur les différents paramètres biologiques tout en tenant compte de nombreux facteurs individuels (sexe, âge, histoire des oiseaux) et environnementaux (date, rivière, altitude...) susceptibles d'affecter l'action des polluants. L'exhaustivité de l'échantillonnage de la population est nécessaire pour étudier les liens avec les différents paramètres et en particulier les paramètres démographiques tels que la survie et le succès reproducteur à l'échelle de la vie, qui ne peuvent être estimés fiablement qu'avec un effort de suivi suffisamment important, mais aussi pour estimer le déterminisme génétique des traits (héritabilité) au travers du pedigree établi via les captures et le suivi de la reproduction.

Raffinement

Le suivi de la population est réalisé depuis une dizaine d'années, et les procédures utilisées lors de la capture et manipulation des oiseaux ont été ajustées au cours de cette période afin de réduire au maximum leur impact sur le devenir des oiseaux et le fonctionnement de la population. L'expérience acquise par les manipulateurs leur permet de réduire au strict minimum le temps nécessaire au démaillage et à la manipulation des oiseaux. Afin de réduire le stress des oiseaux, ceux-ci sont placés dans des pochons spécialement conçus et opaques pendant les temps d'attente, et leur tête est gardée dans le pochon tant que les manipulations le permettent ; cette procédure est reconnue comme limitant le stress des oiseaux. Les manipulations se font en évitant les gestes et buits brusques ou mouvements non nécessaires, qui occasionnent du stress chez les oiseaux. Durant toute la manipulation de l'oiseau, le manipulateur reste vigilant et observe l'oiseau sans interruption afin de détecter les signes de stress intense et peut décider de relâcher l'oiseau immédiatement avant la fin des prélèvements ou mesures si ces signes deviennent trop forts. Ces précautions permettent de réduire quasiment à zéro le risque de mortalité pendant la capture. Les effets à plus long terme du stress de la capture, plus difficiles à évaluer directement, sont régulièrement estimés au travers des données de survie, mouvement et comportement des oiseaux collectées au cours du suivi général, et font l'objet d'une évaluation régulière. Jusqu'ici, aucun effet négatif majeur évident n'a pu être mis en évidence sur la base de ces données.

Choix des espèces

Le cincle plongeur a été choisi comme espèce d'étude en raison de : (1) sa situation élevée dans la chaîne trophique des rivières (c'est un prédateur d'invertébrés aquatiques), entraînant des niveaux de bioconcentration de polluants importants, et donc la possibilité de les quantifier et de détecter leurs effets biologiques mêmes faibles; (2) une variation importante des niveaux et type de pollution entre rivières étudiées, permettant de quantifier les effets de ces polluants ; et (3) la possibilité de suivre individuellement un grand nombre d'oiseaux et leur reproduction au cours de leur vie, grâce à une forte densité locale, assurant des tailles d'échantillons importantes et donc une puissance statistique satisfaisante, en particulier par rapport aux processus populationnels (survie, dispersion). Le cincle plongeur est une espèce protégée, dont le statut de conservation actuel est "préoccupation mineure" sur la liste rouge de l'UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature, qui fait référence pour l'établissement du statut de conservation des espèces), reflétant une absence de vulnérabilité spécifique (effectifs stables en France). Il est considéré comme un bioindicateur des écosystèmes rivulaires. Les prélèvements seront réalisés sur les oiseaux adultes, qui sont installés sur leurs territoires au moment de la capture et ont donc pu bioconcentrer les polluants présents dans l'environnement pendant une durée suffisante pour permettre leur détection et l'exploration de leurs effets biologiques.

Pour vérifier la tolérance de médicaments, de produits d'hygiène et de compléments alimentaires vendus pour les animaux domestiques, 350 chats et 450 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrés à la colonie de l'établissement. Ils reçoivent les produits testés à la dose recommandée mais aussi en surdosage ou sur une durée prolongée, avec injections de tranquillisant, prélèvements sanguins et deux ponctions d'urine par cystocentèse sous anesthésie. Le porteur précise que le chiffre déclaré ne correspond pas au nombre réel d'individus, un même animal entrant dans plusieurs études étant compté plusieurs fois. Il affirme que les protocoles sont conçus pour que les animaux n'encourent aucune lésion dommageable, alors que l'objet même des essais est de chercher des effets indésirables au-delà de la dose d'emploi.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer la sécurité des produits pharmaceutiques, d'hygiène et des compléments alimentaires destinés aux animaux domestiques, notamment chez le chien et le chat. Ces études, de nature répétitive, sont essentielles pour garantir l'absence de toxicité potentielle et la marge de sécurité des produits. Elles répondent aux questions scientifiques sur le produit et fournissent les réponses aux questions des autorités nationales des pays dans lesquels le produit est commercialisé. Le projet respecte les directives et lignes directrices européennes, notamment le règlement (UE) 2019/6 du Parlement européen et du Conseil du 11 décembre 2018 relatif aux médicaments vétérinaires et la ligne directrice VICH GL43. Les essais évaluent la tolérance systémique et locale des produits selon les conditions d'utilisation recommandées (dose et voie d'administration), mais aussi en surdosage et/ou sur une période de traitement prolongée pour identifier d'éventuels effets indésirables. Dans certains cas, des études préliminaires sont également menées pour sélectionner des formulations ou des doses pour des produits en développement. Les animaux sont suivis régulièrement et des examens complémentaires sont effectués. Le protocole est adapté réglementairement, scientifiquement et éthiquement à chaque étude, en justifiant le choix de l'espèce, le nombre d'animaux, la voie d'administration et la dose.

Bénéfices attendus

Les analyses d'innocuité des produits d’essai sont menées dans le respect des recommandations éthiques en vigueur pour la manipulation animale, ont pour but premier de documenter la toxicité éventuelle du produit, les effets potentiellement dangereux ou indésirables dans les conditions d'emploi prévues chez l'animal. les protocoles sont conçus de manière à ce que les animaux de l'étude n'encourent aucune lésion dommageable. En conséquence, les protocoles sont conçus de manière à ce que les animaux de l'étude n'encourent aucune lésion dommageable. Par ailleurs, pour les tests exploratoires, l’approche séquentielle sera réalisée afin de déterminer s’il y a des effets indésirables sur un faible nombre d’animaux. Les bénéfices directs majeurs sont: • De garantir la santé et le bien-être de l'espèce animale cible • D'établir la marge de sécurité thérapeutique • De définir une posologie sûre et bien tolérée • De fournir des données importantes qui orienteront les essais cliniques ultérieurs. • Les bénéfices s'étendent à la santé publique et environnementale L’analyse rétrospective indique que nos produits sont testés à un stade avancé et maîtrisé de développement. Aucun effet dommageable n’a été observé au cours des précédents projets.

Procédures

Prélèvements sanguins : Deux prélèvements sanguins sont prévus, un en début d'étude et un en fin d'étude (Une minute chacune). Des prises de sang additionnelles pourront être réalisées, si nécessaire, afin de surveiller l'état de santé de l'animal (Une minute, en respect des recommandations éthiques). Limitation éthique : Ces prélèvements ne devront pas dépasser les recommandations éthiques, soit un volume maximal de 7,5% du VTC (Volume Total Circulant) par période de 3 jours. Anesthésie/Sédation : Injection d'un tranquillisant (une à deux injections par animal, durée 30 secondes), d'un anesthésique et éventuellement un analgésique. Prélèvements d'urines : Deux prélèvements d'urines seront effectués au cours de l'étude par cystocentèse (Durée 15 minutes). Si des prélèvements complémentaires sont réalisés, elles se feront en respect des recommandations éthiques. Administration du produit d'essai : Le produit peut entre-autres, être administré par injection (2 à 3 minutes selon la nature du produit).

Impact sur les animaux

Nuisances transitoires Ces nuisances sont temporaires (quelques heures au plus) et inhérentes à la manipulation et au suivi de base. Contrainte de Manipulation et Stress lié à la contention, à la séparation transitoire avec les congénères (dans les laboratoires pour les manipulations, ou lorsque l’on veut évaluer la prise alimentaire de l’animal et qu’il est isolé durant le moment de l’alimentation). Administration du Produit et inconfort ou irritation temporaire et localisée au moment de l'administration. Prélèvements biologiques ( prises de sang, prise d’urines) Inconfort lié à la piqure, soit lors de l’administration du produit ou pour l’injection du produit anesthésique ou antalgique (notamment pour les prélèvements d’urine qui sont réalisées sur animaux anesthésiés) Stress lié au prélèvement sanguin de manière vigile Nuisances persistantes Elles sont potentiellement imputables au produit d'essai, elles durent quelques jours tout au plus. Elle peuvent causer un inconfort modéré à l'animal mais ne mettent pas en cause l'état général de celui-ci. Exemples: rougeurs, irritation temporaire liée à l'administration du produit.

Devenir

Les animaux ré-intègrent la colonie de l’établissement utilisateur Le nombre indiqué dans la demande ne représente pas le nombre réel du projet, car les animaux qui entrent dans plusieurs études sont comptabilisés plusieurs fois dans la procédure.

Remplacement

La mise en place de la procédure expérimentale se justifie préalablement, soit par l’absence avérée de méthode alternative équivalente, soit par une obligation règlementaire et éventuellement pour ces deux raisons simultanément. Nos protocoles sont réalisés sur des animaux en bonne santé et représentatifs de l'espèce cible du produit d'essai, conformément à la ligne directrice VICH GL 43.

Réduction

Le principe de la Réduction du nombre d’animaux visant à minimiser le nombre d'animaux utilisés tout en garantissant la validité statistique des résultats est mis en place. 1. Concrètement, une justification préalable du nombre d'animaux nécessaire est réalisée avant chaque procédure 2. La réutilisation des animaux dans les limites éthique et en respect du bien-être animal est appliquée Le nombre d'animaux déclarés ne correspond pas au nombre d'animaux réellement impliqués dans les procédures. Un animal peut être réutilisé dans le cadre du projet, sous réserve d'une évaluation rigoureuse de la sévérité réelle encourue lors des dernières études. De plus, le choix de l'animal pour une procédure sera soumis à l'évaluation d’un vétérinaire de l’établissement utilisateur, en se basant sur des critères spécifiques tels que le cumul des procédures déjà effectuées, la réaction et le comportement général de l'animal au sein de la colonie et le délai nécessaire pour évacuer la molécule testée lors des dernières études.

Raffinement

Toutes les mesures visant à minimiser la douleur, la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux tout au long de leur vie dans le cadre du projet ont été mises en place. Ceci se traduit comme suit: Préparation et Procédures · Acclimatation & Habituation : Mise en place de l'acclimatation des animaux et habituation progressive aux gestes techniques avant les procédures, dès que cela est possible · Renforcement Positif : Utilisation des systèmes de récompenses pour faciliter la coopération lors des actes techniques. · Gestion de la Douleur : Assurer l'application systématique de méthodes d'analgésie et d'anesthésie si un acte provoque un inconfort. · Points Limites : Appliquer des points limites spécifiques dans chaque étude pour arrêter l'expérience avant tout signe de souffrance. Environnement et Soins · Enrichissement : Assurer la présence d'enrichissements et prévoir des périodes de jeux/activités sociales selon nos procédures internes Éthique · Réhabilitation : Pour tous les animaux éligibles après la fin de leur utilisation.

Choix des espèces

Conformément aux exigences réglementaires, les études sont menées sur l'espèce de destination, à la posologie préconisée ou des multiples de celle-ci allant au maximum jusqu’à 5x la dose. L'analyse rétrospective des cinq dernières années et les prévisions de développement des prochains produits confirment que les besoins pour la présente demande d'autorisation de projet ne concerne exclusivement que les espèces chien et chat. Ce sont des animaux dont le stade de développement varie du jeune sevré à l’animal adulte, l’âge sera dépendant du type de test et du produit d’essai envisagé.

755 souris sont tuées pour prélever leurs organes et mesurer où se distribuent les formulations testées, 100 autres pouvant être réutilisées dans d'autres études. 855 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une chirurgie de trente minutes pour recevoir le produit directement dans le cerveau, d'autres une injection dans la veine de la queue après un passage en enceinte chauffée, d'autres un dépôt dans le nez, avec jusqu'à six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Le porteur prévoit de traiter les animaux un par un et de renoncer à traiter le reste du groupe si le premier montre des signes cliniques précoces, ces souris épargnées formant les 100 individus réutilisables.

Objectifs

De nombreuses pathologies affectant le système nerveux et pour lesquelles il n’existe pas de traitement efficace sont décrites (maladie d’Alzheimer ou de Parkinson pour les plus connues). Ces maladies neurologiques, souvent rares (affectant moins de 1 personne sur 2000), sont très invalidantes voire mortelles et considérées comme la première cause de handicap dans le monde. En 2021, près de 3 milliards d’individus étaient atteints d’une maladie neurologique. Les équipes de Recherche et Développement pharmaceutique travaillent pour mettre au point des candidats médicaments en vue d’améliorer le traitement de patients atteints par ces maladies neurologiques. L’une des difficultés dans le développement de ces candidats médicaments est le passage de la barrière hématoencéphalique BHE (barrière physiologique entre le sang et le cerveau) pour qu’ils atteignent les cellules du système nerveux. Pour passer cette barrière, de nombreux médicaments utilisés pour le traitement des maladies neurologiques sont administrés de façon hautement invasive par injection au niveau des vertèbres entre les méninges chez l’Homme (voie intrathécale IT). La souris, modèle de choix pour évaluer la sécurité et l’efficacité de candidats médicaments de maladies neurologiques, présente une forte homologie physiologique et comportementale avec l’Homme. Cependant la voie IT utilisée en clinique humaine n’est pas réalisable chez la souris du fait de sa petite taille, donc les candidats médicaments sont administrés directement dans le cerveau. De nouvelles formulations utilisant des exosomes (vésicules protéiques naturellement excrétées par les cellules constituant une voie de communication intercellulaire) sont actuellement en cours de développement pour améliorer le passage dans les structures cérébrales, l’activité et/ou la tolérabilité de ces candidats médicaments. De plus, ces formulations pourraient permettre d’envisager l’administration des candidats médicaments chez l’Homme par des voies moins contraignantes que la voie IT. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité et la biodistribution d’exosomes (passage de la BHE) administrés chez la souris via d’autres voies, moins contraignantes que directement dans le cerveau, (dans une veine ou par le nez), puis d’évaluer la tolérabilité et la biodistribution d’exosomes chargés avec une molécule de référence, après administration par ces 2 voies en comparaison avec la voie de référence(directement dans le cerveau) chez la souris.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, l’évaluation chez la souris de nouvelles formulations mettant en œuvre des exosomes doit permettre d’identifier des voies d’administration telles que la voie intranasale ou intraveineuse, autorisant le passage de la barrière hémato-encéphalique. En effet, actuellement, une grande majorité des médicaments pour le traitement de maladies neurologiques et notamment neurodégénératives sont administrés en clinique par voie intrathécale, permettant de s’affranchir du passage de la barrière hémato-encéphalique et ainsi permettre l’action du médicament sur le cerveau. Cependant, la voie intrathécale est contraignante pour le patient notamment dans le cadre d’administrations répétées. Les bénéfices escomptés de ce projet sont : - d’évaluer la biodistribution et la toxicité potentielle de formulations (exosomes), puis d’une molécule de référence contenue dans ces exosomes (court terme) -l’optimisation des formulations de candidats médicaments pour améliorer leur activité, leur distribution et diminuer leur toxicité. Le fait de charger ces candidats médicaments dans des exosomes peut aussi permettre de protéger la molécule de la dégradation (permettant de réduire le nombre d’administrations et donc la contrainte à la fois pour l’animal mais aussi pour l’Homme), - à long terme, validation et utilisation de voies d’administration autres que la voie intracérébroventriculaire (chez la souris) ou intrathécale utilisée en clinique pour l’administration de candidats médicaments seuls (moins de contraintes pour l’animal et pour l’Homme dans les études ultérieures), - à terme, un traitement plus efficace possiblement moins contraignant pour les patients atteints de maladies neurologiques.

Procédures

• Administration unique des composés dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie et couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ) • A l’administration (unique) de composés (par injection dans une veine de la queue ou dépôt dans la narine) nécessitant une contention courte ou le passage préalable dans une enceinte thermorégulée • A l’administration (unique) de leurre (par injection dans une veine de la queue) nécessitant le passage préalable dans une enceinte thermorégulée • Administrations d’analgésique (moins de 10 sec, pendant 2 jours max) (maximum 2 x par jour en couverture et selon la voie d’administration du composé testé) • Prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : la contention est d’une durée maximale de 2min et chaque prélèvement dure moins de 30s (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) • Administration d’anesthésiques et analgésie en fin d’expérimentation avant euthanasie (moins de 10 sec) • Prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • Anesthésie en fin d’expérimentation et potentiellement (selon la voie testée) avant administration des composés étudiés (degré de sévérité léger) • Pour certains groupes de souris : phase de chirurgie sous anesthésie générale nécessaire à l’administration unique du composé d’intérêt dans le cerveau ainsi que la période post-opératoire peuvent générer du stress et une douleur modérée • Administration (unique) de composés nécessitant une contention courte (15sec) (degré de sévérité léger) • Administration unique de composés par voie intraveineuse nécessitant le passage préalable dans une enceinte thermorégulée (durée maximale de 5min), contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) (degré de sévérité modéré) • Administration de l’anesthésique en fin d’expérimentation préalable à l’euthanasie (degré de sévérité léger) • Prélèvements de très faibles volumes de sang : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modéré). - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : Le composé administré peut en lui-même induire des effets cliniques et peut provoquer une nuisance (degré de sévérité maximal : modéré, durée maximale des études : 3 semaines) pour l’animal (impacts sur l’activité, état général, variation du poids corporel par exemple).

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’une formulation ou d’une molécule dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour réaliser des prélèvements nécessaires aux analyses et à la détermination de leur distribution et/ou activité au sein de l’organisme. Dans le cas des injections intracérébro-ventriculaires (ICV), il est possible que des souris reçoivent uniquement l’analgésie avant l’injection ICV (si un premier animal traité présentait des signes cliniques précoces, les autres animaux du groupe ne seront pas traités et pourront être inclus dans d’autres études). Dans ce cas, elles pourront être réutilisées soit dans cette DAP soit dans une autre DAP après une période suffisante d’élimination du composé et avis vétérinaire

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer de nouvelles formulations innovantes pour l’administration de candidats médicaments utilisés dans le traitement de maladies neurologiques. Bien qu’ils soient de plus en plus perfectionnés, les modèles in vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique restent néanmoins incomplets pour juger de la distribution, de l’activité et de la tolérabilité des candidats médicaments ainsi que de l’interaction avec les autres processus physiologiques retrouvés au niveau de la barrière hémato-encéphalique d’un organisme entier (système immunitaire, cellules sanguines par exemple). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et la souris est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet à ce stade de développement (constitution de la barrière hémato-encéphalique, processus physiologiques très semblables à l’Homme, panel comportemental faisant de la souris le modèle de choix dans l’évaluation de l’efficacité et de la sécurité de candidats médicaments à visée neurologique).

Réduction

La sélection des formulations contenant des exosomes associées ou non à des candidats médicaments est basée sur des études de screening in vitro et ou silico. Ces méthodes alternatives de screening vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont utilisées préalablement pour caractériser et sélectionner les formulations à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement leur nombre. Ces études préliminaires de sécurité interviennent avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Des tests de chargement de la molécule de référence dans les exosomes associés à des quantifications seront aussi réalisées in vitro préalablement à la mise en place de ce projet. L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. En effet, le nombre d’animaux (3 individus/groupe selon la procédure) est considéré comme un compromis efficace pour interpréter avec fiabilité les résultats scientifiques associés aux objectifs de ce projet tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible. Ce nombre est issu de l’expérience dans le domaine, dans la plupart des projets évaluant une tolérabilité et/ou une distribution, c’est le nombre minimal permettant de donner des résultats interprétables Les études de ce projet permettent d’évaluer l’activité et la distribution de la molécule dans ces formulations et ainsi d’affiner le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le nombre total d’animaux pour les études ultérieures (autres DAP). Selon la procédure, plusieurs examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés sur un même animal (observations cliniques, pesées corporelles, prélèvement de sang pour cinétique ou dosages, etc…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure de ce projet tout en respectant les conseils de la Structure de Bien-Etre Animal. Enfin, les prélèvements de petits volumes de sang, permettent de suivre la cinétique sur un même animal, réduisant également le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision rapide est prise par les équipes scientifiques en charge des animaux (sur la base de critères d’arrêt/points limites) puis par le responsable d’étude et le vétérinaire au besoin. Selon la clinique observée, cette décision peut inclure une prescription de soins, ou en dernier recours une euthanasie de l’animal. Pour aider à la décision, une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée et à la voie d’administration est mise en place avant l’apparition des points limites. Dans cette grille, l’attention sera portée sur l’apparition de signes cliniques concernant à minima le déplacement, l’activité, la posture, la respiration ou l’apparition éventuelle de troubles neuromusculaires. En plus de ce suivi quotidien, les administrations seront réalisées de manière séquentielle quelle que soit la voie d’administration concernée : si un premier animal traité présentait des signes cliniques précoces (30 minutes après traitement par ex.), les autres animaux du groupe ne seront pas traités. L'administration des formulations/molécule directement dans le cerveau est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique afin de limiter tout risque de douleur au réveil de l'animal. La phase de chirurgie est ainsi réalisée selon les bonnes pratiques avec des espaces dédiés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie, une anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie, un maintien de la température corporelle de l’animal dès l’anesthésie et une asepsie maintenue pendant toute la chirurgie. De faibles quantités de sang peuvent être rapidement prélevées chez les souris de manière peu invasive et peu stressante, ce qui limite l'impact sur les animaux et respecte leur bien-être. Cette méthode évite d’utiliser les procédures classiques qui nécessitent de placer l'animal dans une enceinte thermorégulée pour dilater les vaisseaux. Dès qu’un acte expérimental est susceptible de causer une douleur), une analgésie adaptée est mise en place en plus de l’anesthésie générale afin de limiter tout risque de douleur. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant un hébergement individuel), avec de l’enrichissement adapté aux besoins de la souris (matériel de nidification, matériel à ronger, tunnel).

Choix des espèces

L’ensemble des procédures de ce projet est réalisé chez la souris car : - La souris présente une forte homologie physiologique, comportementale et génétique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle permettant d’obtenir la meilleure prédiction possible chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes, issues de la littérature, par souche, âge, sexe), nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que la disponibilité de nombreuses lignées transgéniques mimant des pathologies humaines chez la souris, permettant d’établir l’efficacité des candidats médicaments dans des études ultérieures. - La voie ICV réalisable chez la souris, pourra être utilisée comme un contrôle positif car elle permet de délivrer les formulations ou candidats médicaments directement dans le cerveau (en s’affranchissant du passage de la barrière hémato-encéphalique). De plus, cette voie d’administration nécessite une chirurgie moins invasive que la voie intrathécale utilisée chez d’autres espèces comme le rat - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des formulations et des candidats médicaments, peuvent être aisément prélevées et étudiées. - De nombreuses études nécessaires au développement d’une molécule à visée neurologique utilisent ce modèle expérimental, les études sur les exosomes étant classiquement réalisées chez la souris. De jeunes adultes et adultes seront utilisés ce qui correspond à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de molécule à visée neurologique et dans les études d’efficacité ultérieures à ce projet. Ces études vont permettre de présélectionner précocement de nouvelles formulations ainsi que de nouvelles voies d’administrations pour la délivrance de molécules thérapeutiques avant la mise en place des études ultérieures chez le rat par voie intrathécale, même voie utilisée en clinique chez l’Homme.