Recherche fondamentale

Une irradiation de huit minutes détruit la moelle osseuse des souris receveuses, qui reçoivent ensuite par injection derrière l'œil la moelle prélevée sur des souris donneuses. 490 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de vérifier si deux lignées modifiées pour produire des molécules anti-inflammatoires vieillissent mieux, et si cette résistance se transmet par greffe de moelle. Le porteur écrit que les animaux, anesthésiés pendant l'opération, ne ressentent donc aucune douleur, tout en indiquant que leur système immunitaire restera affaibli une quinzaine de jours et qu'elles pourraient présenter des blessures légères ou une irritation de la peau.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment on peut vieillir en meilleure santé en réduisant une inflammation qui s'installe avec l'âge. Quand on vieillit, notre corps reste souvent dans un état d'inflammation légère et continue, un peu comme une petite blessurequi ne guérit jamais vraiment. On appelle ça l'inflammaging. Pour étudier cela, nous avons créé deux types de souris spéciales : - Les premières produisent une substance anti-inflammatoire à la place d’une autre qui provoque l’inflammation. - Les deuxièmes produisent non seulement cette même substance apaisante, mais aussi une autre qui aide à réparer les tissus du corps. En résumé, ces souris sont conçues pour calmer naturellement l’inflammation au lieu de l’entretenir. Nous pensons que ces souris vieilliront plus lentement et en meilleure santé, car leur corps devrait mieux se défendre contre les effets négatifs de l’âge. Pour le vérifier, nous allons les observer tout au long de leur vie — de leur jeunesse à leur vieillesse — et analyser régulièrement leur sang pour voir comment leur organisme réagit. Enfin, nous ferons aussi des transferts de moelle osseuse (la partie du corps qui fabrique les cellules du sang et du système immunitaire) vers des souris normales, pour voir si cette modification peut aussi rendre d’autres souris plus résistantes au vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre pourquoi notre corps s’enflamme doucement en vieillissant, et surtout comment calmer cette inflammation. Avec l’âge, une inflammation permanente s’installe dans notre organisme. Elle ne fait pas mal, mais elle use nos cellules petit à petit. On sait aujourd’hui qu’elle est impliquée dans près de 80 % des maladies liées au vieillissement : comme l’arthrose, le diabète, l’ostéoporose ou encore les maladies du cerveau comme Alzheimer. Elle joue aussi un rôle important dans le vieillissement de la peau. Notre idée est de transformer les cellules « malades », qui fabriquent des substances inflammatoires, en cellules « réparatrices », qui produisent au contraire des molécules apaisantes et protectrices. En d’autres mots, nous voulons rééduquer le système immunitaire pour qu’il aide le corps à se soigner au lieu de l’abîmer. En d’autres termes, notre stratégie est novatrice et ce projet constituera la preuve de concept de sa faisabilité et de son intérêt. A court terme, cette étude permettra de valider notre hypothèse de travail sur le modèle murin. A plus long terme, elle a vocation à être applicable chez l’homme.

Procédures

Les souris receveuses subiront, sous anesthésie chimique, une irradiation quasi-totale pendant 8 minutes afin d'éliminer leur moelle osseuse. Ensuite, elles recevront une injection de moelle osseuse provenant des souris donneuses. Cette injection, d’une durée d’environ 1 minute, sera effectuée par voie oculaire, c'est-à-dire via une injection dans la zone située derrière l'œil, ce qui permet un accès rapide au système sanguin. Enfin, toutes les souris subiront un prélèvement sanguin de courte durée (environ 1 minute par souris) selon les procédures standard de l'animalerie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certains gestes nécessaires peuvent provoquer un peu de stress ou d’inconfort chez les animaux. Les prises de sang, par exemple, sont rapides mais peuvent provoquer un léger stress chez les souris. Lors des expériences de greffe de moelle osseuse, les souris sont d’abord soumises à une irradiation pour supprimer temporairement leurs cellules sanguines et elles reçoivent, ensuite, une injection intraveineuse, afin d’introduire la nouvelle moelle osseuse. Pendant toute cette procédure, les animaux sont endormis (anesthésiés) : ils ne ressentent donc aucune douleur. L’anesthésie peut provoquer un léger stress passager au réveil. Après l’irradiation, leur système immunitaire sera affaibli pendant environ 15 jours, les rendant plus vulnérables aux infections. Elles pourraient également présenter des blessures légères ou une irritation de la peau.

Devenir

Les animaux de nos groupes d’étude seront eutanasiés pour prélèvement post-mortem de multiples organes.

Remplacement

Ce projet vise à déterminer si les mutations portées par nos souris leur confèrent une protection contre l’inflammation qui apparaît avec l’âge. Cette inflammation est très complexe, car elle touche tout le corps : plusieurs organes, des hormones et des cellules du système immunitaire qui agissent ensemble, etc… qui ne peuvent pas être mimées avec des méthodes alternatives dans l’état actuel des connaissances.

Réduction

Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide d’un logiciel statistique. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes dans des environnements enrichis pour qu'elles puissent vivre dans des conditions favorisant leur comportement naturel et les interactions sociales. Les cages peuvent contenir jusqu'à 5 souris adultes. Chaque cage sera enrichie avec du matériel pour la nidification. Les conditions dans les animaleries, telles que la température, l'humidité et l’éclairage, sont soigneusement contrôlées. De plus, notre animalerie est exempte d'agents pathogènes spécifiques pour minimiser les infections et le stress. Après certaines procédures comme l’irradiation, les animaux recevront des antibiotiques dans leur eau de boisson pour éviter les infections pendant la période où leur système immunitaire est affaibli. Si une souris perd du poids, elle recevra de la nourriture spéciale en gelée, puis, si nécessaire, des soins supplémentaires (comme des injections de réhydratation). En cas de blessures légères, elles seront désinfectées quotidiennement jusqu’à guérison. Les signes de douleur ou d’inconfort (par exemple poils ébouriffés ou attitude apathique) entraîneront une surveillance renforcée et l’administration d’un antidouleur. Toutes ces mesures visent à assurer le bien-être des animaux tout au long de l’étude, en limitant au maximum la douleur, le stress et la souffrance.

Choix des espèces

L’espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et son utilisation dans ce projet est cruciale pour répondre aux questions scientifiques posées. Cette étude porte sur des souris utilisées à partir de 3 mois, car elles sont alors jeunes adultes, avec un organisme stable et comparable entre individus. Cela permet de suivre les animaux sur une longue période pour étudier l’évolution de l’inflammation chronique et du vieillissement, tout en évitant les variations liées à la croissance observées chez des animaux plus jeunes.

Une électrode détruit d'abord les neurones du noyau suprachiasmatique, deux semaines plus tard une seconde chirurgie injecte une protéine Tau fluorescente dans le cerveau et pose un cathéter dans la veine du cou, puis les animaux sont tués dix jours après. 958 souris et rats passent par ces protocoles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certains gardés jusqu'à vingt mois et isolés seuls en cage pendant deux semaines. Un groupe de 150 souris est empêché de dormir par un aliment appétant distribué au début de leur phase de sommeil, puis testé à trois, six et douze mois sur l'activité locomotrice, l'anxiété et les performances cognitives. Aucun animal n'est gardé vivant, y compris ceux qui servent de témoins, tous étant mis à mort pour l'analyse de leur cerveau.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées dont la prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et qui touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Comprendre le développement de la maladie est donc primordial. Cette démence se caractérise en partie par une accumulation et une agrégation d'une protéine, la protéine Tau, provoquant la dégénérescence des neurones touchés. Les atteintes cérébrales sont variées : hippocampe, cortex, … mais également l’hypothalamus et en particulier les neurones du Noyau Supra-Chiasmatique (NSC) impliqués dans le contrôle des rythmes circadiens (rythme biologique qui régule l'alternance veille/sommeil). Les troubles du sommeil représenteraient un marqueur précoce de la maladie avant l’apparition des troubles cognitifs mais également un facteur de risque. Notamment, il a été montré qu’une privation de sommeil chez l’animal et chez l’Homme conduit à une élévation des protéines Tau toxiques dans le liquide céphalorachidien. De plus, le travail de nuit, occasionnel ou habituel, qui concerne environ 15% des salariés en France soit 3,5 millions de personnes, constitue une préoccupation majeure de santé publique du fait des effets sanitaires divers qui lui sont associés, en particulier des troubles cognitifs et d’une augmentation du risque de démences. En outre, il a été montré récemment que les cellules bordant le troisième ventricule du cerveau, nommées les tanycytes, étaient également dégradées dans la maladie d’Alzheimer. Or, ces tanycytes pourraient être impliquées dans la clairance de la protéine Tau contenue dans le liquide céphalorachidien. De plus, il a été récemment suggéré que les neurones du NSC pourraient communiquer avec les tanycytes pour réguler certaines fonctions circadiennes. Le projet se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans l’arrivée de la maladie d’Alzheimer. Les résultats de ces recherches pourraient permettre d’évaluer l’impact des troubles du sommeil ou les horaires de travail décalés sur le développement de la maladie d’Alzheimer et également d’autres démences, et ainsi aider les autorités sanitaires à mettre en place des actions afin de limiter ces facteurs de risques. D’autre part, la dégradation des tanycytes et le manque de nettoyage du liquide céphalorachidien au cours des phases de sommeil profond par ces cellules spécialisées, les tanycytes, pourraient être à l’origine d’autres pathologies et ouvre la voie à de nouvelles recherches. En effet, l’accumulation d’autres protéines dans le liquide céphalorachidien, tel que l’Orexine, pourrait être responsable de troubles métaboliques observés chez les personnes ayant des troubles du sommeil ou en travail posté.

Procédures

Chacune des interventions sera réalisées dans les 2 animaleries. Un 1er groupe d'animaux (100 souris/100 rats) sera nécessaire pour étudier les changements des tanycytes induits par une lésion des NSC. Une chirurgie cérébrale détruira les neurones des NSC par l’introduction d’électrodes qui envoient un courant électrique. Ces animaux subiront une 2e chirurgie 2 semaines après afin d'injecter dans le cerveau une protéine Tau fluorescente et un cathéter sera placé dans la veine du cou afin d'effectuer des prélèvements de sang réguliers. Les animaux seront euthanasiés 10 jours après afin de prélever les cerveaux et étudier leurs morphologies. Un 2e groupe d'animaux sera utilisé pour vérifier l'impact d'une perturbation du rythme circadien (travail posté, mauvais sommeil) sur les fonctions cognitives des souris soit par lésions des NSC, soit par une manipulation environnementale. Un 1er sous-groupe de 240 souris (90 souris sauvages, 90 souris modèles de la maladie d'Alzheimer et 60 souris contrôles) subiront une chirurgie de lésion cérébrale des NSC; un 2e sous-groupe (90 souris avec chocolat en phase de sommeil et 60 souris contrôles avec chocolat en phase de veille) se verra administrer un aliment appétant au début de la phase de sommeil afin de les empêcher de dormir. Toutes ces souris seront testées 3, 6 et 12 mois après par des tests de comportements et par des tests du sommeil. Un 3e groupe d'animaux sera utilisé pour étudier un changement des gènes dans les tanycytes à court et à long terme induit par une lésion des NSC sur 80 souris et 80 rats. Les animaux subiront une lésion des NSC puis après 1, 3, 6, 12 et 18 mois, une chirurgie cérébrale permettra l'injection d'un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Ces animaux seront euthanasiés 2 semaines après l'injection du virus pour des expériences de transcriptomique. Un 4e groupe d'animaux permettra de voir l'impact de l'activation ou l'inhibition des neurones des NSC à la fois sur la morphologie et sur la modification des gènes des tanycytes. Deux sous-groupes (52 souris et 52 rats chacun) auront une injection cérébrale de virus permettant d’activer ou d’inhiber sélectivement les neurones des NSC et un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Deux semaines après l’injection cérébrale, les animaux seront mis à mort 30min après l’activation ou l’inhibition des neurones. Chacune des interventions chirurgicales durera entre 30 minutes et 1 heure.

Impact sur les animaux

Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort et des mesures de raffinement seront mises en place pour les limiter au maximum. En particulier, les expériences de chirurgie ou de prélèvements de sang sont faites sous anesthésie générale avec l'administration d'analgésique pour éviter toute douleur à l'animal lors de son réveil. Afin d’évaluer la perturbation des rythmes circadiens, il sera nécessaire d’isoler les animaux individuellement pendant 2 semaines (évaluation du poids, de l’absorption d’eau et d’aliments, expériences d’optogénétique). Cet isolement reste limité et sera effectué dans des cages transparentes à coté les unes des autres afin de permettre à chaque souris/rat de voir ses congénères. La lignée de souris transgéniques est une lignée de souris mimant la maladie d'Alzheimer. Ce modèle murin développe une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de l’âge de 3 mois, avérée à 6-7 mois et maximale à 12 mois. Ces animaux n'ont pas de problème de déplacement et ne souffriront pas de cette pathologie. D’autres manipulations seront effectuées sur les animaux vigiles : des tests de comportement (sur 390 souris) consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives. Ces expériences n’entraînent aucune douleur, mais peuvent générer du stress suite aux manipulations; les expériences seront réalisées par le même manipulateur et une habituation est effectué avant chaque test. Les molécules (anesthésiques, analgésiques, activateur/inhibiteur) devront parfois être injectés dans le péritoine de l’animal et nécessiteront la contention et l’injection de l’animal; un analgésique local peut être utilisé pour limiter la douleur de l'injection.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans chacune des procédures sera euthanasié à terme même ceux qui servent de contrôles. La durée maximale de conservation des animaux après le début des expériences est de 18 mois. Les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude pour faire des analyses de transcriptomique ou étudier la morphologie des populations cellulaires.

Remplacement

Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3R. L’étude des communications entre différentes régions cérébrales nécessite, en particulier au niveau du cerveau, d’utiliser des organismes entiers. Aucun système cellulaire n’est capable à l’heure actuelle de mimer toutes les interactions entre différentes régions cérébrales et les influences périphériques. Les tanycytes de l’éminence médiane sont des cellules placées au cœur d’une région cérébrale impliquée dans la régulation des fonctions endocrines et préserver l’influence des différentes parties de l’organisme sur cette communication cérébrale est indispensable pour notre projet. Les modèles de rongeurs rats et souris sont donc pertinents pour ce type d’étude et permettront une étude comparée des deux espèces ayant des physiologies différentes.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est calculé de façon à avoir un nombre minimal et homogène d’animaux et que ce nombre soit suffisant pour une analyse statistique. Le calcul du nombre d’animaux est basé sur un calcul statistique d’effectif (seuil de significativité de 5%, puissance égale à 85%, différence entre les moyennes de 15 et écart-type de 10) pour une comparaison entre deux lots et un test statistique bilatéral. Ce calcul évalue le nombre minimum de souris par groupe entre 6 et 10.

Raffinement

Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. * Les animaux sont habitués à la manipulation. * Les hébergements seront enrichis. * Pour les prélèvements sanguins, les animaux sont anesthésiés dès que possible. * Une surveillance quotidienne est effectuée afin de détecter le plus tôt possible une éventuelle morbidité (suite à l’infection). En cas de signes cliniques défavorables et/ou si une perte de poids supérieure à 20% survenait, les animaux concernés seront mis à mort par anesthésie à l’isoflurane avant l’injection létale de barbiturique (Pentobarbital 182,2mg/kg) par voie intrapéritonéale. La souffrance, la détresse, l’inconfort des animaux de laboratoire seront évalués en se basant sur les cinq paramètres suivants : 1. variation du poids de l’animal 2. apparence physique externe (horripilation, accélération de la respiration, tremblements, consistance anormale des fèces associée à une distension de l’abdomen) 3. signes cliniques mesurables (hypothermie) 4. changement du comportement (diminution des soins, animal prostré) 5. réponses comportementales aux stimuli externes (réaction violente de douleur associée à des vocalisations). Les douleurs seront limitées par l'utilisation d'un analgésique (Metacam 5mg/kg pour les souris et 1mg/kg pour les rats; et lidocaine en spray). Une grille de score basée sur ces 5 critères (issue de Wolfensohn et Lloyd, 2003) sera utilisée pour évaluer l'état de chaque animal aprè les chirurgies. Un stress momentané est possible et sera réduit grâce aux bonnes pratiques de la préhension des animaux (suivant les recommandations « refining procedures for the administration of substances » - report of the BVAAWR/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group of refinement). Un tranporteur agréé sera chargé de transporter les animaux entre les 2 animaleries. Une temps de 7 jours sera laissé pour leur permettre de s'habituer à l'animalerie et se remettre du stress généré par le transport.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle rongeur est essentielle pour décrypter les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie d’Alzheimer. La communication entre différentes populations cérébrales impliquées nécessite l’utilisation de l’animal entier. Par ailleurs, la possibilité d’utiliser des souris transgéniques THY-Tau22 mimant le déclin cognitif est un plus et nécessite l’utilisation de souris transgéniques et wild-type. L’utilisation des technologies DREADD et d’optogénétique nécessite également l’utilisation de souris et de rats, technologies aujourd’hui indispensables pour moduler des populations neuronales et en déduire leurs fonctions. La physiologie des souris et des rats étant différente, il nous parait nécessaire d'étudier dès que possible ces 2 espèces afin de permettre leur comparaison. Tous les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux adultes de 8 semaines à 21 mois. Toutes les expériences démarreront à l’âge de 8 semaines et se poursuivront sur 14 ou 24 jours pour les études à court-terme, ou sur 3 mois, 6 mois, 12 mois et 18 mois pour les études sur le long-terme (au maximum, les animaux seront âgés de 20,5 mois).

Les souris utilisées ici sont dépourvues de globules blancs, condition posée pour que des cellules immunitaires humaines s'implantent dans leur organisme. 4 038 d'entre elles, nouveau-nées ou adultes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, un gavage quotidien pendant trois semaines, deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie et des prélèvements sanguins derrière l'œil, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine. Toutes sont tuées en fin d'expérience pour que leurs organes soient prélevés, le porteur jugeant le recours à la souris "indispensable" faute de méthode de laboratoire donnant des cellules immunitaires pleinement fonctionnelles.

Objectifs

Les cellules utilisées dans ce projet sont des globules blancs humains, modifiés en laboratoire afin de leur permettre de reconnaître et d’éliminer les cellules cancéreuses. Bien que cette approche ait déjà montré des résultats encourageants, certaines limites peuvent apparaître, comme la réapparition de la maladie ou une diminution des défenses immunitaires, ce qui peut rendre les patients plus vulnérables aux infections. Le présent projet vise à évaluer une nouvelle stratégie utilisant des cellules capables de persister plus longtemps dans l’organisme, dans le but de renforcer durablement les défenses immunitaires et d’améliorer la protection du patient sur le long terme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider une nouvelle approche de thérapie cellulaire fondée sur l’utilisation de cellules immatures, en tant que stratégie innovante pour le traitement du cancer. Les données générées permettront de consolider les bases scientifiques nécessaires au développement d’une plateforme de thérapie cellulaire/génique en vue d’une application clinique. Cette approche présente un fort potentiel translationnel, en offrant des réponses antitumorales durables et efficaces, tout en contournant certaines limites majeures des thérapies actuelles.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : 1. Injection sous anesthésie générale ou animaux vigiles en contention (1x ; durée < 1 minute/animal). 2. Gavage, 1x par jour pendant 3 semaines, durée < 1 minute/ animal. 3. Un prélèvement sanguin au niveau du sinus orbital sous anesthésie générale, durée < 1 minute/ animal. 4. Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris). 5. Mesure de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie générale 2x par semaine durant 21 jours maximum (5 minutes par souris). 6. Mesure de la croissance tumorale à l’aide d’un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu’à la fin de l’expérimentation. 7. Un prélèvement sanguin avant la mise à mort en phase terminal au niveau du sinus orbital sous anesthésie générale, durée < 1 minute/ animal.

Impact sur les animaux

Les souris seront hébergées en groupe dans des cages ventilées et manipulées par du personnel formé, afin de limiter les risques d’infection liés à leur système immunitaire fragile. L’injection de cellules tumorales ou de traitements peut entraîner certains effets comme une perte de poids ou une anémie. Les différentes techniques d’injection ou le gavage peuvent provoquer une gêne passagère ; en cas de complication, l’animal sera immédiatement mis à mort pour éviter toute souffrance. La croissance de la tumeur peut aussi générer un inconfort, et les examens nécessaires (imagerie, mesures) peuvent induire un stress ponctuel. L’anesthésie peut entraîner une diminution de la température corporelle. Le prélèvement sanguin peut provoquer un inconfort passager ainsi qu’un stress temporaire. Le bien-être des animaux sera suivi de près tout au long de l’étude, notamment par le contrôle régulier du poids et de l’évolution tumorale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode en laboratoire permettant d’obtenir des cellules immunitaires pleinement fonctionnelles sans passer par l’animal. Les systèmes de culture disponibles permettent seulement une maturation partielle, insuffisante pour reproduire les conditions naturelles. L’utilisation de la souris reste donc indispensable, car elle seule permet aux cellules humaines de se développer complètement dans un environnement physiologique. Les expériences proposées interviennent après un long travail de mise au point en laboratoire et visent à confirmer, chez l’animal, le potentiel thérapeutique des cellules avant toute application chez l’homme.

Réduction

L’utilisation des souris immunodéficients a été retenue car elle est particulièrement efficace pour recevoir des cellules humaines, avec un taux d’échec très faible. Ce modèle permet donc d’obtenir des résultats fiables. Ce projet vise à évaluer l’effet d’un produit de thérapie cellulaire dans un modèle tumoral. Ces cellules, issues du système immunitaire (les globules blanc) et génétiquement modifiées, apprennent à identifier les cellules cancéreuses et peuvent ensuite se transformer en un système de défense plus stable et durable. Le déroulement expérimental suivra une approche séquentielle : la poursuite de chaque étape dépendra de la lisibilité et de la pertinence des résultats obtenus à l’étape précédente. Cette démarche progressive, associée au regroupement des tests quand cela est possible, permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la solidité scientifique des résultats.

Raffinement

Les souris immunodéficients seront élevées dans des conditions d’hygiène strictes afin de protéger leur santé fragile liée à leur système immunitaire déficient. Elles seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Chaque cage sera enrichie avec un tunnel rouge pour réduire le stress, du matériel de nidification et un bâtonnet en bois pour répondre à leurs besoins naturels. Aucune souffrance particulière n’est attendue à la suite des greffes. Un suivi attentif et des observations régulières seront assurés tout au long de l’étude. Si des signes de douleur ou d’inconfort apparaissent, des mesures adaptées seront prises dans le respect des points limites définis pour chaque procédure. En cas de souffrance avérée et selon la définition des points limites, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle expérimental en raison de la connaissance approfondie de sa biologie, de sa génétique et de son comportement, ce qui facilite son élevage et le suivi de son état de santé et de bien-être. La lignée utilisée n’a pas de globules blancs, ce qui permet aux cellules humaines de s’implanter facilement. Cela aide à étudier certaines maladies et à tester de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, deux stades d’âge seront utilisés, des souriceaux nouveau-nés et des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines.

1 350 souris sont exposées à un traumatisme sonore pouvant durer deux heures, et 1 080 subissent une injection dans la cochlée, opérées pour certaines dès l'âge de deux jours. 2 700 souris sont utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec cinq tests auditifs de quarante minutes sous anesthésie puis une mesure terminale des potentiels de l'oreille interne. Le porteur qualifie la perte auditive provoquée de dommage permanent "sans impact autre sur la santé de l'animal", et affirme que l'exposition sonore ne provoque ni douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste. Les anciens reproducteurs, génétiquement modifiés et donc jugés non adoptables, sont tués au bout de six mois et remplacés.

Objectifs

Selon l’OMS, d’ici 2030, les atteintes de l’audition constitueront la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien soit plus de 500 millions de personnes. Dans plus de 80% des cas la surdité est liée à une atteinte de l’organe neurosensoriel de l'oreille (on parle de surdité neurosensorielle). Parmi les surdités neurosensorielles, on distingue les surdités d’origine héréditaire (on parle de surdité génétiques) et d’origine environnementale. La première cause environnementale des troubles de l’audition est la surexposition au bruit. De ce fait, un encadrement législatif de protection des travailleurs dans le milieu professionnel existe dans de nombreux pays. Mais selon l’OMS plus d’un milliard de jeunes sont confrontés au risque d’une perte auditive permanente en raison d’une exposition prolongée à des sons de forte intensité lors de loisirs tels que l’écoute de musique et les jeux vidéo. Il peut également y avoir un effet combiné : si la surdité génétique peut entraîner une perte d’audition dès la naissance (on parle de surdité congénitale), elle peut également entrainer une diminution des capacités au cours de la vie (on parle de surdité acquise) notamment par une sensibilité accrue au bruit. En d’autres termes pour un environnement acoustique donné, une personne présentant système auditif déjà fragilisé par une mutation génétique sera plus susceptible de développer une perte auditive qu’une personne n’en présentant pas. L’objectif de la présente étude est premièrement d’identifier quelles surdités génétiques entrainent une sensibilité accrue au bruit et deuxièmement de déterminer si un traitement symptomatique médicamenteux ou curatif par thérapie génique (nécessitant une chirurgie de l’oreille interne) de la surdité héréditaire permettrait de diminuer l’incidence ou la gravité de la surdité acquise qui s’y adjoint.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier les surdités génétiques entrainant une sensibilité accrue au bruit et d’en documenter les processus physiopathologiques et, si les résultats sont probants, contribuera à plus long terme à une meilleure prise en charge des patients et une meilleure sensibilisation du grand public à l’adoption de bonnes pratiques d’écoute.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests auditifs (40 minutes en comptant l’anesthésie) et ce 5 fois (reparti entre 1 mois et 2 mois d’âge). En fin de procédure, les animaux seront soumis à des mesures de potentiels endocochléaires qui nécessitent que l’animal soit vivant mais profondément sédaté et qui est une procédure terminale, sans réveil donc et qui dure 20 min. Parmi ces 2700 animaux, 1350 seront soumis à un traumatisme sonore (2h au maximum) Parmi ces 2700 animaux, 1080 animaux seront soumis à une procédure chirurgicale :injection dans la cochlée qui dure environ 10 à 15 minutes

Impact sur les animaux

Le dommage principal et permanent attendu pour cette étude est la perte/diminution des capacité auditive pour les animaux que l’on induit par une exposition sonore sans impact autre sur la santé de l’animal. Les autres dommages attendus pour cette étude sont une peur et un stress physique transitoire lors des traumatismes sonores et une douleur – modérée, contrôlée par des analgésiques - consécutive à la chirurgie de l’oreille interne.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Animaux pour élevage : Les anciens reproducteurs sont des animaux transgéniques ne pouvant être adoptés, ils seront mis à mort au bout de 6 mois et renouvelés Animaux utilisés pour les expériences : Les animaux seront mis à mort pour réaliser nos analyses sur prélèvements.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central des rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). De plus, il n’est pas possible de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux, et aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

Les tailles des groupes de souris indiquées ont été calibrées pour répondre aux questions posées. Les groupes sont constitués afin de détecter un certain niveau de différences entre groupes. Les groupes seront constitués de 6 animaux et les expériences répétées 2 fois. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet.

Raffinement

Pour la chirurgie : • emploi d’analgésiques et application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. • les souris nouveau-nées anesthésiées seront gardées sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans leur cage initiale. • surveillance pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans notre grille d’évaluation de référence. Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort. Pour les mesures auditives : • Les mesures auditives sont réalisées sur des souris anesthésiées, application d’un gel ophtalmique. A la fin des enregistrements, les souris seront placées dans des cages sur un tapis chauffant, et surveillées jusqu’à leur réveil complet. Un gel nutritif et hydratant sera disposé dans les cages d’hébergement. • Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort. Pour l’exposition sonore : La procédure ne provoque ni douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste . • Avant l'exposition au bruit, les souris sont placées dans la cage d'exposition pendant 15 minutes par jour pendant une semaine afin de s'y habituer et d'éviter un stress chez les animaux. • Pendant le traumatisme sonore, les animaux seront surveillés pour s’assurer que les animaux ne présentent aucun signe de douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste. • Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec des souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris en post natal. : Pendant les 8 premiers jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. Les chirurgies de l’oreille interne seront réalisées sur des nouveaux nés, 2 jours après la naissance. Les traumatismes sonores et les tests auditifs seront réalisés à l’âge adulte.

Tout signe clinique grave qui persiste plus de vingt-quatre heures déclenche la mise à mort de la souris concernée. 1 098 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever l'oreille interne. Injectées dans l'oreille interne au premier jour de vie, elles subissent ensuite des tests auditifs sous anesthésie de un à douze mois, puis des tests d'équilibre et d'orientation, dont une épreuve de trente et une minutes et un test de nage de dix secondes. Le porteur crée une lignée déficiente en deux protéines, sourde et probablement sujette à des troubles de l'équilibre, tout en affirmant qu'aucune dégradation de l'état des animaux n'est attendue et en renvoyant les essais cliniques au long terme.

Objectifs

Environ 40% des pertes auditives sont d’origine génétique. Les prothèses auditives (dans le cas des surdités légères) et les implants (dans les cas de surdités sévères ou profondes) sont des dispositifs médicaux qui permettent d’accéder aux sons, mais ne restaurent pas une audition naturelle. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner les surdités génétiques. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une telle approche dans des modèles murins de surdité liée à une déficience en molécule que nous souhaitions étudier. Nous testerons deux stratégies de thérapie génique dans des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder les déficits sensoriels (audition/équilibre) liés à une déficience en molécule étudiée. A court terme, nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour apporter une protéine fonctionnelle (supplémentation de gène) ou réparer le gène d’une protéine mutée (édition de gène) au niveau des cellules sensorielles de l’oreille interne. A long terme, nous espérons grâce à ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques afin de prévenir la surdité postlinguale chez les patients porteurs de mutation sur les gènes codant pour les Clarines. Le fait de générer une souris double déficiente en molécules étudiées va nous permettre de : 1) enrichir nos connaissances sur la possible redondance biologique des 2 molécules, 2) consolider les effets bénéfiques de la thérapie génique par supplémentation de gènes ou par édition génique pour corriger la perte auditive et les troubles d’équilibre.

Procédures

Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections sous anesthésie gazeuse et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes. Tests auditifs : Les souris seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 1 mois. Ces tests pourront être répétés à 2, 3, 4, 5, 6 et 12 mois. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris seront également soumises à des tests comportementaux. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera quantifiée par 2 tests (l’un durant 31 minutes, l’autre 2 minutes). Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à deux autre tests (10 à 60 secondes chacun). Un test de nage sera finalement réalisé (10 secondes) avant le retour en cage d’hébergement.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en molécule étudiée présentent des déficits auditifs progressifs. La nouvelle lignée de souris que nous souhaitons créer sera déficiente en deux molécules et pourrait présenter des troubles de l’équilibre, en plus d’un déficit auditif. Les injections dans l’oreille interne seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en pré- et post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté contribuera à rétablir les fonctions sensorielles des souris injectées. En découle la liste ci-dessous des interventions après raffinement, et de leurs éventuels effets indésirables supérieurs ou égaux à une piqûre d’aiguille : 1) Pour la création d’une lignée de souris transgénique déficiente en deux molcéules, élevées dans un milieu fortement enrichi -> surdité et troubles d’équilibre, 2) Pour les injections sous anesthésie gazeuse et analgésie, avec soins pré- et post-opératoires -> pas de nuisance attendue du fait des injections réalisées sous contrôle strict pré- et post-opératoire.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements post-mortem de l’oreille interne, à des fins d’analyses.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous aurons recours à la souris dans notre projet pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la surdité et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué un test de puissance statistique à partir des données issues de l’une de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nous limitons également le nombre d’individus de nos groupes contrôles en réexploitant, quand cela est pertinent, les données contrôles de nos expériences antérieures. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents. Nos données quantifiées seront analysées avec un logiciel. Selon la taille et la distribution des échantillons, nous utiliserons différents tests statistiques.

Raffinement

A) Grille d’évaluation d’un phénotype dommageable : Notre projet prévoit la création d’une nouvelle lignée de souris transgéniques déficientes en deux molécules. Dans la mesure où toute création d’une nouvelle lignée de souris implique de surveiller la survenue d’un phénotype dommageable, nous suivrons la « fiche d'évaluation de phénotype suite à une création de lignée » proposée par notre SBEA. Ainsi, sur un minimum de 14 mâles et de 14 femelles (issues de 4 portées distinctes, nous examinerons un panel de critères physiques et comportementaux à trois stades : 1) à la naissance : taille des portées, soins apportés par les mères, présence d’une poche de lait stomacale, poids, apparence, réactivité, 2) au sevrage : âge de séparation, nombre de souris sevrées, proportion mâles/femelles, poids, apparence, réactivité, 3) à 2 ou 3 mois : poids, apparence, comportement, posture, consistance des selles. La survenue d’un signe clinique grave et persistant (plus de 24h) entrainera la mise à mort de l’individu concerné. B) Enrichissement de l’environnement Chez la souris, les troubles sensoriels peuvent s’accompagner d’hyperactivité, de désorientation, de stress et de bagarres (chez les mâles). D’expérience, nous avons remarqué que pour limiter ces effets, il suffisait d’ajouter deux igloos par cage, des copeaux en carton, des bâtonnets en bois à grignoter (1 par souris), et d’équilibrer le nombre d’animaux normaux et d’animaux déficients dans une même cage. Les cages doivent de plus être manipulées avec une très grande délicatesse et le moins souvent possible (une fois par jour maximum). Les personnes amenées à intervenir sur nos cages de souris déficientes sont alertées sur les consignes à appliquer. C) Monitoring des souris en amont et en aval d’une anesthésie avec ou sans chirurgie L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans leur cage. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par notre SBEA.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Nous projetons d’en créer un nouveau, déficient pour deux molécules. Ces modèles vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections se feront sur des souris âgées de 1 jour, soit à un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. La mise à mort se fera entre 8 jours et 6 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long termes d’une correction génique.