Recherche fondamentale

Tuées pour des prélèvements analysés plus tard, 284 souris immunodéficientes vont être utilisées dans la seconde partie de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux tumeurs sont greffées sous la peau de chaque animal, puis viennent les injections de liposomes photosensibles, les prélèvements sanguins hebdomadaires, l'éclairage des tumeurs pendant dix à soixante minutes et jusqu'à quinze séances d'imagerie. Le porteur annonce une gêne, une douleur légère, une brûlure cutanée possible et un risque d'infection lié à l'immunodéficience des souris. La preuve de concept visée reste une étape de laboratoire, l'usage en thérapie humaine étant renvoyé au "plus long terme".

Objectifs

La vectorisation, c'est-à-dire le transport, des médicaments à l’aide de véhicule est une alternative thérapeutique très prometteuse, car elle présente plusieurs avantages par rapport aux produits non-vectorisés: (1) une meilleure biodisponibilité des médicaments ; (2) une meilleure accumulation dans les tumeurs ; (3) une meilleure biocompatibilité : grâce à une accumulation privilégiée dans les tumeurs par rapport aux tissus sains, les effets nocifs sont diminués ; et (4) une libération prolongée des médicaments. Dans le cas des véhicules sensibles à la lumière, le relargage des molécules transportées peut être contrôlé par la lumière. L'objectif est de montrer l'efficacité des véhicules sensibles à la lumière que nous avons développés dans le cadre du traitement de tumeurs cutanées. Ce projet sera réalisés dans 2 établissement utilisateurs : EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Preuve de concept de l'efficacité du relargage contrôlé par la lumière des produits anticancéreux, à partir de véhicules sensibles à la lumière. A plus long terme, cette technologie pourrait être utilisée en thérapie chez l'homme.

Procédures

Injection dans la veine sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée inférieure à 1 minute, dans l'EU2. Injection dans le ventre sur animal vigile : 1 à 3 fois, durée 10 secondes, dans l'EU 2. Prélèvement de sang sur animal anesthésié : une fois par semaine , 2 ou 3 fois, durée 1 minute, dans l'EU 2. Injection sous la peau sur animal anesthésié : 1 fois, durée 1 minute, dans l'EU 1. Eclairage d'une tumeur sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée entre 10 et 60 minutes, dans l'EU 2. Imagerie sur animal anesthésié : 9 à 15 fois, durée entre 1 à 5 min, dans l'EU 2. Anesthésie : 11 à 20 fois, durée entre 5 et 10 min, dans l'EU 1 et EU 2.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses en sous cutané peut provoquer une infection au niveau du site d’injection. La présence d’une tumeur sous cutanée peut engendrer une légère douleur, une gêne. Une perte de poids liée à la croissance tumorale peut survenir. Le suivi en imagerie peut fatiguer les animaux à cause des anesthésies répétées. L’injection du véhicule peut provoquer une mauvaise réaction chez l’animal, une douleur au niveau du site d’injection. L’irradiation peut engendrer une légère brulure cutanée. L’immunodéficience des animaux peut entrainer une infection par des pathogènes.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Malgré la possibilité de valider sur des cellules in vitro l’efficacité des molécules, nous souhaitons montrer l’intérêt de notre technologie dans le traitement des tumeurs qui sont des structures dont la composition est hétérogène. De plus l’objectif est d'injecter ces molécules dans la circulation sanguine ce qui est à l’heure actuelle quelque chose de difficile à reproduire sur des modèles in vitro. Nous souhaitons tester notre approche thérapeutique dans un contexte tumoral sachant que le microenvironnement joue un rôle primordial, le modèle animal reste donc nécessaire.

Réduction

L’efficacité des molécules et leur toxicité seront en amont testées sur des cellules en culture. Nous avons prévu des étapes de décision entre les différentes procédures en fonction des résultats obtenus. Les souris seront porteuses de 2 tumeurs sous la peau afin d’avoir sur la même souris une tumeur traitée et une tumeur non traitée. Le suivi du devenir des molécules une fois injectées dans l’animal est réalisé par imagerie non invasive permettant un suivi dans le temps sur un même animal. L’éclairage des tumeurs se fera par une source lumineuse externe ce qui nous permettra, si besoin, d’éclairer plusieurs fois la même tumeur sans être invasif. Le nombre d’animaux (284) a été déterminé en utilisant une application dédiée et un test statistique sera réalisé.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 3 jours après leur arrivée dans l'établissement. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel ou maison, paille, bâton à ronger) sur un portoir ventilé. L’hébergement en portoir ventilé permet de limiter les risques d’infection des animaux par des pathogènes et/ou des opportunistes. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix en imagerie optique de par sa petite taille. La souris étant un animal de petit gabarit, nous sommes capables de détecter des signaux faibles et profonds en imagerie optique. Le bioimageur utilisé pour l’imagerie de fluorescence est adapté à la souris. Les modèles de tumeurs sous cutanées utilisés dans ce projet ont été établis chez la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation et l’imagerie optique.

Soumises trois fois à la pose d'une éponge intravaginale, à une injection intramusculaire d'hormone puis à quinze jours de prélèvements sanguins quotidiens à la jugulaire, 75 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste une hormone recombinante censée remplacer celle qui est aujourd'hui purifiée à partir du sang de juments gestantes, prélèvements suivis d'avortements provoqués que le porteur décrit comme plus rentables pour la production. Il présente le bénéfice principal comme une réponse aux "attentes sociétales" sur le bien-être des animaux non-humains, et affirme que le "besoin" d'une molécule de ce type est "réel et pressant" pour les entreprises et les éleveurs. Les 25 brebis traitées avec l'hormone naturelle retournent à l'élevage, les 50 autres, traitées avec la recombinante faute d'autorisation de mise sur le marché, sont tuées et envoyées à l'équarrissage.

Objectifs

La maîtrise de la reproduction en élevage des ruminants (bovins, ovins, caprins) ainsi que des porcins fait appel depuis 70 ans à une hormone naturelle très active, purifiée à partir de sang de juments gestantes (PMSG : Pregnant Mare Serum Gonadotropin, aussi appelée eCG : equine Chorionic Gonadotropin). Les fortes oppositions d’ordre éthique liées au bien-être animal nous ont conduit à envisager la production de cette hormone par génie génétique et sa production in vitro en cultures cellulaires, donc sans prélèvement de sang sur des « animaux-usines ». L’objectif du projet est de réaliser une preuve de concept de la capacité des eCG recombinantes d’induire une ovulation fertile chez la brebis avec une efficacité similaire à celle de la eCG extraite du sang des juments gravides. L’objetif final est le dépôt d’une demande de brevet pour les eCG recombinantes afin de proteger la proprieté intellectuelle.

Bénéfices attendus

Le principale benefice de l’eCG recombinante est de répondre aux attentes sociétales concernant le bien-être animal. En effet, on évitera de prélever de grands volumes de sang chez des juments gestantes, puis souvent de réaliser les avortements car les concentrations baissent fortement dans la deuxième moitié de la gestation et qu’il est plus rentable pour la production de l’hormone de redémarrer une gestation. Redistribuer à des millions d’animaux d’élevage une eCG partiellement purifiée provenant de sérums de multiples juments, au statut sanitaire inconnu, constitue un risque. En 2017 l’Union Européenne a publié un rapport dans lequel elle se dit "vivement préoccupée par l'importation et l'utilisation de médicaments vétérinaires contenant de la eCG". Cette situation impacte très négativement l’image des industriels et des éleveurs, lesquels se trouveraient par ailleurs en grande difficulté en cas d’interdiction de la eCG naturelle. Par ailleurs, en l’état, la capacité de synchroniser les ovulations par des méthodes sans hormone (effet mâle et photopériode pour les brebis) est insuffisante pour la pratique efficace de l’insémination artificielle, véritable pilier de la diffusion du progrès génétique en élevage. Le besoin d’une molécule de type eCG est réel et pressant pour les entreprises et les éleveurs, avec un cahier des charges exigeant, respectueux du bien-être animal. Notre proposition est le développement d’une eCG recombinante largement similaire à la eCG mais n’impliquant pas, de fait, le prélèvement de volumes sanguins très conséquents chez des juments gestantes. Ceci permettrait donc d’éliminer l’utilisation des juments pour la production de l’eCG et par consequant une amélioration du bien être animal.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à 3 séries d’expériences et chaque expérience est constituée de la pose d'une éponge intravaginale et d’une injection intramusculaire d’hormone suivie, en fonction des lots experimentaux, par quinze jours de prélèvements sanguins à raison d’un prélèvement par jour et par brebis ou d'un seul prélevement 8 jours après l'injection de l'hormone. Chaque prélèvement sanguin dure entre 3 et 5 seconds.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang à la jugulaire peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les injections en intramusculaire peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose d’une éponge intravaginale peut être désagréable pour la brebis.

Devenir

Comme l’eCG naturelle possède une AMM (autorisation de mise sur le marché) les 25 brebis traitées avec cette eCG seront réplacées et retourneront dans l’élevage. Par contre, comme l’eCG recombinante n’a pas d’AMM les brebis traitées avec cette molécule seront euthanasiées et envoyées à l’équarissage.

Remplacement

La physiologie est bien plus que la somme des multiples niveaux d’action – que nous sommes loin d’appréhender. Et cette somme ne peut pas être anticipée ; notre niveau de connaissance est très insuffisant. Chaque niveau interagit avec celui ou ceux qui a (ont) engendré son activité, et réagit aussi en fonction des niveaux d’intégration supérieurs afin de produire la réponse physiologique la mieux adaptée (le nombre de paramètres intégrés nous échappe largement mais reste la clé de l’adaptation des organismes à leur environnement – laquelle est en perpétuelle évolution). Tout cela ne peut se produire que dans un organisme entier ; aucune possibilité de reproduire cette somme d’interactions dans un modèle in vitro – on parle ici assurément de multiples (dizaines?) de types cellulaires et d’organes « indépendants » - ou dans un quelconque modèle in silico – qui restera toujours borné par les informations (partielles et incomplètes) dont nous pouvons le nourrir. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. Ceci justifie pleinement l’emploi d’animaux entiers ; seuls à même de rendre compte de ce que signifie la physiologie, et seule option valide pour espérer modifier les paramètres de celle-ci

Réduction

Nous allons réutiliser le même lot de brebis pour réaliser les trois experiences prévues dans le projet. Nous allons utiliser trois lots de 25 brebis. Ce nombre a été éstimé en utilisant un test de comparaison de deux proportions (proportion de brebis ayant ovulé et nombre d'ovulations fertiles dans chaque groupe).

Raffinement

Suite à l’injection et au prélèvement de sang nous donnerons des granulés à manger comme renforcement positif. Tout au long des experiences les animaux seront régulierement surveillés pour identifier des possibles signes de douleurs ou d’inconfort. Tout signe d’inconfort et/ou de douleur sera pris en charge par des antalgiques locaux. Les brebis étant des animaux sociaux resteront en groupe tout au long de l’expérience afin d’éviter un stress d’isolement social. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période des prélèvements pour évaluer l'état de bienêtre des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence seront suivi avec attention pour détecter d'éventuels signes de souffrance et de détresse. En cas de signe de détresse et de malêtre significatif, les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux. Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux.

Choix des espèces

La brebis est une des espèces cibles pour l’utilisation d' eCGs recombinante dans la maitrise de la reproduction en élévage. En outre la brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Pour pouvoir étudier l'effet sur l'ovulation et la fertilité nous utiliserons des brebis adultes.

284 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune porte deux tumeurs greffées sous la peau, l'une traitée et l'autre non, subit de neuf à quinze séances d'imagerie, de onze à vingt anesthésies, et des éclairages de tumeur pouvant durer une heure. Le porteur annonce une possible brûlure cutanée liée à l'irradiation, une perte de poids liée à la croissance tumorale et une fatigue liée aux anesthésies répétées. Il reconnaît que l'efficacité des molécules peut être validée sur cellules, et justifie le recours aux souris par l'hétérogénéité des tumeurs et la difficulté de reproduire une injection dans la circulation sanguine.

Objectifs

La vectorisation, c'est-à-dire le transport, des médicaments à l’aide de véhicule est une alternative thérapeutique très prometteuse, car elle présente plusieurs avantages par rapport aux produits non-vectorisés: (1) une meilleure biodisponibilité des médicaments ; (2) une meilleure accumulation dans les tumeurs ; (3) une meilleure biocompatibilité : grâce à une accumulation privilégiée dans les tumeurs par rapport aux tissus sains, les effets nocifs sont diminués ; et (4) une libération prolongée des médicaments. Dans le cas des véhicules sensibles à la lumière, le relargage des molécules transportées peut être contrôlé par la lumière. L'objectif est de montrer l'efficacité des véhicules sensibles à la lumière que nous avons développés dans le cadre du traitement de tumeurs cutanées. Ce projet sera réalisés dans 2 établissement utilisateurs : EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Preuve de concept de l'efficacité du relargage contrôlé par la lumière des produits anticancéreux, à partir de véhicules sensibles à la lumière. A plus long terme, cette technologie pourrait être utilisée en thérapie chez l'homme.

Procédures

Injection dans la veine sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée inférieure à 1 minute, dans l'EU2. Injection dans le ventre sur animal vigile : 1 à 3 fois, durée 10 secondes, dans l'EU 2. Prélèvement de sang sur animal anesthésié : une fois par semaine , 2 ou 3 fois, durée 1 minute, dans l'EU 2. Injection sous la peau sur animal anesthésié : 1 fois, durée 1 minute, dans l'EU 1. Eclairage d'une tumeur sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée entre 10 et 60 minutes, dans l'EU 2. Imagerie sur animal anesthésié : 9 à 15 fois, durée entre 1 à 5 min, dans l'EU 2. Anesthésie : 11 à 20 fois, durée entre 5 et 10 min, dans l'EU 1 et EU 2.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses en sous cutané peut provoquer une infection au niveau du site d’injection. La présence d’une tumeur sous cutanée peut engendrer une légère douleur, une gêne. Une perte de poids liée à la croissance tumorale peut survenir. Le suivi en imagerie peut fatiguer les animaux à cause des anesthésies répétées. L’injection du véhicule peut provoquer une mauvaise réaction chez l’animal, une douleur au niveau du site d’injection. L’irradiation peut engendrer une légère brulure cutanée. L’immunodéficience des animaux peut entrainer une infection par des pathogènes.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Malgré la possibilité de valider sur des cellules in vitro l’efficacité des molécules, nous souhaitons montrer l’intérêt de notre technologie dans le traitement des tumeurs qui sont des structures dont la composition est hétérogène. De plus l’objectif est d'injecter ces molécules dans la circulation sanguine ce qui est à l’heure actuelle quelque chose de difficile à reproduire sur des modèles in vitro. Nous souhaitons tester notre approche thérapeutique dans un contexte tumoral sachant que le microenvironnement joue un rôle primordial, le modèle animal reste donc nécessaire.

Réduction

L’efficacité des molécules et leur toxicité seront en amont testées sur des cellules en culture. Nous avons prévu des étapes de décision entre les différentes procédures en fonction des résultats obtenus. Les souris seront porteuses de 2 tumeurs sous la peau afin d’avoir sur la même souris une tumeur traitée et une tumeur non traitée. Le suivi du devenir des molécules une fois injectées dans l’animal est réalisé par imagerie non invasive permettant un suivi dans le temps sur un même animal. L’éclairage des tumeurs se fera par une source lumineuse externe ce qui nous permettra, si besoin, d’éclairer plusieurs fois la même tumeur sans être invasif. Le nombre d’animaux (284) a été déterminé en utilisant une application dédiée et un test statistique sera réalisé.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 3 jours après leur arrivée dans l'établissement. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel ou maison, paille, bâton à ronger) sur un portoir ventilé. L’hébergement en portoir ventilé permet de limiter les risques d’infection des animaux par des pathogènes et/ou des opportunistes. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix en imagerie optique de par sa petite taille. La souris étant un animal de petit gabarit, nous sommes capables de détecter des signaux faibles et profonds en imagerie optique. Le bioimageur utilisé pour l’imagerie de fluorescence est adapté à la souris. Les modèles de tumeurs sous cutanées utilisés dans ce projet ont été établis chez la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation et l’imagerie optique.

Deux chirurgies par animal, la seconde durant de quatre à douze heures, puis des enregistrements cérébraux d'une à six heures pendant leur sommeil : 200 rats et 200 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés en cages individuelles ou semi-partagées et maintenus en restriction alimentaire pendant environ un mois, avant d'être entraînés à des tâches de mémoire dans des labyrinthes puis soumis à des micro-stimulations cérébrales destinées à modifier leurs performances. Le porteur écrit que la restriction alimentaire est bénéfique pour la santé et ne constitue pas une nuisance, et que l'isolement n'engendre qu'un stress léger. La validation des enregistrements exige un prélèvement histologique, donc la mise à mort, seuls des animaux non implantés pouvant être placés auprès d'associations, et les tests comportementaux sont annoncés sans être précisés.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier les mécanismes de la formation et de la consolidation de la mémoire, ainsi que de son utilisation pour la prise de décision, l’anticipation et l’imagination. Nous entraînerons des rongeurs à effectuer des tâches de mémoire, nous enregistrerons leur activité cérébrale pendant l’accomplissement de ces tâches et pendant le sommeil, et nous tenterons de modifier les performances des animaux grâce à des micro-stimulations cérébrales ciblées (à l’instar des micro-stimulations qui améliorent la motricité de patients atteints de la maladie de Parkinson). Des rats et des souris seront utilisés pour toutes les étapes de ce projet. Ces rongeurs sont des modèles standards, aussi bien en psychologie animale qu’en neurophysiologie chez l’animal libre de ses mouvements, pour l’étude de la mémoire en conditions normales et pathologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux de la mémoire. Nous nous intéresserons en particulier à l’hippocampe, une structure qui chez l’homme joue un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée dans les troubles mnésiques liés aux maladies neurologiques, notamment l’épilepsie, la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer. À ce titre, nos travaux précédents décrivant une méthode d’amélioration de la consolidation de la mémoire chez le rat ont été récemment répliqués chez l’homme et laissent entrevoir la possibilité de pallier certains déficits mnésiques liés à l’âge ou à la pathologie.

Procédures

Ce projet utilisera au plus 200 rats et 200 souris. Les animaux seront hébergés en cages semi-partagées ou individuelles et en légère restriction alimentaire typiquement pendant 1 mois. Tous subiront 2 chirurgies : la première durant typiquement 1 à 2 heures, la seconde durant typiquement 4 à 12 heures. Les deux chirurgies sont espacées de 1 à 3 semaines. Les enregistrements dureront typiquement 1 à 2 heures pendant les tests comportementaux et 1 à 6 heures pendant leur sommeil, le tout pendant 2 à 3 semaines. En général, chaque animal n’est testé que dans une seule tâche, et n’explore donc qu’un labyrinthe particulier (dans certains cas, comme pour des tâches en plusieurs étapes, ils peuvent être amenés à en explorer plusieurs, mais le principe reste le même et la durée totale est similaire, soit typiquement un mois en incluant la familiarisation et le pré-entraînement avant enregistrements). État de conscience : les animaux sont vigiles pendant l’hébergement, les tests comportementaux et les enregistrements ; ils sont anesthésiés pendant les chirurgies.

Impact sur les animaux

Les chirurgies peuvent engendrer des douleurs post-opératoires modérées sur de courtes périodes. Les implants peuvent être source d’inconfort pendant le cours laps de temps que l’animal s’y habitue. L’isolement des animaux va engendrer un stress léger typiquement pendant 1 mois. Concernant les tests comportementaux et les enregistrements, ils peuvent occasionner un très léger stress lié à la nouveauté lors des toutes premières sessions. La légère restriction alimentaire est bénéfique pour la santé et ne constitue pas une nuisance.

Devenir

À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique. Certains animaux non exploitables seront replacés auprès d’associations spécialisées (animaux non implantés, jugés aptes par un vétérinaire, acceptés pour placement, etc.)

Remplacement

Certains mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant la mémoire (par exemple, le recrutement de nouveaux récepteurs au niveau synaptique) peuvent être défrichés in vitro. Certaines propriétés computationnelles de petits réseaux de neurones peuvent être testées in silico. Mais in fine, l’étude des mécanismes de réseau de la mémoire nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire, et ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer >100 neurones simultanément, ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal. L'approche statistique tirera profit des tout derniers développements statistiques et analytiques du domaine.

Raffinement

Les soins post-opératoires incluront des traitements analgésiques, ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Nos expériences s'effectueront sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements pour se rapprocher au mieux de la physiologie et limiter le stress. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Pendant les périodes nécessitant une restriction alimentaire précise et une protection des implants, les animaux (rats et souris) doivent être maintenus dans des cages semi-partagées maintenant un contact auditif, olfactif, et visuel. Les rats auront également un lien tactile partiel. De la musique sera diffusée dans la pièce pour réduire le stress causé par les éventuels bruits environnants, qui bien que réduits pourraient devenir plus saillants dans le silence. La légère restriction alimentaire est bénéfique pour un grand nombre de marqueurs de santé et de vieillissement. L’exploration de labyrinthes constitue par ailleurs une stimulation bénéfique (exercice physique, curiosité, récompenses alimentaires,…) Les animaux sont suivis grâce à l’utilisation de grilles de score qui permettent la mise en place de points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rongeur est un modèle idéal pour étudier la mémoire spatiale en raison de ses excellentes capacités de navigation. S’agissant de l’espèce de référence pour toutes les études depuis les années 70, les données déjà publiées servent de base pour faire progresser nos connaissances. De plus, l’existence de modèles transgéniques permet de cibler des groupes cellulaires spécifiques. Nous utiliserons de jeunes adultes (typiquement 2 à 6 mois), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.

Opérées à douze semaines pendant une heure sous anesthésie gazeuse pour recevoir une sonde télémétrique dans un vaisseau sanguin, puis mises à jeun six heures à plusieurs reprises et piquées à la queue deux fois par semaine, 130 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre-vingt-seize d'entre elles reçoivent en plus cinq injections sous-cutanées quotidiennes. Toutes sont tuées pour autopsie. Une partie sont des animaux de réforme, que le porteur décrit comme des souris transgéniques de génotype non pertinent "systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet", et il annonce 130 souris sur quatre ans pour ce qu'il qualifie lui-même d'étude de faisabilité.

Objectifs

Les objectifs de cette étude sont : - de maîtriser la méthode d’utilisation d’une sonde de mesure de glucose posée dans l’artère carotide d’une souris. - de développer chez la souris une technique chirurgicale permettant de mesurer la glycémie en continu dans le sang entre l’intestin et le foie grâce à cette sonde télémétrique. Cette mesure de glucose se réalise habituellement dans le sang périphérique, il est donc nécessaire de réaliser des adaptations pour pouvoir la mesurer dans le sang qui sort de l’intestin. Cette étude permettra également de vérifier si cette sonde permet de mesurer une production de glucose par l’intestin. Pour cela, les souris seront soumises à des courtes périodes de jeûnes et des régimes variés pour suivre en continu les variations de cette glycémie.

Bénéfices attendus

L’intérêt de développer la surveillance continue du glucose par télémétrie dans les circulations sanguines artérielle et veineuse est de fournir un suivi en temps réel avec une haute précision des variations subtiles du glucose sans avoir à intervenir sur l’animal. L’innovation tient au développement de la mesure continue du glucose dans la veine porte, située entre l’intestin et le foie. La présence de glucose et de nutriments dans la veine porte contrôle le fonctionnement du foie et la régulation de l’appétit. A court terme, cette mesure continue du glucose au niveau de la veine porte aidera à comprendre la régulation de la prise alimentaire et le fonctionnement du foie. Elle offrira la possibilité de comprendre la dynamique du glucose dans des modèles de souris reproduisant diverses maladies : obésité, diabète, maladies cardiovasculaires, cancer.

Procédures

Les souris de cette étude seront soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie gazeuse pour implanter la sonde télémétrique dans les vaisseaux sanguins (durée 1h). En pré-médication, 2 injections d’analgésiques sous la peau seront effectuées (2x 15 secondes) et au moment de la chirurgie, une injection d’analgésie locale sera rajoutée (30 secondes). Pour gérer la douleur post-opératoire une injection sous la peau d’un analgésique sera effectuée 1 fois/jour pendant 3 jours (3x 15secondes). Pour 6 souris : une mise à jeun pendant 6 heures sera réalisé avant une injection de glucose. Le geste nécessaire à l’injection dure 20 à 30 secondes et la mesure de glycémie quelques secondes. Pour cela, une goutte de sang sera prélevée (au total 7 fois au cours du test) à l’extrémité de la queue. Une seule incision initiale de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une crème anesthésiante. Des prélèvements 2 fois/semaine sur 2,5 semaines soit 5 prélèvements de 30 secondes chacun seront ensuite réalisés. Pour 96 souris, 5 injections journalières sous la peau à différents endroits (durée 15 secondes) à l’âge de 13 semaines seront réalisées et ces souris seront mises à jeun pendant 6h à 4 reprises. Un prélèvement de sang à la queue sera réalisé 2 fois/semaine pendant 4 semaines (8x30 secondes) Pour diminuer la douleur, une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements. Une anesthésie gazeuse sera mise en place avant la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

A l’âge de 12 semaines, les souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un capteur de glucose dans un vaisseau sanguin. Les chirurgies sont susceptibles de provoquer de la douleur post-opératoire, notamment au niveau des sutures de l’abdomen. Le prélèvement d’une goutte de sang à la queue, peut provoquer du stress et une douleur transitoire. Les mise à jeun pendant 6H chez ces souris opérées peuvent induire un stress. A l’âge de 13 semaines, 96 souris recevront une injection sous-cutanée, qui peut induire un stress lié à la contention et une douleur au point d’injection. Les points d’injection seront différents tous les jours afin d’éviter une douleur au point d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour autopsie.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de suivre en continu la glycémie d’un organisme entier, en fonction de ses états physiopathologiques. La régulation de la glycémie dépend de la coopération de différents organes et ne peut pas être reproduite sur cellules ou organoïdes. Actuellement il n’existe pas de modèle informatique de la régulation du glucose sanguin.

Réduction

Une partie des animaux utilisés sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de génotype non pertinent non utilisables en protocole et non replaçables, systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet. L’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux uniquement pour les étapes de mises au point. Le nombre de souris utilisées dans la procédure d’étude a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux, du métabolisme du glucose et des connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 16 souris maximum par génotype et par sexe seront utilisés pour déterminer si la production de glucose par l’intestin peut être mesurée par une sonde télémétrique placée en veine porte. Au total, ce projet réalisé sur 4 ans nécessitera 130 souris transgéniques.

Raffinement

Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Ces interventions seront réalisées par des personnes expérimentées avec du matériel biocompatible et adapté à la souris. Pendant l’intervention chirurgicale, les souris seront placées sur un tapis chauffant afin de maintenir leur température corporelle entre 36 et 38°C et un gel lubrifiant sera déposé sur les yeux. En fin d’intervention, les animaux seront réhydratés par une injection sous-cutanée de solution physiologique et surveillés dans une pièce chauffée à 28°C pour faciliter leur récupération. Le suivi post-opératoire se fera dans une pièce dont la température sera réglée à 24°C pendant une semaine pour favoriser la reprise de poids des souris. De l’aliment hydraté sera également mis à disposition dans la cage les jours suivants. Les injections répétées sous la peau seront réalisées en changeant de point d’injection pour éviter des inflammations locales. La mise en place d’une grille de score pendant toute la durée du projet permet d’adapter la surveillance et l’utilisation d’antalgiques selon l’état de l’animal. Cette grille de score et l’utilisation de points limites adaptés ont permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet.

Choix des espèces

En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le protocole sera réalisé chez des souris adultes âgées de 12 semaines, âge auquel les animaux ont un meilleur rétablissement post-chirurgical.

Gavage quotidien pendant cinq jours, chirurgie du lymphœdème, injection de cellules tumorales, puis jusqu'à huit prélèvements sanguins à la queue par test de tolérance : 530 souris, en grande majorité des femelles, subissent ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet porte sur le rôle des hormones féminines dans le système lymphatique et la diffusion métastatique, et se déroule dans deux établissements entre lesquels les animaux sont transportés. Le porteur écrit que la chirurgie du lymphœdème ne génère pas d'effet indésirable majeur, tout en listant les signes qui déclencheraient un analgésique, dos voûté, yeux plissés, absence de toilettage. Les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour récolter les tissus.

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs. L’AJOUT DE DEUX TECHNIQUES NÉCESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISÉ (MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE ET TEST DE TOLÉRANCE ORALE AUX LIPIDES).

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Dans le premier établissements utilisateur : dans un premier temps, une gavage quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). TROIS FOIS AU COURS DU PROTOCOLE, UNE MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE, un test de tolérance au glucose et UN TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE SERONT RÉALISÉS, ESPACÉS DE DEUX JOURS. LA COMPOSITION CORPORELLE SERA ÉVALUÉE PAR RMN (MINISPEC, BRUKER) CHEZ DES SOURIS ÉVEILLÉES (2 MINS). LES TESTS DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET LIPIDES IMPLIQUENT UN GAVAGE (20 SEC), SUIVI DE PRÉLÈVEMENTS SANGUINS SÉQUENTIELS À LA QUEUE (8 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET 4 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE). Dans le second établissement utilisateur : les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie juste avant la mise à mort. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure.

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place. LE MINISPEC PEUT PROVOQUER UN STRESS LÉGER ET TEMPORAIRE DÛ AU CONFINEMENT. LE GAVAGE PEUT CAUSER UN STRESS TEMPORAIRE, UNE LÉGÈRE IRRITATION DE L’ŒSOPHAGE ET UN RISQUE D’ASPIRATION, AVEC UN RISQUE MINIME DE LÉSIONS SI LA TECHNIQUE EST CORRECTE.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de métastases ou l'apparition du lymphoedème secondaire après curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation génique du récepteur aux oestrogènes ERα a été généré seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant à une invalidation du ERα de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 22 semaines.

Toutes tuées à l'issue, tumeur et intestin prélevés pour analyse, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau des cellules d'une lignée tumorale colorectale, qui forment une masse en trois semaines, puis des traitements d'immunothérapie ou de chimiothérapie censés la réduire. Une nécrose apparaît parfois et entraînerait la mise à mort des souris concernées, ce que le porteur relativise en indiquant que le modèle sous-cutané n'entraîne jamais de métastases et atténue "une possible souffrance". Il conclut au caractère "indispensable" du modèle in vivo pour évaluer l'efficacité dans un "contexte physiologique complet".

Objectifs

Il s'agit d'approfondir la connaissance des mécanismes impliqués dans la résistance aux immunothérapies et chimiothérapies du cancer colorectal et d'explorer de nouvelles pistes thérapeutiques, afin de limiter la progression du cancer et le sensibiliser au traitement d'immunothérapie ou de chimiothérapie dans un modèle de souris porteuse de tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet veut apporter la preuve de concept que la résistance au traitement d'immunothérapie ou de chimiothérapie peut être levé avec l'administration d’un anticorps thérapeutique contre Reg3b.

Procédures

Le modèle expérimental consiste à injecter sous la peau des cellules d'une lignée tumorale d'origine colorectale. Ces cellules vont se multiplier pour former une masse tumorale qui reste cependant limitée (

Impact sur les animaux

Le modèle tumoral sous-cutané qui sera utilisé induit après 3 semaines une tumeur s’accompagnant parfois d’une nécrose qui dans la plupart des cas n’entraine ni saignement, ni ulcération. Le développement de nécrose entrainerait l’euthanasie des souris concernées. Il faut noter que pour les modèles utilisés, la masse de cellules tumorales reste délimitée au niveau sous-cutané et n'entraine jamais d'envahissement ou de métastases, ce qui limite les effets chez les animaux et attenue une possible souffrance.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés et différents organes analysés (tumeur, intestin...)

Remplacement

L’utilisation d’un modèle in vivo est indispensable dans ce projet pour évaluer l’efficacité thérapeutique dans un contexte physiologique complet. Contrairement aux modèles in vitro, qui permettent uniquement une analyse partielle et simplifiée des mécanismes cellulaires, le modèle in vivo reproduit la complexité du microenvironnement tumoral, incluant les interactions entre cellules tumorales, cellules immunitaires et signaux microbiens.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux tout en garantissant une puissance statistique suffisante, des groupes de 6-8 souris seront constitués pour chaque condition expérimentale. Ce choix repose sur des expériences préliminaires ayant mis en évidence une variabilité interindividuelle de la croissance tumorale.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un environnement présentant des enrichissements dans les conditions usuelles prévues par la législation. Ils seront manipulés par des personnes formées dans une salle dédiée séparée de la zone d’hébergement. Au maximum, deux manipulateurs différents s'occuperont des animaux tout au long du protocole. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront surveillés par du personnel formé avec un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe). Une semaine après injection des cellules tumorales, les animaux sont suivies tous les 2-3 jours (Lu, Me, Ve) avec mesure des tumeurs ce qui permet d'intervenir rapidement en cas d'évolution anormale.

Choix des espèces

Les lignées de souris utilisées sont tolérantes aux cellules tumorales injectées ce qui permet leur croissance (pas de phénomène de rejet). Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8-16 semaines) pour permettre au microbiote intestinal de se stabiliser et au système immunitaire d’être à maturité.